与控制可变剪接和rna加工的核糖开关有关的方法和组合物的制作方法

专利名称：：与控制可变剪接和rna加工的核糖开关有关的方法和组合物的制作方法
技术领域：
：本文公开的发明主要涉及基因表达领域，具体涉及基因表达调控领域。
背景技术：
：精确遗传控制是活体系统的一个基本特征，因为细胞必须通过改变基因表ii^式来对多种生化信号和环境信号作出应答。大多数已知的遗传控制机制涉及到蛋白因子的使用，所述蛋白因子会感受到化学或物理刺激，然后通过与相关DNA或信使RNA序列选择性相互作用来调节基因表达。蛋白可采用复杂形状并行使使活体系统可准确地感受到它们的化学和物理环境的多种功能。对代谢物有应答的蛋白因子通常通过结合DNA以调节转录起始(如lac阻遏蛋白；Matthews,K.S.,andNichols,J.C"1998，Prog.NucleicAcidsRes.Mol.Biol.5S，127-164)或通过结合RNA以控制转录终止(如PyrR蛋白；Switzer，R丄"etal.，1999，Prog.NucleicAcidsRes.Mol.Biol.62，329-367)或翻剩如TRAP蛋白；Babitzke,P"andGollnick，P.，2001，J.Bacteriol.7^5，5795-5802)来发挥作用。蛋白因子通过多种机制如变构调节或翻译后修饰来应答于环境刺激，并擅长利用这些机制来作为高反应性遗传开关(如参见Ptashne，M.，andGann，A.(2002).GenesandSignals.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。除了蛋白质因子广泛参与基因控制之外，还已知RNA也可在基因调节中有活跃的作用。最近的研究逐渐揭示出小的非编码RNA在选择性靶向和破坏mRNA从而导致基因表达的下调方面的重要作用(参见例如Hannon，GJ.2002，NatureWS，244-251和该文章的参考文献)。这种RNA干扰过程利用了短RNA通过Watson-Crick碱基互补而选择性识别目标mRNA耙标的能力，在该过程之后被结合的mRNA通过蛋白质的作用而被破坏。在这一系统中RNA为分子识别的理想媒介物，因为通过进化过程产生新的靶标特异性RNA因子要比产生具有新的高特异性RNA结合位点的蛋白质因子容易得多。虽然蛋白质可以满足生物学对于酶、受体和结构功能的大部分需求，但是RNA也具有这些能力。例如，RNA具有足够的结构塑性，能形成多种具有很高的酶活力和精确的分子识别能力的核酶结构域(Cech&Golden,BuildingacatalyticactivesiteusingonlyRNA.In:J/reiA^4『wWR.F.Gesteland，T.R.Cech，J.F.Atkins,eds.,pp.321-350(1998);Breaker,7/iv//nselectionofcatalyticpolynucleotides.C/re/w.iev.97，371-3卯(1997))和受体结构域(Osborne&Ellington,Nucleicacidselectionandthechallengeofcombinatorialchemistry.C/re附.及ev.97,349-370(1997);Hermann&Patel，Adaptiverecognitionbynucleicacidadapters.5Wewce287，820-825(2000))。此外，上述能力还可以组合产生可被效应物分子选择性调节的变构核酶(Soukup&Breaker,EngineeringprecisionRNAmolecularswitches./Voc.TV"//.5"c/.USA96，3584-3589(1999);Seetharamanetal"Immobilizedriboswitchesfortheanalysisofcomplexchemicalandbiologicalmixtures.AWure5/Cec/fo/.19，336-341(2001))。可变剪接过程涉及mRNA前体上剪接位点的选择性使用。可变剪接使得可从单个基因产生多种蛋白，从而使得产生具有不同功能的蛋白。可变剪接事件可通过多种方式出现，包括外显子跳跃、相互排斥的外显子的使用以及5'和/或3'剪接位点的差异选择。对于许多基因来说(例如同源基因、癌基因、神经肽、细胞外基质蛋白和肌肉收缩蛋白)，可变剪接以发育或组织特异的方式调控。