专利名称：：含有角蛋白生物材料的伤口愈合组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及角蛋白生物材料及其在生物医学应用中的用途。
背景技术：
：最早文献记载的角蛋白医学用途来自一位名为李时珍的中草药医生(《本草纲目》(MateriaMedica)，即一部由李时珍(1518-1593)著述的中草药辞典)。在为期38年里，他著述了一部通称《本草纲目》的800巻书文集。这些书出版于1596年，即他死后3年。在这些巻中所述的11000多种处方当中，一种名为血余炭(又名CrinisCarbonisatus)的物质由来自热解人发的研磨灰分构成。血余炭的所述适应症是加速伤口愈合和血液凝固。在19世纪初期，当蛋白质还被称为类清蛋白(albuminoids)(清蛋白是当时众所周知的蛋白质)时，很多不同种类的蛋白质正在被发现。1849年左右，"角蛋白"(keratin)这个词在文献上出现，以描述构成硬组织例如动物角和蹄的材料(keratin来自希腊语"kera"，系指角)。这种新蛋白质引起科学家的兴趣，因为它表现得不像其它蛋白质。例如，用于溶解蛋白质的通常方法对角蛋白无效。尽管燃烧和研磨之类的方法为人所知已有一段时间，但很多科学家和发明家对溶解毛发和角更感兴趣，以期制造更好的产品。在1905年至1935年间，开发出利用氧化和还原化学提取角蛋白的很多方法(BreinlF和Baudisch0，ZphysiolChem1907;52:158-69;NeubergC，美国专利No.926，999，1909年7月6日;LissizinT，BiochemBull1915;4:18-23;ZdenkoS，ZphysiolChem1924;136:160-72;LissizinT，ZphysiolChem1928;173:309-11)。到1920年代晚期，已经开发出破坏毛发、角和蹄的结构的很多技术，但科学家被其中一些纯化蛋白质的行为弄糊涂了。科学家们很快断言，在这些提取物中存在很多不同形式的角蛋白，并断言毛发纤维一定是一种复杂结构，而不只是蛋白质束。1934年，发表了一篇关键研究论文，该论文描述了不同类型的角蛋白，其主要区别在于有不同分子量(GoddardDR和MichaelisL，JBiolChem1934;106:605-14)。这篇重要论文证实，有很多不同的角蛋白同系物，且各自在毛囊的结构和功能方面发挥不同的作用。利兹大学和英国羊毛工业研究协会的早期研究表明，羊毛和其它纤维由外角质层和中心皮层构成。在此资料基础上，CSIRO的科学家对羊毛的结构和组成作出许多最基本的研究。与氧化和还原化学方法配合使用X-射线衍射和电子显微术，CSIRO制作出毛发纤维的最初的完整图(RivettDE等人，"KeratinandWoolResearch,，，TheLe翻xLegacy，CSIR0Publishing;Collingwood，VIC，Australia;1996)。61965年，CSIRO科学家W.GordonCrewther及其同事发表了关于角蛋白化学的权威著作(CrewtherWG等人，TheChemistryofKeratins.AnfinsenCBJr等人编辑，AdvancesinProteinChemistry1965。AcademicPressNewYork:191-346)。《蛋白质化学进展》(AdvancesinProteinChemistry)中的这一章含有超过640项公开的角蛋白研究的参考文献。一旦科学家知道如何从毛发纤维提取角蛋白、将其提纯和表征，可用角蛋白生产的衍生材料的数目就成指数增长。从1970年开始的10年中，全世界若干个研究团体开发并公布了将提取的角蛋白制成粉末、薄膜、凝胶、涂料、纤维和泡沫体的方法(AnkerCA，美国专利No.3，642，498，1972年2月15日；KawanoY和0kamotoS，KagakuToSeibutsu1975;13(5):291-223;0kamotoS，NipponShokuhinKogyoGakkaishi1977;24(1):40-50)。所有这些方法都利用了此前数十年发展的氧化和还原化学。1982年，日本科学家发表了描述在血管移植物上使用角蛋白涂料作为消除血液凝固的一种途径的第一个研究(NoishikiY等人，KobunshiRonbunshu1982;39(4):221-7)以及关于角蛋白的生物兼容性的实验(ItoH等人，KobunshiRonbunshu1982;39(4):249-56)。此后不久，在1985年，英国的2位研究者发表了一篇思考使用角蛋白作为新型生物材料发展的结构单元的前景的综述文章(jarmanT和LightJ，WorldBiotechR印1985;1:505-12)。1992年，角蛋白基生物材料主体的发展和试验成为法国研究生IsabelleValherie的博士论文的主题(ValherieI和GagnieuC.Chemicalmodificationsofkeratins-Preparationofbiomaterialsandstudyoftheirphysical,physiochemicalandbiologicalproperties.Doctoralthesis。InstNatlSciA卯lLyon，France1992)。此后不久，日本科学家在1993年发表了关于角蛋白在生物材料发展前沿可能占据的突出位置的评论(VariousAuthors,KogyoZairyo1993;41(15)Specialissue2:106-9)。总而言之，以上提到的公开著作大体说明角蛋白的独特化学性质、物理性质和生物性质。然而，目前仍非常需要用于生物医学用途，特别是用于治疗伤口的优化角蛋白制剂。发明概述本发明的一个方面是包含角蛋白衍生物(例如，角质骨骼、还原角蛋白、或其组合)和任选至少一种附加活性成分(例如，镇痛剂、抗菌剂、附加伤口愈合剂等)的药物组合物。本发明的另一方面是治疗有需要的对象的伤口(例如烧伤、擦伤、裂伤、切伤、褥疮、剌伤、贯穿伤、枪伤、挤压伤等)的方法，包括将角蛋白衍生物以有效治疗该伤口的量施用到该伤口上。在一些实施方案中，所述带正电荷的组合物包含、组成为或基本组成为角质骨骼、还原角蛋白、或其组合。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为a角质骨骼、Y角质骨骼、酸性a角质骨骼、碱性a角质骨骼、酸性Y角质骨骼、碱性Y角质骨骼、a还原角蛋白、Y还原角蛋白、酸性a还原角蛋白、碱性a还原角蛋白、酸性Y还原角蛋白、碱性Y还原角蛋白、或其组合。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物以有效抑制伤口转化和/或促进伤口闭合的量施用到伤口上。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物局部施用。在一些实施方案中，该角7蛋白衍生物通过注射到对象体内来施用。本发明的又一方面是治疗有需要的对象的烧伤的方法，包括将角蛋白衍生物以有效治疗烧伤的量施用到该伤口上。在一些实施方案中，所述带正电荷的组合物包含、组成为或基本组成为角质骨骼、还原角蛋白、或其组合。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为a角质骨骼、Y角质骨骼、酸性a角质骨骼、碱性a角质骨骼、酸性Y角质骨骼、碱性Y角质骨骼、a还原角蛋白、Y还原角蛋白、酸性a还原角蛋白、碱性a还原角蛋白、酸性Y还原角蛋白、碱性Y还原角蛋白、或其组合。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物以有效抑制伤口转化和/或促进伤口闭合的量施用到伤口上。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物局部施用。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物通过注射到对象体内来施用。本发明的另一方面是外科手术或紧急护理辅助器，其包含固态的生理学可接受基底；和在该基底上的角蛋白衍生物。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为a角质骨骼、Y角质骨骼、酸性a角质骨骼、碱性a角质骨骼、酸性Y角质骨骼、碱性Y角质骨骼、a还原角蛋白、Y还原角蛋白、酸性a还原角蛋白、碱性a还原角蛋白、酸性Y还原角蛋白、碱性Y还原角蛋白、或其组合。本发明的再一方面是包含角蛋白衍生物和容器的药盒(kit)，所述角蛋白衍生物以无菌形式包装在该容器中。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为a角质骨骼、Y角质骨骼、酸性a角质骨骼、碱性a角质骨骼、酸性Y角质骨骼、碱性Y角质骨骼、a还原角蛋白、Y还原角蛋白、酸性a还原角蛋白、碱性a还原角蛋白、酸性Y还原角蛋白、碱性Y还原角蛋白、或其组合。本发明的另一方面是本文所述的角蛋白衍生物用于制备实施本文所述的治疗方法用的组合物或药剂或用于制造本文所述的制品的用途。附图简述图1.皮肤组成细胞增殖。用可溶角蛋白生物材料处理的角质形成细胞(a)和成纤维细胞(b)比仅用培养基处理的细胞更容易增殖。图2.化学烧伤面积随时间的变化。用苯酚处理以诱发化学烧伤的小鼠经受伤口位置的钝化以便不发生正常伤口生长过程。图3.猪的烧伤面积。通过数字图像分析测定伤口面积并正规化至第0天的数值。用角蛋白凝胶处理的伤口在最初几天没有发生面积显著增加，并且比对照物更快愈合。图4.Kaplan-MayerSurvivalGraph:时间在对数标度上以分钟为单位表示。对照组中的所有动物在60分钟内死亡。角蛋白组中的一个动物和HemCon⑧止血绷带组的一个动物在动物护理人员的建议下被处死。总体上，角蛋白优于其它组，只有一个死亡，与此相比，QuikClot⑧止血剂和HemCon⑧止血绷带组中2个死亡。图5.流血(ShedBlood):按体重将失血标准化，并表示为体重的百分比。角蛋白和QuikClot⑧止血剂组的失血明显(*)少于对照和HemCon⑧止血绷带组。图6.平均动脉压(MAP):以初始压力的百分比表示血压。阴性对照和QuikClot⑧止血剂组的压力骤降至初始MAP的40%。用角蛋白或HemCon⑧止血绷带处理的动物能够使MAP稳定在初始压力的80%附近。这些差异与对照物没有统计上的不同。图7.休克指数(SI):通过将心率除以MAP，计算这种修正的休克指数。该指数在临床上用于评估休克的严重性，值越低越好。角蛋白组中的动物在整个研究期间表现出补偿的(compensated)低值，而QuikClot⑧止血剂和HemCon⑧止血绷带组具有与阴性对照组类似的值。组之间没有统计显著性。图8.组织学评估代表性的组织切片用苏木精和曙红染色，50x。A)阴性对照组显示出具有宽和空的正弦曲线的灌注不良迹象。表面缺乏功能性血块。B)QuikClot⑧止血剂处理的样品的表面显示出坏死(箭头)和凝结区。只能看出轻微的细胞浸润和组织再生。