Gdnf剪接变体及其用途的制作方法

专利名称：Gdnf剪接变体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经胶质细胞系来源的神经营养因子(Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor, GDNF)蛋白及其cDNA，更具体来说，涉及被称为(Y)pro-GDNF的 ⑶NF蛋白的新剪接变体，该变体由新的mRNA剪接变体pre- ( y ) pro-GDNF编码，并以神经元活性依赖性的方式分泌。本发明涉及(Y)pro-GDNF蛋白、其cDNA和它的部分的用途。
背景技术：
⑶NF是支持周围交感神经、副交感神经、肠神经和感觉神经的神经元以及中脑多巴胺神经元和运动神经元的发育和存活的神经营养因子。在帕金森氏症(PD)的多种动物模型中，GDNF可以预防神经毒素诱导的多巴胺神经元的死亡，并且促进轴突出芽最终导致功能的恢复。被称为pre_(a )pro_GDNF(先前称为⑶NF a )和pre-( β )pro-GDNF(先前称为GDNF0)的两种GDNF剪接变体已有描述(Suter-Crazzolara and Unsicker, Neuroreport,5 :2486-2488 (1994)) 这些剪接变体是通过GDNF mRNA的不同剪接产生的。多种分泌蛋白包括神经营养因子都是以前体、前-原-成熟蛋白的形式合成的。 由ER信号肽构成的前区(pre region)在翻译过程中被信号肽酶剪掉，原_成熟蛋白在合成后立即被释放到ER腔中。成熟蛋白的蛋白水解切割可以发生在细胞内或胞外基质或者这两种情况都有。原-成熟蛋白还可以保持不被切割的状态，具有不同于切割好的成熟蛋白的功能。例如，神经细胞既分泌成熟的脑来源神经营养因子(BDNF)，也分泌原-BDNF。 成熟BDNF与TrkB受体结合，诱导神经元存活、分化和突触调制，而原-BDNF与p75NTK和分拣蛋白(sortilin)受体结合，诱发细胞凋亡(参见Thomas and Davies, Curr. Biol, 15 262-264(2005) ；Teng et al，J. Neurosci.，25 :5455-5463 (2005)等综述)。GDNF剪接变体含有氨基端信号序列(前区)和会被从成熟结构域切下的原序列(Lin et al.，Science，260 1130-1132 (1993))(图 1)。(3)pro-⑶ NF 的原区 (pro-region)比(α )pro-⑶NF 的原区少 26 个氨基酸(aa) (Trupp et al.，J. Cell Biol, 130 :137-148(1995)).这两种剪接变体产生的成熟⑶NF蛋白非常可能是一样的。成熟 ⑶NF由134个氨基酸(aa)组成，含有两个推测的N-糖基化位点和7个保守半胱氨酸，这些半胱氨酸与TGF-β蛋白家族的其他成员处于同样的相对间距(Lin et al. ,Science, 260 1130-1132(1993) ；Eigenbrot and Gerber，Nat. Struct. Biol，4 :435-438(1997) ；Chang et al.，Endocri. Rev. ,23 :787-823(2002))(图 1)。生物活性的成熟 GDNF 二聚体是通过单体中未配对的半胱氨酸之间的共价二硫键形成的(Eigenbrot and Gerber, Nat. Struct. Biol. 4 :435-438(1997))。在科学文献中，⑶NF mRNA和⑶NF蛋白这两个名称已被用于全长pre_((a) pro-GDNF mRNA和(a ) pro-GDNF蛋白被蛋白水解切割产生的成熟⑶NF蛋白。对于成熟 ⑶NF蛋白已有广泛深入的研究，在PubMed中⑶NF有2500个以上的引用。⑶NF的鉴定基于其提高神经突长度、细胞大小和多巴胺能神经元数量的能力，以及它们摄入培养基中多巴胺的高亲和力(Linet al.，Science，260 1130-1132 (1993))。GDNF 在 PD 动物模型中以及PD患者的治疗中，是保护黑质多巴胺能神经元抗毒素诱导的降解的有力因子(综述见 Airaksinen and Saarma, Nat. Rev. Neurosci. 3 :383-394(2002),禾口 Bespalov and Saarma, Trends Pharmacol. Sci. 28 :68-74(2007)) 此外，GDNF 在治疗肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis) (ALS)、成瘾症、酗酒和抑郁症的动物模型中具有医疗作用(综述见 Bohn，Exp. Neurol, 190 :263-275(2004) ；Messer et al.，Neuron, 26 247-257(2000) ；He et al. , J. Neurosci. ,25 :619-628(2005) ；Angelucci et al. , Int. J. Neuropsycho-pharmacol.，6 =225-231 (2003)) GDNF 在神经系统之外也有重要作用。 它是肾发育过程中的形态发生素，并且能够调节精原细胞的分化(综述见Sariola and Saarma, J. Cell Sci. 116 :3855-3862(2003))。在例如美国专利6，362，319和欧洲专利06102M中公开了( α )pro_GDNF蛋白，截短形式的⑶NF在美国专利6，184，200和欧洲专利0920448中有公开。已经利用成熟⑶NF蛋白进行了治疗帕金森氏症的临床试验。临床前试验中得到的结果很有希望(Gill et al., Nat. Med. ,9 :589-595(2003) ；Slevin et al，J. Neurosurg.，102 :401 Q005))，但是 I/II 期临床试验的结果不令人满意。据报道帕金森氏症的症状没有统计学上显著的改善，并且存在着潜在的安全风险。因此，成熟⑶NF蛋白的临床试验被全部终止(Lang et al. , Ann. Neurol,59 :459-466(2006))。pre-( β )pro-GDNF mRNA 剪接变体由 Suter-Crazzolara 禾口 Unsicker (Neuroreport, 5 =2486-2488)在1994年首次描述了存在于大鼠组织，由Matsushita等 (Gene, 203 :149-157(1997))在 1997 年描述存在于小鼠组织，Grimm 等(Hum. MoI. Genet.， 12 :1873-1886 (1998) )1998年报道存在于人组织。除了 mRNA的表达数据，Trupp等(J. Cell Biol, 130 :137-148(1995))显示，pre-( β ) pro_GDNF cDNA所编码的分泌的 GDNF 蛋白在 ElO 鸡椎旁交感神经元中促进了强健存活、广泛的神经突生长并提高了细胞体的大小。发明概述本申请中描述的发明显示，除了以前知道的被称为pre-(a)pro-GDNF和 pre- ( β ) pro-GDNF的⑶NF mRNA剪接变体，还存在着第三个不同的剪接变体，称为 pre- ( y ) pro-⑶NF (图 3 和 4)。人 pre- ( a ) pro-⑶NF 和 pre- ( β ) pro-⑶NF 的开放读码框 (ORFs)从外显子2开始，而pre-( γ )pro-GDNF剪接变体缺少整个外显子2的序列，而是在外显子1中含有替代的蛋白翻译起始密码子CTG(图2)。pre-(y)pro-GDNF mRNA所编码的(γ )pro_GDNF蛋白的前原区长度为47个氨基酸(aa)，比(a) pro-GDNF的前原区短30个aa (

图1)。pre-( y ) pro-GDNF的前原区的26 个C末端aa由外显子3编码，因此与pre- ( α ) pro-GDNF和pre- ( β ) pro-GDNF中的相应区域相同。(Y)Pro-GDNF的前21个aa由外显子1编码，是该剪接变体特有的(图2)。由这三种GDNF剪接变体产生的成熟GDNF蛋白非常可能是一样的(图1)。我们的结果显示(α ) pro-GDNF、( β ) pro-GDNF 和(Y ) pro-GDNF 以原-GDNF 蛋白和成熟蛋白的形式分泌，其中成熟蛋白是原-GDNF被蛋白水解切割产生的。(cOpro-GDNF 和成熟⑶NF的分泌是组成性的，而(β ) pro-GDNF和(γ ) pro-GDNF的分泌是神经元活性依赖性的，即受到神经元和神经生理刺激的调节。这使得(i3)pro-GDNF和(Y)pro-GDNF以及它们的编码cDNAs比(α ) pro-GDNF及其cDNA更有可能成为基因疗法治疗PD的治疗分子。
因此，本发明的主要对象是由人pre-(Y)pro-GDNF剪接变体编码的，包含SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的纯化和分离的人(Y)pro-GDNF蛋白剪接变体。作为对比，我们也纯化和分离了由小鼠pre-(Y)pro-GDNF剪接变体编码的，包含SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的小鼠(Y ) pro-GDNF蛋白剪接变体。发明的另一个对象是人(Y)pro-GDNF蛋白剪接变体的修饰，其中氨基端亮氨酸残基被甲硫氨酸残基代替。所述修饰的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。发明的再一个对象是人pre-( γ )pro-GDNF的成熟多肽部分，包含SEQ IDNO 2中的氨基酸1到134，以及(γ )pro-序列，即SEQ ID NO 2中氨基酸-47到-1的序列部分， 这部分具有调控功能但不含信号序列。发明的一个对象是人(Y)ro-GDNF蛋白剪接变体的前原氨基酸序列，以及修饰的前-原序列，这两个氨基酸序列分别如SEQ ID N0:19和SEQ IDNO :21所示。SEQ ID NO: 21中显示的具有调控功能的前-原序列的(Y)pro部分也包含在本发明中。人(Y )pro_GDNF蛋白剪接变体的截短形式，即缺少成熟多肽部分中N末端的38 个氨基酸(SEQ ID NO :24)，及其如上所述的Leu-Met修饰(SEQ IDNO 26)也是发明的对象。人(γ ) pro-GDNF剪接变体的V34M突变体(SEQ ID NO 27)及其如上所述的 Leu-Met修饰(SEQ ID NO 29)也是发明的对象。本发明的再一方面是纯化的、分离的和V38M突变的人神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白剪接变体(pre-(i3)pro-GDNF)，以及所述pre-(i3)pro-GDNF的截短形式，该截短形式缺少成熟多肽部分N末端的38个氨基酸。这些蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID N0:31和SEQ ID NO :35所示。另外，pre-( β ) pro-GDNF剪接变体及编码该变体的多核苷酸(如SEQ IDNO 51所示)在特别是利用基因疗法治疗神经系统疾病 (neurological disorder)或神经退行性疾病(neurodegenerative disease)中的用途，也是发明的一个具体方面。发明还涉及纯化的、分离的和V64M突变的人神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白剪接变体(pre-(a)pro-GDNF)。其氨基酸序列如SEQ ID NO 33所示。发明的另一些对象是编码以上指定形式的GDNF蛋白剪接变体的分离的多核苷酸。特异结合(Y)pro-GDNF蛋白剪接变体的抗体构成本发明的再一对象。还提供了与(a ) pro-GDNF、( β ) pro-GDNF和/或(Y ) pro-GDNF蛋白剪接变体的原部分特异结合的抗体。此外,还考虑了与 pre- ( a ) pro-GDNF、pre- ( β ) pro-GDNF 或 pre- ( γ ) pro-GDNF 蛋白剪接变体的前原区特异结合的抗体。本发明的一个优选项提供了重组形式的人pre-( γ )pro-GDNF剪接变体编码的蛋白。应当理解，可以从其他哺乳动物中获得同源pre-(Y)pr0-GDNF分子及其编码序列。作为一个实例，提供了包含如SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的小鼠(Y)pro-GDNF蛋白剪接变体。附图简述图 1 是 pre- ( a ) pro-⑶NF、pre_ ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF mRNA 编码的蛋白的结构示意图。为了清楚起见，包含了氨基端的信号序列(前区)，虽然它们在蛋白翻
7译过程中已被切除。图中显示了成熟分子中的氨基酸(以織表示)，原区中的氨基酸(以表示)、前区中的氨基酸(以■表示)的数量。在Pre-(Y)pro-GDNF中，前原区以霧示。7个保守半胱氨酸的相对位置以黑色条带指示。GDNF中两个推测的N-糖基化位点标有箭头。图 2 显示了 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF 剪接变体的特点。在⑶NF cDNA中，剪接变体的ORFs显示为■,未翻译的(UTR)区域显示为； pre- ( α ) pro-GDNF 和 pre- ( β ) pro-GDNF 的 ORFs 被分为外显子 2 和 3，pre- ( y ) pro-⑶NF 的分为外显子1和3。pre-(3 )pro-GDNF剪接变体的外显子2的3’区缺少78bp0 pre-(y) pro-GDNF剪接变体的外显子1中含有替代的蛋白翻译起始密码子CTG，和一个独特的61bp 的序列。成熟⑶NF由外显子3编码，在全部三种剪接变体中很可能一样。图3。通过RT-PCR分析的小鼠⑶NF mRNA在肾组织中的表达。泳道1 胚胎第13 天(E 13)肾组织；泳道2 :E15肾组织；泳道3 :E17肾组织；泳道4 产后第1天(Pl)肾组织；泳道5 :P5肾组织；泳道6 :P6肾组织；泳道7 空泳道；泳道8 =PCR阴性对照。pre_( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF和pre- ( γ ) pro-⑶NF变体标有箭头。在样品El3-Pl中检测 IlJ pre- ( α ) pro-GDNF 和 pre- ( β ) pro-GDNF 变体。样品 E13、E15 和 P1 中检测 pre- ( γ ) pro-⑶NF变体。图4。通过RT-PCR分析的⑶NF mRNA在成人脑组织中的表达。泳道1和2 成人脑组织；泳道 3 =PCR 阳性对照；泳道 4 阴性 PCR 对照。pre- ( α ) pro-GDNF,pre- ( β ) pro-GDNF 和pre- ( γ ) pro-GDNF变体标有箭头。图5。小鼠(a)pro-GDNF和(β )pro_⑶NF蛋白在CHO细胞中表达的分析。含有小鼠pre- ( a ) pro-GDNF或pre- ( β ) pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的 cDNAs克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。将生长在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至6孔板，当生长至大约80%铺满时，每孔转染4 μ g质粒。转染后4小时，将培养基替换为OptiMEM培养基。转染后48小时，收集细胞和培养基(上清)， 用小鼠抗GDNF抗体(3. 3 μ g/样品)将GDNF免疫沉淀，利用15 %变性SDS-PAGE凝胶分离， 随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween (0. )的5%牛奶封闭。通过ECL方法，用兔抗 ⑶NF抗体(Santa Cruz，l 500稀释)和偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000稀释)检测⑶NF。泳道1 转染了小鼠pre-( α )pro-GDNF的细胞、细胞裂解物；泳道2 转染了小鼠pre-(i3)pr0-GDNF的细胞、细胞裂解物；泳道3 未转染的细胞(阴性对照)、细胞裂解物；泳道4 转染了小鼠pre-(a)pr0-GDNF的细胞、培养基；泳道5 转染了小鼠pre-( β ) pro-GDNF的细胞、培养基；泳道6 未转染的细胞(阴性对照)、培养基。图6。人(a)pro-GDNF和(β )pro_⑶NF蛋白在CHO细胞中表达的分析。含有人 pre- ( a ) pro-GDNF或pre- ( β ) pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNAs 克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。将生长在含有10% FCS和抗生素的 DMEM中的CHO细胞接种至6孔板，当生长至大约80%铺满时，每孔转染4 μ g质粒。转染后 4小时，将培养基替换为OptiMEM培养基。转染后48小时，收集细胞和培养基(上清)，利用15%变性SDS-PAGE凝胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween (0. 1%)中的5% 牛奶封闭。通过ECL方法，用兔抗⑶NF抗体(Santa Cruz, 1 500稀释)和偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000稀释)检测⑶NF。泳道1 转染了人pre-(a)pro-GDNF的细胞，细胞裂解物；泳道2 转染了人pre-(i3)pro-GDNF的细胞、细胞裂解物；泳道3 未转染的细胞(阴性对照)、细胞裂解物；泳道4 转染了人pre-( α )pro-GDNF的细胞、培养基； 泳道5 转染了人pre-(i3 )pro-GDNF的细胞、培养基；泳道6 未转染的细胞(阴性对照)、