因此，可变剪接在基因表达中起到关键的作用。最近的研究已揭示出可变剪接在复杂生物体的表达策略中的重要性。mRNA前体(mRNAprecursor)(mRNA前体(pre-mRNA))的可变剪接在调控哺乳动物基因表达中起到重^ft用。可变剪接的调节出现在多种谱系的细胞中，并且是大量基因的表达程序的一部分。最近，已经逐渐明确的是，可变剪接可控制蛋白同种形的产生，所述同种型有时具有完全不同的功能。在细胞转化方面具有不同性质且有时具有相对性质的癌基因和原癌基因蛋白同种型经由可变剪接产生。这类基因的实例见Makela，T.P.etal.1992，Science256:373;Yen,J.etal.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:5077;Mumberg，D.etal.1991，GenesDev.5:1212;Foulkes，N.S.andSassone-Corsi，P.1992，Cell68:411。同时，可变剪接经常用于控制在程序性细胞死亡中涉及的蛋白的产生，所述蛋白例如Fas、Bcl-2、Bax和Ced-4(Jiang,Z.H.andWuJ.Y"1999，ProcSocExpBiolMed220:64)。mRNA前体的可变剪接可产生一种阻遏蛋白，而在不同条件下可从相同mRNA前体产生一种激活子(BlackD.L.2000,Cell103:367;Graveley，B.R.2001，TrendsGenet.17:100)。本领域需要可以用于经核糖开关(riboswitch)调节可变剪接的方法和组合物。
发明内容本文公开了一种可调节的基因表达构建体，所述构建体包含一个编码如下一种RNA的核酸分子，所述RNA包含可操作地连接于一个编码区的核糖开关，其中所述核糖开关调节所述RNA的剪接，其中所述核糖开关和编码区是异源的，并且其中对剪接的调节影响所述RNA的加工。所述核糖开关可调节所述RNA的可变剪接。所述核糖开关可包含一个适体Uptamer)结构域和一个表达平台结构域，其中所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。所述RNA可进一步包含一个内含子。所述核糖开关可在所述RNA的3'非翻译区。所述内含子可在所述RNA的3'非翻译区。RNA加工位点可在所述内含子中。所述内含子的剪切可从所述RNA上除去所述RNA加工位点，从而影响所述RNA的加工。对所述RNA加工的影响可包括由所述RNA加工位点调节的所述RNA加工的消除。对所述RNA加工的影响可包括转录终止的改变。对所述RNA加工的影响可包括所述RNA降解的增加。对所述RNA加工的影响可包括所述RNA更新的增加。所述核糖开关可与所述内含子的3，剪接位点部分重叠。所述内含子的剪接可降低或消除所述核糖开关被激活的能力。所述剪接点可为5'剪接位点。所述核糖开关可在所述RNA的内含子内。RNA加工也可不依赖或不参与剪接而被调节或影响。所述表达平台结构域可包括所述内含子中的剪接位点。所述表达平台结构域可包括在所述内含子末端的剪接位点(即所述5，剪接位点或3，剪接位点)。所述RNA可进一步包括一个内含子，其中所述表达平台结构域包括所述内含子中的分支位点。所述剪接点可在所述核糖开关被激活时具有活性。所述剪接位点也可在所述核糖开关未被激活时即具有活性。所述核糖开关可由触发分子例如硫胺素焦磷酸(TPP)激活。所述核糖开关可以是一种TPP-应答性核糖开关。所述核糖开关可激活剪接。所述核糖开关可抑制可变剪接。所述核糖开关可改变RNA的剪接。所述RNA可具有分支结构(branchedstructure)。所述RNA可以是mRNA前体。控制剪接的适体区域可位于例如P4茎和P5茎。控制剪接的适体区域还可出现于例如环5。控制剪接的适体区域还可出现于例如P2茎。因此，表达平台结构域例如可与P4和P5序列、环5序列和/或P2序列相互作用。仅当触发分子未结合于上述适体结构域时，所述适体序列通常才可用于与所述表达平台结构域相互作用。例如，所述剪接位点和/或分支位点可位于相对于所述适体5'端的-130至-160之间的位置。所述RNA可进一步包括第二个内含子，其中所述第二内含子的3'剪接位点位于相对于所述适体结构域5'端的-220至-270之间的位置。还公开了一种用于影响RNA加工的方法，包括将包含核糖开关的构建体导入所述RNA,其中所述核糖开关能够调节RNA剪接，其中所述RNA包含一个内含子，并且其中对剪切的调控影响到对所述RNA的加工。