空隙区代表已移除的QuikClot⑧止血剂颗粒。c)来自HemCon⑧止血绷带处理的动物的组织样品显示出附着的凝固血区域，其中存在低的细胞浸润水平。D)来自用角蛋白处理的动物的肝样品显示出附着到受损表面上角蛋白生物材料厚层。有迹象表明存在具有高细胞活性的优异生物相容性和在角蛋白之间的空隙中形成早期颗粒组织(大箭头)。此外，肝细胞与角蛋白生物材料的直接接触程度高(小箭头)。图9.角蛋白处理组，高放大率A)在角蛋白凝胶的空隙内形成早期颗粒状组织，200x。B)角蛋白凝胶和肝组织之间的界面，表现出生物材料和组织的融合，以及早期细胞浸润，400x。优选实施方案详述所有引用的美国专利参考文献的公开文书均在与本公开一致的程度上经此引用并入本文。在1986年和1987年的2篇论文中公布了所提取的角蛋白溶液在微米规模上自发自组装的能力(ThomasH等人，IntJBiolMacromo11986;8:258-64;vandeL6chtM，MelliandTextilberichte1987;10:780-6)。这种现象并不令人惊讶，因为无论从何处得到毛发角蛋白，都有高度受控的超结构。当恰当地加工时，这种自组装能力可以得到保全和用来在有益于细胞浸润的尺寸规模上产生规则结构。当角蛋白(例如用酸或碱)水解时，其分子量降低，且它们丧失自组装能力。因此，使水解降到最低限度的加工条件是优选的。出于两个原因，这种自组装能力对组织工程支架而言是特别有用的特征。第一，自组装产生具有可再现的构造、维度和孔隙率的高度规则结构。第二，这些构造在良性条件下能自动形成，这一事实使得细胞在基质形成时并入。这两个特征对试图模仿原生细胞外基质(ECM)的任何系统而言都是至关重要的。细胞识别也是寻求模仿ECM的生物材料的一个重要特征。通过细胞表面整合蛋白(integrins)结合到由ECM组成蛋白质所提供的特定氨基酸基序上，促进这种识别。主导的蛋白质包括胶原蛋白和纤连蛋白，两者都已在细胞结合方面受到广泛研究。这两种蛋白质都含有若干个能支持多种细胞类型的附着的区域。已经表明，除公知的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序外，纤连蛋白上的"X"-天冬氨酸-"Y"基序也被整合蛋白a4131识别，其中X等于甘氨酸、亮氨酸或谷氨酸，而Y等于丝氨酸或缬氨酸。由人毛发衍生的角蛋白生物材料含有这些相同的结合基序。NCBI蛋白质数据库的检索揭示了71种分立、独特的人发角蛋白的序列。其中，55种来自高分子量、低硫、a-螺旋家族。这组蛋白质通常被称为a-角蛋白，并负责赋予人毛发纤维韧性。这些a-角蛋白具有高于40kDa的分子量和4.8摩尔％的平均半胱氨酸(响应分子间和分子内蛋白质结合的主要氨基酸)含量。此外，这些a-角蛋白的氨基酸序列的分析显示，78X含有至少一种纤连蛋白样整合蛋白受体结合基序，而25%含有至少2种或更多种。2篇最近的论文通过证实加工的角蛋白泡沫体上的优异细胞粘合来强调如下事实这些结合部位可能存在于角蛋白生物材料的表面上(TachibanaA等人，JBiotech2002;93:165-70;TachibanaA等人，Biomaterials2005;26(3):297-302)。可以以与所公开的角蛋白制剂类似的方式使用的天然聚合物的其它实例包括但不限于胶原、明胶、纤连蛋白、玻连蛋白(vitronectin)、层粘连蛋白、纤维蛋白、粘蛋白、弹性蛋白、巢蛋白(触角蛋白entactin)、蛋白多糖等(参见例如授予Katsuen等人的美国专利No.5，691，203)。人毛发提取物的生物活性理论包括，人毛发角蛋白("HHK")本身是生物活性的。超过70种人毛发角蛋白是已知的，并公布了它们的cDNA衍生序列。然而，HHK的全家福(fullcompliment)是未知的，已提出100多种的估计值(GillespieJM，Thestructuralproteinsofhair-isolationcharacterization,andregulationofbiosynthesis。GoldsmithUV(编车茸)，Biochemistryandphysiologyoftheskin(1983)，OxfordUniversityPress。NewYork;475-510)。在HHK的整个范围内，少数已表明参与伤口挛縮和细胞迁移(Martin,P.，Science1997;276:75-81)。特别是，角蛋白K_6和K-16在伤口愈合期间在表皮中表达，而且也存在于毛囊的外根鞘中(BowdenPE，MolecularAspectsofDermatology(1993)，JohnWiley&Sons，Inc.，Chichester:19-54)。这些HHK在人毛发提取物中的存在及其随后直接给药于伤口床，可能成为本来漫长的分化、迁移和增殖过程的"捷径"，或可能缓解某种生物化学上的不足，从而加速组织修复和再生过程。十多年来已经知道，在发育的毛囊中存在生长因子例如骨形态发生蛋白-4(BMP-4)和转化生长因子-P(TGF-P)超家族(superfamily)的其它成员(JonesCM等人，Development1991;111:531-42;LyonsKM等人，Development1990;109:833-44;BlessingsM等人，GenesandDevelop1993;7:204-15)。事实上，超过30种生长因子和细胞因子参与环化毛囊的生长(HardyMH，TrendsGenet1992;8(2):55-61;StennKS等人，JDermatoSci1994;7S:S109_24;RogersGE，IntJDevBiol2004;48(2-3):163-70)。这些分子中很多在各种组织的再生中发挥关键作用。非常可能的是，当细胞因子结合到位于毛囊隆突区的干细胞上时，许多生长因子被夹带在人毛发内(PanteleyevAA等人，JCellSci2001;114:3419-31)。这些生长因子预计与角蛋白一起从末端切割的人毛发中提取出来。这种观察并非没有先例，因为以前已经显示，很多不同类型的生长因子存在于各种组织的提取物中，并且即使在化学提取后也保持它们的活性。诸如此类的观察显示出如下确凿证据许多生长因子可能存在于末端切割的人毛发中，且角蛋白可能充当这些生长因子等的高度有效输送基质。角蛋白是在脊椎动物的毛发、皮肤和其它组织中发现的蛋白质家族。毛发是人角蛋白的一个独特来源，因为它是易得且廉价的少数人体组织之一。尽管角蛋白的其它来源是本发明的可接受原料(例如羊毛、毛皮、角、蹄、喙、羽、鳞等)，但人毛发因其生物兼容性而优选用于人类对象。角蛋白可以使用业内已公开的方法通过氧化或还原而从人毛发纤维中提取(见例如CrewtherWG等人Thechemistryofkeratins,AdvancesinProteinChemistry1965;20:191-346)。这些方法通常采用两步法，从而通过氧化或还原破坏角蛋白的交联结斜呈构。在这些反应中，使半胱氨酸氨基酸残基中的二硫化物键裂解，从而使角蛋白可溶(皿丄)。角质层基本不受这种处理影响，因而大部分角蛋白仍截留在该角质层的保护结构内。为了提取这些角蛋白，必须采用使用变性溶液的第二步骤。或者，在还原反应的情况下，这些步骤可以组合。业内已知的变性溶液包括脲、过滤金属氢氧化物、表面活性剂溶液、及其组合。优选的方法在氧化和还原反应中分别使用浓度为0.1至1.0M的Tris水溶液和浓度0.1至10M的脲溶液。N末端、'n末端o、-c、,ch2s、'c末端+:^r~0—c末端HA或ch,cooohN末端o、h,ch3o，oN末端N—g:ch2末端+hsch,coohN末端h—Wn本端^1^_0—C末端oSIhh^~0—c末端b,c、M^l角蛋白中二硫化物交联键的(a)氧化和(b)还原的一般表述。这些反应使半胱氨酸残基中的硫-硫键裂解，从而破坏该超结构并使该角蛋白可溶于反应介质。所得级分是角质骨骼(a)和还原角蛋白(b)。如果采用氧化处理，则所得角蛋白被称作"角质骨骼"。如果使用还原处理，则所得角蛋白被称作"还原角蛋白"(见M^！)。角蛋白的粗提取物，无论氧化还原状态如何，都可以例如用等电沉淀法进一步精制成"Y"级分和"a"级分。高分子量角蛋白或"a角蛋白"(a螺旋)被认为衍生自毛囊的微原纤维区域，且分子量范围典型地为约40-85kD。低分子量角蛋白或"Y角蛋白"(球状)被认为衍生自毛囊的细胞外基质区域，且分子量范围典型地为约10-15kD(见CrewtherWG等人Thechemistryofkeratins,AdvancesinProteinChemistry1965;20:191-346)。尽管a和Y角蛋白具有独特的性能，但a禾PY角蛋白亚科(subfamily)的性能都只能通过更精细的提纯手段揭示。例如，角蛋白可以分级成"酸性"和"碱性"蛋白质级分。优选分级方法是离子交换色谱法。这些级分具有独特性能，例如它们对血细胞聚集的不同影响(见下表1;也见美国专利申请公开No.2006/0051732)。本文所用的"角蛋白衍生物"是指单独或与其它角蛋白衍生物或其它组分组合的任何角蛋白级分、衍生物或其混合物，包括但不限于a-角质骨骼、Y-角质骨骼、a-还原角蛋白、Y-还原角蛋白、meta角蛋白、角蛋白中间丝、及其组合，包括其酸性成分和碱性成分，除非另有说明；以及本领域技术人员根据本公开显而易见的它们的各种变体。在一些实施方案中，角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为角蛋白的特定级分或亚级分。所述衍生物可以包含、组成为或基本组成为至少80、90、95或99重量％(或更多)所述级分或亚级11分。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为酸性a角质骨骼。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为a角质骨骼，其中该a角质骨骼包含、组成为或基本组成为至少80、90、95或99重量％(或更多)的酸性a角质骨骼，且其中该a角质骨骼包含、组成为或基本组成为不多于20、10、5或1重量％(或更少)的碱性a角质骨骼。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为碱性a角质骨骼。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为a角质骨骼，其中该a角质骨骼包含、组成为或基本组成为至少80、90、95或99重量％(或更多)的碱性a角质骨骼，且其中该a角质骨骼包含、组成为或基本组成为不多于20、10、5或1重量％(或更少)的酸性a角质骨骼。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为酸性a还原角蛋白。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为a还原角蛋白，其中该a还原角蛋白包含、组成为或基本组成为至少80、90、95或99重量％(或更多)的酸性a还原角蛋白，且其中该a还原角蛋白包含、组成为或基本组成为不多于20、10、5或1重量％(或更少)的碱性a还原角蛋白。