培养基。图7。小鼠(Y)pro-GDNF蛋白在BHK细胞中表达的分析。含有小鼠pre_(i3) pro-GDNF或pre- ( γ ) pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的pre- ( y ) pro-⑶NF cDNAs克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。将生长在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的BHK细胞接种至6孔板，当生长至大约80%铺满时，每孔转染4 μ 质粒。转染后4小时，将培养基替换为OptiMEM培养基。转染后48小时，收集细胞和培养基 (上清)，用小鼠抗⑶NF抗体(3. 3 μ g/样品)将⑶NF免疫沉淀，利用15 %变性SDS-PAGE 胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0. )的5%牛奶封闭。通过ECL方法，用兔抗⑶NF抗体(Santa Cruz,l 500稀释)和偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗 (1 2000稀释)检测⑶NF。泳道1 转染了小鼠pre-(i3 )pro-GDNF的细胞、细胞裂解物； 泳道2 转染了小鼠pre-(Y)pro-GDNF的细胞、细胞裂解物；泳道3 未转染的细胞(阴性对照)、细胞裂解物。图8A和8B。人(Y ) pro-GDNF蛋白在BHK和C0S-7细胞中表达的分析。含有人pre- ( y ) pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNAs (含有ATG或 CTG作为蛋白翻译的起始密码子)克隆到PAAV-MCS(Stratagene)或pEGFP-Nl表达载体 (Invitrogen)中制备的。将生长在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的BHK细胞接种至 6孔板，当生长至大约80%铺满时，每孔转染4μ g质粒。转染后4小时，将培养基替换为 OptiMEM培养基。转染后48小时，收集培养基(上清)，利用15%变性SDS-PAGE凝胶分离， 随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0. )的5%牛奶封闭。通过ECL方法，用兔抗 ⑶NF抗体(Santa Cruz，l 500稀释)和偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000稀释)检测⑶NF。图8A 泳道1 转染了含有人pre-( y )pro-GDNF(翻译起始密码子为ATG) 的pAAV-MCS的BHK细胞、培养基；泳道2 转染了含有人pre- ( y ) pro-GDNF (带有翻译起始密码子CTG和终止密码子)的pEGFP-Nl的BHK细胞、培养基。图8B 泳道1 转染了含有人 pre- ( y ) pro-GDNF (翻译起始密码子为ATG)的pAAV-MCS的C0S-7细胞、培养基；泳道2 未转染的C0S-7细胞(阴性对照)、培养基。图9A和9B。⑶NF在分化PC-6. 3细胞中的亚细胞定位的免疫荧光分析。含有人 pre- ( α ) pro-GDNF或pre- ( β ) pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNAs 克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。PC-6. 3细胞在转染前，在含有达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco' smodified Eagle' s medium) (DMEM)、5% HS(Gibco)、 2. 5% FCS和50ng/ml神经生长因子(NGF)的分化培养基中分化3天。转染后M小时，将细胞用4% PFA固定，或者先用50mM KCl和50 μ g/ml环己亚胺刺激2小时，使蛋白合成停止， 然后用 4% PFA 固定。所有细胞用 0. 5% BSA (Sigma)封闭，并用 0. 1% Triton X-IOO(Sigma) 使通透性增加。将细胞与溶于0.5% BSA中的一抗，即多克隆抗⑶NF(Gene Way Biotech Inc. ；1 750稀释)和成熟高尔基体的单克隆抗GM130 (Abeam ;1 100稀释)在室温下温育1小时，清洗，然后用二抗重复上述过程。通过显微镜(AX70ft~OVis ；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70 ；Olympus)获取图像。图 9A pre-( α )pro-GDNF(白色)或 pre_(i3) pro-GDNF(灰色)编码的蛋白在未被刺激的PC_6. 3细胞中的亚细胞定位的定量。显示了蛋
9白在单独高尔基体中或者在囊泡+/_高尔基体中的百分比(n = 3)。= 0. 0023.误差条显示 SD。图 9B:Q pre-(a)pro-GDNF 和 pre-(0)pro_GDNF 编码的蛋白在分化 PC-6. 3 细胞中的亚细胞定位的定量。显示了蛋白在单独高尔基体中、在囊泡+/_高尔基体中或者在单独囊泡中的百分比(n = 3)。细胞没有处理(oh)或者用50mM KCl和50 μ g/ml环己亚胺处理2小时(2h)。图10。收集自分化PC-6. 3细胞的细胞培养基中的小鼠⑶NF Western印迹分析。 含有小鼠pre- ( a ) pro-GDNF或pre- ( β ) pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。将生长在含有10%马血清 (HS)、5%胎牛血清(FCS)和抗生素的DMEM中的PC-6. 3细胞接种至6孔板，当生长至大约 80%铺满时，每孔转染4yg质粒。转染后4小时，将培养基替换为含有5% HS和2. 5% FCS、 50mg/ml神经生长因子(NGF)和抗生素的DMEM分化培养基。72小时后，用溶于DMEM的25mM KCl将PC-6. 3细胞去极化5小时。对照(未去极化的)细胞用DMEM处理。收集培养基(上清)，利用15%变性SDS-PAGE凝胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween (0.1%) 的5%牛奶封闭。通过ECL方法，用兔抗⑶NF抗体(Santa Cruz，l 500稀释)和偶联HRP 的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000稀释)检测⑶NF。在细胞培养基中，pro-GDNF、加工过的中间体pro-GDNF和成熟⑶NF条带标有箭头。泳道1 转染了小鼠pre- ( α ) pro-GDNF的未去极化的PC-6. 3细胞、培养基；泳道2 转染了小鼠pre-(i3 )pro-GDNF的去极化的PC-6. 3 细胞、培养基；泳道3 转染了小鼠pre-(i3 )pro-GDNF的未去极化的PC-6. 3细胞、培养基； 泳道4 转染了小鼠pre-(i3 )pro-GDNF的去极化的PC-6. 3细胞、培养基。图11。收集自分化PC-6. 3细胞的细胞培养基中的人⑶NF Western印迹分析。含有人pre-( α )pro-GDNF或pre-( β )pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的 cDNAs克隆到pAAV-MCS表达载体(Stratagene)中制备的。将生长在含有10% HS、5% FCS 和抗生素的DMEM中的PC-6. 3细胞接种至6孔板，当生长至大约80%铺满时，每孔转染4 μ g 质粒。转染后4小时，将培养基替换为含有5% HS和2. 5% FCS、50mg/ml NGF和抗生素的 DMEM分化培养基。72小时后，用溶于DMEM的50mM KCl将PC-6. 3细胞去极化5小时。对照(未去极化的)细胞用DMEM处理。收集培养基(上清)，利用15%变性SDS-PAGE凝胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0. )的5%牛奶封闭。通过ECL方法，用兔抗⑶NF抗体(SantaCruz，1 500稀释)和偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000 稀释)检测⑶NF。泳道1 转染了人pre-(a)pro-GDNF的未去极化的PC-6. 3细胞、培养基；泳道2 转染了人pre-(a )pro-GDNF的去极化的PC-6. 3细胞、培养基；泳道3 转染了人pre- ( β ) pro-GDNF的未去极化的PC-6. 3细胞、培养基；泳道4:转染了人pre_(i3) pro-GDNF的去极化的PC-6. 3细胞、培养基。图12A和12B。通过ELISA分析确定PC-6. 3细胞中的⑶NF浓度。含有小鼠 pre- ( a ) pro-GDNF或pre- ( β ) pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNAs 克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。在pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen) 中含有不带终止密码子的大鼠前-原-BDNF的表达构建体作为对照。将生长在含有10% HS,5% FCS和抗生素的DMEM中的PC-6. 3细胞接种至M孔板，当生长至大约80%铺满时， 每孔转染0. 8 μ g质粒。转染后4小时，将培养基换成含有5 % HS和2. 5% FCS、50mg/ml NGF和抗生素的DMEM分化培养基。72小时后，用溶于DMEM的50mM KCl将PC-6. 3细胞去
10极化2小时。对照(未去极化的)细胞用DMEM处理。收集培养基(上清)，利用⑶NF Efflax ImmunoAssay System (Promega)分析 GDNF,利用 BDNF Emax ImmunoAssay System (Promega) 分析BDNF。图12A:第1栏转染了人pre-(a)pro-GDNF的去极化的PC-6. 3细胞、培养基；第2栏转染了人pre-( a )pro-GDNF的未去极化的PC-6. 3细胞、培养基；第3栏转染了人pre-( β )pro-GDNF的去极化的PC-6. 3细胞、培养基；第4栏转染了人pre-( β ) pro-⑶NF的未去极化的PC-6. 3细胞、培养基，(n = 3) · *，P = 0. 092227。误差条表示SD0 图12Β 第1栏转染了大鼠前-原-BDNF的去极化的PC-6. 3细胞、培养基；第2栏转染了大鼠前-原-BDNF的未去极化的PC-6. 3细胞、培养基，(n = 3).*,P = 0. 00307。误差条表示 SD。图 13Α 和 i;3B。321/pro-⑶NF 抗体识别 CHO 细胞中 pre- ( a ) pro-⑶NF、pre_ ( β ) pro-GDNF和pre- ( γ ) pro-GDNF的原-结构域特异性的免疫荧光分析。含有小鼠pre- ( a ) pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNA克隆到pEGFP-Nl表达载体 (Invitrogen)中制备的。含有人 pre_( β )pro_GDNF、人 pre_( γ )pro_GDNF 的表达构建体 (含有ATG作为蛋白编码起始密码子和人pre-⑶NF)是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pAAV-MCS表达载体(Stratagene)中制备的。由空的pEGFP-Nl载体表达绿色荧光蛋白(GFP)。将生长在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至4孔板，当生长至大约80%铺满时，每孔转染0. 8 μ g质粒。转染后4小时，将培养基换成含有10% FCS和抗生素的新鲜DMEM。转染后M小时，用4%仲甲醛(Sigma)将细胞固定，并用0. 1 % "Triton X-IOO(Sigma)使通透性增加。将细胞与溶于0. 5% BSA中的一抗，即抗⑶NF原-结构域的多克隆321/pro-GDNF(l 200稀释)和抗成熟⑶NF的单克隆小鼠抗⑶NF(1 100稀释)在室温下温育1小时，清洗，然后用二抗重复上述过程。细胞核用Hoechst染色。通过显微镜(AX70Provis ；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70 ；Olympus)获取图像。图13A 在CHO细胞中过表达小鼠(a)pro-GDNF、人(β ) pro-GDNF、人(Y )pro_GDNF和没有原区的人成熟⑶NF，用321/pro-GDNF (红色)和抗⑶NF (绿色)双重免疫荧光染色。将未转染的细胞染色作为对照。细胞核以蓝色显示。图13B:在CHO细胞中表达GFP蛋白(绿色)，细胞用321/pro-GDNF抗体(红色)免疫荧光染色。细胞核以蓝色显示。图 14A 和 14B。320/ ( a ) pro-⑶NF 抗体识别 CHO 细胞中 pre- ( a ) pro-⑶NF 的原-结构域特异性的免疫荧光分析。含有小鼠pre- ( a ) pro-GDNF和pre- ( β ) pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNA克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。含有人pre-( γ )pro-GDNF的表达构建体(含有ATG作为蛋白编码起始密码子和人pre-GDNF)是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pAAV-MCS表达载体(Stratagene) 中制备的。由空的pEGFP-Nl载体表达绿色荧光蛋白(GFP)。将生长在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至带有盖片的4孔板，当生长至大约80%铺满时，每孔转染0. Syg质粒。转染后4小时，将培养基换成含有10% FCS和抗生素的新鲜DMEM。转染后M小时，用4%仲甲醛(Sigma)将细胞固定，并用0. 1% Triton X-IOO(Sigma)使通透性增加。将细胞与溶于0.5% BSA中的一抗，即抗(a)pro-GDNF原-结构域的多克隆320/ (a)pro-GDNF(l 200稀释)和抗成熟GDNF的单克隆小鼠抗GDNF(1 100稀释)在室温下温育1小时，清洗，然后用二抗重复上述过程。细胞核用Hoechst染色。通过显微镜 (AX70Provis ；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70 ；Olympus)获取图像。图14A 在CHO细胞中过表达小鼠(a)pro-GDNF、小鼠(β )pro-GDNF、人(Y )pro-GDNF和没有原区的人成熟⑶NF，用320/( a )pro-GDNF(红色)和抗⑶NF(绿色)双重免疫荧光染色。细胞核以蓝色显示。图14B 在CHO细胞中表达GFP蛋白(绿色)，细胞用320/( a ) pro-GDNF抗体(红色)免疫荧光染色。细胞核以蓝色显示。图 15A 和 15B。322/ ( β ) pro-⑶NF 抗体识别 CHO 细胞中 pre- ( β ) pro-⑶NF 的原-结构域特异性的免疫荧光分析。含有小鼠pre- ( a ) pro-GDNF和pre- ( β ) pro-GDNF的表达构建体是通过将带有终止密码子的cDNA克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中制备的。含有人pre-( γ )pro-GDNF的表达构建体(含有ATG作为蛋白编码起始密码子和人pre-GDNF)是通过将带有终止密码子的cDNAs克隆到pAAV-MCS表达载体(Stratagene) 中制备的。由空的PEGFP-Nl载体表达绿色荧光蛋白(GFP)。将生长在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至带有盖片的4孔板，当生长至大约80%铺满时，每孔转染0. Syg质粒。转染后4小时，将培养基换成含有10% FCS和抗生素的新鲜DMEM。转染后M小时，用4%仲甲醛(Sigma)将细胞固定，并用0. 1% Triton X-IOO(Sigma)使通透性增加。将细胞与溶于0.5% BSA中的一抗，即抗(i3)pro-GDNF原-结构域的多克隆322/ (^)pro-GDNF(l 200稀释)和抗成熟GDNF的单克隆小鼠抗GDNF(1 100稀释)在室温下温育1小时，清洗，然后用二抗重复上述过程。细胞核用Hoechst染色。通过显微镜 (AX70Provis ；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70 ；Olympus)获取图像。图15A 在CHO 细胞中过表达小鼠(a)pro-GDNF、小鼠(β )pro-GDNF、人(Y )pro-GDNF和没有原区的人成熟⑶NF，用322/(β )pro-GDNF(红色)和抗⑶NF(绿色)双重免疫荧光染色。细胞核以蓝色显示。图15B 在CHO细胞中表达GFP蛋白(绿色)，细胞用322/( β ) pro-GDNF抗体(红色)免疫荧光染色。细胞核以蓝色显示。图 16A、16B 禾Π 16C。321/pro-⑶NF 抗体识别 CHO 细胞中 pre-( a ) pro-GDNF、 pre-( β ) pro-⑶NF和pre- ( γ ) pro-GDNF的原-结构域特异性的Western印迹分析。将生长在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至6孔板，当生长至大约80%铺满时，每孔转染4yg质粒。转染后4小时，将培养基换成aiil OptiMEM培养基。转染后48小时，收集细胞和培养基(上清)，将培养基浓缩，样品利用15% 变性SDS-PAGE胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween(0. 1 % )的5 % 牛奶封闭。通过ECL方法，用多克隆321/pro-GDNF抗体(1 500稀释)或抗成熟⑶NF的多克隆D20抗体(Santa Cruz, 1 500稀释)以及偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000稀释)检测⑶NF。泳道1 转染了人pAAV-MCS-pre-( α ) pro-⑶NF 的 CHO 细胞、细胞；泳道 2 转染了人 pAAV-IRES-hrGFP-pre-( α ) pro-⑶NF 的CHO细胞、细胞；泳道3 转染了人pAAV-MCS-pre-( α )pro-GDNF的CHO细胞、 培养基；泳道 4 转染了人 pAAV-IRES-hrGFP-pre-(a )pro-GDNF 的 CHO 细胞、 培养基；泳道5 转染了人pAAV-MCS-pre-( β )pro-GDNF的CHO细胞、细胞；泳道 6 转染了人 pAAV-IRES_hrGFP-pre-(0 )pro-GDNF 的 CHO 细胞、细胞；泳道 7 转染了人pAAV-MCS-pre-(i3 )pro-⑶NF的CHO细胞、培养基；泳道8 :转染了人 pAAV-IRES-hrGFP-pre-( β )pro-GDNF的CHO细胞、培养基；泳道9 转染了表达GFP的空 pEGFP-Nl载体的CHO细胞，细胞；泳道10 转染了人pAAV-MCS-pre_GDNF的CHO细胞，细胞；泳道11 转染了表达GFP的空pEGFP-Nl载体的CHO细胞，培养基；泳道12 转染了人