所述核糖开关可包含一个适体结构域和一个表达平台结构域，其中所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。所述核糖开关可在所述RNA的内含子内。所述核糖开关可由触发分子例如TPP激活。所述核糖开关可以是一种TPP-应答性核糖开关。所述核糖开关可激活剪接。所述核糖开关可抑制剪接。所述核糖开关可改变对RNA的剪接。所述剪接可以非天然地发生。控制剪接的适体区域可出现于例如环5。控制剪接的适体区域也可出现于例如P2茎。例如，所述剪接位点可位于相对于所述适体5，端的-130至-160之间的位置。所述构建体可进一步包括所述内含子。还公开了一种影响基因表达的方法，所述方法包括使(a)—种包含一种构建体的细胞与(b)有效量的核糖开关的触发分子相接触，从而影响基因表达，所述构建体包含一个编码如下一种RNA的核酸分子，所述RNA包含可操作地连接于一个编码区的核糖开关，其中所述核糖开关调节所述RNA的剪接，其中所述核糖开关和编码区是异源的，并且其中对剪切的调节影响到所述RNA的加工。所述核糖开关可为TPP-应答性核糖开关。所述触发分子可为硫胺素或TPP。所公开的方法和组合物的其他优点一部分将在下文的描述中阐明，一部分可以从说明书中获知，或者可通过实施公开的方法和组合物而得知。所公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求书中具体指明的要素和组合实现和获得。应当理解的是，上文的一般性描述和下文的具体描述都仅仅是示例性和解释性的，并不是对本发明要求保护范围的限制。附图包含于本说明书中并作为本说明书的一部分，附图阐述了所公开方法和组合物的一些实施方案，它与文字描述一起作为对所公开方法和组合物的原理的解释。图1显示TPP适体在植物品种中是保守的并具有广泛的分布。(A)多种植物品种的TPP适体序列的比对揭示了序列和结构的高保守性。形成P1-P5茎的核苷酸以不同的阴影高亮显示，星号标识在全部实例之间保守的核苷酸。序列来自拟南芥(j^fl/iVimi)(Ath，NC003071;SEQIDNO:l)，ficfl爐Vfl(Bsa，EF588038;SEQIDNO:2)，甘蓝(5層由C簡卿(BoI，BH250462;SEQIDN0:3)，5oec/^r"Wr/c似(Bst，DU681973;SEQIDN0:4)，番木瓜(CW/ctf/w/w拜)(Cpa，DX471004;SEQIDN0:5)，甜橙(O附s/"e"s/s)(Csi，DY305604;SEQIDN0:6)，烟草(脸C/fl朋/由c"附(Nta，EF588039;SEQIDNO:7)，本塞姆氏烟草(iV/cCVmfl&"//^附/""")(Nbe，EF588040;SEQIDN0:8)，毛果杨(尸印"/"s/f/cA織r/m)(Ptr，JGI，populusgenome，LGJX:7897690-7897807;SEQIDNO:9)，百乐j^艮(丄C"s>戸/譜)(Lja，AG247551;SEQIDNO:10)，番痴(丄戸戸s/謹^c"/e"Z"附)(Les，EF588041;SEQIDNO:11)，马铃薯(5W"Wm附似6eras"附)(Stu，DN941010;SEQIDNO:12)，罗勒(Oc/附"附6aw7ic"附v)(Oba，EF588042;SEQIDNO:13)，牵牛(/;w附o^1wiY)(Ini，BJ566897;SEQIDNO:14)，葡萄(W他W"(/^yi)(Vvi，AM442795;SEQIDNO:15)，水稻(Oo^"sW/v<i)(Osa，NC008396;SEQIDNO:16),偏生早熟禾(i^asecw/fl)(Pse，AF264021;SEQIDNO:17)，小麦(7W/,cm附"e幼V"附)(Tae，CD879967;SEQIDNO:18)，大麦(^onfe"附v"/gare)(Hvu,BM374959;SEQIDNO:19)，高粱0^rg/i"附(Sbi，CW250951;SEQIDNO:20)，火炬松(尸/""stoe由)(Pta，CCGB，Contigl16729RTDS2—8—E12.gl—A021:551-686;SEQIDNO:21)，和小立碗藓/mfe附)(Ppa，gnl网856卯1678(SEQIDNO:22)，gnl|ti|893553357(SEQIDNO:23)，gnl网876297717(SEQIDNO:24)，(Langetal.