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为碱性a还原角蛋白。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为a还原角蛋白，其中该a还原角蛋白包含、组成为或基本组成为至少80、90、95或99重量％(或更多)的碱性a还原角蛋白，且其中该a还原角蛋白包含、组成为或基本组成为不多于20、10、5或1重量％(或更少)的酸性a还原角蛋白。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为未分级的a+Y-还原角蛋白。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为酸性a+Y-还原角蛋白。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为碱性a+Y-还原角蛋白。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为未分级的a+Y-角质骨骼。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为酸性a+Y-角质骨骼。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为碱性a+Y-角质骨骼。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为未分级的|3-角质骨骼(例如，衍生自角质层)。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为碱性e-角质骨骼。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为酸性e-角质骨骼。该碱性a角质骨骼优选通过例如用离子交换色谱法从包含酸性和碱性a角质骨骼的混合物中分离碱性a角质骨骼来制造，且任选地，该碱性a角质骨骼的平均分子量为10至100或200kD(千道尔顿)。该平均分子量更优选为30或40至90或100kD。任选但优选地，该方法进一步包含下列步骤使所述碱性a角质骨骼再溶解于变性和/或缓冲溶液，任选在螯合剂存在下进行以络合痕量金属，然后使该碱性a角质骨骼从该变性溶液中再沉淀。要认识到，该组合物优选含有不多于5、2、1、或0.1重量％(或更少)的酸性a角质骨骼。该酸性a角质骨骼优选通过上述技术的相反方向制造即例如用离子交换色谱法从酸性和碱性a角质骨骼的混合物中分离和保留酸性a角质骨骼，且任选地，该酸性a角质骨骼的平均分子量为10至100或200kD。该平均分子量更优选为30或40至90或100kD。任选但优选地，该方法进一步包含下列步骤使所述酸性a角质骨骼再溶解于变性溶液和/或缓冲溶液，任选在螯合剂存在下进行以络合痕量金属，然后使碱性a角质骨骼从该变性溶液中再沉淀。要认识到，该组合物优选含有不多于5、2、1或0.1重量％(或更少)的碱性a角质骨骼。其它角质骨骼的碱性级分和酸性级分可以以与上文对碱性和酸性a角质骨骼所述类似的方式制备。碱性a还原角蛋白优选通过例如用离子交换色谱法从酸性和碱性a还原角蛋白的混合物中分离碱性a还原角蛋白来制造，且任选地，该碱性a还原角蛋白的平均分子量为10至100或200kD。任选但优选地，该方法进一步包含下列步骤使所述碱性a还原角蛋白再溶解于变性溶液和/或缓冲溶液中，任选地在螯合剂存在下进行以络合痕量金属，然后使该碱性a还原角蛋白从该变性溶液中再沉淀。要认识到，该组合物优选含有不多于5、2、1、或0.1重量％(或更少)的酸性a还原角蛋白。酸性a还原角蛋白优选通过上述技术的相反方向制造即例如用离子交换色谱法从酸性和碱性a还原角蛋白的混合物中分离和保留酸性a还原角蛋白，且任选地，该酸性a还原角蛋白的平均分子量为10至100或200kD。该平均分子量更优选为30或40至90或100kD。任选但优选地，该方法进一步包含下列步骤使所述酸性a还原角蛋白再溶解于变性溶液和/或缓冲溶液中，任选在螯合剂存在下进行以络合痕量金属，然后使碱性a还原角蛋白从该变性溶液中再沉淀。要认识到，该组合物优选含有不多于5、2、1或0.1重量％(或更少)的碱性a还原角蛋白。其它还原角蛋白的碱性级分和酸性级分可以以与上文对碱性和酸性a还原角蛋白所述类似的方式制备。角蛋白材料衍生自任何合适的来源，包括但不限于羊毛和人毛发。在一个实施方案中，角蛋白衍生自获自理发店和美发厅的末端切割的人毛发。该材料用热水和温和洗涤剂洗涤、干燥、并用非极性有机溶剂(典型地为己烷或醚)提取以在使用前去除残油。角质骨骼.角质骨骼级分通过任何合适的技术获得。在一个实施方案中，它们使用Alexander和同事的方法获得(P.Alexander等人，Biochem.J.46，27-32(1950))。基本上，使毛发在室温下与浓度小于10%的过乙酸水溶液反应24小时。将该溶液过滤，通过添加无机酸至pH约4而使该a-角质骨骼级分沉淀。将该a-角质骨骼过滤分离、用另外的酸洗涤、随后用醇脱水、然后冷冻干燥。可如下达到提高的纯度使该角质骨骼再溶解于变性溶液，如7M脲、氢氧化铵水溶液或20mMTris碱缓冲溶液(例如1^211^@碱)中、再沉淀、再溶解、相对于去离子水渗析、和在pH4再沉淀。制造角质骨骼的优选方法是用过氧化氢、过乙酸、或过甲酸氧化。最优选的氧化剂是过乙酸。优选浓度为1_10重量/体积％(w/v^)，最优选为约2w/v^。本领域技术人员会认识到，可以略微改变该浓度以实现不同氧化程度，且反应时间、温度和液/固比随之改变。Crewther等人也已经讨论了过甲酸提供与过乙酸相比最低限度的肽键裂解的优点。然而，过乙酸提供成本和可得性的优点。优选氧化温度是0至10(TC。最优选的氧化温度是37°C。优选氧化时间是0.5至24小时。最优选的氧化时间是12小时。优选的液/固比是5至100:1。最优选比率是20:1。氧化后，该毛发用大量蒸馏水漂洗掉残留氧化剂。该角质骨骼可以使用变性剂水溶液从氧化的毛发中提取。蛋白质变性剂是本领域公知的，但优选溶液包括脲、过渡金属氢氧化物(例如氢氧化钠和钾)、氢氧化铵、和三(羟甲基)氨基甲烷(Tris碱)。优选溶液是浓度范围为0.01至謹的丁1^211^@碱(Tris碱的一种品牌)。最优选浓度是O.1M。本领域技术人员会认识到，可以略微改变该浓度以实现不同的提取程度，且反应时间、温度和液/固比随之改变。优选提取温度是0至IO(TC。最优选的提取温度是37t:。优选提取时间是0.5至24小时。最优选的提取时间是3小时。优选的液/固比是5至100:1。最优选比率是40:1。随后可用Tris碱稀溶液或去离子(DI)水萃取以实现额外收率。提取后，通过离心和/或过滤法去除溶液中的残留固体。粗提取物可以通过先将该溶液中和至pH7.0-7.4来分离。最优选的pH是7.4。通过相对于DI水渗析，去除残留变性剂。将渗余物浓縮、随后冻干或喷雾干燥，得到Y-和a_角质骨骼二者的干粉末混合物。或者，通过滴加酸直至该溶液的PH达到大致4.2，从而从提取物溶液中分离出a-角质骨骼。优选的酸包括硫酸、盐酸和乙酸。最优选的酸是浓盐酸。a-级分的沉淀始于pH6.0左右，并持续至约pH4.2。分级沉淀可用于分离具有不同等电性质的不同蛋白质范围。可通过离心或过滤法回收固体a-角质骨骼。该a角质骨骼可通过使该固体再溶解于变性溶液来进一步提纯。可以使用与提取所用的那些相同的变性溶液，但是，优选变性溶液是tris碱。可以添加乙二胺四乙酸(EDTA)以络合和去除毛发中存在的痕量金属。优选变性溶液是含20mMEDTA的20mMtris碱或含20mMEDTA的DI水。如果痕量金属的存在不危害预期用途，则可以省略EDTA。通过滴加盐酸至大致4.2的最终pH，从这种溶液中再沉淀a-角质骨骼。该固体的分离是通过离心或过滤进行的。这一过程可以重复数次以进一步提纯该a-角质骨骼。该Y角质骨骼级分在pH4留在溶液中，并通过添加到水可混溶有机溶剂(如醇)中、随后过滤、用另外的醇脱水和冻干来分离。可如下达到提高的纯度使该角质骨骼再溶解于变性溶液，如7M脲、氢氧化铵水溶液或20mMtris缓冲溶液，添加无机酸使pH降至4、去除所形成的任何固体、中和上清液、用醇使该蛋白质再沉淀、再溶解、相对于去离子水渗析和通过添加到醇中再沉淀。通过经由蒸馏先浓縮该角质骨骼溶液，可以最大限度降低这些步骤中醇的消耗量。a角质骨骼脱除后，典型的提取溶液中的Y角质骨骼浓度为大约1_2%。通过添加到水可混溶非溶剂中，可以分离出Y角质骨骼级分。为实施沉淀，可以通过蒸发过量水来浓縮该Y-角质骨骼溶液。这种溶液可以通过去除90%的水而浓縮至大约10-20%。这可以使用真空蒸馏或通过降膜蒸发法进行。浓縮后，将该Y-角质骨骼溶液滴加到过量冷的非溶剂中。适用的非溶剂包括乙醇、甲醇、丙酮等。最优选的非溶剂是乙醇。最优选的方法是将该Y角质骨骼溶液浓縮至大约10w/v^蛋白质，并将其滴加到8倍过量的冷乙醇中。沉淀的Y角质骨骼可通过离心或过滤法分离，并干燥。合适的干燥方法包括冷冻干燥(冻干)、风干、真空干燥或喷雾干燥。最优选的方法是冷冻干燥。还原角蛋白.还原角蛋白级分可以使用Bradbury与Ch即man(J.Bradbury等人，Aust.J.Biol.Sci.17,960-72(1964))和Goddard与Michaelis(D.Goddard等人，J.Biol.Chem.106,605-14(1934))的方法的组合获得。基本上，超声去除毛发纤维的角质层以避免过度水解和允许在第二步骤中有效还原皮层二硫化物键。将该毛发置于二氯乙酸溶液中并用超声波探头处理。这种方法的进一步优化指出，使用80%二氯乙酸、1:16固/液比、和180瓦超声波功率的条件是最佳的(H.Ando等人，Sen'iGakkaishi31(3)，T81-85(1975))。从溶液中过滤移除固体碎片、漂洗、风干、随后筛分，以将毛发纤维与脱除的角质细胞分离。在一些实施方案中，在该角质层的超声脱除后，通过剥蚀的(de皿ded)纤维与巯基乙醇的反应，获得a-和Y-还原角蛋白。具体而言，使用在酸性pH下的低水解法(E.Thompson等人，Aust.J.Biol.Sci.15，757-68(1962))。在典型反应中，用已通过添加少量在含有0.02M乙酸盐缓冲剂和0.OOIM表面活性剂的脱氧水中的氢氧化钾而调节至pH5的4M巯基乙醇将毛发提取24小时。过滤该溶液，通过添加无机酸至pH大约4，使a还原角蛋白级分沉淀。过滤分离该a还原角蛋白、用另外的酸洗涤、随后用醇脱水、然后真空干燥。如下达到提高的纯度使该还原角蛋白再溶解于变性溶液，如7M脲、氢氧化铵水溶液或20mMtris缓冲溶液，再沉淀、再溶解、相对于去离子水渗析和在pH4下再沉淀。该Y还原角蛋白级分在pH4下留在溶液中，并通过添加到水可混溶有机溶剂(如醇)中、随后过滤、用另外的醇脱水和真空干燥来分离。