12pAAV-MCS-pre-GDNF的CHO細胞，培养基。图16A 用321/pro_GDNF抗体检测的样品。图16B 用D20抗体检测的样品。图16C 用321/pro-GDNF抗体检测(a) pro-GST和(β ) pro-GST 融合蛋白。图 17A、17B、17C 禾Π 17D。320バ α )pro-GDNF 抗体识别 CHO 细胞中 pre-(a ) pro-GDNF的原-结构域特异性的^iestern印迹分析。将生长在含有10 % FCS和抗生 素的DMEM中的CHO細胞接种至6孔板，当生长至大约80%铺满吋，每孔转染4μ g质 粒。转染后4小时，将培养基换成aiil OptiMEM培养基。转染后48小时，收集細胞和 培养基(上清)，将培养基浓縮，样品利用15%变性SDS-PAGE胶分离，随后转印到尼龙 膜上，用溶于TBS-Tween (0. 1 % )的5 %牛奶封闭。通过ECL方法，用多克隆320/ ( a ) pro-GDNF抗体(1 500稀释)或多克隆D20抗体(Santa Cruz，l 500稀释)以及偶 联HRP的驴抗兔免疫球蛋白ニ抗(1 2000稀释)检测GDNF。細胞转染了以下构建体 泳道 1 小鼠 pre-( α )pro-⑶NF-pEGFP-Nl ；泳道 2 人 pre-( α )pro-⑶NF-pEGFP-Nl ；泳道 3 人 pAAV-IRES-hrGFP-pre- ( α ) pro-⑶NF ；泳道 4 人 pAAV-MCS-pre- ( α ) pro-⑶NF ；泳道 5 小鼠 pre- ( β ) pro-⑶NF-pEGFP-Nl ；泳道 6 人 pre- ( β ) pro-⑶NF-pEGFP-Nl ；泳道 7 人 pAAV-IRES-hrGFP-pre- ( β ) pro-⑶NF ；泳道 8 人 pAAV-MCS-pre- ( β ) pro-⑶NF ；泳道 9 表 达 GFP 的空 pEGFP-Nl 载体；泳道 10 没有原区的 pAAV-MCS-pre-GDNF。图 17A 用 320/ ( α ) pro-GDNF抗体检测的CHO細胞，細胞。图17B 用320/ ( α ) pro-GDNF抗体检测的CHO細胞， 培养基。图17C 用D20抗体检测的CHO細胞，細胞。图17D 用D20抗体检测的CHO細胞，
培养基。发明详述缩略语aa氨基酸ALS肌萎縮侧索硬化症AtT-20细胞系小鼠垂体肿瘤细胞系BDNF脑来源的神经营养因子BHK-21幼仓鼠肾细胞系bp碱基对BSA牛血清清蛋白CDR补决定区CHO細胞系中国仓鼠卵巢细胞系C0S-7SV40 转化的猴肾細胞系DMEM达尔伯克氏改良伊格尔培养基ELISA酶联荧光吸收法ER内质网FCA弗氏完全佐剂FCS胎牛血清FIA弗氏不完全佐剂⑶NF神经胶质細胞系来源的神经营养因子GFP绿色荧光蛋白
“变体”是指与本发明的多核苷酸或多肽不同，但保持了关键特性的多核苷酸或多肽。通常，变体在整体上非常相似，许多区域中与本发明的多核苷酸或多肽是相同的。“剪接变体”是由一个基因转录得到的不同成熟mRNA分子。这样的剪接过程称为选择性剪接，在真核细胞中可能发生。由一个基因转录和翻译产生的不同剪接变体蛋白，它们的功能可能有明显不同。“严紧”同源物(即来源于人以外物种的Pre-(Y)Pro-GDNF剪接变体分子的核酸) 或其他相关序列(例如旁系同源物)可以利用本领域公知的用于核酸杂交和克隆的方法， 通过与作为探针的特定人序列的全部或部分进行低、中等或高严紧杂交获得。利用cDNA、mRNA或替代的基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物，聚合酶链式反应(PCR)扩增技术可以用于扩增pre-(Y)pro-GDNF剪接变体。可以将这类核酸克隆到合适的载体中，通过DNA序列分析进行表征。此外，可以通过标准合成技术，例如自动DNA 合成仪制备pre-( γ )pro-GDNF序列所对应的寡核苷酸。“引物”是指能够与指定的多核苷酸模板特异杂交并提供合成其互补多核苷酸的起点的多核苷酸。当多核苷酸引物被置于能够诱发合成的条件下，即在有核苷酸、互补多核苷酸模板和诸如DNA聚合酶的聚合剂的情况下，可发生这类合成。引物一般是单链的，但可以是双链。引物一般是脱氧核糖核酸，但有许多合成的和天然的引物可以用于多种应用。引物与它被设计成要与之杂交的模板互补，从而作为合成的起始位点，但不需要反映模板的确切序列。在这种情况中，引物与模板的特异杂交取决于杂交条件的严紧度。引物可以标记上例如发光的、放射性的或者荧光部分，作为可检测部分。术语“载体”用在本文中是指编码外源核酸的任何质粒或病毒。该术语还应当被理解为包括协助核酸转移到毒粒或细胞中的非质粒和非病毒的化合物，比如例如多聚赖氨酸化合物等。载体可以是适合作为将编码目标蛋白或其突变体的核酸递送到细胞的递送媒介的病毒载体，或者载体可以是适用于相同目的的非病毒载体。用于将DNA递送到细胞和组织的病毒和非病毒载体的实例是本领域已知的，在例如Ma et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,94 :12744-12746(1997))中有描述。病毒载体的实例包括，但不限于重组痘苗病毒、重组腺病毒、重组逆转录病毒、重组腺相关病毒、重组禽痘病毒、重组杆状病毒、重组乳头瘤病毒、重组慢病毒等(Cranage et al,EMB0 J.，5 :3057-3063 (1986) ；PCT 申请WO 94/17810和 PCT申请WO 94/23744) 0非病毒载体的实例包括，但不限于细菌、真菌、哺乳动物、昆虫、植物或酵母载体或者脂质体、DNA的多胺衍生物等。“探针”是不同长度的核酸序列，根据具体用途，优选有至少约10个核苷酸(nt)、 IOOnt或许多(例如，6000nt)。探针用于检测相同、相似或互补的核酸序列。更长的探针可以从天然或重组来源获得，是高度特异的，比较短的寡聚探针杂交慢得多。探针可以是单链或双链的，其设计保证它在PCR、基于膜的杂交技术或类似ELISA技术中具有特异性。探针也可以与生物样品中的核酸分子杂交，由此能够直接使用在染色体作图、连锁分析、组织鉴定和/或分类以及多种法医学方法和本发明的诊断方法中。“同源物”是来源于不同物种的特定基因的核酸序列或氨基酸序列。“核酸序列同一性百分比(％)”定义为将序列对位排列并根据需要引入缺口以达到最大序列同一性百分比后，候选序列中与特定蛋白中相同的核苷酸的百分比。
ORF是带有起始密码子(ATG或CTG)并以三个“终止”密码子(TAA、TAG或TGA)之一结束的核苷酸序列。术语“抗体”取其最广泛的含义，特别涵盖单克隆抗体、具有多表位特异性的抗体组合物、双特异性抗体、二体和单链分子，以及抗体片段(例如Fab、F(ab')和Fv)，只要它们表现出所需的生物活性。该术语还涵盖编码上述抗体及其衍生物的DNA片段和cDNAs。术语“单克隆抗体”用于本文是指从基本同源的抗体群(即构成群体的各个抗体是相同的，除了少量存在的可能天然发生的突变)中获得的抗体。单克隆抗体是高特异性的，针对的是单个抗原位点。并且，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品不同，每个单克隆抗体针对的是抗原上的单个决定簇。除了其特异性，单克隆抗体的优势还在于它们是通过杂交瘤培养合成的，不会污染其他免疫球蛋白。修饰词“单克隆”表明抗体是由基本同源的抗体群中获得的特点，不应理解为必须通过任何特定方法来制备。例如，适合用于本发明的单克隆抗体可以通过K0hleretal，Nature，256 495(1975)首先描述的杂交瘤方法来制备，或者通过重组DNA方法(参见例如，美国专利 4,816, 567 (Cabilly et al)制备。“单克隆”抗体还可以利用例如 Clackson et al,Nature, 352 :624-628(1991)和 Marks et al, J. MoI. Biol，222 :581-597 (1991)中描述的方法从噬菌体抗体文库中分离。文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，以及这些抗体的片段， 只要它们表现出需要的生物活性。所述嵌合抗体中，重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种的抗体或者属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或者同源，而链的其他部分与来自另一物种的抗体或者属于另一抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或者同源，(Cabilly et al, Proc. Natl. Acad. Sci.USA,81 :3273-3277(1984) ； Cabilly et al，Gene,40 :157-161(1985) ；Cabilly et al，Gene，85 :553-557(1989) ；Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984))。本发明的抗体还可以包含多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。可以在哺乳动物中培育多克隆抗体，例如通过将免疫剂，如果需要的话，和佐剂一起给予各种宿主动物来诱发产生含有抗原特异的多克隆抗体的血清，其中所述宿主动物包括，但不限于兔、小鼠、大鼠等。通常，免疫剂和/或佐剂可以通过多次皮下或腹腔内注射给予哺乳动物。免疫剂可以包括前-原-GDNF多肽，多肽的合适的部分或融合蛋白。给蛋白质偶联上已知在被免疫动物中是免疫原性的试剂可能有用。这类免疫原性蛋白的实例包括， 但不限于匙孔嘁血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以采用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂A-合成海藻糖二霉菌酸酯)。 本领域技术人员可以无需过多试验而选择出免疫接种方案。然后给哺乳动物取血，分析血清的前-原-GDNF抗体滴度。如果需要，可以给予哺乳动物强化剂直至抗体滴度提高。非人(例如小鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链(比如Fv、Fab、Fab'、F(ab')或抗体的其他抗原结合亚序列)或其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的片段。很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自诸如小鼠、大鼠或兔的非人物种的CDR的残基(供体抗体)所代替，后者具有所需的特异性、亲和力和结合容量。在某些情况中，人免疫球蛋白 Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含受体抗体或者导
17入的CDR或框架序列中都没有的残基。进行这些修饰是为了进一步改进和优化抗体性能。 通常，人源化抗体包含基本上全部至少1个，一般是两个可变结构域，其中全部或基本全部 CDR区与非人免疫球蛋白的CDR区对应，全部或基本全部FR区是人免疫球蛋白序列。最优地，人源化抗体还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，一般是人免疫球蛋白的恒定区。更详细内容参见 Jones et al, Nature, 321 :522-525 (1986)、Reichmann et al，Nature，332 323-329(1988)和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol, 2 :593-596 (1992)。人源化抗体包括灵长类化的抗体，其中所述抗体的抗原结合区来源于通过用目的抗原免疫猕猴产生的抗体。聚合酶链式反应(PCR)是不使用活生物体的酶法DNA复制技术。这项技术利用温度介导的酶-DNA聚合酶允许小量DNA被指数性地扩增。逆转录-PCR(RT-PCR)是用于扩增一段确定的核糖核酸(RNA)分子的技术。RNA链首先被逆转录为它的互补DNA(cDNA)，然后利用PCR进行扩增。DNA测序是确定给定DNA片段(称为序列)中核苷酸顺序的过程。表达载体是用于向靶细胞中弓丨入并表达特定DNA序列的环形DNA分子。表达质粒的构建是将例如含有所需基因的ORF的特定DNA片段克隆到表达载体的过程。转染是将外来DNA导入细胞。转染包括在细胞上瞬时打开小孔，允许表达质粒进入。表达质粒一旦进入了细胞，该DNA序列编码的蛋白即通过细胞转录和翻译机制产生。质粒DNA没有整合到细胞基因组中，而只是瞬时表达了。细胞培养是细胞系或从组织中分离的原代细胞在受控条件下生长的过程。细胞在合适的温度和混合气体中，生长和维持在细胞培养器里的培养基中。Western印迹分析是检测给定样品中的蛋白的方法。该方法利用凝胶电泳将变性蛋白按照质量分开。分离后，将蛋白转移到膜上，利用能够识别蛋白的抗体在膜上进行检测。酶联免疫吸收法(ELISA)分析是一种利用两种抗体检测样品中存在的抗体或抗原的技术。一种抗体是抗原特异性的，另一种与抗原-抗体复合体反应，并偶联了酶。该二抗可以导致发光的、放射性或荧光底物产生信号。在免疫荧光分析中，利用一抗来检测特定蛋白表位。该一抗的检测通过标记了酶、 放射标记或荧光团的二抗来实现。利用荧光或共聚焦显微镜来分析免疫荧光标记的细胞和组织样品。本发明基于新发现的⑶NF基因的新剪接变体-pre-(Y)pr0-GDNF。本文描述的实施例显示，pre- ( y ) pro-GDNF mRNA在人脑中表达(图4)，该剪接变体所编码的蛋白的分泌受到严格的生物和生理调控，表明(Y )pro-GDNF蛋白是比(α )pro-GDNF有效地多的治疗帕金森氏症、ALS、成瘾症、酗酒、局部缺血、癫痫和抑郁症的治疗分子。此外，还在肺和子宫中研究了 pre-( γ )pro-GDNF mRNA的表达(数据未显示)。治疗pre- ( β ) pro-GDNF和pre- ( γ ) pro-GDNF具有体内基因治疗用途，可用于给予哺乳动物，尤其是人来治疗与GDNF活性有关的或者可以得益于GDNF-反应性的疾病或病症。 特别优选的是神经系统疾病，优选中枢神经系统疾病、帕金森氏症、阿尔茨海默氏病、ALS、 脊髓损伤、成瘾症和酗酒。发明特别考虑了通过基因操纵来调控蛋白表达或活性。可以使用任何合适的载体将目的转基因导入动物。文献中曾描述过的示范性的载体包括复制缺陷的逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体(Kim et al, J.Virol, 72 :811-816(1998) ；Kingsman & Johnson，Scrip Magazine, October, 1998, pp. 43-46.)、腺病毒(参见例如，美国专利5，824，544、美国专利5，707，618、美国专利5，792，453、美国专利5，693，509、美国专利 5，670，488、美国专禾Ij 5，585，362、Quantin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 2581-2584(1992) > Stratford-Perricadet et al, J.Clin. Invest. , 90 :626-630(1992) 和Rosenfeld et al, Cell，68 :143-155 (1992))、逆转录病毒(参见例如，美国专利 5，888，502、美国专禾Ij 5，830，725、美国专利5，770，414、美国专利5，686，278、美国专利 4，861，719)、腺相关病毒(参见例如，美国专利5，474，935、美国专利5，139，941、美国专利5，622，856、美国专利5,658, 776、美国专利5，773，289、美国专利5，789，390、美国专利 5，834，441、美国专利 5，863，541、美国专利 5，851，521、美国专利 5，252，479、Gnatenko et al, J. Investig. Med. ,45 :87_98 (1997)、腺病毒-腺相关病毒杂交体(参见例如美国专利5，856，15 或者痘苗病毒或疱疹病毒(参见例如，美国专利5，879，934、美国专利5，849，571、美国专利5,830, 727、美国专利5，661，033、美国专利5，328，688)、阳离子脂质体介导的基因转移(BRL)、脂质体载体(参见例如，美国专利5，631，237 (Liposomes comprising Sendai virus proteins)]，以及其基因表达可以体内调控的病毒载体，和以上各种的组合。以上提到的全部文献通过引用全文并入本文。复制缺陷型腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒构成本发明的优选实施方案。半透性的、可植入的膜装置在某些情形中可以作为递送药物的手段。例如，可以将分泌可溶性(i3)pro-GDNF或(Y )pro_GDNF或嵌合体的细胞包埋起来，然后这类装置可以植入患者。例如，植入患有帕金森氏症的患者的脑。参见Aebischer等的美国专利 4，892，538、Aebischer 等的美国专利 5，011，472、Aebischer 等的美国专利 5，106，627、 PCT 申请 WO 91/10425、PCT 申请 WO 91/10470、Winn et al, Exper. Neurology, 113 322-329(1991)、Aebischer et al, Exper. Neurology, 111 :269-275(1991)禾口 Tresco et al, ASAI0，38 :17-23(1992)。相应地，还包括预防或治疗神经损伤或其他(β )pro_GDNF或(γ )pro_GDNF反应性细胞损伤的方法，所述方法包括将分泌(i3)pro-GDNF或(Y)pro-GDNF的细胞植入有需要的患者的体内。最后，本发明包括通过植入患者来预防或治疗神经损伤或其他细胞损伤的装置，所述装置包含半透性膜，和包埋在所述膜内分泌(β )pro-GDNF或(Y)pro-GDNF的细胞，其中所述膜对(i3)pro-GDNF或(Y)pro-GDNF是通透性的，而患者中对细胞有害的因子不能透过。患者自己的被离体转化为产生(0) 1~0-60顺或(^) 1~0-60顺的细胞可以直接植入患者，任选不进行包埋。