，2005))。/.附7的序列表示一种cDNA的剪接变体，因此缺少所述适体的5，末端。这些序列的左Pl序列为GCACC,但不包括Ppa2序列(为GCGCC)和Ini序列。这些序列的右Pl序列为GUGUGC，但不包括Lja序列(为GAGUGC)和Les序列(为GCGUGC)。(B、C)基于植物(B;SEQIDNO:25和26)或细菌和古细菌(C;SEQIDNO:27-29)的所有代表的TPP核糖开关适体的共同序列和二级结构模型是相似的。这种交互信息反映了框中碱基对存在的可能性。P5茎上所框碱基对的p值从上到下分别为O.l、0.1、0.01、0.01和0.01。P4茎上所框戚基对的p值从上到下分别为0.01、0.01和0.1。Pl茎上和P3a茎上所框>5^对的p值为0.01。P3茎上所框碱基对的p值从左到右分别为0.1、0.01、0.01、0.01、0.01和0.01。图2显示rH/C3，UTR的结构是保守的。(A)r及/C基因的3，区域的结构和产生的转录物类型是相似的。第一个框表示所述编码区的最后的外显子，其带有所示终止密码子UAA。所述终止密码子后为一个内含子(不包括L.esculentu,其中所述内含子紧接在所述终止密码子之前)，其通常在所有转录物类型(1、II、II)中都被剪接。GU和AG的标志分别标识5'和3，剪接位点。编号1-6的粗线标识长度如(B)中所描述的RNA转录物的6个区域。虚线表示剪接事件，而菱形符号表示所述转录物加工位点。(B)在(A)中定义的核苷酸的数目在7种植物品种中近似。区域6的堆叠柱状图表示不同长度的转录物的识别。(C)在所有检测的品种中，用多聚T引物获得的cDNA上2W/C3，UTR的PCR扩增只产生II型RNA。用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离RT-PCR产物并通过溴化乙锭染色和紫外线照射观察。"M，，表示包含以100个g对递增的DNA的分子量标记道。(D)使用同(C)中使用的cDNA相同的cDNA、I和II型RNA特异的引物组合进行RT-PCR分析。(E)用不同RT引物形成的拟南芥cDNA的I和III型RNA3，UTR的RT-PCR产物。RT所用引物为多聚T、随机六聚物或结合标示出的rH/C末端(适体末端下游221个核苷酸)或如所示的更下游(适体末端下游882个核苷酸)附近的序列特异性引物。NoRT表示使用没有反转录的RNA作为模板源的对照反应。图3显示了rH/C转录物类型对拟南芥中硫胺素水平改变的应答不同。(A)对在添加有0、0.1和1mM硫胺素的培养基上生长14天的拟南芥的r好/C转录物进行qRT-PCR分析。用不同的引物组合分别检测到I、II和III型RNA和总r好/C转录物。用多聚T引物或随机六聚物产生cDNA以检测I型RNA。对每种引物组合将表勤目对于用未添加硫胺素的培养基测得的值标准化。值是三个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。(B)(A)中所述相同样品的7WJC转录物的RNA印迹分析。将20吗总RNA上样到每道中并用与7H/C编码区、I型和II型RNA的延伸3，UTR或对照转录物五/F"J结合的探针分析。7^/C探针的信号示于2到3kb大小的范围内。3'UTR探针产生的信号较弱，因此将其曝光时间相对于其他探针的1天膝光延长到3天。(C)硫胺素处理对拟南芥的rH/c转录物的时间依赖的作用的qRT-PCR分析。幼苗在不含硫胺素的培养基上生长14天然后用50jiM的碌u胺素和0.25mg/ml的Tween80对其喷雾。而对照幼苗用只含Tween80的溶液处理。在4小时和26小时后收集样品并进行qRT-PCR分析。根据用多聚T引物生成的cDNA分析r好/C转录物的量并相对于未应用硫胺素的对照样品的值(空心条)标准化。值是三个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。(D)在野生型(WT)和硫胺素相对改变。幼苗在不含硫胺素的培养基上生长12天然后通过qRT-PCR分析T^/C转录物类型的量。数据被相对于WT样品的值标准化并反映三次重复的平均值，误差条表示标准偏差。图4显示7^/C的长3'UTR造成不依赖适体功能的基因表达的降低。(A)拟南芥的rH/CIII型RNA(SEQIDNO:30和31)剪切后产生的所述TPP适体的二级结构模型。Pl和P2茎上加灰色阴影的核苷酸标识与原始未剪接适体相比的g改变。