可如下达到提高的纯度使该还原角蛋白再溶解于变性溶液，如7M脲、氢氧化铵水溶液或20mMtris缓冲溶液，经由添加无机酸使pH降至4、去除所形成的任何固体、中和上清液、用醇使该蛋白质再沉淀、再溶解、相对于去离子水渗析和通过添加到醇中再沉淀。通过先蒸馏浓縮该角蛋白溶液，可以最大限度降低这些步骤中醇的消耗量。在另一方法中，通过使该毛发与巯基乙酸钠水溶液反应，获得该还原角蛋白级分。还原角蛋白的优选制造方法是用巯基乙酸或13-巯基乙醇还原毛发。最优选的还原剂是巯基乙酸(TGA)。优选浓度为1至10M，最优选为大约1.0M。本领域技术人员会认识到，可以略微改变该浓度以实现不同还原程度，且pH值、反应时间、温度和液/固比随之改变。优选pH值为9至11。最优选的pH值是10.2。通过添加碱，改变该还原溶液的pH值。优选的碱包括过渡金属氢氧化物、氢氧化钠和氢氧化铵。最优选的碱是氢氧化钠。通过向该还原剂溶液中滴加氢氧化钠饱和水溶液，进行pH调节。优选还原温度是0至IO(TC。最优选的还原温度是37°C。优选还原时间是0.5至24小时。最优选的还原时间是12小时。优选的液/固比是5至100:1。最优选比率是20:1。与上述氧化反应不同，还原在碱性pH下进行。事实上，角蛋白高度可溶于该还原介质并有望被提取出来。因此，将该还原溶液与随后的提取溶液合并并相应地加工。还原的角蛋白不像它们的氧化对等物那样亲水。因此，还原的毛发纤维不像氧化的毛发那样溶胀和裂开，从而导致相对较低的收率。影响该还原/提取过程的动力学的另一因素是还原角蛋白的相对溶解度。在水中的相对溶解度等级从最大可溶到最小可溶为^-角质骨骼>a-角质骨骼〉^-还原角蛋白>a-还原角蛋白。因此，还原的毛发纤维的提取收率没那么高。事实上，用另外的还原剂加变性剂溶液进行后继提取。后继提取用的优选溶液包括TGA加脲、TGA加tris碱、或TGA加氢氧化钠。在提取后，可以使用对角质骨骼所述的程序分离a-和Y-还原角蛋白的粗级分。然而，Y-和a-还原角蛋白的沉淀物在暴露于氧时重新形成其胱氨酸交联。因此，必须将沉淀物迅速再溶解以避免提纯阶段中的不可溶性，或在不存在氧的情况下沉淀。可以通过渗析从溶液中除去残留还原剂和变性剂。典型渗析条件是1至2%还原角蛋白溶液相对于DI水渗析24至72小时。本领域技术人员会认识到，除渗析外，还存在用于除去低分子量污染物的其它方法(例如微过滤、色谱法等)。只有还原角蛋白的初步增溶要求使用tris碱。一旦溶解，无需变性剂，该还原角蛋白在溶液中就是稳定的。因此，可以在不造成还原角蛋白沉淀的情况下除去该变性剂，只要pH值仍在中性或以上。可以通过添加/去除水来调节这些纯化溶液中还原角蛋白的最终浓度。无论该角蛋白的形式(即角质骨骼或还原角蛋白)如何，都可以对角蛋白溶液采用几种不同的进一步提纯方案。然而，必须小心选择求助于角蛋白独特溶解度特征的技术。最简单的分离技术之一是等电沉淀。在这种方法中，可以通过调节该溶液的PH值和移除沉淀材料来分离不同等电点的蛋白质。在角蛋白的情况下，Y-和a_两种形式在pH>6.0时都可溶。然而，随着PH降到低于6，a-角蛋白开始沉淀。通过在给定pH值下停止沉淀和用离心和/或过滤法分离沉淀物，可以分离出角蛋白级分。在大约4.2的pH值下，基本所有a-角蛋白都已沉淀。这些分离的级分可以被再溶解于中性pH的水中、渗析、浓縮和通过冻干或喷雾干燥法还原成粉末。但是，还原角蛋白级分必须在不存在氧的情况下或以稀溶液形式贮存，以避免交联。分离角蛋白的另一普通方法是色谱法。可以采用几种类型的色谱法给角蛋白溶液分级，包括尺寸排阻或凝胶过滤色谱法、亲和色谱法、等电点聚焦、凝胶电泳、离子交换色谱法、和免疫亲和色谱法。这些技术是本领域公知的，并能借助分子量、化学官能度、等电点、电荷或与特定抗体的相互作用等特征分离包括蛋白质在内的化合物，而且可以单独或以任何组合使用，以实现高度分离和所得纯度。优选的提纯方法是离子交换(IEx)色谱法。由于一般而言的蛋白质和具体而言的角蛋白的两亲性质，IEx色谱法特别适合蛋白质分离。根据该溶液的起始pH值以及准备要保留的所需级分，可以使用阳离子型或阴离子型IEx(分别为CIEx或AIEx)技术。例如，在pH6和以上，Y-和a-角蛋白都可溶并在它们的等电点以上。因此，它们是阴离子型的并可结合到阴离子交换树脂上。然而，已经发现，角蛋白的一个亚级分没有结合到弱阴离子交换树脂上，而是穿过填充此类树脂的柱。用于AIEx色谱法的优选溶液是以0至5重量/体积％的浓度在纯净水中的如上所述分离的纯化或分级角蛋白。优选浓度是0至4w/v%。最优选浓度是大约2w/v^。优选起初使所述溶液的离子强度保持相当低以促进结合到AIEx柱上。这通过使用最少量的酸来滴定该角蛋白的纯化水溶液至pH6至7来实现。最优选的PH值是6。这种溶液可以加载到八1￡又柱，如0￡八6-861131~086@树脂柱或。-86卩1131"086@树脂柱上。优选的柱树脂是DEAE-Sepharose⑧树脂。可以收集通过该柱的溶液并如上所述进一步处理以分离酸性角蛋白粉末级分。在一些实施方案中，通过使用AIEx柱制造角蛋白，来提高角蛋白基质的活性，从而促进细胞粘合。不想受任何特定理论约束，但相信，通过阴离子柱的级分(即酸性角蛋白)促进细胞粘合。另一种级分容易结合，并且可以使用业内已知的盐化技术从柱上洗掉。优选洗脱介质是氯化钠溶液。氯化钠的优选浓度是0.1至2M。最优选浓度是2M。该溶液的pH值优选为6至12。最优选的pH值是12。为了在洗脱过程中维持稳定的pH值，可以添加缓冲剂盐。优选的缓冲剂盐是丁1^21113@碱。本领域技术人员会认识到，可以略微改变盐浓度和PH值以实现不同性质的角蛋白级分的洗脱。也可以依次使用不同的盐浓度和PH值或者采用盐和/或pH梯度来产生不同级分。然而，无论采取的方案如何，都可以收集柱洗脱物并如上所述进一步处理以分离碱性角蛋白粉末级分。使用CIEx技术的互补性(complimentary)程序也是可行的。即，可以将角蛋白溶液添加到阳离子交换树脂例如Sp86卩1131>086@树脂(强阳离子型)或01861^1"036@树脂(弱阳离子型)中，并收集通过的碱性级分。所保留的酸性角蛋白级分可以如上所述用盐化分离。Meta角蛋白.使用基本相同的程序由a-和Y-还原角蛋白级分二者合成meta角蛋白。基本上，将还原角蛋白溶解在变性溶液，如7M脲、氢氧化铵水溶液或20mMTris缓冲溶液中。将纯氧鼓泡通过该溶液以引发半胱氨酸基团的氧化偶合反应。通过使用SDS-PAGE测得的分子量增加监测该反应的进展。将氧连续鼓泡通过该反应溶液直至达到2倍或3倍分子量。可以通过添加无机酸，将该变性溶液的pH值调节到中性，以避免蛋白质水解。角蛋白中间丝(intermediatefilament).使用Thomas及其同事的方法获得人毛发纤维的IF(H.Thomas等人，Int.J.Biol.Macromol.8，258-64(1986))。这基本上是化学蚀刻方法，其使用于将IF"胶合"到位的角蛋白基质反应掉，由此留下IF。在典型的提取过程中，角质层的溶胀和基质蛋白质的亚硫酸盐解是使用O.2MNa2S03、0.1丽320634/81脲和0.1MTris-HCl缓冲剂在pH9实现的。该提取在室温下进行24小时。在浓縮后，通过添加乙酸锌溶液至约6的pH值，使溶解的基质角蛋白和IF沉淀。然后，通过相对于0.05M四硼酸盐溶液渗析，使IF与基质角蛋白分离。如下获得提高的纯度用乙酸锌使渗析的溶液沉淀、使IF再溶解于柠檬酸钠、相对于蒸馏水渗析、然后使该样品冻干。角蛋白制剂的进一步讨论见美国专利申请公开2006/0051732(VanDyke)，该专利申请经此引用并入本文。组合物和制剂.可以根据已知技术，例如冷冻干燥(冻干)由如上所述的角蛋白衍生物形成干粉末。在一些实施方案中，本发明的组合物可以通过将这样的干粉末组合物形式与水溶液混合产生，从而产生包含其中溶解着所述角蛋白衍生物的电解质溶液的组合物。该混合步骤可以在任何合适的温度(通常室温)下进行，并且可以通过任何合适的技术例如搅拌、振荡、搅动等进行。该电解质溶液的盐和其它构成成分(例如，除该角蛋白衍生物和水外的所有成分)可以全部包含在该干粉末中、全部包含在该水性组合物内、或可以在该干粉末与该水性组合物之间分配。例如，在一些实施方案中，该电解质溶液的至少一部分成分包含在该干粉末中。可以根据本领域内早就确立的技术或本领域技术人员显而易见的其变体进行包含如上所述的角蛋白材料的基质的形成。在一些实施方案中，将角蛋白制剂干燥并在使用之前再水合。见授予Lustig等人的美国专利No.2，413，983、授予Schollkipf等人的美国专利No.2，236，921、和授予Anker的美国专利No.3，464，825。在优选实施方案中，通过用合适的溶剂，例如水或磷酸盐缓冲食盐水(PBS)将该冻干材料再水合，形成该基质或水凝胶。该凝胶可以例如用Co60源通过Y-辐射(800krad)灭菌。角蛋白基质的其它合适的形成方法包括但不限于美国专利No.6，270，793(VanDyke等人)，6，274，155(VanDyke等人)，6，316，598(VanDyke等人)，6，461，628(Blanchard等人)，6，544，548(Siller-Jackson等人)，和7，01，987(VanDyke)中列举的那些。在一些组合物实施方案中，角蛋白衍生物(特别是a-和/或Y-还原角蛋白以及0_和/或^-角质骨骼)的平均分子量为约10至70或85或lOOkD(千道尔顿)。其它角蛋白衍生物，特别是meta-角蛋白，可以有更高的平均分子量，例如高达200或300kD。一般而言，该角蛋白衍生物(这个术语包括多种衍生物的组合)可以以约O.1、0.5或1重量％直至3、4、5或10重量％的量包括在该组合物中。该组合物在混合时优选具有约1或1.5至4、8、10或20厘泊的粘度。任何浓度下的粘度都可以通过改变a/Y角质骨骼的比率来调制。该角蛋白衍生物组合物或配制剂可任选含有一种或多种活性成分，例如一种或多种生长因子、镇痛剂、抗菌剂、附加凝血剂等(例如，其量为包含该一种或多种角蛋白衍生物的组合物的O.0000001至1或5重量％)，以促进生长或愈合、缓解疼痛、抑制微生物(如细菌)的生长、促进或抑制血凝固、促进或抑制细胞或组织粘合等。合适的生长因子的实例包括但不限于神经生长因子、血管内皮生长因子、纤连蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白、酸性和碱性成纤维细胞生长因子、睾酮、神经节苷脂GM-1、过氧化氢酶、类胰岛素生长因子-I(IGF-I)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、神经元生长因子galectin-l及其组合。参见，例如，授予Hansson等人的美国专利No.6，506，727、和授予Horie等人的美国专利No.6，890，531。本文所用的"生长因子"包括促进组织的再生、生长和存活的分子。本发明的一些实施方案中使用的生长因子可以是角蛋白提取物中天然存在的那些，也可以呈添加到角蛋白提取物或所形成的角蛋白基质中的添加剂形式。