用于活细胞膜包埋的方法是本领域技术人员所熟悉的，制备包埋细胞及其向患者的植入无需过度试验即可实现。因此，本发明包括通过将细胞植入有需要的患者体内来预防或治疗神经损伤的方法；天然能够产生或者经工程化能够分泌(i3)pro-GDNF或(Y)pro-GDNF的细胞。优选地， 当患者为人时，分泌的(β ) pro-GDNF或(γ ) pro-GDNF是可溶性的人(β ) pro-GDNF或(γ ) pro-GDNF。优选植入物是非免疫原性的和/或防止免疫原性的植入细胞被免疫系统识别。 用于CNS递送，优选的植入部位是纹状体。在采用病毒载体的实施方案中，优选的多核苷酸包含合适的启动子和多腺苷酸化序列以便促进在目标组织中的表达。对于本发明，适用于哺乳动物细胞表达的启动子 /增强子包括，例如巨细胞病毒启动子/增强子(Lehner et al. , J. Clin. Microbiol, 29 2494-2502(1991) ；Boshart et al.，Cell，41 :521-530 (1985) )、Rous 肉瘤病毒启动子 (Davis et al. ,Hum. Gene Ther.，4 :151 (199 )、猴病毒40启动子、逆转录病毒的长末端重复(LTR)、角蛋白14启动子和α肌球蛋白重链启动子。在基因治疗应用中，基因被导入细胞以便实现体内合成有疗效的基因产物，用于例如取代缺陷基因。“基因治疗”包括常规的基因治疗，这种情况通过一次治疗达到持久的效果)；和给予基因治疗剂，这种情况包括一次或者反复给予治疗有效的DNA或mRNA。反义RNAs和DNAs可以用作治疗剂来阻断某些基因的体内表达。研究显示，虽然由于细胞膜限制了它们的摄取造成其在胞内浓度低，短的反义寡核苷酸可以被输入细胞作为抑制剂 (Zamecnik et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 :4143-4146 (1986)) 可以通过例如用不带电荷的基团取代带负电荷的磷酸二酯基使寡核苷酸改变以提高它们的摄入。有许多技术可以将核酸导入活细胞。这些技术根据核酸是被体外、离体还是体内转移到目标宿主的细胞中而不同。适合将核酸转移到体内哺乳动物细胞的技术包括利用脂质体(Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721 :185-190(1982)； Fraley, et al, Proc.Natl. Acad. Sci. USA,76 :3348-3352 (1979) ；Feigner, Sci.Am, 276(6) :102-106(1997) ；Feigner, Hum. Gene Ther. ,7(15) :1791-1793, (1996))、电穿孑L (Tur-Kaspa, et al, MoI. Cell Biol,6 :716-718(1986) ；Potter, et al, Proc. Nat. Acad. ki. USA，81 :7161-7165(1984))、直接显微注射(Harland and ffeintraub, J. Cell Biol.，101 :1094-1099(1985))、细胞融合、DEAE-右旋糖(Gopal，MoI. Cell Biol.，5 :1188-1190(198 )、磷酸钙沉淀法(Graham and Van Der Eb, Virology, 52 456-467(1973) ；Chen and Okayama, MoI. Cell Biol,7 :2745-2752,(1987) ；Rippe，et al, MoI. Cell Biol. , 10 :689-695 (1990)、细胞超声波处理(Fechheimer，et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，84 :8463-8467(1987))、利用高速微粒子射击的基因轰击(Yang, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :9568-9572 (1990)。目前优选的体内基因转移技术包括用病毒(一般是逆转录病毒)载体进行的转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau et al, Trends in Biotechnology，11 :205-210 (1993))。某些情况中，给核酸源提供靶向到目标细胞的试剂是可取的，比如靶细胞细胞表面上的膜蛋白的特异抗体、靶细胞上的受体的配体。采用脂质体的情况中，可以利用蛋白质进行导靶和/或协助摄取，所述蛋白质能够结合细胞表面上与胞吞相关的膜蛋白，这类蛋白包括例如对特定细胞类型嗜性的衣壳蛋白或其片段、内化参与循环的蛋白的抗体以及能够靶向到胞内位置并提高胞内半寿期的蛋白。 受体介导的胞吞技术在例如 Wu et al, J. Biol. Chem.，262 :4429-4432(1987)和 Wagner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87 :3410-3414(1990)中有描述。有关目前已知的基因标记和基因治疗试验方案的综述见Anderson et al，Science，256 :808-813 (1992)。在本发明的一个具体实施方案中，可以将表达构建体包埋在脂质体中。脂质体是囊状结构，其特征在于磷脂双层膜和内部的水性基质。多室脂质体具有通过水性基质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中可以自动形成所述脂质体。脂类成分在形成闭合的结构前进行自身重组，将水和溶解的溶质包裹在脂双层之间((^hosh and Bachhawat, “ In Liver Diseases，Targeted Diagnosis And Therapy UsingSpecific Receptors And Ligands, “ Wu, G. , Wu, C, ed. , New York :Marcel Dekker, PP. 87-104(1991))。向阳离子脂质体中加入DNA导致脂质体拓扑转换为光学双折射液晶凝聚球(Radler，et al, Science，275 :810-814 (1997))。这些 DNA-脂质复合体是可能用于基因治疗和递送的非病毒载体。本发明还考虑了涉及“脂转染”技术的多种商业方法。发明的某些实施方案中，脂质体可以与血凝病毒(HVJ)复合。已有研究显示这有助与细胞膜的融合，促进脂质体包埋的DNA进入细胞(Kaneda, et al.，Science，243 :375-378 (1989))。在其他实施方案中，脂质体可以与非组蛋白性染色体蛋白质复合或者与它一起使用(HMG-I) (Kato,et al. ,J.Biol. Chem.，266 :3361-3364 (1991))。再一些实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG-I两者复合或一起使用。因为这类表达构建体已被成功地用于核酸的体外和体内转移和表达，它们可以用在本发明中。可以用于将编码治疗基因的核酸递送到细胞的其他载体递送系统包括受体介导的递送媒介。这类媒介利用了几乎所有真核细胞中都存在的受体介导的胞吞对大分子的选择性摄取。因为各种受体的细胞类型特异性分布，递送可以是高度特异的(Wu and ffu,Adv. Drug Del. Rev.，12 :159-167(1993))。在发明的另一个实施方案中，表达构建体可以仅由裸露的重组DNA或质粒构成。 这类构建体的转移可以通过以上提到的任何可以物理地或化学地透过细胞膜的方法来实现。这特别适用于体外转移，但也可以应用在体内使用。Dubensky等(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81 :7529-7533(1984))成功地将多瘤病毒DNA以CaPO4沉淀物的形式注射到成年和新生小鼠的肝和脾内，表现出活跃的病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83 :9551-9555(1986))也展示直接腹膜内注射CaPO4沉淀的质粒造成了转染基因的表达。本发明另一个向细胞转移裸露DNA表达构建体的实施方案可以包括粒子轰击。这种方法依赖的是将包被DNA的微粒加快到高速，使它们能够在不杀伤细胞的情况下穿透细胞膜并进入细胞(Klein，et ah, Nature, 327 :70-73(1987))的能力。已开发出给小粒子加速的几种装置。一种这类装置依赖高压放电产生电流，然后电流提供原动力(Yang，et ah, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87 :9568-9572 (1990))。使用的微粒由生物惰性物质，比如钨或金珠构成。本领域技术人员明白如何将基因递送应用于体内(in vivo)和离体(exvivo)情形。对于病毒载体，通常要制备病毒载体储液。根据病毒类型和可达到的滴度，可以给患者递送 IxlO4, IxlO5, IxlO6, IxlO7, IxlO8、IxlO9, IxlO10, IxlO11 或 IxlO12 个感染性颗粒。通过比较相对的摄取效率，类似的数量可以推及脂质体或其他非病毒制剂。药物可接受组合物类的制剂在下文讨论。给各种细胞类型考虑了多种途径。对于几乎任何细胞、组织或器官类型，考虑了系统递送。其他实施方案中，可以采取各种直接的、局部和区域性的措施。例如，可以给细胞、 组织或器官直接注射表达载体或蛋白。在不同的实施方案中，还考虑了离体基因治疗。在离体实施方案中，取出患者的细胞，保持在体外至少一段时间。在这个时间内，递送治疗剂，之后将细胞重新导入患者。将基因转移到体内靶细胞的策略包括以下基本步骤(1)选择其表达与CNS疾病或功能障碍相关的合适的转基因；( 挑选和建立适宜有效的基因转移载体；C3)证明靶细胞转导和转基因表达稳定有效地进行；(4)证明体内基因治疗程序没有引起严重的有害效应；以及( 证明宿主动物中出现希望的表型效应。虽然可以使用其他载体，用于发明所述方法的优选载体是病毒和非病毒载体。选定的载体应当满足以下标准1)载体必须能够感染靶细胞，因此必须挑选有合适宿主范围的病毒载体；幻被转移的基因应当能够在细胞中保留并表达较长的一段时间(而不引起细胞死亡)从而在细胞中稳定地存在并表达；以及幻载体应当对靶细胞，如果有的话，只有很小的损伤。因为成年哺乳动物脑细胞不能分裂，选择的重组表达载体必须能够转染不分裂的细胞并在其中表达。当前已知具有这一能力的载体包括诸如腺病毒、腺相关病毒(AAV)的 DNA病毒，和某些RNA病毒，比如基于HIV的慢病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)和马免疫缺陷病毒(EIV)。其他具有这一能力的载体包括单纯疱疹病毒(HSV)。但是，这些病毒中的一些 (例如AAV和HSV)会产生毒性和/或有免疫原性。最近，建立了一个基于HIV的慢病毒载体系统，与其他逆转录病毒一样，可以将转基因插入宿主细胞的核内(增加表达的稳定性)， 但是与其他逆转录病毒不同，该系统可以将基因插入不分裂细胞的核内。慢病毒载体曾被证实在直接注射后，能够稳定地感染脑细胞，并稳定地表达外来转基因而没有可检测到的来自病毒蛋白的致病性(参见，Naldini, et al.，Science, 272 J63167 (1996)，其公开内容通过引用并入本文)。遵照最先构建HIV-I逆转录病毒载体的研究人员的教导，本领域技术人员能够构建适用于发明所述方法的慢病毒载体(涉及逆转录病毒构建的更一般性的参考文献，参见例如 Kriegler, Gene Transfer and Expression, ALaboratory Manual, W. Freeman Co. (NY 1990)禾口 Murray, E J, ed. , Methods inMolecular Biology, Vol. 7, Humana Press(NJ 1991))。重组AAV载体的作用很有效，感染相对长期，一般没有毒性，除非载体中重组了有毒的转基因。AAV是助手依赖型的细小病毒，由一个围绕着简单、没有包被的二十面体蛋白外壳的4. 71Λ单链DNA基因组构成。成年人群中大约85%是AAV血清阳性的。但是，没有与AAV感染关联的病理学。AAV依靠腺病毒或疱疹病毒作为助手来建立建立有成效的感染。 在没有辅助病毒时，AAV基因组应对毒性攻击(UV辐射、羟基脲接触)时也会扩增。如果没有毒性攻击或者辅助病毒，野生型AAV将位点特异地整合到人的第19号染色体。整合由 AAV Rep蛋白驱动，该蛋白介导在染色体整合位点形成AAV-染色体复合体。大部分病毒基因组(96% )将被去除，仅留下两个145碱基对(bp)的反向末端重复(ITRs)用于病毒基因组的包装和整合。本领域已建立了有效繁殖重组AAV、rAAV的技术利用迷你腺病毒基因组质粒、在一个质粒中编码AAV包装功能和腺病毒辅助功能的质粒。而且，用于分离高度纯化 WrAAV以及滴定rAAV储液的方法比较直接和迅速。为了跟踪rAAV介导的转基因表达，经常在rAAV中以双顺反子使用绿色荧光蛋白(GFP)，该蛋白是已被很好地研究过的238个氨基酸的荧光蛋白。借助不同启动子选择性和特异性地表达rAAV介导的基因转移也已鉴定。 我们使用可以购买到的AAV Helper-free system(Stratagene)来构建我们的重组AAVs。 利用常规重组DNA技术，可以将β )pro-GDNF和pre-( γ )pro_GDNF克隆到AAV系统载体/质粒中。表达pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 的病毒载体
用于本发明重组表达神经系统生长因子的载体的构建可以利用常规技术实现， 这些技术不需要对本领域技术人员详细说明。文中列出了构建AAV 载体的具体方面。 更详细的参考，普通技术人员可能希望查阅Maniatis et al.，in Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982)。简单来说，重组表达载体的构建采用标准的连接技术。为了分析证实构建载体中的序列正确，可以用连接混合物转化宿主细胞并在合适的情况中，通过抗生素抗性选择成功的转化子。制备来自转化子的载体，通过限制酶切进行分析和/或通过例如Messing等的方法(Nucleic Acids Res.，9 :309 (1981))、Maxam 等的方法(Methods in Enzymology， 65:499(1980))或者本领域技术人员知道的其他合适方法测序。利用例如Maniatis等 (Molecular Cloning, pp. 133-134 (1982))描述的常规的凝胶电泳将切割过的片段按照大小分离。在转录、翻译或翻译后水平调控cDNA(pre_( β )pro_GDNF和pre_( γ ) pro-GDNF-ATG)的表达。转录起始是基因表达中的早期关键步骤。其取决于启动子和增强子序列，受到与这些序列相互作用的特异细胞因子的影响。许多原核基因的转录单位由启动子，在许多情况中还有增强子或调控元件组成(Banerji et al. , Cell 27 =299(1981)； Corden et al. , Science,209 1406 (1980)； 禾口 Breathnach and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50 :349(1981))。对于逆转录病毒，参与逆转录病毒基因组复制的调控元件位于长末端重复中(LTR) (Weiss et al, eds. , The molecular biology of tumor viruses RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982))。貞^“/S氏鼠白病毒(Moloney murine leukemia virus) (MLV)和 Rous 肉瘤病毒(RSV) LTRs 含有启动子和 ±曾强子序列(Jolly et al.，Nucleic Acids Res. , 11 :1855(1983) ；Capecchi et al.，In Enhancer and eukaryotic gene expression,Gulzman and Shenk, eds. , pp.101-02,Cold Spring Harbor Laboratories (NY 1991))。其他强启动子包括来源于巨细胞病毒(CMV)的启动子和其他野生型病毒启动子。美国专利5，720，720,6, 027，931,6, 071，889 中，以及 WO 99/61066 中可以找到制备和使用rAAV的方法以及将rAAV体内递送给各种细胞的方法，上述文献均通过引用并入本文。存在不同血清型的AAV，它们表现出组织嗜性。因此，正确使用血清型取决于要被转导的组织。关于利用腺相关病毒(AAV)和选定启动子在神经系统中进行成功的、定位、长期和无毒的转基因表达的方法，可以参考Klein et ah, Experimental Neurology, 150 183-194(1998), “ Neuron-Specific Transduction in the Rat Septohippocampal or Nigrostriatal Pathway by Recombinant Adeno-associated Virus Vectors"。关于利用重组AAV，通过稳定表达神经营养因子NGF、⑶NF、BDNF进行基因治疗的方法，以及产生的可神经化学定量的治疗效果，可以参考Klein et al. ,Neuroscience,90 815-821(1999), “ Long-term Actions of Vector-deri ved Nerve Growth Factor or Brain-derived Neurotrophic Factor on Choline Acetyltransferase and Trk Receptor Levels in the Adult Rat Basal Forebrain〃 。另一个重要的参数是要递送到靶组织中的pre- ( β ) pro-GDNF和pre- ( γ ) pro-GDNF的剂量。对于病毒载体，可以以每ml神经营养组合物中病毒克隆的数量来界定pre- ( β ) pro-GDNF和pre- ( γ ) pro-GDNF的浓度。最佳情况，要利用病毒表达载体递送 pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF，每单位剂量的 pre- ( γ ) pro-⑶NF 应当包含 2· 5 到25 μ 1 pre-(Y)pro-GDNF组合物，其中所述组合物包括存在于药物可接受液体中的病毒表达载体，每ml pre-(0)pro_GDNF或pre-(Y)pro-GDNF组合物中提供101°到IO15的 pre-( β )pro-GDNF或pre-( γ )pro-GDNF表达病毒粒子。