黑框内的核苷"示发生如图所示的改变从而生成不与TPP结合的突变Ml和M2。(B)TPP结合(A)中所示的剪接适体的直读探测分析。各道包括未反应的(NR)、用RNaseTl(Tl)部分消化后或用碱(-OH)部分消化后上样的RNA。对点1和2进行定量以建立(C)中所示的KD。(C)曲线表示自发剪切的RNA标准化分数相对于(B)中点1和2的TPP浓度。(D)包含与萤火虫荧光素酶(LUC)编码区的3，末端融合的拟南芥II型或III型RNA的3，UTR的才艮告构建体的体内表达分析。构建体M1和M2基于III型RNA的3'UTR,但包含(A)中所示的突变。LUC-IIIM1，包含构建体LUC-IIIM1的反向3，UTR序列。在瞬时本塞姆氏烟草(A7cC//m6e"^"w/"mi)表达试验中分析才艮告构建体并将值相对于海肾共表达荧光素酶基因的值标准化。将表^目对于包含II型RNA的3，UTR的融合构建体标准化。所示数据是三个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。(E)含有拟南芥(At)或本塞姆氏烟草(Nb)的r及/cII型或III型RNA的3，UTR的EGFP才艮告融合构建的qRT-PCR分析。将表勤目对于共表达DsRED报告基因标准化并相对于包含II型3，UTR的构建体标准化。所示数据是两个代表性实验的平均值，误差条表示标准偏差。图5显示核糖开关功能的体内分析。(A)剪下稳定转染的表达与五GF户3，末端融合的At77//C的完整3，区域的报告融合蛋白的拟南芥系的叶子并与叶柄在水中或含0.02。/。硫胺素的水中培育。在处理开始后的0、48和72小时检测EGFP荧光。图中示出了三次重复的数据的一个代表性集合，其中数字标识一个转基因系的不同叶子。(B)(A)中所示的叶子在三个时间的EGFP荧光定量。所示数据代表每片叶子的平均荧光密度和标准偏差。图中还示出了WT叶子的平均背景荧光。(C)在水中或0.02。/o硫胺素中培育72小时的叶子的总EGFP和r好/C转录物的qRT-PCR分析。转录物总量相对于内对照转录物标准化并相对于水处理样品中的转录物丰度标准化。值是使用不同转基因系的四个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。(D，E)在无外源硫胺素的存在下生长的拟南芥报告转化体的EGFP和7TWC转录物类型的不同3，UTR的RT-PCR分析。为生成cDNA,如图所示使用了多聚T引物、随机六聚物或两个不同基因特异性的引物(与所述适体末端下游221或882个核苷酸结合)。正向引物对EGFP(左)或r及/c(右)编码区的最后一个外显子的末端是特异的，而反向引物为多聚T引物(D)或与所述适体末端下游221个核苷酸的区域同源。(E)分离RT-PCR产物并如图2的描述所述进行观察。M表示包含以100个碱基对递增的DNA的分子量标记道。NoRT表示用无反向转录的RNA作为模板来源的对照反应。1-1和1-2分别代表带有未剪接的或剪接的在终止密码子后的上游内含子的I型RNA。(E)中多聚T反应中最下面的带来自所述RT反应中剩余的多聚T引物对rHJCII型RNA的扩增。其他未标记的带对应通过全部RT-PCR产物的克隆和测序确认的非特异性扩增。图6显示适体突变对核糖开关功能的作用。(A)与EGFP融合的来自拟南芥基因组序列并位于rH/C的3，区域的WTTPP适体的二级结构模型和序列(SEQIDNO:32和33)。黑框内的核苷^JL生如图所示的改变从而生成妨碍TPP结合的突变M2、M3和M4。(B)表达含有WT适体序列或突变型M2、M3和M4的报告构建体的拟南芥转化体的叶子的EGFP荧光定量。将叶子切下并在水或0.02%>琉胺素中与叶柄培育72小时后进行荧光分析。值为至少3个使用不同转基因系的独立实验的平均值。误差条代表标准偏差。(C)(B)所述的拟南芥转化体中EGFP和7H7C转录物含量的qRT-PCR分析。(用对照转录物标准化的)转录物的量相对于水处理样品中的转录物丰度标准化。值为2-4个使用不同转基因系的独立实验的平均值。误差条代表标准偏差。(D，E)带有突变M2或M3的拟南芥转化体的EGFP和7H/C转录物的RT-PCR分析。如图5D和5E的描述所述进行RT-PCR分析。正向引物对EGFP或7H/C编码区的最后一个外显子的末端是同源的，而反向引物为多聚T引物(D)或与所述适体末端下游221个核苷酸的区域互补(E)。Kbp表示千4^对。