生长因子的实例包括但不限于神经生长因子(NGF)及其它神经营养素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、促红细胞生长素(EP0)、促血小板生长素(TP0)、肌生成抑制素(myostatin)(GDF-8)、生长分化因子-9(GDF9)、基础成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、粒细胞群剌激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞群剌激因子(GM-CSF)。存在许多结构上和进化上相关的蛋白质构成生长因子的大家族，并存在许多生长因子家族，例如神经营养素(NGF，BDNF和NT3)。神经营养素是尤其促进神经组织的生长和存活的分子家族。神经营养素的实例包括但不限于神经生长因子(NGF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养素3(NT-3)和神经营养素4(NT-4)。参见授予Johnson,Jr等人的美国专利No.5，843，914;授予Persson等人的美国专利No.5，488，099;授予Barde等人的美国专利No.5，438，121;授予Collins等人的美国专利No.5，235，043;和授予Burton等人的美国专利No.6，005，081。例如，生长因子可以以有效促进各种组织的再生、生长和存活的量添加到该角蛋白基质组合物中。该生长因子以O.lng/mL至1000ng/mL的浓度提供。更优选地，生长因子以Ing/mL至100ng/mL的浓度，最优选10ng/mL至100ng/mL的浓度提供。参见授予Urso的美国专利6，063，757。18该组合物优选是无菌和非热原的。该组合物可以提供为预成形的并无菌包装在适当容器例如挠性聚合物袋或瓶或箔容器中，或者也可以提供为在一个容器中的无菌干粉末和在另一分开容器中的无菌水溶液(它们在紧邻使用前混合)的药盒。当提供为预成形的和包装在无菌容器中时，该组合物在粘度显著丧失(例如超过10或20%)和/或角蛋白衍生物显著沉淀(例如目测时可察觉的沉降)之前在室温下有至少4或6个月(最多2或3年或更久)的储存寿命。该药盒可以含有单一单位剂量的活性角蛋白衍生物。根据其预期用途，单一单位剂量可以为0.1或O.5或l，至100或200或300克的角蛋白衍生物或更多。可以以与所公开的角蛋白制剂类似的方式使用的天然聚合物的其它实例包括但不限于胶原、明胶、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白、粘蛋白、弹性蛋白、巢蛋白(触角蛋白，entactin)、蛋白多糖等(参见例如授予Katsuen等人的美国专利No.5，691，203)。含角蛋白生物材料的控制出血的凝血组合物和方法.本发明的一个方面是治疗受出血伤口困扰的对象的出血的方法，包括将角蛋白衍生物以有效治疗出血的量施用到出血伤口上。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为如上所述的还原角蛋白、a还原角蛋白、Y还原角蛋白、酸性a还原角蛋白、碱性a还原角蛋白或其组合。出血可能与例如造成迅速大量出血的严重创伤联系在一起，包括但不限于外科手术；穿透性损伤，如剌伤和枪伤；机动车创伤；以及头、颈、胸和腹出血；存在或不存在到达出血点的清晰路径。许多不同的组合物可以包含止血剂，包括但不限于，角蛋白衍生物。止血剂的其它实例包括但不限于，包含纤维蛋白或纤维蛋白原、凝血酶、因子XIII、钙、脱乙酰壳多糖(脱乙酰化的聚-N-乙酰基葡糖胺)、沸石(硅、铝、钠、镁和石英的氧化物)、甲壳质(乙酰化的聚-N-乙酰基葡糖胺)、牛凝血因子、非沸石类矿物(例如疏水聚合物和钾盐)和来自植物来源的分子筛材料(例如，TraumaDEXTM、AristaTMAH等、Medafor，Inc、Minne即olis，MN)的那些。但是，应该指出，并非所有这些止血剂都推荐用于所有类型的出血治疗，且本领域技术人员应该相应地选择在所公开的组合物和方法中使用的止血剂。例如，沸石仅适合外用。在本发明的一些实施方案中，使用含角蛋白衍生物的凝胶。这些实施方案的凝胶附着到组织上并且是亲水的。在一些实施方案中，在沉积到伤口的出血表面上时，该凝胶足够粘以致即使存在活动性出血也不会被洗掉。在一些实施方案中，该凝胶从血液中吸收流体并变得更粘(例如在施用的几分钟内)。一些实施方案的凝胶与血液的接触能够通过可能地血小板活化和/或凝血因子的浓縮而激发血栓形成。此外，不希望受制于任何特定理论，但一些实施方案的粘性凝胶被认为可以形成伤口位置的物理密封并为细胞浸润和颗粒状组织形成提供多孔支架，就像凝固血那样。在一些实施方案中，该角蛋白组合物直接施用到出血点上。在一些实施方案中，将该角蛋白组合物注射到对象体内以治疗内出血点，例如在没有到达出血点的清晰路径的情况下。含角蛋白生物材料的伤口愈合组合物和促进伤口愈合的方法.本发明的一个方面是治疗有需要的对象的伤口(例如，烧伤、擦伤、裂伤、切伤、褥疮、剌伤、贯穿伤、枪伤、挤压伤等)的方法，包括将角蛋白衍生物以有效治疗该伤口的量施用到该伤口上。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物包含、组成为或基本组成为如上所述的角质骨骼、a角质骨骼、Y角质骨骼、酸性a角质骨骼、酸性Y角质骨骼、碱性a角质骨骼、碱性Y角质骨骼、还原角蛋白、a还原角蛋白、Y还原角蛋白、酸性a还原角蛋白、酸性Y还原角蛋白、碱性a还原角蛋白、碱性Y还原角蛋白等，或其组合。该角蛋白衍生物能够以干粉末配制剂形式局部施用，或在一些实施方案中，在水性载体中施用(例如以凝胶形式)。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物在油膏(ointment)(油包水制剂，其中在该乳状液中油的量超过水的量)或霜(cream)(水包油制剂，其中在该乳状液中水的量等于或超过油的量)中提供。在一些实施方案中，该角蛋白衍生物皮下注射以到达体内损伤点。要用本文中所述方法和组合物治疗的"对象"(或"患者")既包括人类对象，也包括兽医用途的动物对象(特别是其它哺乳动物对象，如狗、猫、马、猴等)。特别优选人类对象。该对象可以是雄性或雌性的，并且可以是任何年龄，包括新生儿、婴儿、少年、青年、成人和老年人对象。可用本发明治疗的伤口的实例包括烧伤。烧伤是由热、化学品、日光、电、辐射等引起的组织损伤。由热引起的烧伤，或热烧伤是最常见的。化学烧伤类似热烧伤。尽管烧伤往往最常发生在皮肤上，但也可能影响其它身体结构。例如，严重烧伤可能穿透到脂肪、肌肉或骨头。伤口通常由损伤深度表征。例如，烧伤程度根据受损组织的深度被归类为一度、二度或三度。在一度烧伤中，只有皮肤顶层(表皮)受损。在二度烧伤中，皮肤中层(真皮)受损。最后，在最严重类型的三度烧伤中，损伤深到足以影响皮肤内层(脂肪层)。类似地，皮肤的褥疮被归类为I期(皮肤发红、未破损，红斑不随压力释放而减退)、II期(表皮破坏，通常侵入真皮)、III期(真皮损伤)、IV期(暴露出皮下组织)。在褥疮伤中，压力诱发的局部毛细管收縮造成在受影响的皮肤中出现局部缺血。类似地，由于相关联的毛细血栓形成，烧伤局部缺血。糖尿病性溃疡是灌注不良伤口的另一实例。对这些类型的伤口(其中血液不易供给以辅助正常伤口愈合过程)而言，在一些实施方案中，含有角蛋白衍生物的组合物不仅可用于提供伤口位置的物理密封，还可用于为细胞浸润和颗粒状组织形成提供多孔支架，就像凝固血那样。伤口可能是进展性损伤，即组织破损面积在初始损伤后发展。例如，烧伤通常是以三个区域为特征的进展性损伤坏死区、损伤区和充血区。坏死区是直接受到外伤(例如热或化学损伤)的区域，并含有不可逆受损的组织。损伤区在坏死区外围和下方，且组织一开始可存活但脆弱。在典型烧伤中，随着损伤区中的组织被破坏，坏死区的面积增加。术语"伤口转化"描述了损伤区发展成坏死区以致提高伤口总面积的过程。参见，例如，授予Daynes等人的美国专利No.5，583，126。充血区在损伤区外围和下方。其具有极小细胞损伤，但血管舒张。不希望受制于任何特定理论，但本文公开的角蛋白衍生物被认为既抑制由伤口转化引起的伤口扩展(例如通过随时间经过的伤口面积测得，这通过观察接受和/或未接受治疗的组织损伤的严重性等来测定)，又促进和/或加速伤口愈合(例如，测得的伤口面积在治疗下随时间经过以更快速率减小，在治疗时，观察到伤口以更快速率愈合，等等)。表面和浅度(partial-thickness)伤口的正常愈合过程是通过在伤口表面处由存在的基细胞再生上皮进行的，伴随或不伴随着温和收縮。深伤口通过上皮再生和收縮的组合愈合。收縮用于减小伤口面积，且上皮从创缘再生。在一些实施方案中，该角蛋白生物材料可用于通过增强成纤维细胞(例如，真皮成纤维细胞)和/或角质形成细胞(例如，表皮角质形成细胞)的增殖来促进伤口愈合。参见例如授予Baetge等人的美国专利No.6，673，603和授予Herstein等人的美国专利No.5，840，309。不希望受制于任何特定理论，但该角蛋白制剂内天然存在的生长因子被认为促进成纤维细胞和/或角质形成细胞增殖的增强。在一些类型的伤口中，治疗包括控制出血。例如，擦伤、裂伤、切伤、贯穿伤和挤压伤等通常涉及出血。例如，挤压伤可能涉及开放伤(即，其中皮肤撕裂且组织暴露在环境中)，或闭合伤(即，其中皮肤完整但下方组织受损)。擦伤是表面伤，其中皮肤表皮被擦掉。擦伤可由例如在粗糙表面伤摔倒引起。挫裂伤是通常由例如对位于硬组织(例如骨头)上的软组织(例如皮肤)的钝冲击引起的不规则伤口，或涉及软组织的撕裂(例如与分娩相关联的挫裂伤)。挫裂伤通常表现出桥接，其中结缔组织和/或血管平贴在下方硬组织表面上。有时，由锐物引起的损伤也被称作挫裂伤。在由锐物引起的损伤的情况下，通常没有桥接，因为结缔组织和血管被切断。切口或切伤通常由整齐的锋利物造成。表面切口(仅涉及表皮)通常被称作"割伤(cuts)"。切口可能由刀、剃刀、玻璃碎片等造成，或者可能在外科手术或其它医疗程序过程中由手术刀造成。贯穿伤由插入身体的物体(例如刀)造成。剌伤由穿透皮肤的物体，如针或钉子造成。枪伤由进入、划过和有时离开身体的子弹造成。伤口具有感染危险。在一些实施方案中，该伤口愈合组合物包括抗菌剂。可局部施用的抗菌剂的实例包括但不限于，杆菌肽(例如，400-500U/g油膏)、多粘菌素B硫酸盐(例如，5，ooo或io，ooou/g油膏)、新霉素(例如，3.5mg/g油膏)、Polysporin⑧抗生素(多粘菌素B硫酸盐和杆菌肽在油膏基料中的掺合物)、Neosporin⑧抗生素(新霉素、杆菌肽和多粘菌素B硫酸盐在油膏基料中的掺合物)、聚维酮碘、磺胺嘧啶银(例如，l%霜)、醋酸磺胺米隆(甲基化局部磺胺化合物，例如作为0.5%霜)、制霉菌素(一种杀真菌剂)、呋喃西林(例如，O.2%)和庆大霉素(例如，O.1%霜)。抗菌溶液包括但不限于，乙酸(例如，O.5%或0.25%)、次氯酸钠(Dakin's溶液，例如0.5%或0.25%Na0Cl)、硝酸银(例如，0.5%)和葡萄糖酸氯己定(例如，0.5%)。