这样高的滴度对AAV尤其有用。 对慢病毒来说，滴度通常更低，每mllO8到101°转导单位(TU/ml)。实验实施例1通过RT-PCR克隆⑶NF剪接变体cDNAs和分析⑶NF剪接变体niRNA的表达我们通过RT-PCR从小鼠肾和脑细胞(利用第一对引物42和43，以及巢式引物46 和47)以及人肾、子宫和脑细胞(利用第一对引物53和49，以及巢式引物48和54)中克隆了 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF cDNAs (图 3 和 4)。用 RNA 提取试剂盒(Ambion)分离小鼠总RNA，人RNA购自Clontech。将来自不同组织的总RNA (5 μ g) 作为模板，以寡聚(dT) (Promega)为引物，用逆转录酶(Superscript11，hvitrogen)合成第一链 cDNAs。用于克隆小鼠pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF 以及人 pre- ( α ) pro-GDNF, pre- ( β ) pro-GDNF 和 pre- ( γ ) pro-GDNF 的引物是小鼠Gdnf基因5，方向的第一引物(引物42)5-GCTCCTGCCCGAGGTC-3 ‘ (SEQ ID NO 7)小鼠Gdnf基因3’方向的第一引物(引物43)5-CCTTTCTTCGC ACTGT AGC AG-3' (SEQ ID NO 8)小鼠Gdnf基因5，方向的巢式引物(引物46)5-GTCCGGATGGGTCTCCTGG-3‘ (SEQ ID NO 9)小鼠Gdnf基因3’方向的巢式引物(引物47)5-CACAGCAGTCTCTGGAGCCG-3‘ (SEQ ID N0:10)人Gdnf基因5’方向的第一引物(引物53)5-GACCTGTTGGGCGGGGCTC-3‘ (SEQ ID NO 11)人Gdnf基因3，方向的第一引物T(引物49)5-CCTGGGAACCTTGGTCCCTTTC-3‘ (SEQ ID N0:12)人Gdnf基因5’方向的巢式引物(弓丨物48)5' -GCTCCAGCCATCAGCCCGG-S‘ (SEQ ID NO 13)人Gdnf基因3，方向的巢式引物(弓丨物54)5' -CACAGCAGTCTCTGGAGCCGG-S‘ (SEQ ID NO 14)PCR反应在50 μ 1或25 μ 1体积中进行，其中含有2/5或1/5RT反应作为模板和 3. 75或1. 86单位的酶混合液，混合液中分别含有热稳定的Taq DNA聚合酶和Tgo DNA聚合酶(Roche)，以及按照制造商的说明 Expand LongDistance Template PCR System 试剂盒 (Roche)。第一 PCR反应后进行巢式PCR反应，其中使用1-2 μ 1的第一 PCR反应作为模板。 在第一和巢式PCR反应中，采用以下条件扩增DNA :94°C (2分钟)；94°C (10秒)、62°C (30 秒)、68°C (1 分钟)，10 个循环；94°C (15 秒)、62°C (30 秒)、68°C (1 分 20 秒)，25 个循环；
2468 0C (7分钟)、4°C (5分钟)，1个循环。扩增的RT-PCR产物在2%琼脂糖凝胶上分离，然后直接将PCR片段测序，或者将片段克隆到pCR2. 1载体(Invitrogen)中，然后通过测序确认。DNA片段的测序用Dye Terminator (v3. 1)试剂盒(Applied Biosystems)按照制造商的建议在ABI 3100Capillary测序仪上进行。用于凝胶提取的人PCR片段测序的引物是⑶NF基因5’方向 5' -GCTCCAGCCATCAGCCCGG-3 ‘ (SEQ ID NO 15)禾口 GDNF 基因 3'方向 5' -CACAGCAGTCTCTGGAGCCGG-3‘ (SEQ ID NO :16)。用于小鼠PCR片段测序的引物是GDNF 基因 5，方向(SEQ ID NO 9)和 GDNF 基因 3，方向 5，-CACAGCAGTCTCTGGAGCCG-3 ‘ (SEQ ID NO 10)。为了分析各自mRNAs的表达，用限制酶xhol和HindIII从pCR2. 1载体中切割小鼠和人 pre-(a)pro-⑶NF、pre-(0)pro-⑶NF 和 pre-(Y)pro-⑶NF，连接到用相同限制酶切割好的PEGFP-Nl表达载体中。用于给插入的PCR片段测序的引物是 5，方向 5 ‘ -CAACGGGACTTTCCAAAATG-3 ‘ (SEQ IDNO :37)和 3 ‘方向 3，-GGACACGCTGAACTTGTGG-5，(SEQ ID NO :38)。为了进行进一步的表达分析，将人pre_(a )pro-GDNF和pre-( β )pro-GDNF克隆到 pAAV-MCS 和 pAAV-IRE S-hrGFP 表达载体(Stratagene)中，得到 pAAV-MCS-pre-( α ) pro-GDNF、pAAV-MCS-pre-( β )pro_GDNF、pAAV-IRES-hrGFP-pre-( α )pro_GDNF 禾口 pAAV-IRES-hrGFP-pre- ( β ) pro-GDNF构建体。克隆使用的引物有5'方向的引物(89)5' -CAACAAGGATCCATGAAGTTATGGGATGTCGTGG-3' (SEQ IDNO 39)3'方向的引物(90)3，-CCACCACTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-5，(SEQ IDNO 40)为了表达分析的进行，将人pre- ( y ) pro-GDNF的翻译起始密码子CTG替换为常规的ATG翻译起始密码子，cDNA克隆到pAAV-MCS表达载体(Stratagene)中产生 pAAV-MCS-pre- ( y ) pro-GDNF-ATG构建体。克隆使用的引物有5'方向的引物(91)5' -CAACAAGGATCCATGGGACTTGGGGCACCTGGAGTTAATG-S' (SEQ ID NO 17)3'方向的引物(92)5' -CCACCACTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAGCGG-S' (SEQID NO 18)引物 89 和 90，或者 91 和 92 与 Dynazyme DNA 聚合酶(Finnzymes)和 Dynazyme IOx缓冲液用于PCR。PCR反应总体积是50μ 1，其中含有40ng在pEGFP-Nl载体中的人 pre- ( α ) pro-GDNF或pre- ( β ) pro-GDNF作为模板。采用以下条件扩增DNA :95°C (5分钟)； 950C (45 秒),560C (45 秒),72°C (1 分钟)，25 个循环；72°C (7 分钟)、4°C (7 分钟)，1 个循环。扩增的PCR产物用限制酶BamRl和Biol切割，连接到经相同限制酶切割的pAAV-MCS 载体(Stratagene)中，然后通过测序确认。用于给插入的PCR片段测序的引物5’方向是5-ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3‘ (SEQ ID NO :41)，3，方向是 3，-TA-GAAGGACACCTAGTCAGA-5‘ (SEQ ID NO 42).实施例2细胞培养
CHO、HEK-293, PC-6. 3 和 AtT-20 细胞系生长在含有抗生素，与 10% FCS (Gibco) (对于 CHO 和 HEK-293 细胞),10% HS(Gibco)和 5% FCS(PC-6. 3 细胞),10% FCS,4. 5g/ 1葡萄糖和1.5g/l碳酸钠(AtT-20细胞)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中。 BHK-21细胞系生长在含有抗生素、7. 5% FCS、0. 04%胰蛋白胨磷酸盐培养液(Difco)和
谷氨酸盐(Gibco)的基础培养基(MEM)中。用含有小鼠pre-(a)pro-GDNF、pre_(i3) pro-GDNF 或 pre-(Y)pro-GDNF,或者人 pre-( a )pro_GDNF、pre-( β )pro_GDNF 或 pre_( γ ) pro-GDNF cDNA 的 pEGFP-Nl (Invitrogen)表达载体转染细胞。替代地,采用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)转染方案，用含有人 pre- ( α ) pro-GDNF, pre- ( β ) pro-GDNF 或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG cDNA 的 pAAV-MCS 或 pAAV-IRES-hrGFP 载体转染细胞。在 Western 印迹分析中，将被转染细胞在OptiMEM(Sigma)培养基中生长48小时，然后收集培养基，从细胞中制备蛋白提取物。用 Amicon Ultra_4Centrifugal Filter Units (Millipore)将分泌蛋白(培养基)浓缩，或者利用小鼠抗GDNF抗体免疫沉淀GDNF。蛋白提取物在15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，用D20抗体(Santa Cruz)通过flfestern印迹分析。在免疫荧光分析中，被转染细胞在正常的生长培养基中生长M小时，然后进行固定和通透化。用一抗和二抗将细胞染色，通过显微镜(AX70ft~OViS ；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70 ； Olympus)获取图像。结果结果显示人和小鼠(α ) pro-GDNF和(β )pro_GDNF以及它们的成熟⑶NFs从CHO 细胞系中分泌出来(图5和6)。此外，它们还被HEK493、PC-6. 3和AtT-20细胞系分泌。小鼠(y) pro-GDNF及其成熟GDNF可以从BHK-21 (图7)、CH0和PC-6. 3细胞系分泌，Λ (υ) pro-GDNF-ATG (其中CTG翻译起始密码子被ATG代替)及其成熟⑶NF从BHK-21和C0S-7 细胞系分泌(图8)实施例3人pre-( α ) pro-GDNF和pre-( β ) pro-GDNF从分化的PC_6. 3细胞和海马原代细胞中的分泌PC-6. 3细胞的分化和刺激转染后，PC-6.3细胞生长在含有达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、5% HS(Gibco)、2. 5% FCS和50ng/ml NGF的分化培养基中。72小时后，移走培养基，换成含有或不含有50mM KCl的无血清DMEM。转染中使用的表达构建体是pEGFP中的人和小鼠pre- ( α ) pro-GDNF和pre- ( β ) pro-GDNF。ELISA分析中，含有不带终止密码子的大鼠前 _ 原-BDNF (Volkmar Lessman 博士惠赠，University of ohannes-Gutenberg, Mainz, Germany)的pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)作为活性依赖性分泌的阳性对照(Haubensak et al.，J. Cell ScL，111 1483-93 (1998))。这个构建体与其他使用的构建体克隆过程类似。在Western印迹分析中，5小时后收集培养基(上清)，用Amicon Ultra-4Centrifugal Filter Units (Millipore)浓缩。蛋白提取物在 15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，用识别⑶NF的D20抗体(Santa Cruz)通过^festern印迹分析。在ELISA 分析中，2小时后收集培养基，用⑶NF Emax ImmunoAssay System(Promega)或者BDNF Emax ImmunoAssay System (Promega)分转染分化PC-6. 3细胞的免疫荧光分析
通过将带有终止密码子的cDNA克隆到pEGFP-Nl表达载体(Invitrogen)中产生含有人pre-(a)pro-GDNF或pre-(0)pro-GDNF的表达构建体。转染前，PC-6. 3细胞在含有达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、5% HS(Gibco)、2. 5% FCS和50ng/ml NGF 的分化培养基中分化3天。转染使用的表达构建体是pEGFP中的人和小鼠pre-(a) pro-GDNF和pre-( β ) pro-GDNF。转染后24小时，细胞用4% PFA固定，或者先用50mM KCl和SOyg/ml环己亚胺(中止蛋白合成)刺激2小时，然后用4% PFA固定。用0.5% BSA(Sigma)封闭所有细胞，并用0. 1% Triton X-IOO(Sigma)使通透性增加。细胞与一抗， 即多克隆抗-GDNF(Gene Way Biotech Inc. ；1 :750dilution)和成熟高尔基体的单克隆抗 GMl 30 (Abeam5I =IOOdilution)在0.5% BSA中，室温下温育1小时，清洗，然后用二抗，即偶联 Cy2 的驴抗小鼠 IgGCJackson ImmunoResearch laboratories)和偶联 Cy3 的驴抗兔 IgG (Jackson ImmunoResearch laboratories)重复上述过禾呈。最后用 Immu_mount (Thermo electron corporation)盖上盖片。通过显微镜(AX70ftx)vis ;01ympus)上的电荷耦合照相机(DP70 ；Olympus)获取图像。悔马酣懒、M胞』浦糖射·为了制备海马神经元，将来自El 8大鼠的海马解剖。用溶于HBSS的0.25%胰蛋白酶在37°C将组织消化10-15分钟。加入DNaseI (lmg/ml)，用硅化玻璃移液管磨碎样品。细胞用含有IOmM葡萄糖(Sigma)的HBBS洗三次。在悬浮液中，利用Rat Neuron Nucleofector Kit(Amaxa biosys-tems)，按照制造商的建议用含有人或小鼠pre_(a ) pro-⑶ NF 或 pre- ( β ) pro-⑶ NFcDNA 的 pEGFP-Nl (Invitrogen)表达载体转染细胞。将细胞铺在包被多聚D-赖氨酸氢溴酸盐(Sigma)的培养板上，培养物生长在补充了 L-谷氛酸盐(Gibco Invitrogen)禾口 Ix B—27 (Gibco Invitrogen)的 Neurobasal 培养基 (GibcoInvitrogen)中。经过4天培养后，移去培养基，换成含有或不含有50mM KCl的 Neurobasal 培养基(Gibco Invitrogen)。15-30 分钟后，收集培养基，通过GDNF Emax Immuno-Assay System (Promega)分析 GDNF 的浓度。MM免疫荧光分析的结果显示，在分化的PC-6. 3细胞中，刺激前后，pre-(a) pro-GDNF和pre- ( β ) pro-GDNF编码的蛋白的位置有明显不同。未刺激PC-6. 3细胞中， pre-(a)pro-GDNF编码的⑶NF更经常仅位于高尔基复合体上，而不是囊泡+/_高尔基体上(图9)。相反，大部分pre-( β )pro-GDNF编码的⑶NF位于囊泡+/-高尔基体上，小部分仅位于高尔基体。KCl刺激后，(i3)pro-GDNF及其成熟⑶NF形式比(a)pro-⑶NF及其成熟⑶NF形式更迅速地移动到囊泡腔内(图9)。Western印迹分析的结果显示pre_( a ) pro-GDNF cDNA编码的小鼠和人⑶NF均从分化的类神经元PC_6. 3细胞中组成性地分泌，而 (β )pro-GDNF cDNA编码的⑶NF的分泌是活性依赖性的(图10和11)。这一结果进一步通过ELISA分析进行了证实，分析中大鼠BDNF的分泌作为阳性对照(图12)。这些结果表明，(β ) pro-GDNF及其编码cDNA可能是比(a ) pro-GDNF及其cDNA更有潜力的基因疗法治疗PD的治疗分子。讨论通过重组慢病毒载体递送在完整黑质纹状体多巴胺系统中长期体内表达 pre-(a)pr0-GDNF导致多巴胺合成中的关键酶-酪氨酸羟化酶蛋白被选择性地下ijf (Georgievska, et al. , J. Neuro-sci. ,24 :6437-6445(2004) ；Sajadi, et al., J. Neurochem. ,93 :1482-1486 (2005))。并且，通过重组慢病毒载体递送，在6-羟基多巴胺损毁的帕金森氏症模型大鼠的纹状体中持续体内表达pre-(a)pro-GDNF诱导了保存的纹状体多巴胺终末中酪氨酸羟化酶的下调(Georgievska，et al.，Exp. Neurol, 177 461-474(2002))。这非常可能是由于某种补偿机制，该机制中多巴胺神经元在持续的⑶NF 刺激下能够通过降低酪氨酸羟化酶活性对增加的多巴胺合成和释放进行补偿。Perwphin 是神经营养因子中⑶NF家族的成员。试验非常清楚地显示，高浓度的pers印hin是神经毒性的(Tomac, et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 99 :9521-9526 (2002)) 最近在非人灵长类中进行的试验也表明，高浓度的GDNF诱发小脑毒性(Lang, et al, Ann. Neurol. ,59 459-466(2006))。因此，今后的治疗应当避免高浓度的⑶NF，并且优选在⑶NF水平可以生理地调节的系统中进行。我们的体外结果显示，pre-(i3)pro-GDNF编码的⑶NF的分泌受到生物刺激的调节，而pre-(a)pro-GDNF编码的⑶NF的分泌是组成性的。这使得(β) pro-GDNF及其编码cDNA是比(α )pro-GDNF及其cDNA潜力大得多的基因疗法治疗PD的治疗分子。实施例4病毒载体构建和病毒粒子制备为了构建病毒载体，按照制造商的说明使用了 AAV Helper-Free System (Stratagene)。利用合适的限制酶，将人 pre- ( α ) pro-GDNF, pre- ( β ) pro-GDNF 和 pre- ( γ ) pro-GDNF-ATG的编码序列插入pAAV-MCS的多克隆位点，或者替代的插入 pAAV-IRES-hrGFP 载体，分别得到载体 pAAV-MCS-pre- ( α ) pro-GDNF, pAAV-MCS-pre- ( β ) pro-⑶NF、pAAV-MCS-pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 或 pAAV-IRES-hrGFP-pre- ( α ) pro-GDNF, pAAV-IRES-hrGFP-pre- ( β ) pro-⑶NF、pAAV-IRES-hrGFP-pre- ( y ) pro-⑶NF-ATG。将以上提到的载体与pHelper和pAAV-RC载体一起共转染到AAV-293细胞中，导致产生表达 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 的重组 AAV 粒子。相应地，使用载体pAAV-IRES-hrGFP产生表达GFP的对照病毒粒子。按照AAV Helper Free System(Stratagene)的制造商使用说明制备并纯化重组病毒粒子。将分装的重组病毒保存在_80°C。利用Southern斑点印迹确定病毒粒子数量。实施例5在帕金森氏症神经保护性动物模型中进行的体内基因转移动物。重250480g的雄性Wistar大鼠(Harlan)分成每组3到4只的组，喂养在 22°C的室温，12:12小时的昼夜循环。自来水和鼠粮(Altromin 1324，Chr. Petersen A/S) 任取。病毒注射和6-0HDA损毁。所有立体定位注射参照I^axinos和Watson (The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic press, San Diego, 1997)的图谱，利用相对前囟和硬脑脊膜的坐标(A/P+1.0，L/M + 2.7，D/V-4)，在左纹状体进行。异氟醚麻醉 (诱导阶段是4. 5%，手术阶段2. 5% )下的立体定向手术基本按照以前的描述分两步进行 (Kearns et ah, J. Neurosci.，17 :7111-7118 (1997))。给动物注射携带 GFP 的 cDNA，或者 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 的 cDNA 的重组 AAV 载体 (η = 5-7/组)。rAAV注射后14天，将动物再次麻醉，利用相对前囟和硬脑脊膜的坐标(A/