图7显示植物中核糖开关功能的机制。(A)TPP导致5，剪切位点附近的RNA结构的改变，所述结构对r好/cni型RNA的形成有重要作用。为进行直读探测，将5，端用32P标记的起始于5'剪接位点(+l)上游14个核苷酸并延伸至TPP适体3，末端的拟南芥的RNA(核苷酸-14-261)在存在(+)或不存在(-)10jiMTPP的条件下培育，并且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离所产生的自发切割产物。标记物为用RNaseTl(Tl)或碱COH)部分消化的RNA。该图示出了所示泳道中的带的相对强度。(B)5，剪接位点区域和所述TPP适体的P4-P5茎之间的碱基配对潜能(SEQIDNO:34-47;互补核苷酸加有阴影)。互补核苷酸链也存在于所有其他可获得的植物7W/CmRNA序列中。(C)植物中rH/CTPP核糖开关功能的模型包括控制转录物的剪接和可变3，末端加工。当TPP浓度低时(左)，P4和P5茎部分与所述5，剪接位点相互作用从而防止剪接。位于5'剪接位点和所述TPP适体之间的转录加工位点得以保留，并且其作用导致了可高表达的具有短3，UTR的转录物的形成。当TPP浓度高时(右)，TPP与所述适体共转录地结合，这导致阻止与所述5，剪切位点相互作用的结构改变。剪接发生并除去所述转录加工位点。转录继续并且在延伸的3，UTR上的可变加工位点产生ZH/CIII型RNA。所述长3，UTR导致RNA降解增加，从而使rzwc的表达降低。图8显示不同植物品种的rff/C基因中TPP核糖开关的基因组DNA序列文本(SEQIDNO:48-54)。^H标识rH/C开放阅读框的终止密码子，H^A示第一个内仝子(以斜体显示)的5'和3，剪切位点。翻和M标识用于生成III型RNA的剪接位点。II型RNA的3'UTR以下划线标出，所述适体序列以粗体下划线标出。所显示的序列的3，末端对应拟南芥(Jni&Vfo/w/s幼"/fVwi")和稻(Oo;zfls"ftVfl)的基因注释。对于其他植物品种，所显示的序列与RT-PCR识别的3，末端一致。图9显示拟南芥的r及/C启动子与添加硫胺素后ZH/C表达的下调无关。一个包含拟南芥的rH/C启动子的1595bp片段的构建体与报告基因P-葡糖苷酸酶(GUS)融合并转化到拟南芥中。通过qRT-PCR分析在无石克胺素和添加有100jiM硫胺素的培养基上生长的9天大的幼苗中GUS和r及/C转录物的量并相对于对照转录物e五F-2a的表达标准化。数据是三种不同转基因系和三个独立实验的平均值。误差条代表标准偏差。图10示出了r好/C的昼^达。(A)在持续光照下培育48小时的植物的总T^JC转录物的qRT-PCR分析。植物在在无硫胺素和添加有100fiM硫胺素的培养基上光/暗循环(16/8小时)生长11天。在第12天的早上，植物被转移到持续光照下，并每3小时采样。表^目对于在无硫胺素的培养基上生长的植物在时间点0的样品值标准化。误差条代表重复3次的qRT-PCR分析的标准偏差。无误差条表示它们小于所示数据点的直径。(B)III型RNA的qRT-PCR分析。植物材料和数据标准化方法如(A)所述。图ll示出了不同类型的r及/C转录物的3，UTR对报告基因表达的作用。(a)利用瞬时叶侵染试验表达包含egfp和拟南芥的r及/c-n或rH/C-IIIRNA的3，UTR的报告融合构建体并在48和96小时后测量荧光。将结果与用荧光素酶报告基因构建体观察到的结果比较。已知瞬时表达系统可导致转录后基因沉默(PTGS)(JohansenandCarrington，2001;Voinnetetal.，2003)。为评估PTGS可能的作用，在缺少或存在P19的条件下测定了两种3，UTR变型的相对表达，所述P19是一种已知的基因沉说明书第ll/82页默抑制子。将荧光相对于包含rH/C-II3，UTR的构建体的值标准化。值是4个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。所述两种构建体的活性比在P19的共表达后保持不变，说明PTGS不参与所观察到的区别。(B)所示为包含本塞姆氏烟草7H/CII型和III型RNA的3，UTR的EGFP报告构建体在叶侵染试验表达后的相对荧光。将表&目对于包含型RNA的3，UTR的构建体的值标准化。值是两个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。