在一些实施方案中，该伤口愈合组合物包括附加的伤口愈合组分。一些抗菌剂被认为还通过除它们作为杀菌剂或杀真菌剂等的作用外的机制促进伤口愈合。例如，有迹象表明，磺胺嘧啶银——美国最常用的局部烧伤护理剂，具有这种双重作用(WardRS和SaffleJR，PhysicalTher即y1995;75(6)526-38)。在一些实施方案中，该伤口愈合组合物包括用于缓解疼痛的镇痛剂或麻醉剂、表面活性剂、抗炎剂等。参见，例如，授予Miller的美国专利No.6，562，326。本文公开的角蛋白组合物可用于控制出血和促进伤口愈合。该组合物可用于开放伤和闭合伤。在闭合伤的情况下，可以通过例如用注射器注射或由加压罐将该角蛋白施加到伤口位置。在钝伤的情况下，可以例如将该角蛋白组合物透过皮肤注射到腹内的内出血点。但是，本领域技术人员会认识到，组织肿胀必须计入考虑以避免过度膨胀和可能的组织和/或器官损伤。也可以使用减轻肿胀，如冷敷(例如，冷水、冰等)和受影响的区域的隆肿的方法。施用到伤口上的角蛋白材料的剂量取决于受害的特定伤口以及对象的年龄和总体状况、给药途径等，并且可以根据已知技术优化。在一些实施方案中，根据其预期用途，该剂量为0.1或0.5或1，至100或200或300克角蛋白衍生物，或更多(例如，在粉末或水性载体中)。在一些实施方案中，该角蛋白以0.001至10毫克/毫升或0.01至5毫克/毫升的浓度提供。在一些实施方案中，该角蛋白以0.1%至80%(w/v)或l^至50X(w/v)，或5%至30%(w/v)的浓度提供。在一些实施方案中，通过施用凝胶、霜或油膏形式的角蛋白制剂，治疗该伤口。也可以用〃湿对湿(wet-to-moist)〃敷料处理伤口，其中该角蛋白(和任选其它添加剂)通常以其粉末形式添加到水性载体(例如蒸馏水或盐水)中，并使敷料(例如纱布)由该水性制剂浸透并置于伤口上。该水性制剂应该在必要时再次施用以防止敷料干燥。或者，该角蛋白制剂可以如授予Blanchard等人的美国专利No.6，274，163中所述成型成片状伤口敷料。在进一步实施方案中，该角蛋白制剂被配制成以喷雾(例如可用气溶胶泵喷在伤口上的溶液，如水性制剂)形式使用。在一些实施方案中，通过例如一天数次或按需要地再次施用所公开的组合物，从而治疗该伤口。在治疗过程中也可以清洁除去细菌和使用清创术除去坏死碎片。可以施用保湿霜或油膏以软化伤口焦痂，从而有助清创。外科手术或紧急护理辅助器.本发明的另一方面是外科手术或紧急护理辅助器，其包括固态的生理学可接受基底和在所述基底上的角蛋白衍生物。"基底"包括海绵、包扎材料、伤口敷料(如纱布或绷带)、缝合线、织物和修复器具。包含角蛋白衍生物的药盒.本发明的另一方面是包含、组成为或基本组成为在容器中的角蛋白衍生物的药盒。该角蛋白衍生物优选以无菌形式包装在容器中。该药盒可包括生理学可接受的基底，如海绵、包扎材料、伤口敷料(如纱布或绷带)、缝合线、织物和修复器具。在下列非限制性实施例中进一步描述本发明的实施方案。实施例l:角g白衍牛物/级分使用以Alexander及其同事的方法为基础的方法获得角质骨骼级分。但是，该方法经过实质性改进以最大限度降低肽键水解。简言之，使50克从当地理发店收集的清洁干燥头发与1000毫升2w/v^过乙酸(PAA)水溶液在室温下反应12小时。氧化的头发用500微米筛回收，用大量DI水漂洗、并除去过量水。用1000毫升100慮丁1^21113@碱从该氧化头发纤维中提取角质骨骼。3小时后，用筛分离该头发，并通过滴加盐酸(HC1)中和该液体。通过分别使用1000mL0.lMTrizma碱和1Q00mLDI水的2次后继提取，从剩余头发中提取额外的角质骨骼。每次都是用筛分离该头发、并用HC1中和液体。将所有3次提取物合并、离心、过滤除去任何残留固体材料。通过用lkDa标称低分子量截止膜相对于DI水切向流渗析，将该合并的提取物提纯。将该溶液浓縮并冻干，以产生粗角质骨骼粉末。使用Goddard和Michaelis所述方法(JBiolCheml934;106:605-14)的改进方法获得还原角蛋白级分。简言之，使头发与1MTGA水溶液在37t:下反应24小时。通过滴加饱和Na0H溶液，将该TGA溶液的pH值调节至pH10.2。将提取物溶液过滤以除去还原的发纤维并予以保留。通过如下依序提取法，从该纤维中提取额外的角蛋白用1000毫升lOOmMTGA在pH10.2下提取24小时，用1000毫升10mMTGA在pH10.2下提取24小时，和用DI水在pH10.2下提取24小时。每次提取之后，都将该溶液离心、过滤和添加到渗析系统中。最后，合并所有提取物、用lKDa标称低分子量截止膜相对于DI水渗析。将该溶液浓縮、滴定至pH7、以大约5%总蛋白质浓度储存在41:下。或者，该浓溶液可以冻干并在冷冻和氮气下储存。紧邻分级前，将角质骨骼样品再溶解于超纯水并通过添加稀HCl溶液滴定至pH6。也通过小心添加稀HCl溶液，将还原角蛋白样品滴定至pH6。将样品在温和压力下加载到含有DEAE-Sepharose⑧(弱阴离子型)或Q-Sepharose⑧(强阴离子型)离子交换树脂(50-100目；Sigma-Aldrich，Milwaukee，WI)的200毫升快速色谱柱中，并收集流出的级分(酸性角蛋白)。使用小体积10慮丁1^11^@碱(约200毫升)在pH6下彻底洗涤该样品。用100mMTris碱加2MNaCl在pH12下从该柱中洗脱碱性角蛋白。各样品分别中和，并用lKDa的L丽C0的切向流渗析法相对于DI水渗析、通过旋转蒸发法浓縮、并冷冻干燥。如上所述，制造a-角质骨骼样品、在DEAE-S印harose⑧iEx柱上分离成酸性级分和碱性级分、溶解于PBS、将pH值调节至7.4。这些溶液以5重量％浓度制备，并用新鲜全人血通过以l:1比率混合来粗略评估它们红细胞(RBC)凝聚特征。20分钟后取样，通过光学显微镜法评估。离子交换色谱法在分离该凝聚现象方面高度有效(数据未显示)。碱性a-角质骨骼基本不与血细胞相互作用，而酸性a-角质骨骼则引起过度凝聚。酸性和碱性a-角质骨骼、未分级的a+Y-还原角蛋白、未分级的a+y-角质骨骼和P-角质骨骼(衍生自角质层)在磷酸盐缓冲食盐水(PBS)中以大约4w/v^和pH7.4制备。测试样品的粘度和RBC凝聚。这些结果显示在^I中表1.角蛋白溶液的粘度和RBC凝聚试验结果。流体配制剂在<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*凝聚程度1=无，5=高輔你l2:云M勿禾草种,朐扁纖口M进行几个体外和体内研究以验证角蛋白生物材料的生物活性。它们包括使用通过使用氧化和还原反应破坏皮层的三级结构而由人毛发制成的角蛋白和根据下列方法提取可溶蛋白质。衍生自人毛发的角蛋白生物材料介导皮肤组成细胞的生长行为。在细胞培养实验中，某些类型的角蛋白促使成纤维细胞和角质形成细胞有丝分裂。角蛋白基水凝胶据显示能够分别钝化小鼠和猪模型中的化学和热烧伤。角质骨骼:将干净、干燥的毛发切成小纤维并用过乙酸氧化。用变性溶液提取游离蛋白质，中和，通过渗析法提纯，浓縮和通过冻干分离。通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)再水合，形成水凝胶。还原角蛋白:将干净、干燥的头发切成小纤维并用巯基乙酸还原。用变性溶液提取游离蛋白质，渗析、中和并浓縮。浓縮后，在暴露在空气中时形成粘性水凝胶。细胞增殖:将角质骨骼粉末(未分级的角质骨骼、a+Y)以几种浓度溶解在含和不含血清的培养基中，并用于培养人真皮成纤维细胞和角质形成细胞。在暴露在含角蛋白的溶液中之前，该细胞已经在含血清的培养基中生长至大约50%汇合度(confluency)，并血清饥饿24小时。在用含角蛋白的培养基培养24小时后，使用线粒体代谢检测法(MTT检测法)评测细胞增殖。使用角质形成细胞和成纤维细胞的细胞增殖检测法显示了角质骨骼处理组的统计显著提高(图1)。伤口愈合:将免疫活性小鼠脱毛并使用苯酚在肩部之间诱发化学烧伤。在20分钟后用角蛋白水凝胶和封闭绷带处理伤口。所用角蛋白是未分级的(a+Y)角质骨骼。每三天换一次敷料，持续最多10天。获取伤口的数码相片，并在不同时间点处死动物以进行伤口区域的组织学检查。小鼠伤口愈合研究证实化学烧伤的有效钝化。图2显示了仅用封闭敷料处理的伤口的正常伤口发展过程，伤口面积初始时增加。这归因于外周组织的血管支持的破坏，此后在创缘处坏死。结果是伤口面积的特有增长。但是，在角蛋白处理的组中，趋势是伤口面积在损伤开始时稳定化。这被认为归因于限制病态的保护性机制和/或血管生成的迅速诱发，这抵消血管支持的最初损失。在随后的大型动物研究中，将猪清洗和刮毛，并用加热的黄铜块沿背脊中线制造一系列深度烧伤。每三天处理伤口，持续最多27天。所用角蛋白是未分级的(a+Y)角质骨骼和未分级的(a+Y)还原角蛋白。获取伤口的数码相片，并在不同时间点处死动物以进行伤口区域的组织学检查。在这种大型动物研究中，证实了来自上文详述的小鼠研究的前述发现，角蛋白治疗与对照组相比抑制伤口扩展和加速愈合(图3)。实施例3:动物模型中出血的控制在适度激发的动物模型中评测角蛋白凝胶的止血潜力。该角蛋白凝胶包含未分级的还原角蛋白(a+Y)。由于肝的尺寸和伤口都增大，肝损伤众所周知地成问题。这种兔模型会产生大量并且致命的出血。使用受控的肝切除作为手段来建立一组一致的条件，它们在不存在治疗的情况下(阴性对照)造成失血过多而死，但在施加传统止血剂时(阳性对照)提供受试动物的复原。应该指出，在此研究中充当阳性对照的止血剂是用于局部伤口的，并要求伴随着压力；它们在此研究中在不加压的情况下施加。这样做是为了避免混淆性的起作用的压力增加，因为其不与角蛋白凝胶一起使用。在此研究中使用总共16只新西兰兔(平均3.7公斤)。该动物受到标准化的肝损伤，包括切除大约1/3的左中叶，然后随机分到四组之一中。四个动物充当阴性对照并且不受任何治疗，四个动物接受QuikClot⑧止血剂治疗，四个动物用HemCon⑧止血绷带处理，且四个动物用角蛋白凝胶治疗。没有给予液体复苏，且所有动物在手术过程中严密监测。在l小时后，闭合手术伤口并将动物转移到圈养设施中。所有存活的动物在72小时后24杀死。在杀死时，取出肝组织用于组织学分析。手术禾口术后治疗.所有程序都根据WakeForestUniversity'sAnimalCareandUseCommitteeguidelines进行，其包括管理和鉴定机构指南。动物在紧邻手术前称重。所有动物都通过肌肉注射用氯胺酮10毫克/千克和甲苯噻嗪4毫克/千克的组合镇静，插管并在该程序的其余时间供以2-3%异氟烷。然后将动物置于背卧位，刮毛并连接到监测装置上。所有动物都连接ECG引线、在尾巴上连接脉搏氧饱和度仪箍带、和用于监测温度的食道内探针。在无菌皮肤准备和铺单(pr印pinganddraping)后，进行剖腹术，并暴露出肝。在肝损伤之前，暴露出动物的腹织脉并使用连接到压力传感器(Lab-stat，ADInstrumentsPty.Ltd.CastleHill，Australia)上的23号规格(gauge)针插管，该压力传感器又连接到用于采集数据的PowerLab寧(ADInstruments)系统上。