28P+1. 0，L/M+2. 7，D/V-4)，向纹状体中注射一个剂量的20 μ g6-0HDA (Sigma ；按游离基计算， 溶解在补充了 0. 02%抗坏血酸的3或4μ 1冰冷盐水中)。注射速度是1 μ 1/分钟，注射器在拔出前在原位再保留3分钟。注射6-0HDA之前，给予地昔帕明(Desipramine) (Sigma ； 15mg/kg，i. p. , lml/kg)以防止6-0HDA摄入去甲肾上腺素能神经末端，从而保护这些神经末端不被破坏。行为测试。rAAV注射后第10天，和注射6-0HDA的四周后，给大鼠注射安非他明(amphetamineM2. 5mg/kg i. ρ·)，并监测大鼠于120分钟内在自动转盘(automated rotometer bowls, Colbourn Instruments, Inc. , Allentown, PA)上的转体反应(turning response)。旋转试验后，将脑灌流并收集进行免疫组织化学分析。酪氨酸羟化酶免疫组织化学分析。6-0HDA注射观天后，用戊巴比妥钠将动物深度麻醉，经心脏灌流PBS，然后灌流200ml冰冷的4%多聚甲醛(PFA)。将脑解剖，在相同的固定剂中固定3-4小时，转移到25%蔗糖中48小时。在冰冻切片机上切成40 μ m的连续切片。按照以前的描述进行酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组织化学(Kirik et al,Eur. J. Neu-rosci.， 13 :1589-1599(2001)) ο形态学分析SN细胞计数。利用光学分合法(West，et al, Anat. Rec, 231 482-497(1991))估计SNpc中TH阳性细胞的数量。按照以前的描述(Sauer，et al, Proc. Natl. Acad. Sci. ,92 :8935-8939 (1995)),用 Olympus BX51 显微镜上附带的 Mereo Investigator platform(MicroBrightField)分析 SNpc。简单来说，从每只动物中选择 3个切片进行定量分析，这些切片来自有内侧尾核(medial terminal nucleus) (MTN)的 SNpc 中部(Paxinos 禾口 Watson 图谱(paxinos, G. & Watson， C，1997， The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic press, San Diego)中的 A/P-5. 3mm)。在低倍(4x) 镜下大概地找出每个参考空间，用高倍(60x，油浸)物镜计数细胞。细胞数量表达为平均数量/切片。细胞计数利用光学分合法联合析象原则(dissector principle)和不偏计数规则。统计分析。利用单向ANOVA和之后的Tukey/Kramer' s事后(post-hoc)检测，分析神经保护研究中的所有同侧旋转数量和TH阳性细胞数量。实施例6帕金森氏症神经修复动物模型中的体内基因转移动物。重250480g的雄性 Wistar大鼠(Harlan)分成每组3到4只的组，喂养在室温22°C，12:12小时的昼夜循环。 自来水和鼠粮(Altromin 1324, Chr. Petersen A/S )任取。病毒注射和6-0HDA损毁。所有立体定位注射参照Paxinos和Watson (The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic press, San Diego, 1997)的图谱，利用相对前囟和硬脑脊膜的坐标(A/P+l. 0，L/M+2. 7，D/V-4)，在左纹状体进行。异氟醚麻醉(诱导阶段是4. 5%，手术阶段2. 5% )下的立体定向手术基本按照以前的描述分两步进行(Kearns et ah, J. Neurosci. ,17 :7111-7118 (1997))。利用相对前囟和硬脑脊膜的坐标(AfP+1. O, L/M+2. 7，D/V-4)，给每个动物向纹状体中注射一个剂量的20 μ g 6-0HDA (Sigma ；按游离基计算，溶解在补充了 0. 02%抗坏血酸的3μ 1冰冷盐水中)。注射速度是1 μ 1/分钟，注射器在拔出前在原位再保留3分钟。注射6-0HDA之前，给予地昔帕明(Desipramine) (Sigma ； 15mg/kg, i. p. , lml/kg)以防止6-0HDA摄入去甲肾上腺素能神经末端，从而保护这些神经
29末端不被破坏。6-0HDA注射后观天，将动物再次麻醉，给动物注射携带GFP的cDNA，或者 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 的 cDNA 的重组 AAV 载体 (η = 5-7/ 组)。注射 6-0HDA 21 天后，以及递送 rAAV-pre- ( α ) pro_GDNF、rAAV-pre- ( β ) pro-GDNF 或 rAAV-pre-( γ )pro-GDNF-ATG 后 1、2、4 和 8 周，给大鼠注射安非他明(2. 5mg/ kg i.p.)，并监测大鼠 120 分钟内在自动转盘(Colbourn Instruments, Inc.，Allentown, PA)上的转体反应。旋转试验后，将脑灌流并收集进行免疫组织化学分析。行为测试、酪氨酸羟化酶免疫组织化学分析、形态学分析和黑质细胞计数如下进行酪氨酸羟化酶免疫组织化学分析。AAV注射8周后，用戊巴比妥钠将动物深度麻醉，经心脏灌流PBS，然后灌流200ml冰冷的4% PFA。将脑解剖，在相同的固定剂中固定3-4 小时，转移到25%蔗糖sucrose中48小时。在冰冻切片机上切成40 μ m的连续切片。按照以前的描述进行酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组织化学分析(Kirik et al,Eur. J. Neu-rosci.， 13 :1589-1599(2001)) ο形态学分析SN细胞计数。利用光学分合法(West，et al, Anat. Rec, 231 482-497(1991))估计SNpc中TH阳性细胞的数量。按照以前的描述(Sauer，et al, Proc. Natl. Acad. Sci. ,92 :8935-8939 (1995)),用 Olympus BX51 显微镜上附带的 Mereo Investigator platform(MicroBrightField)分析 SNpc。简单来说，从每只动物中选择 3 个切片进行定量分析，这些切片来自有内侧尾核(MTN)的SNpc中部(Paxinos和Watson图谱(Paxinos,G. &ffatson,C,1997,The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic press, San Diego)中的A/P-5. 3mm)。在低倍Gx)镜下大概地找出每个参考空间，用高倍 (60x，油浸)物镜计数细胞。细胞数量表达为平均数量/切片。细胞计数利用光学分合法联合析象原则和不偏计数规则。实施例7病毒递送 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 在癫痫动物模型中的用途电极埋植和病毒的脑室内注射。雄性Sprague Dawley大鼠^)0_300g)用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，放在立体定位仪上。用带有特氟龙涂层的不锈钢丝制成的双极性电极埋植到右杏仁体基底外侧核(离前囟-2. 8mm前后向；+4. 9mm横向；和-8. 6mm背侧) (Paxinos and Watson,The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. New York Academic Press, Paper Back, 1997)。对照大鼠给予4_8 μ 1对照病毒(AAV-GFP)，其他大鼠立体定位注射 4-8 μ 1 表达 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 的 AAV,注射器尖位于右侧脑室(-0. 8mm前后向；+1. 5mm横向和-3. 6mm背侧)(Paxinos and Watson,The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. New York :Academic Press,Paper Back, 1997)。用牙科粘合剂和锚固螺丝将插管和电极紧紧固定在颅骨上，接地线连到一个锚固螺丝上(Binder et al. J. Neurosci.，19 1424-1436 (1999))。开始点燃刺激前，允许动物在术后恢复4天。点燃程序。每个点燃刺激的构成是频率为60Hz、1毫秒两相矩形脉冲串共1秒，振幅在癫痫样电图阈值(EST)之上ΙΟΟμΑ。EST是通过在刺激第一天从100 μ A开始以每分钟 100 μ A 的增幅确定的(Kokaia et al. Eur. J. Neurosci. , 11 1202-1216 (1999)) 动物每天刺激两次，共11天(共22次刺激)。由一个对处理一无所知的观察者记录每次刺激的行为(癫痫类型)和电生理[癫痫样电图时程(ESD)]参数。癫痫行为类型按照Racine的分类法(Racine，1972)打分0型，没有行为改变；1型，面部痉挛；2型，点头；3型，单侧前肢痉挛；4型，后肢直立，并双侧前肢痉挛；以及5型，后肢直立和跌倒(姿势控制丧失)。动物分析。最后一次刺激后4或M小时或者1周，将动物断头。组织用氯化三苯四氮唑染色。利用原位标记分析检测皮层组织中的凋亡细胞。实施例8中风动物模型中 rAAV-pre_(a )pro_⑶NF、rAAV-pre-(0 )pro_⑶NF 和 rAAV-pre-( γ )pro-⑶NF-ATG的体内基因转移rAAV-pre-( a ) pro-GDNF、rAAV-pre-( β ) pro-GDNF 或 rAAV-pre- ( γ ) pro-GDNF-ATG 向皮层递送。为了探讨表达 pre- ( a ) pro-GDNF、pre- ( β ) pro-GDNF 或 pre- ( γ ) pro-GDNF-ATG的重组rAAV载体作为中风基因疗法的潜能，将表达pre- ( a ) pro-⑶NF，pre- ( β ) pro-⑶NF or pre- ( y ) pro-⑶NF-ATG 的 rAAV 载体注射到大鼠的皮层中，所述大鼠正经受暂时性双侧颈总动脉结扎30或90分钟(Arvidsson et al., Neuro-biol. Dis.，14 :542-556 (2003))。如果 rAAV 注射动物皮层组织中的 pre- ( α ) pro-GDNF、pre- ( β ) pro-GDNF 或 pre- ( γ ) pro-GDNF-ATG 水平明显高于注射了表达 GFP 的rAAV(rAAV-GFP)的对照动物，表明rAAV可以被递送到皮层组织中，并表达pre_( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 基因。前脑缺血的诱发。23只在缺血损伤时重280到^Og的雄性Wistar大鼠(Taconic M&B A/S)喂养在12小时/12小时明暗环境下，食物和水任取。禁食过夜后，通过吸入3. 5% 氟烷，然后人工通风混在ROiO2中的1-2%氟烷(70 30)将动物麻醉。将尾动脉和静脉分别插管取血、记录血压并输注药物。用放置到直肠的温度计测量体温，利用加热垫将体温保持在大约37°C。分离颈总动脉。然后给予50IU肝素，氟烷浓度降低到0.5%，静脉内输注 2mg/h 维库夕臭I安(vecuronium bromide) (Organon Tek-nika B. V.，Boxtel, The Netherlands)作为肌肉松弛剂。之后是30分钟的稳定状态，在这个过程中监测生理参数和脑电波(EEG)。通过双侧阻塞颈总动脉，并结合从颈静脉放血达到的低血压(动脉血压 40-50mm Hg)来诱发缺血。10分钟后通过再灌注血液和移去堵塞夹恢复血液循环。在刚开始重新循环时，给予碳酸氢钠(静脉内给予0. 5ml,50mg/ml)来防止系统酸中毒(Arvidsson et al.，Neuroscience, 106 27-41(2001))。动物分析。再灌注后4和M小时以及1周，将动物(每组n = 6)断头。假手术组动物(η = 5)同样处理，但没有阻塞颈总动脉。用氯化三苯四氮唑将组织染色。利用原位标记分析检测皮层组织中的凋亡细胞。实施例9胆碱能细胞死亡动物模型中的体内基因转移给胆碱能细胞死亡大鼠模型注射病毒载体以确定利用体内基因递送，递送 pre- ( α ) pro-GDNF, pre- ( β ) pro-GDNF 或 pre- ( γ ) pro-GDNF-ATG 载体防止神经元变性的程度和参数。为了准备动物模型，给成年雄性Wistar大鼠进行穹窿横切以诱发基底前脑胆碱能神经元死亡。将2. 5到10 μ 1范围内的Pre-(a )pro-GDNF, pre-( β )pro-GDNF或 pre- ( γ ) pro-⑶NF-ATG 载体(pAAV-MCS-pre- ( a ) pro-⑶NF、pAAV-MCS-pre- ( β ) pro-⑶NF 或pAAV-MCS-pre- ( γ ) pro-GDNF-ATG)或对照EGFP载体储液注射到胆碱能基底前脑，每
31ml (神经营养组合物)含有IOici-IO12颗粒。颗粒在3-5分钟内于以下坐标注射到右半球内 离脑表面ΑΡ-0. 3 ；ML-0. 5 ；DV-6。将皮肤缝合，允许动物存活2_4周。实施例10肌萎缩侧索硬化症(ALQ动物模型中的体内基因转移概论。肌萎缩侧索硬化症(ALQ是一种涉及运动神经元选择性变性的不断进行性发展的致命疾病。预期GDNF是很有希望的ALS和其他运动神经元疾病的治疗剂。 因为AAV已发展成安全性得到证实的基因递送系统，我们探索了在ALS的G93A小鼠模型中通过AAV载体肌内递送⑶NFcDNAs的治疗效果。家族性ALS的GlH转基因小鼠模型携带带有Gly93Ala突变的人超氧化物歧化酶(SODl) (Gurney et al. Science, 264 1772-1775(1994))。因为携带pre-( α ) pro-GDNF剪接异构体的AAV也已发展成安全性得到证实的ALS基因递送系统(Wang et al. Gene Ther.，9 :381-383 Q002))，我们探索了在 ALS 的 G93A 小鼠模型中通过 AAV 载体(rAAV-pre- ( α ) pro-GDNF, rAAV-pre- ( β ) pro-GDNF 和 rAAV-pre- ( γ ) pro-⑶NF)肌内递送 pre- ( α ) pro-⑶NF、pre- ( β ) pro-⑶NF 和 pre- ( γ ) pro-GDNF cDNA的治疗效果。动物和病毒注射。带有G93A人SODl突变(S0D1G93A)的雄性转基因小鼠从The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)获得。AAV载体质粒在上文有详细描述。在9-10周龄，将ALS小鼠随机分配到四肢(腓肠肌和肱三头肌)注射 rAAV-pre- ( α ) pro-⑶NF、rAAV-pre- ( β ) pro-⑶NF 或 rAAV-pre- ( γ ) pro-⑶NF 载体(η = 10)的三个处理组中，或者注射AAV-GFP载体(n = 5)和媒介(n = 5)的两个对照组之一。 腓肠肌剂量是25 μ 1，肱三头肌剂量为15 μ 1。行为测试。测试前，给小鼠三天来熟悉旋转杆装置(Rota-Rod/7650 ；或Rota-Rod Treadmill for Mice)。检测时，将小鼠放在转速为5、10和20rpm的旋转杆上，自动记录每只小鼠在杆上停留的时间。发病时间定义为如以前描述(Li et al. Science, 288 335-339 (2000)),小鼠不能在20rpm转速下在杆上停留5分钟的时候。如果小鼠在杆上保留 > 5分钟，结束测试并评估为5分钟。小鼠每两天测试一次，直至它们不能执行这项工作。 死亡记录为当小鼠被仰面朝上放置，不能在30秒内翻身时的死亡年龄(Li et al. Science, 288 :335-339(2000)) ο形态学分析。肌肉切片(ΙΟμπι)在冷的丙酮中固定，然后与作为一抗的兔抗⑶NF D20多克隆抗体(1 500 ；Santa Cruz)和作为二抗的生物素化的抗兔抗体(1 400 ；Santa Cruz)温育。用3，3-二氨基联苯胺作为色原，通过链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合