所述结果与用基于拟南芥的3，UTR的构建体观察到的结果等价。图12示出了所述适体的5'侧翼序列中TPP诱导的调节。通过体外转录获得一M始于所述5，剪接位点上游14个核苷酸并延伸到所述适体末端的RNA(-14-261)并用32P标记5，末端。在缺少TPP或存在10jiMTPP的条件下进行直读探测反应后，通过PAGE分离剪切产物。通过RNaseTl处理(Tl)或部分碱COH)消化生成标记物。所述5'剪接位点的G残基被定义为位置1和所述适体跨越核苷酸146-256。所述适体外的TPP依赖的调节主要在与所述5，剪接位点相邻的区域内被观察到。然而，其他结构改变揭示5，侧翼以外的配体依赖的调节可能对控制所述5，剪接位点的结构起重要作用。具体实施例方式通过参考对下文中包括的实施例和具体实施方案的具体描述，以及参考附图及其上下文的描述，可以更容易地理解所公开的方法和组合物。信使RNA通常被认为是遗传信息的被动载体，它可在翻译过程中被蛋白调节因子或小RNA调节因子和核糖体作用。已发现某些mRNA带有天然适体结构域，并且特异性代谢物与这些RNA结构域的结合可导致基因表达的调节。天然核糖开关具有天然RNA通常不具有的两种特殊的功能。其一，mRNA元件可变为不同的结构状态，其中一种结构可作为其靶标代谢物的精确的结合袋。其二，由代谢物诱导的在结构状态之间的变构互变可导致通过几种不同机制之一的基因表达水平的改变。核糖开关通常可被划分为两个独立的结构域一个选择性地结合靶标(适体结构域)，另一个影响基因控制(表达平台)。这两个结构域之间的动态相互作用导致对基因表达的依赖于代谢物的变构控制。已识别了不同类别的核糖开关，这些不同类别的核糖开关表现出选择性地识别激活化合物(在本文中被称为触发分子)。例如，辅酶B12、甘氨酸、硫胺素焦磷酸(TPP)和黄素单核苷酸(FMN)激活存在于如下的基因中的核糖开关，所述基因编码这些化合物的代谢或转运途径中关键的酶。每一类核糖开关的适体结构域与高度保守的共有序列和结构相一致。因此，可使用序列同源性检索来识别相关的核糖开关结构域。已在细菌、古细菌和真核生物等多种生物中发现了核糖开关结构域。已报道了在真细菌中可感受10种不同的代谢物的12种以上结构类的核糖开关(Mandal2004;Winkler2005;Breaker2006;Fuchs2006;Roth.AeubacterialriboswitchselectiveforthequeuosineprecursorpreQicontainsanunusuallysmallaptamerdomain.Nat.Struct.Mol.Biol.(2007))，并且大量的其他类正在被表征。每种核糖开关的适体结构域可通过其甚至在亲缘关系远的生物之间仍保持高度保守的核苷酸序列(Rodionov2002;Vitreschak2002;Vitreschak2003)和折叠结构(Nahvi2004;Batey2004;Serga,2004jMontenge2006;Thore2006;Serga丽2006;Edwards2006)进行区分。核糖开关通常包括一个对适体的代谢物结合应答时可调节基因表达的表达平台，但表达平台在序列、结构和控制机制上可广泛地不同。适体异常的保守水平使得可使用生物信息学在不同生物中识别相似的核糖开关代表。现今，已经从所有3个生命域中识别了仅与TPP核糖开关适体共有序列一致的序列(Sudarsan2003)。虽然从真菌(Sudarsan2003;Galagan2005X图5)和植物预测的一些真核TPP适体已显示可结合TPP(Sudarsan2003Yamauchi)，但是代谢物结合通过何种机制控制基因表达此前尚是未知的。在真菌中，每个TPP适体均位于5，非翻译区(UTR)内含子或mRNA蛋白编码区中，这暗示mRNA剪接受代谢物结合的控制(Sudarsan2003;Kubodera2003)。在植物中，每个TPP适体残基都位于mRNA的3，非翻译区(UTR)内或蛋白编码区内。已发现，植物TPP应答性核糖开关影响其所在的所述RNA的加工。A.核糖开关RNA的一般性结构细菌核糖开关RNA是主要位于特定mRNA主编码区域的5，非翻译区(5，-UTR)的基因控制元件。结构性探查研究(下文将详述)发现核糖开关元件通常包括两个结构域作为配体结合结构域的天然适体(T.Hermann,D.J.Patel，2000，287，820;L.Gold,etal"及ev/ew0/5iVc/^附/对o;1995，64，763)和与参与基因表达的RNA元件(例如Shine-Dalgarno(SD)元件；转录终止茎)相接的"表达平台"。