在整个程序过程中连续记录平均动脉压(MAP)。监测所有动物数分钟并确保在肝损伤前处于稳定态。由于其充足的尺寸和易达性，使肝的中叶损伤。模型开发过程中的初步数据表明，可以制造一致的肝损伤横截面积，其在保持未治疗时造成死亡，但在用对照材料治疗时可拯救动物。使用2.0平方厘米表面积的环以用于通过将左中叶拉过该环并用手术刀紧挨该环切割来产生尺寸一致的损伤。在整个程序中在30秒、5、15、30、45和60分钟记录MAP、温度、心率、(^饱和和流血。在各时间点使用置于肝损伤下方的预称重的无菌外科纱布测量流血。此外，通过耳静脉提取血样以用于CBC。将所有动物随机分成之前提到的四个实验组。阴性对照组不接受任何治疗并以遭受损伤后的分钟数记录死亡时间。至于其它实验组，在5分钟时间点施以治疗，除非MAP降至开始值的一半。为了标准化，测量或称重所施加的止血材料。该角蛋白凝胶不要求加压，因此在其它处理组中都不使用加压以便不会混淆结果。在HemCon⑧止血绷带处理组中，在缝合之前移除在整个程序中置于肝出血表面上的4.5X2.5厘米的绷带片。在QuikClot⑧止血剂处理组中，使用每动物2.5克高压釜消毒材料。将该材料铺在出血表面上并在缝合后留在存活动物体内。在角蛋白处理组的情况下，每动物使用2毫升凝胶。通过1毫升注射器将无菌角蛋白凝胶施加到出血表面上。该角蛋白也在动物缝合后留在原处。基于伤口位置的完全覆盖，在初始模型开发过程中测定这些参数。对存活动物而言，监测持续60分钟，此后动物被视为已从初始创伤中存活下来且出血停止。用HemCon⑧止血绷带处理的动物必须除去该材料，因为按照制造商的指示，其不能留在腹内。除去主动脉插管并在插入位置确定止血。在验尸中在任何动物中都没有观察到主动脉出血。以两层缝合腹部筋膜和皮肤。在腹部完全缝合后，使动物复苏并转移到圈养设施中，在此每15分钟监测它们直至从麻醉中完全复苏，然后在接下来的三天内每天监测三次。每天从所有存活动物中提取血样用于CBC分析。在72小时时间点处死后，获取各动物的肝进行组织学评测。所有列出的数据以平均值和相应的标准偏差标识。对统计分析而言，使用SPSSv.11(SPSSInc，Chicago,IL)。使用修改的z-分数(绝对偏差中值)，异常值被定义为具有比+3.0大或比-3.0小的z-分数。通过方差单向分析法(AN0VA)，分析所有时间点的数据。如果发现显著的F值，则通过Fischer's最小显著差试验(LSD)进一步分析这些组。p<0.05的a被视为显著。通过限制比较，使I型误差的概率最小化；只进行一个阴性对照组vs3个处理组。为了补偿死亡动物的过早退出(即在60分钟手术期结束前失血过多而死的动物)引起的偏差，使用多项式回归至已知病理学终点以评估前60分钟期间的值。对失血百分比图解数据(图5)(其中一些组达到统计相关性)而言，数值以平均值以及它们的相应标准误差表示。阴性对照动物(即无处理)如预期那样在60分钟手术期内失血过多而死(31±19分钟)。QuikClot⑧止血剂组中的两个动物和HemCon⑧止血绷带组中的一个动物没有活过最初60分钟手术期。同样在HemCon⑧止血绷带组中，在兽医人员的建议下，一个动物在术后24小时被安乐死。该动物不能走动且不能进食或饮水。角蛋白组中的一个动物也在48小时时被杀死。尽管该动物在其笼中自由走动，但其不进食或饮水。在验尸时，这些动物都没有表现出在手术期后额外出血的迹象。所有的其它存活动物平安无事地复苏，在24小时内在其笼中自由走动，并到72小时时具有正常CBC(未显示数据)。存活数据的概述显示在图4中。平均动脉压.使用插入腹织脉下部的23号规格(gauge)针记录平均动脉压(MAP)。将该针连接到PE50管上，该管又连接到压力传感器(Lab-stat)上，该压力传感器连接到用于记录压力的PowerLab系统上。在整个程序过程中或直至动物死亡，连续监测MAP。为了进一步评测MAP和心率的变化显著性，使用休克指数。休克指数是用于快速评估创伤患者的完善的临床评分系统。通过将心率除以MAP(mmHg)，计算这种修正的休克指数。记录腹织脉中的平均动脉压60分钟。角蛋白组和HemCon⑧止血绷带组中的动物能够在5分钟后实现开始值的75%的稳定MAP。QuikCl0t⑧止血剂和对照组不能稳定MAP并在60分钟后降至开始值的45X(图6)。但是，这些数据没有达到组之间的统计显著性。休克指数(SI):失血严重性的预测性计分分级系统，表明角蛋白组的有益结果，其在前60分钟内为低值(图7)。QuikClot⑧止血剂的高值与在前20分钟2个过早死亡的观察结果相符，证实了这种衡量标准的预测性。尽管指出了趋势，但这些数据在本研究中没有达到统计显著性。温度、ECG和心率.用连接到手术室监测器上的食道探针记录中心温度。在整个程序中连续监测动物体温并在之前提到的时间点记录。使用连接到手术室检测器上的三引线系统监测ECG和心率并持续整个程序期间。使用平直线或带有电机械分离的不规则电活性确定死亡时间。该研究中所用的肝损伤模型代表具有显著迅速失血的严重创伤。肝切除制造致命性损伤，通常涉及1或2根直径大约1毫米的大血管和几根0.5至1.0毫米直径范围内的血管。损伤严重性使得未治疗的兔子在60分钟手术期内都失血过多而死。这些动物无一能以心率提高来补偿血量损失。所有动物都表现出在30分钟后从263bpm降至188bpm和在l小时后降至154bpm的相当的下降。组之间没有统计显著性差异。但是，角蛋白组在从30分钟到60分钟的手术第二半程中表现出在心率提高下的补偿和恢复的趋势。所有动物的体温都以类似方式降低，在前5分钟骤降0.『C并经60分钟降低总共2.7°C。在实验组之间没有统计上显著的差异。流血.通过减去预称重纱布重量后的重量测量流血。在各时间点记录重量并将新纱布置于肝损伤下方。流血表示为各动物的原始体重的百分比。在HEMAVet⑧多物种组织学系统(型号950FS，DrewScientific，Dallas,TX)上由取自耳静脉的样品测定CBC。通过将置于受损肝叶下方的手术纱布称重，测量失血。将失血表示为原始体重的百分比。如未受控出血研究中预期的那样，所有动物都表现出大出血的初始阶段，然后是随着map降低，具有较低出血速率的线性阶段(图5)。角蛋白和QuikClot⑧止血剂组与阴性对照组的比较表现出在30、45和60分钟时间点的显著降低的失血量(角蛋白vs.阴性对照组的p值为o.oi8、o.oil和o.007;QuikClot⑧止血剂vs.阴性对照组的p值分别为0.009、0.005和0.004)。如预期的那样，动物存活率看起来依赖于损伤点的血管解剖学，即使控制总横切表面积，这也随动物而变。当在损伤区域中遇到单个极大出血血管(>1毫米)或多个大出血血管(在lm尺寸范围内〉2至3个)时，动物的存活机会在QuikCl0t⑧止血剂组和HemCon⑧止血绷带组中可忽略不计。特别是在QuikClot⑧止血剂组中，单个极大出血血管或超过2至3个大出血血管可确保致死。但是，应该指出，当根据制造商的指示伴随压力使用时，其它研究已经表明使用QuikClot⑧止血剂和HemCon⑧止血绷带时的更好存活率。在用角蛋白凝胶处理的所有情况(其也不在任何加压下使用)下，动物存活至少24小时，无论切断的血管大小如何。尽管在所有试验组中使用少量动物(11=4)，但这些结果是振奋人心的。该角蛋白止血凝胶始终如一地在各测量结果，特别是流血量、MAP和(重要地)存活率方面表现良好。一个特别显著的结果是休克指数。在多数出血情况下，心输出量提高以补偿血压下降。一旦该机制启动，休克指数值迅速提高且存活率变得不确定。显著地，角蛋白处理组中的休克指数保持为所有受试材料的最低值，与早期有效止血一致。组织学.在安乐死1小时内从各动物上取下包括受损肝表面的组织样品。将各样品置于Tissue-Teko.c.T.化合物4583(Sakura)中并在液氮中冷冻。使用低温恒温器(型号CM1850，LeicaMicrosystems,Bannockburn,IL)容纳肝切片部分，将冻结块切成8微米切片，并置于显微镜载玻片上。将载玻片固定并用苏木精和曙红(H&E)染色。QuikClot⑧止血剂和HemCon⑧止血绷带切片都出现切片中的技术困难。脆的QuikClot⑧止血剂使平整切片困难，并在切片中产生空隙。HemCon⑧止血绷带在腹部缝合之前取出，因此凝固血仅部分可见。在各种放大率下获取数字图像(ZeissAxioImagerM1Microscope，CarlZeiss，Thornwood，NY)以观察止血剂与肝受损区域之间的相互作用。100X放大率表明该组织的总响应，而200X和400X放大率用于使细胞响应直观化。通过H&E染色切片的光学显微术，检查横断的肝表面。阴性对照组表现出没有组织响应或坏死的整洁切面(图8A)。此外，没有观察到功能性凝结，其中几乎没有血栓附着在该表面上。由于在血块中存在这种硬的颗粒状沸石，QuikClot⑧止血剂样品难以加工。组织学揭示了与血块混合的坏死组织(图8B)。透明区域代表在加工过程中移除的QuikClot⑧止血剂粒子。HemCon⑧止血绷带组显示出一些具有凝固血和相邻细胞浸润的区域(图8C)。由于HemCon⑧止血绷带在60分钟后移除，大部分肝表面只有血块薄层。角蛋白组显示出附着到受损肝表面上的生物材料厚层(图8D)。在角蛋白生物材料凝胶的孔隙中已经形成具有细胞浸润的颗粒状组织(图9)。该角蛋白止血凝胶附着到组织上并且是亲水的。在沉积到肝的出血表面上时，其足够粘以致即使存在大量出血也不会被洗掉。该凝胶在施用的几分钟内从血液中吸收流体27并变得甚至更粘。凝结和粘着几乎在接触时瞬时发生。有意义地，该角蛋白凝胶在伤口位置上形成厚的颗粒状组织密封72小时。在组织切片的检查中，可以看到受伤后3天的宿主细胞浸润该凝胶。据信，这些实验中所用的角蛋白凝胶起到两个作用。首先，该凝胶与全血的接触可能通过血小板活化或凝血因子的浓縮激发血栓形成。其次，该粘性凝胶形成伤口位置的物理密封并为细胞浸润和颗粒状组织形成提供多孔支架，就像凝固血那样。以上是本发明的说明，而不应被视为其限制。本发明由下列权利要求规定，而权利要求的等效物也将涵盖于内。权利要求角蛋白衍生物用于制备实施伤口治疗方法所用的组合物或药剂的用途，其中所述角蛋白衍生物包括角质骨骼、还原角蛋白、或其组合。2.权利要求1的用途，其中所述角蛋白衍生物基本由角质骨骼、还原角蛋白、或其组合构成。3.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述角蛋白衍生物基本由角质骨骼构成。4.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述角蛋白衍生物基本由还原角蛋白构成。5.权利要求l的用途，其中所述组合物或药剂进一步包含至少一种附加活性成分，其选自镇痛剂、抗菌剂和附加伤口愈合剂。6.权利要求5的用途，其中所述组合物或药剂基本由所述角蛋白衍生物和附加活性成分构成，其中所述附加活性成分是抗菌剂。7.