} Ml^ (Vectastain ABC kits ；Vector Laboratories )。用于肌肉的双重免疫荧光染色，切片依次与封闭液、多克隆兔抗GDNFD20抗体 (1 500 ；Santa Cruz)、偶联FITC的羊抗兔IgG(1 200 ；Santa Cruz)和偶联四甲基若丹明的α-金环蛇毒素(Molecular Probes)温育。切片在共聚焦激光扫描显微镜(TCSNT ； Leica, Heidelberg, Germany)下检验禾口照相。为了脊髓的形态学分析，获得Nissl、SMI-32或CTB免疫染色连续横截面切片(30 μ m)。按照制造商的试验方案，用 Mouse-on-Mouse kit (Μ. 0. Mkit) (Vector Laboratories)将悬浮切片对SMI-32免疫组织化学染色。经处理用于分析CTB免疫反应性的切片用5%兔血清封闭，然后与抗CTB抗体(1 10000，针对CTB的羊抗血清)温育。通
32过标准ABC法将切片显色。形态度量学分析(morphometric analysis)和细胞计数。用Olympus BX51显微镜和KS 400图像分析软件(Zeiss)，对用CXD相机捕获的图像进行形态学分析。在随机挑选区域内，由> 1000个纤维的计数计算肌肉纤维的平均面积。为了比较脊髓中运动神经元的数量，我们按照以前的描述(Lewis etal. Nat. Genet. ,25 :402-405 (2000))，计数了每组中跨颈膨大和腰骶膨大的Nissl染色的切片以及SMI-32和CTB免疫染色的切片中的神经元。 对于每只小鼠，每组第六连续切片中至少数20个切片。只有满足以下标准的大的细胞特征被包括在内位于中央管(central canal)的侧线(lateral line)以下的前角(ventral horn)中；含有带核仁的明显的细胞核；以及具备至少一个厚(宽)thick process。实施例11脊椎损伤动物模型中的体内基因转移概论。已证实向受损脊髓递送神经营养因子能够刺激神经元存活和再生。这表明缺少足够的营养支持是导致哺乳动物脊髓没有自发再生的一个因素。先前递送pre-(a) pro-GDNF是通过重组腺病毒(AdCMVgdnf或AdCMVlacZ)介导的，并在脊髓受损的成年大鼠中测试了对功能恢复和中枢神经元萎缩的作用。结果显示腺病毒介导递送的pre-(a) pro-GDNF在脊髓受损的大鼠中能够防止皮质脊髓运动神经元的退化性萎缩，并提高运动功能(Tang et al.Neuroreport；15 :425-429(2004))。利用提供营养支持的基因递送方法，我们将表达pre-(a)pr0-GDNF、pre-(i3) pro-⑶NF 或 pre-( γ ) pro-GDNF 的 AAV 载体(rAAV-pre-( α ) pro-GDNF、rAAV-pre-(b) pro-GDNF或rAAV-pre-( y )pro-GDNF)注射到脊髓损毁部位。我们从解剖学上分析了成年脊髓受损大鼠皮质脊髓束(CST)再生情况，从行为学的角度分析了感觉-运动功能的改善。动物。所有试验在赫尔辛基大学(University ofHelsinki)的试验动物中心 (Laboratory Animal Center)进行，试验动物研究和试验方案遵循芬兰国家立法、EU指令 (86/609) ,European Convention(ETS 123)和国家基因技术的规定。成年雌性Lewis大鼠 (160-190gm)4到6只一组养在标准笼子里，12小时/12小时明暗循环，食物和水可任取。 动物皮下注射 Hypnorm (120 μ l/200g 体重 Janssen Pharmaceutics)和多美康(Dormicum) (每200g体重0. 75mg,溶于150 μ 1 ；Roche Pharmaceuticals)麻醉。在这个较长的过程中，施用含有维生素A的眼膏来防止眼睛脱水。按照Liebscher等的程序(Liebscher et al. Ann. Neurol，58 :706-719 (2005))，用虹膜切开剪和锋利的尖刀在胸T8节段做一个T型损毁，包括脊髓背向部分，有主要的CST和CST的背外侧和腹内侧部分。病毒的递送。动物分成四批(rAAV-pre-(α )pro-GDNF、rAAV-pre-( β )pro-GDNF、 rAAV-pre-( Y)pro-GDNF和AAV-GFP)进行同样的手术和行为测试。试验以完全双盲方式进行大鼠被随机编号，各组在笼子里混合。所有的试验人员对试验各阶段处理不知情，处理包括手术、保健、行为测试以及再生、出芽和损毁大小的评估。手术前，在取得基础测量值之前，将所有动物为行为测试处理和训练4周。为了 AAV注射，将大鼠随机分到试验组中损毁+rAAV-pre-(a )pro-GDNF、损毁+rAAV-pre-(i3) pro-GDNF、损毁+rAAV-pre-( γ )pro-GDNF、损毁+对照AAV-GFP。损毁后立即用1 μ 1生理液冲洗伤口开始AAV注射。2周后，开始行为评估，并隔一周重复一次。5周后，单侧跟踪CST。 手术9周后，在行为测试的最后，进行形态学分析。
BBB运动(locomotor)评分。所有的测试由数码摄像机监测，并以双盲方式分析。 手术前，在预训练4周后，获取基础测量值。手术后，以一周的间隔进行行为评估。允许大鼠自由运动，在4分钟内由两名观察者对其使用后肢的能力进行评分。根据21分BBB运动分级法(Basso et al. J. Neurotrauma，12 :1-12 (1995))，评判关节活动、足爪放置、体重支撑和前/后肢协调性。游泳试验。游泳试验的设置包括矩形有机玻璃盆(150x40x13cm)。水Q3_25°C ) 的深度足够使大鼠不能碰到盆底。正常动物游泳是通过后肢和尾巴划水，前肢举在颂下不动(Stolz et al. Behav. Brain Res.，106 :127-132 (1999))。利用以 45 度放在池底的镜子从侧面和底部同时拍摄大鼠，每只大鼠监测5轮游泳情况。通过按照以下标准给它们的动作打分来分析大鼠的游泳表现前肢使用2分=未使用(正常)，1分=整个距离使用一个手臂或者半程使用两只手臂，0分=一直使用两只手臂；后爪距离(支撑基础)2分=小距离，后腿在身体下方，1分=腿在身体外侧，但爪子仍在身下，0分=距离大，腿和脚都在身体外侧；后肢打水2分=打水有力，1分=打水力量中等，0分=虚弱或没有打水动作；尾巴动作2分=整个尾巴运动规律有力，1分=部分运动，0分=没有或者只有很弱的运动。 因此正常的游泳可以得到7到8分，训练良好的大鼠常规地达到这一数值。纤维计数和出芽评分在全部纵切连续切片中，以最终400x放大倍数在三个限定的区域(0. 25mm头尾轴宽度，距损毁部位尾端0.5mm、2mm和5mm)内计数从主要CST发出的再生纤维数量。由有经验的不了解情况的观察者，根据紧靠损毁头端的CST出芽的密度、异常途径、朝向损毁和损毁周围的弯曲、长度和分枝评分(0 =没有出芽，3 =非常强的出芽)。实施例12培育抗⑶NF前原区的抗体320/ ( α ) pro-⑶NF、321/pro_⑶NF和322/ ( β ) pro-GDNF肽合成给每种待培育的抗体制备一种肽，共制备了三种。所述肽是肽A320 :CGKRLLEAPAEDHSLGHRRVP (SEQ ID NO :46)，用于 320/( α ) pro-⑶NF肽A321 CPEDYPDQFDDVMD (SEQ ID NO 47)，用于 321/pro-⑶NF 禾口肽A322 :CHTASAFPLPAA匪(SEQ ID NO 48)，用于 322/( β ) pro-GDNF。肽的制备基于利用Fmoc化学固相肽合成(SPPS)技术。Fmoc代表9_芴甲基氯甲酸酉旨(fluorenylmethyl chloroformate)(9H-(f)luoren-9-yl(m)eth (o)xy (c)arbonyl)， 描述的是给氨基酸的N添加的Fmoc保护基团以防止不需要的反应，在酸性条件下稳定。合成按照标准禾呈序(Benoiton，Chemistry of Peptide Synthesis,Taylor&Francis Group， 2005)，以0. Immol的规模从肽的C末端到N末端自动进行。合成过程中，氨基酸侧链的功能基团用永久性保护基团保护，这些保护基团在合成完成后被切割，但它们在合成过程中对所有化学试剂是稳定的。切割后，利用HPLC(高效液相色谱)技术控制肽纯度(肽溶解于乙腈)，HPLC不同流份的质量用MALDI TOF-MS (基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱) 控制，并在冷冻干燥设备中冻干。此外，在HPLC中纯化2mg肽用于免疫(>95%纯度)。 肽-树脂保存在-20°C，肽粉末保存在+4°C。KLH 偶联
将2mg纯肽偶联到载体蛋白KLH(匙孔嘁血蓝蛋白)上以便在之后的免疫过程中刺激免疫反应。KLH很合适，因为它的分子量大(MW 4.5xl05到1.3xl07)、免疫原性强并且带有很多赖氨酸可以用于偶联。用于偶联到肽上，使用的是马来酰亚胺活化的KLH。马来酰亚胺基团与添加到肽N末端的半胱氨酸(每个肽只有一个Cys，避免内部Cys)的SH-基反应，以便确保定点偶联和未被遮蔽的肽用于免疫过程。反应在中性条件下进行，之后利用透析纯化。最终溶液是溶于PBS的偶联剂浓度为0.5mg/ml。用偶联前和后收集的样品 (有和没有KLH的肽)，以Ellman测试控制偶联步骤。利用Ellman试剂(二硫双(2-硝基苯甲酸))或DTNB)进行Ellman测试来估计含有巯基的肽与KLH偶联的效率(Walker，The Protein Protocols Handbook,2nd edition, Humana Press inc. 2002, pp 595-596)。免疫免疫时间表第0天-免疫前血清和第一次(I)免疫；第14天-第二次(II)免疫；第35天-第三次(III)免疫；第45天-初步取血和ELISA检测；第56天-第四次(IV) 免疫；第66天-最后的取血和ELISA检测。第一次免疫使用了弗氏完全佐剂(FCA)，其他免疫使用弗氏不完全佐剂(FIA)。弗氏佐剂是油包水的乳剂，含有FCA，能够杀死结核分支杆菌，被用于增强免疫反应。将佐剂与KLH-肽偶联溶液小心地1 1混合，皮下注射到两个部位。一个课题中，使用了 2只兔子。从耳静脉(air vain)取血，凝结并离心制备血清。 免疫前血清的量是 1ml，用于ELISA检测的初期血清是 0. :3ml，最终血清 30ml。ELISA将适量的肽A320、A321或A322与牛血清清蛋白(BSA)偶联(与KLH偶联程序相同)。然后将该肽-BSA偶联物包埋到高容量蛋白结合微量滴定板上(每个样品一式两份)。用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔IgG抗体作为二抗，3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为底物，通过标准ELISA检测免疫前、初期和最终血清。用ELISA检测仪测量 450nm的光密度。IgG-特异性纯化IgG纯化采用了MAbsorbent 技术。MAbsorbent 合成亲和配体吸附剂被证实
可以用于从血清、血浆、腹水、哺乳动物细胞培养物上清或转基因来源提纯抗体，它是替代蛋白A纯化的一种创新技术。从血抗血清纯化抗体是通过将它们与MAbsorbent A1P/A2P 结合进行的。Mabsorbent合成亲和配体吸附剂“模拟”重组和天然蛋白A。但它们非常不同的是Mabsorbents能够结合所有IgG亚型。它能有效结合多种人和哺乳动物多克隆抗体 (包括牛、小鼠、绵羊、山羊、马和兔)以及完整单克隆抗体、人源化抗体嵌合分子和抗体片段。首先，按照随空柱子和Mabsorbent提供的使用说明准备柱子。简单来说，将吸附剂浆温和地混勻，加到柱子中，并用结合缓冲液平衡柱子。其次，将稀释在结合缓冲液中的适量抗血清加入柱子，温育并使其流过柱子。血清中的抗体与MAbsorbent A1P/A2P结合。然后将柱子清洗，从亲和吸附剂上洗脱抗体并收集成2ml的流份。这之后，将柱子再次平衡用于新一轮纯化。可以反复进行这一步，直至所需量的抗血清被纯化。平衡和结合在中性PH进行，洗脱在酸性条件下进行。收集后，将全部流份对PBS透析，利用BCATM蛋白检测技术测量抗体浓度。最后，将抗体溶于磷酸盐缓冲液 (PBS)中，保存在_20°C。
表位特异性纯化表位特异性亲和纯化采用了 NHS-活化的Sepharose 介质技术。NHS-活化的 kpharose可与抗原形成稳定的酰胺键，这里是与肽形成酰胺键，之后肽会结合血清中的抗体。抗体将被洗脱并收集。这个方法帮助纯化血清中抗给定肽的抗体。首先，按照随空柱子和NHS-活化的Sepharose 介质提供的使用说明准备柱子。 简单来说，将NHS-活化的Sepharose 介质加到空柱子中并清洗以除去储存液。将抗原溶解在偶联缓冲液中，加入柱的活性基团在温育期间结合。然后将柱子立在 TRIS缓冲液中以封闭任何未发生反应的活性基团。然后用pH值不同的两种不同的缓冲液 (例如，第一种缓冲液PH8-9，第二种缓冲pH3-4)清洗柱子。其次，用结合缓冲液将准备好的柱子平衡，并取稀释在PBS中的适量血液抗血清装柱。允许淤浆停留几分钟以便抗体与抗原结合。用不同pH(pH8_6.5)的结合缓冲液洗柱子，然后在酸性条件下洗脱抗体，收集每份Iml的流份。收集后，将全部流份对PBS透析， 利用BCA 蛋白检测技术测量抗体浓度。最后，将抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，保存在-200C。pro-GDNF抗体特异性的表征通过Wfestern印迹和免疫荧光分析验证了 pro-GDNF抗体的特异性。在免疫荧光分析中，将生长在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至带有盖片的4孔板， 当生长至大约80%铺满时，每孔转染0. 8 μ g质粒。用于转染的构建体是包含在pEGFP载体(Invitrogen)中人和/或小鼠pre-( α )pro-⑶NF和pre-( β )pro-⑶NF，以及包含在 pAAV-MCS载体中蛋白编码起始密码子为ATG的人pre- ( γ ) pro-GDNF。包含在pAAV_MCS 载体中缺少原区的人pre-GDNF作为对照(Pia Runeberg-Roos博士惠赠，University of Helsinki，Finland)。该构建体与其他所用构建体克隆过程类似。从空pEGFP-Nl载体表达重组GFP蛋白作为模拟转染对照。转染后4小时，将培养基换成含有10% FCS和抗生素的新鲜DMEM。转染后M小时，用4%仲甲醛(Sigma)将细胞固定，并用01 % "Triton X-IOO(Sigma)使通透性增加。将细胞与溶于0. 5% BSA中的一抗，即抗⑶NF pro-结构域的多克隆 320/(a )pro-GDNF(l 200 稀释)、321/pro_GDNF(1 200 稀释)或 322/( β ) pro-GDNF(1 200稀释)，和抗成熟⑶NF的单克隆小鼠抗⑶NF(1 100稀释)在室温下温育1小时，清洗，然后用二抗即偶联Cy2的驴抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch laboratories)禾口偶联 Cy3 的驴抗兔 IgG (JacKson ImmunoResearch laboratories)重复上述过禾呈。细胞核用 Hoechst 染色。最后用 Immu-mount (Thermo electron corporation) 盖上盖片。通过显微镜(AX70ft~OViS ；Olympus)上的电荷耦合照相机(DP70 ；Olympus)获取图像。在Wfestern印迹分析中，将生长在含有10% FCS和抗生素的DMEM中的CHO细胞接种至6孔板，当生长至大约80%铺满时，每孔转染4μ g质粒。用于转染的构建体是包含在 pEGFP-NI 载体(Invitrogen)中人和 / 或小鼠 pre- ( α ) pro-⑶NF 和 pre- ( β ) pro-⑶NF，包含在 pAAV-IRES-hrGFP 载体(Stratagene)中的人 pre- ( α ) pro-⑶NF 和 pre- ( β ) pro-⑶NF 以及包含在 pAAV-MCS 载体(Stratagene)中的 pre- ( α ) pro-⑶NF 和 pre- ( β ) pro-⑶NF。包含在pAAV-MCS载体中缺少原区的人pre-GDNF作为对照。该构建体与其他所用构建体克隆过程类似。从空pEGFP-Nl载体表达重组GFP蛋白作为模拟转染对照。转染后4小时，将培养基换成aiil OptiMEM培养基。转染后48小时，收集细胞和培养基(上清)，将培养基浓缩，样
36品利用15%变性SDS-PAGE凝胶分离，随后转印到尼龙膜上，用溶于TBS-Tween (0. )中的5%牛奶封闭。通过ECL方法，用抗⑶NF原-结构域的多克隆320/(a)pro-GDNF(l 500 稀释)或321/pro-GDNF(l 500稀释)和抗成熟⑶NF的多克隆D20抗体(Santa Cruz, 1 500稀释)，以及随后的偶联HRP的驴抗兔免疫球蛋白二抗(1 2000稀释)检测⑶NF。MM免疫荧光分析结果显示，321/pro-GDNF抗体能够识别(α ) pro-GDNF、( β ) pro-GDNF和(γ ) pro-GDNF的⑶NF原-结构域，但不能识别缺少原区的⑶NF蛋白或者重组GFP蛋白。此外，在未被转染的细胞中未看到特异性染色。用识别GDNF成熟部分的小鼠抗⑶NF抗体也可以检测(α ) pro-GDNF和(β ) pro-GDNF以及缺少原区的⑶NF蛋白(图 13)。在免疫荧光分析中，320/ ( α ) pro-GDNF抗体能够识别(α ) pro-GDNF的⑶NF原区，但不能识别(β ) pro-GDNF、( γ ) pro-GDNF、缺少原区的⑶NF或者重组GFP蛋白。用识别⑶NF 成熟部分的小鼠抗⑶NF抗体也可以检测(a)pro-GDNF和(i3)pro_GDNF以及缺少原区的 ⑶NF蛋白。除了小鼠抗⑶NF染色，转染了 pre-(i3)pro-GDNF cDNA的细胞中还看到某些 GFP信号(绿色)，很可能是从pEGFP-Nl载体泄露的(图14)。在免疫荧光分析中，322/( β) pro-GDNF抗体能够识别(β ) pro-GDNF的⑶NF原-结构域，但不能识别(a ) pro-GDNF, ( γ ) pro-GDNF、缺少原区的⑶NF或重组GFP蛋白。用识别⑶NF成熟部分的小鼠抗⑶NF抗体也可以检测(a ) pro-GDNF和(β ) pro-GDNF以及缺少原区的⑶NF蛋白。除了小鼠抗⑶NF 染色，转染了 pre-(i3)pro-GDNF cDNA的细胞中还看到某些GFP信号(绿色)，很可能是从 PEGFP-Nl载体泄露的(图15)。Western印迹分析结果显示，321/pro-GDNF抗体能够识别(a )pro_GDNF和(β ) pro-GDNF的⑶NF原-结构域，但不能识别缺少原区的⑶NF蛋白或重组GFP蛋白。此夕卜， 321/pro-GDNF抗体能够识别(a ) pro-GST和(β ) pro-GST融合蛋白。抗⑶NF成熟部分的抗GDNF D20抗体能够识别(a)pro-GDNF、(0)pro-GDNF和缺少原区的⑶NF蛋白(图16)。 在Western印迹中，322/ ( a ) pro-GDNF抗体能够识别(a ) pro-GDNF的⑶NF原-结构域，但不能识别(β )pro-GDNF或缺少原区的⑶NF蛋白。抗⑶NF成熟部分的抗⑶NFD20抗体能够识别(a ) pro-GDNF, ( β) pro-GDNF和缺少原区的GDNF蛋白(图17)。实施例13培育pre- ( y ) pro-GDNF的特异性抗体根据如实施例12中所用的已知技术，制备包含pre-(Y)pr0-GDNF肽特有的氨基酸序列的肽。偶联将纯肽偶联到载体蛋白KLH(匙孔嘁血蓝蛋白)上以便在之后的免疫过程中刺激免疫反应。用于偶联到肽上，使用的是马来酰亚胺活化的KLH。马来酰亚胺基团与添加到肽 N末端的半胱氨酸(每个肽只有一个Cys，避免内部Cys)的SH-基反应，以便确保定点偶联和未被遮蔽的肽用于免疫过程。反应在中性条件下进行，之后利用透析纯化。最终溶液溶于PBS，偶联剂浓度为0.5mg/ml。用偶联前和后收集的样品(有和没有KLH的肽)，如实施例12所述通过Ellman测试控制偶联步骤。利用Ellman试剂(二硫双(2-硝基苯甲酸)) 或DTNB)进行Ellman测试来估计含有巯基的肽与KLH偶联的效率(Walker，The Protein Protocols Handbook,2nd edition, Humana Press inc. 2002, pp 595—596)。
37
免疫按照以下方案给兔免疫第0天-免疫前血清和第一次⑴免疫；第14天-第二次 (II)免疫；第35天-第三次(III)免疫；第45天-初步取血和ELISA检测；第56天-第四次(IV)免疫；第66天-最后的取血和ELISA检测。第一次免疫使用了弗氏完全佐剂(FCA)， 其他免疫使用弗氏不完全佐剂(FIA)。弗氏佐剂是油包水的乳剂，含有FCA，能够杀死结核分支杆菌，被用于增强免疫反应。将佐剂与KLH-肽偶联溶液小心地1 1混合，皮下注射到两个部位。从耳静脉(air vain)取血，凝结并离心制备血清。免疫前血清的量是 1ml， 用于ELISA检测的初期血清是 0. :3ml，最终血清 30ml。ELISA将适量的用于免疫的肽与牛血清清蛋白(BSA)偶联(与KLH偶联程序相同)。然后将该肽-BSA偶联物包被到高容量蛋白结合微量滴定板上(每个样品一式两份)。然后， 用BSA将板上的所有空结合位点封闭。由免疫前、初期和最终血清制备稀释液(在最后的 ELISA过程中)，并加入微孔中。用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔IgG抗体作为二抗检测结合样品，从而形成“三明治”结构。在两个孔中用磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照， 每个步骤后将板温育并清洗。最后，加入3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺(Tiffi)后与!PR发生比色反应，用ELISA检测仪测量450nm的光密度。抗体纯化IgG纯化采用了MAbsorbent 技术。从血液抗血清纯化抗体是通过将它们与 MAbsorbent A1P/A2P结合进行的。Mabsorbent合成亲和配体吸附剂“模拟”重组和天然蛋白A。首先，按照随空柱子和Mabsorbent提供的使用说明准备柱子。简单来说，将吸附剂浆温和地混勻，加到柱子中，并用结合缓冲液平衡柱子。然后，将稀释在结合缓冲液中的适量抗血清加入柱子，温育并使其流过柱子。血清中的抗体与MAbsorbent A1P/A2P结合。然后洗柱子，从亲和吸附剂上洗脱抗体并收集成2ml的流份。这之后，将柱子再次平衡用于新一轮纯化。可以反复进行这一步，直至所需量的抗血清被纯化。平衡和结合在中性PH进行，洗脱在酸性条件下进行。收集后，将全部流份对PBS透析，利用BCA 蛋白检测技术测量抗体浓度。最后，将抗体溶于磷酸盐缓冲液 (PBS)中，保存在_20°C。表位特异性亲和纯化采用了 NHS-活化的Sepharose 介质技术。NHS-活化的 kpharose可与抗原形成稳定的酰胺键，这里是与肽形成酰胺键，之后肽会结合血清中的抗体。抗体将被洗脱并收集。这个方法帮助纯化血清中抗给定肽的抗体。首先，按照随空柱子和NHS-活化的Sepharose 介质提供的使用说明准备柱子。 简单来说，将NHS-活化的Sepharose 介质加到空柱子中并清洗以除去储存液。将抗原溶解在偶联缓冲液中，加入柱的活性基团在温育期间结合。将柱子立在TRIS 缓冲液中以封闭任何未发生反应的活性基团。然后用PH值不同的两种不同的缓冲液(例如，第一种缓冲液PH8-9，第二种缓冲液PH3-4)洗柱子。随后，用结合缓冲液将准备好的柱子平衡，并取稀释在PBS中的适量血液抗血清装柱。允许淤浆停留几分钟以便抗体与抗原结合。用不同pH(pH8-6.5)的结合缓冲液洗柱子，然后在酸性条件下洗脱抗体，收集每份Iml的流份。收集后，将全部流份对PBS透析， 利用BCA 蛋白检测技术测量抗体浓度。最后，将抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，保存在-20 °CO
序列表自由格式(free text)
SEQIDNO1 [223]；天然人pre-gamma-pro-GDNF
SEQIDNO3[223]-'J、鼠 pre-gamma-pro-GDNF
SEQIDNO5[223]K pre-gamma-pro-GDNF,带 ATG
SEQIDNO7[223]‘引物42
SEQIDNO8[223]‘引物43
SEQIDNO9[223]‘引物46
SEQIDNO10223]引物47
SEQIDNO11223]引物53
SEQIDNO12223]引物49
SEQIDNO13223]引物48
SEQIDNO14223]引物讨
SEQIDNO15223]人⑶NF 5‘引物
SEQIDNO16223]人⑶NF 3‘引物
SEQIDNO17223]引物91
SEQIDNO18223]引物92
SEQIDNO19223]pre-gamma-pro aa Ιψβ}, ^ Leu
SEQIDNO20223]pre-gamma-pro nt 序列，带 CTG
SEQIDNO21223]pre-gamma-pro aa 序列，带 Met
SEQIDNO22223]pre-gamma-pro nt 序列，带 ATG
SEQIDNO23223]截短的 pre-gamma-pro-GDNF nt,带 CTG
SEQIDNO25223]截短的 pre-gamma-pro-⑶NF nt,带 ATG
SEQIDNO27223]V34M pre-gamma-pro-GDNF aa, ^ Leu
SEQIDNO28223]V34M pre-gamma-pro-GDNF nt,带 CTG
SEQIDNO29223]V34M pre-gamma-pro-GDNF aa，带 Met
SEQIDNO30223]V34M pre-gamma-pro-GDNF nt，带 ATG
SEQIDNO31223]V38M pre-beta-pro-GDNF aa
SEQIDNO32223]V38M pre-beta-pro-GDNF nt
SEQIDNO33223]V64M pre-alfa-pro-GDNF aa
SEQIDNO34223]V64M pre-alfa-pro-GDNF nt
SEQIDNO35223]截短的 pre-beta-pro-GDNF aa
SEQIDNO36223]截短的 pre-beta-pro-GDNF nt
SEQIDNO37223]pEGFP 5'引物
SEQIDNO38223]pEGFP 3'引物
SEQIDNO39223]引物89
SEQIDNO40223]引物90
SEQIDNO41223]pAAV-MCS5'引物
SEQIDNO42223]pAAV-MCS3'引物
39
SEQ ID NO 43[223]⑶NF蛋白剪接变体alfa，beta或gamma中任一种的前原序列的C末端沈个氨基酸的序列SEQIDNO44[223]人 pre-alfa-pro-GDNF 的原肽
SEQIDNO45[223]人pre-beta-pro-⑶NF的原肽
SEQIDNO46[223]抗体320的表位(基于小鼠alfa-原序列)
SEQIDNO47[223]抗体321的表位(基于pro-GDNF的C末端)
SEQIDNO48 [223]抗体322的表位(基于beta-原序列)
SEQIDNO49[223]pre-alfa-pro-⑶NF的前原区
SEQIDNO50[223]pre-beta-pro-GDNF 的前原区
SEQIDNO51[223]人 pre-beta-pro-GDNF
SEQIDNO51[223]原肽
权利要求
1.纯化和分离的人神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白剪接变体 (pre- ( y ) pro-⑶NF)，其包含如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
2.修饰的人⑶NF蛋白剪接变体(pre-(Y)pro-GDNF)，其中SEQID NO 2的氨基末端亮氨酸替换为甲硫氨酸，如SEQ ID N0:6所示。
3.人pre-(Y)pro-GDNF的成熟多肽部分，其包含SEQID NO :2中的氨基酸1到134和 SEQ ID NO 2中的氨基酸-47到-1序列部分，所述-47到-1部分具有调控功能，但缺少信号序列。
4.权利要求1所述的人GDNF蛋白剪接变体的前原氨基酸序列，其包含如SEQID NO 19所示的氨基酸序列。
5.权利要求2所述的人GDNF蛋白剪接变体的前原氨基酸序列，其包含如SEQID NO 21所示的氨基酸序列。
6.如SEQID NO 21中所示的具备调控功能的信号序列部分。
7.权利要求1所述的人GDNF蛋白剪接变体的截短形式，缺少成熟多肽部分中N末端的 38个氨基酸，所述形式如SEQ ID NO 24所示。
8.权利要求2所述的人GDNF蛋白剪接变体的截短形式，缺少成熟多肽部分中N末端的 38个氨基酸，所述形式如SEQ ID NO 所示。
9.人pre-(Y)pro-GDNF的截短的成熟多肽部分，包含SEQID NO :2中的氨基酸39到 134，以及具有调控功能的SEQ ID NO 2中氨基酸-47到-1的信号序列部分。
10.权利要求1所述人⑶NF蛋白剪接变体的V34M突变体，包含如SEQID NO 27所示的氨基酸序列。
11.权利要求2所述人⑶NF蛋白剪接变体的V34M突变体，包含如SEQID NO 29所示的氨基酸序列。
12.纯化的、分离的V38M突变的人神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白剪接变体(pre-(0 )pro-GDNF)，其包含如SEQ ID NO 31所示的氨基酸序列。
13.截短的人神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白剪接变体(pre-(i3) pro-GDNF)，其缺少成熟多肽部分N末端的38个氨基酸，包含如SEQ ID NO 35所示的氨基酸序列。
14.纯化的、分离的V64M突变的人神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白剪接变体(pre-( α )pro-GDNF)，其包含如SEQ ID NO 33所示的氨基酸序列。
15.多核苷酸，编码权利要求1-14之一的GDNF蛋白剪接变体或其部分
16.权利要求15的多核苷酉■，其包含SEQ IDNO:1所示的核酸序列。
17.权利要求15的多核苷酉■，其包含SEQ IDNO:5所示的核酸序列。
18.权利要求15的多核苷酉■，其包含SEQ IDNO20所示的核5睃序列。
19.权利要求15的多核苷酉■，其包含SEQ IDNO22所示的核5睃序列。
20.权利要求15的多核苷酉1，其包含SEQ IDNO23所示的核5睃序列。
21.权利要求15的多核苷酉1，其包含SEQ IDNO25所示的核5睃序列。
22.权利要求15的多核苷酉1，其包含SEQ IDNOJ8所示的核5睃序列。
23.权利要求15的多核苷酉1，其包含SEQ IDNO30所示的核5睃序列。
24.权利要求15的多核苷酉1，其包含SEQ IDNO32所示的核5睃序列。
25.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQID NO 36所示的核酸序列。
26.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQID NO :34所示的核酸序列。
27.载体，其包含与表达调控元件可操纵地连接的权利要求1516任一所述多核苷酸。
28.权利要求27所述的载体，其中所述载体是病毒或非病毒载体。
29.权利要求观所述的载体，其中所述病毒载体是重组痘苗病毒、重组腺病毒、重组逆转录病毒、重组腺相关病毒、重组杆状病毒、重组乳头瘤病毒、重组慢病毒或重组禽痘病毒载体，或者是其中的基因的表达可以体内调控的病毒载体。
30.权利要求观所述的载体，其中所述非病毒载体是细菌、真菌、哺乳动物、昆虫、植物或酵母载体或者脂质体或DNA的多胺衍生物。
31.经转化或转染的、已从其天然环境分离的宿主细胞，包含权利要求27-30中任一项所述的载体。
32.抗体，所述抗体与GDNF蛋白剪接变体α、β或Y中任一种的前原序列中的C末端26个氨基酸部分特异结合，该部分具有如SEQ ID NO :43所示的氨基酸序列。
33.抗体，所述抗体与pre-( α ) pro-GDNF蛋白剪接变体的pro区域特异结合，该区域具有如SEQ ID NO 44所示的氨基酸序列。
34.抗体，所述抗体与pre-(a)pro-GDNF蛋白剪接变体的前原区域特异结合，该区域具有如SEQ ID NO :49所示的氨基酸序列。
35.抗体，所述抗体与pre-( β ) pro-GDNF蛋白剪接变体的pro区域特异结合，该区域具有如SEQ ID NO 45所示的氨基酸序列。
36.抗体，所述抗体与pre-(i3)pro-GDNF蛋白剪接变体的前原区域特异结合，该区域具有如SEQ ID NO 50所示的氨基酸序列。
37.抗体，所述抗体与具有如SEQID NO :2或SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的pre_( γ ) pro-GDNF蛋白剪接变体特异结合。
38.抗体，所述抗体与具有如SEQID N0:19或SEQ ID NO :21所示氨基酸序列的 pre- ( y ) pro-GDNF蛋白剪接变体的前原区特异结合。
39.用在治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的方法中的GDNF蛋白剪接变体或其部分，所述剪接变体或其部分选自权利要求1-14之一的GDNF蛋白剪接变体和如SEQ ID N0 52所示的⑶NF蛋白剪接变体。
40.GDNF蛋白剪接变体或其部分在制备治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的药物中的用途，其中所述剪接变体或其部分选自权利要求1-14之一的GDNF蛋白剪接变体和如SEQ ID NO 52所示的⑶NF蛋白剪接变体。
41.用于治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的方法的多核苷酸，所述多核苷酸选自权利要求15所述的多核苷酸和如SEQ ID NO 51所示的多核苷酸。
42.多核苷酸在制备治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的药物中的用途，其中所述多核苷酸选自权利要求15所述的多核苷酸和如SEQ IDNO 51所示的多核苷酸。
43.权利要求40或42所述的用途，其中所述神经系统疾病是中枢神经系统疾病、脊髓损伤、成瘾症、酗酒、局部缺血、癫痫、抑郁症或中风。
44.权利要求40或42所述的用途，其中所述神经退行性疾病是帕金森氏症、阿尔茨海默氏病或肌萎缩侧索硬化症(ALS)。
45.多核苷酸在制备治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的药物中的用途，其中所述多核苷酸选自权利要求16-25中任一项所述的多核苷酸和如SEQ ID NO :51所示的多核苷酸，其中体内生成的pre- ( y ) pro-GDNF和pre- ( β ) pro-GDNF蛋白的分泌受到神经元和神经物理刺激的调控。
46.治疗神经系统疾病或神经退行性疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的 pre-(y)pro-GDNF蛋白或pre_( β )pro_GDNF蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸给予患有这类病症或疾病的个体。
47.权利要求46所述的方法，其中的pre-(Y)pro-GDNF蛋白是权利要求2、5、8和11 中任一项所述的蛋白。
48.权利要求46所述的方法，其中的pre-( β ) pro-GDNF蛋白选自权利要求12或13所述的蛋白和如SEQ ID N0:52所示的蛋白。
49.药物组合物，其包含与药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂联用的有效量GDNF蛋白剪接变体，其中所述蛋白剪接变体选自权利要求1-14中任一项所述的GDNF蛋白剪接变体和如SEQ ID NO :52所示的⑶NF蛋白剪接变体。
50.药物组合物，其在载体中包含有效量的选自权利要求16-26中任一项所述的多核苷酸和如SEQ ID NO :51所示的多核苷酸中的多核苷酸，所述载体适合将所述多核苷酸导入患有神经系统疾病或神经退行性疾病的患者的细胞中，从而能够体内合成治疗有效的GDNF 蛋白产物。
全文摘要
本发明涉及神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)蛋白和基因，更具体来说，涉及GDNF蛋白的新的剪接变体，该剪接变体由新的剪接变体pre-(γ)pro-GDNF编码，其分泌受到生物学调控。
文档编号A61K38/18GK102282165SQ200880122830
公开日2011年12月14日 申请日期2008年10月24日 优先权日2007年10月25日
发明者莉娜·尼瓦莱塔, 马特·萨尔马 申请人:莉娜·尼瓦莱塔, 马特·萨尔马