权利要求5或权利要求6的用途，其中所述附加活性成分是选自杆菌肽、多粘菌素B硫酸盐、新霉素、Polysporin⑧抗生素、Neosporin⑧抗生素、聚维酮碘、磺胺嘧啶银、醋酸磺胺米隆、制霉菌素、呋喃西林和庆大霉素的抗菌剂。8.权利要求l-7任一项的用途，其中所述伤口选自烧伤、擦伤、裂伤、切伤、褥疮、剌伤、贯穿伤、枪伤和挤压伤。9.权利要求l-9任一项的用途，其中所述角蛋白衍生物基本由还原角蛋白构成。10.权利要求10的用途，其中所述角蛋白衍生物基本由a还原角蛋白构成。11.权利要求10的用途，其中所述角蛋白衍生物基本由酸性a还原角蛋白构成。12.权利要求10的用途，其中所述角蛋白衍生物基本由碱性a还原角蛋白构成。13.权利要求1-9任一项的用途，其中所述角蛋白衍生物基本由角质骨骼构成。14.权利要求14的用途，其中所述角蛋白衍生物基本由a角质骨骼构成。15.权利要求14的用途，其中所述角蛋白衍生物基本由酸性a角质骨骼构成。16.权利要求14的用途，其中所述角蛋白衍生物基本由碱性a角质骨骼构成。17.权利要求l-16任一项的用途，其中所述角蛋白衍生物以粉末形式或在水性载体中提供。18.权利要求1-16任一项的用途，其中所述角蛋白衍生物以油膏或霜形式提供。19.权利要求1-18任一项的用途，其中所述角蛋白衍生物局部施用。20.权利要求l-18任一项的用途，其中所述角蛋白衍生物通过将所述角蛋白衍生物注射到所述对象体内来施用。21.权利要求l-20任一项的用途，其中所述组合物或药剂以有效抑制伤口转化、促进伤口闭合或既抑制伤口转化又促进伤口闭合的量施用到所述伤口上。22.权利要求1-21任一项的用途，其中所述伤口是烧伤。23.药物组合物，其包含a)角蛋白衍生物；禾口b)任选地，至少一种附加活性成分；其中所述角蛋白衍生物包括角质骨骼、还原角蛋白、或其组合。24.权利要求23的组合物，其中所述角蛋白衍生物包含还原角蛋白。25.权利要求23的组合物，其中所述角蛋白衍生物基本由角质骨骼、还原角蛋白、或其组合构成。26.权利要求23-25任一项的组合物，其中所述角蛋白衍生物基本由还原角蛋白构成。27.权利要求23-26任一项的组合物，其中所述角蛋白衍生物基本由酸性还原角蛋白构成。28.权利要求23-27任一项的组合物，其中所述角蛋白衍生物基本由酸性a还原角蛋白构成。29.权利要求23-27任一项的组合物，其中所述角蛋白衍生物基本由酸性y还原角蛋白构成。30.权利要求23-29任一项的组合物，其中所述至少一种附加活性成分选自镇痛剂、抗菌剂和附加伤口愈合剂。31.权利要求23-30任一项的组合物，其中所述附加活性成分是选自杆菌肽、多粘菌素B硫酸盐、新霉素、Polysporin⑧抗生素、Neosporin⑧抗生素、聚维酮碘、磺胺嘧啶银、醋酸磺胺米隆、制霉菌素、呋喃西林和庆大霉素的抗菌剂。32.处理有需要的对象的伤口的方法，包括将角蛋白衍生物以有效处理所述伤口的量施用到所述伤口上，其中所述角蛋白衍生物基本由角质骨骼、还原角蛋白、或其组合构成。33.权利要求32的方法，其中所述伤口选自烧伤、擦伤、裂伤、切伤、褥疮、剌伤、贯穿伤、枪伤和挤压伤。34.权利要求32或权利要求33的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由还原角蛋白构成。35.权利要求32-34任一项的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由a还原角蛋白构成。36.权利要求32-35任一项的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由酸性a还原角蛋白构成。37.权利要求36的方法，其中所述酸性a还原角蛋白通过用离子交换色谱法将包含酸性和碱性a还原角蛋白的混合物分级的方法制成。38.权利要求32或权利要求33的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由角质骨骼构成。39.权利要求32、权利要求33或权利要求38的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由a角质骨骼构成。40.权利要求32、权利要求33、权利要求38或权利要求39的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由酸性a角质骨骼构成。41.权利要求40的方法，其中所述酸性a角质骨骼通过用离子交换色谱法将包含酸性和碱性a角质骨骼的混合物分级的方法制成。42.权利要求32-41任一项的方法，其中所述角蛋白衍生物以粉末形式或在水性载体中提供。43.权利要求32-41任一项的方法，其中所述角蛋白衍生物以油膏或霜形式提供。44.权利要求32-43任一项的方法，进一步包括将抗菌剂和/或镇痛剂以处理有效量施用到所述伤口上。45.权利要求32-44任一项的方法，其中所述角蛋白衍生物以有效抑制伤口转化、促进伤口闭合或既抑制伤口转化又促进伤口闭合的量施用到所述伤口上。46.权利要求32-45任一项的方法，其中所述角蛋白衍生物局部施用。47.权利要求32-45任一项的方法，其中所述角蛋白衍生物通过将所述角蛋白衍生物注射到所述对象体内来施用。48.处理受烧伤困扰的对象的烧伤的方法，包括将包含角蛋白衍生物的组合物以有效处理所述烧伤的量局部施用到所述烧伤上，其中所述角蛋白衍生物基本由角质骨骼、还原角蛋白、或其组合构成。49.权利要求48的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由还原角蛋白构成。50.权利要求48或权利要求49的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由a还原角蛋白构成。51.权利要求48-50任一项的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由酸性a还原角蛋白构成。52.权利要求51的方法，其中所述酸性a还原角蛋白通过用离子交换色谱法将包含酸性和碱性a还原角蛋白的混合物分级的方法制成。53.权利要求48-50任一项的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由碱性a还原角蛋白构成。54.权利要求53的方法，其中所述碱性a还原角蛋白通过用离子交换色谱法将包含酸性和碱性a还原角蛋白的混合物分级的方法制成。55.权利要求48的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由角质骨骼构成。56.权利要求48或权利要求55的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由a角质骨骼构成。57.权利要求48、权利要求55或权利要求56的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由酸性a角质骨骼构成。58.权利要求57的方法，其中所述酸性a角质骨骼通过用离子交换色谱法将包含酸性和碱性a角质骨骼的混合物分级的方法制成。59.权利要求48、权利要求55或权利要求56的方法，其中所述角蛋白衍生物基本由碱性a角质骨骼构成。60.权利要求59的方法，其中所述碱性a角质骨骼通过用离子交换色谱法将包含酸性和碱性a角质骨骼的混合物分级的方法制成。61.权利要求48-60任一项的方法，其中所述角蛋白衍生物以粉末形式或在水性载体中提供。62.权利要求48-60任一项的方法，其中所述角蛋白衍生物以油膏或霜形式提供。63.权利要求48-62任一项的方法，进一步包括将抗菌剂和/或镇痛剂以处理有效量施用到所述伤口上。64.权利要求48-63任一项的方法，其中所述角蛋白衍生物以有效抑制所述烧伤的伤口转化、促进伤口闭合或既抑制伤口转化又促进伤口闭合的量施用到所述烧伤上。65.外科手术或紧急护理辅助器，包含固态的生理学可接受基底；禾口在所述基底上的角蛋白衍生物，其中所述角蛋白衍生物基本由角质骨骼、还原角蛋白、或其组合构成。66.根据权利要求65的外科手术或紧急护理辅助器，其中所述基底选自海绵、包扎材料、伤口敷料、缝合线、织物和修复器具。67.根据权利要求65或权利要求66的外科手术或紧急护理辅助器，其中所述外科手术或紧急护理辅助器是无菌的，且其中所述外科手术或紧急护理辅助器包装在无菌容器中。68.根据权利要求65-67任一项的外科手术或紧急护理辅助器，其中所述角蛋白衍生物基本由还原角蛋白构成。69.根据权利要求65-68任一项的外科手术或紧急护理辅助器，其中所述角蛋白衍生物基本由a还原角蛋白构成。70.根据权利要求65-68任一项的外科手术或紧急护理辅助器，其中所述角蛋白衍生物基本由酸性a还原角蛋白构成。71.根据权利要求70的外科手术或紧急护理辅助器，其中所述酸性a还原角蛋白通过用离子交换色谱法将包含酸性和碱性a还原角蛋白的混合物分级的方法制成。72.根据权利要求65-67任一项的外科手术或紧急护理辅助器，其中所述角蛋白衍生物基本由角质骨骼构成。73.根据权利要求65、权利要求66、权利要求67或权利要求72的外科手术或紧急护理辅助器，其中所述角蛋白衍生物基本由a角质骨骼构成。74.根据权利要求65、权利要求66、权利要求67、权利要求72或权利要求73的外科手术或紧急护理辅助器，其中所述角蛋白衍生物基本由酸性a角质骨骼构成。75.根据权利要求74的外科手术或紧急护理辅助器，其中所述酸性a角质骨骼通过用离子交换色谱法将包含酸性和碱性a角质骨骼的混合物分级的方法制成。76.药盒，包含a)角蛋白衍生物；禾口b)容器，其中所述角蛋白衍生物以无菌形式包装在所述容器中，且其中所述角蛋白衍生物包括角质骨骼、还原角蛋白、或其混合物。77.权利要求76的药盒，其中所述角蛋白衍生物以水合或脱水形式提供。78.权利要求76或权利要求77的药盒，其中所述容器包括箔容器。79.权利要求76-78任一项的药盒，其中所述容器是真空包装的。80.权利要求76-79任一项的药盒，其中所述角蛋白衍生物包含单一单位剂量。81.权利要求76-80任一项的药盒，其中所述角蛋白衍生物包含0.5至200克脱水角质骨骼、还原角蛋白、或其混合物。82.权利要求76-80任一项的药盒，其中所述角蛋白衍生物包含0.5至200毫升水合角质骨骼、还原角蛋白、或其混合物。83.权利要求76-82任一项的药盒，进一步包含生理学可接受基底。84.权利要求83的药盒，其中所述基底是无菌的，且其中所述基底以无菌形式包装在所述容器中。85.权利要求83或权利要求84的药盒，其中所述基底选自海绵、包扎材料、伤口敷料、缝合线、织物和修复器具。全文摘要公开了用于医学用途的角蛋白制剂。提供了治疗伤口的方法，其中将角蛋白制剂以治疗有效量施用到该伤口上。提供了外科手术或紧急护理辅助器，其包含其上带有角蛋白制剂的基底。还提供了包含以无菌形式包装的角蛋白衍生物的药盒。文档编号A61P17/02GK101730540SQ200880020599公开日2010年6月9日申请日期2008年4月17日优先权日2007年4月17日发明者M·E·范迪克申请人:韦克福里斯特大学健康科学院