上述结论是基于下述观察结果体外合成的适体结构域在不存在表达平台的条件下与合适的配体相结合(见美国专利申请公布文本No.2005-0053951的实施例2、3和6)。此外，结构性探查研究表明，在独立检测的时候大多数核糖开关的适体结构域采用一种特定的二级和三级结构折叠，这基本上与存在完整的5，前导RNA时检测到的适体结构相同。这表明在许多情况下，适体结构域作为与独立于表达平台折叠的一个模块单元(见美国专利申请公布文本No.2005-0053951的实施例2、3和6)。适体结构域的配体结合状态或未结合状态最终通过表达平台来反映，表达平台可以对基因表达产生影响。核糖开关作为一个模块元件的观点被以下事实进一步支持适体结构域在多种生物之间是高度保守的(TPP核糖开关甚至在不同生物界之间都是保守的)(N.Sudarsan，etal.，iAC42003,9,644)，而表达平台在序列、结构和控制附带开放阅读框表达的机制方面都有所变化。例如，配体结合到枯草芽孢杆菌(及s"6说/s)的mRNA的TPP核糖开关上可导致转录终止(A.S.Mironov，etal.，ce//2002，111，747)。这种表达平台与大肠杆菌(￡"c0//)幼ZMmRNA的TPP核糖开关的表达平台在序列和结构上均不同，大肠杆菌幼ZMmRNA的TPP核糖开关与TPP结合时会通过SD阻断机制导致对翻译的抑制(见美国专利申请公布文本No.2005-0053951的实施例2)。这两种转录单位的TPP适体结构域很容易被识别，并且具有几乎相同的功能特征，但U因控制机制和实现该机制的表达平台则相当不同。核糖开关RNA的适体结构域通常长度为~70至170个核苷酸(美国专利申请公布文本No.2005-0053951的附图11)。这一结果有些出人意料，因为体外进化实验识别了多种结合小分子的适体，它们的长度相当短，并且结构复杂(T.Hermann,D.J.Patel，Sc/ewce2000，287，820;L.Gold,etal"Jwwfl/及ev/ew丑i》c/^附/s/ij1995,64，763;M.Famulok，Cw/re"f0/;/"/wi,ViS^"""ni/5,Wogj;1999，9，324)。虽然天然适体序列相对于人工适体在复杂性和信息含量上的显著增加的原因还需要进一步的确证，但是相信这种复杂性是形成具有高亲和力和高选择性功能的RNA受体所需要的。配体-核糖开关复合物的表观KD值从低纳摩尔量至低微摩尔量不等。还值得注意的是，当一些适体结构域与附带的表达平台相分离时，表现出比完整核糖开关更高的(~10至IOO倍)对靶配体的亲和力(见美国专利申请公布文本No.2005-0053951的实施例2)。可以推测，对由完整的核糖开关RNA所需的多种不同的RNA构象进行采样中有消耗能量，这一点通过配体亲和力的损失而反映出来。由于适体结构域必须作为分子开关，这可能提高了天然适体的功能性要求，这一点可能也有助于解释它们为什么有更复杂的结构。B.TPP核糖开关辅酶硫胺素焦磷酸(TPP)是维生素B1的活性形式，它是多种蛋白催化的反应中必需的参与者。来自所有3个生命域的生物(包括细菌、植物和真菌)使用感受TPP的核糖开关来控制负责输入或合成硫胺素及其磷酸化衍生物的基因，这就使得该类核糖开关成为分布最广的感受代谢物的RNA调节系统的成员。其结构显示一种折叠的RNA,其中一个亚结构域形成TPP的4-氨基-5-羟曱基-2-曱基嘧咬部分的嵌入袋，而另一个亚结构域形成这样的一个更宽袋，即该袋使用二价金属离子和水分子以使得桥式连接至所述配体的焦磷酸部分。这两个袋所处的位置可使其作为识别扩展构象的TPP的分子测量设备发挥功能。中央噻唑部分不被RNA识别，调:胺素代谢基因的表达。天然'配体ii药物样类似物;可稳定由所述核糖开关控制的二级和三级结构元件，以调节mRNA编码蛋白的合成。此外，该结构可提供这样的认识，即折叠的RNA如何能形成与蛋白遗传因子形成的结合袋相当的精确结合袋。在丝状真菌粗糙脉孢菌中检查了3种TPP核糖开关，发现通过控制mRNA剪接(Cheah2007),—种TPP核糖开关激活基因表达，且另两种TPP核糖开关抑制基因表达(Cheah2007)。对于编码TTP代谢中涉及的蛋白的NMT1mRNA前体，阐明了一种涉及核糖开关介导的碱基配对改变和可变剪接控制的详细机制(Cheah2007)。这些结果证明，真核细胞利用代谢物结合的RNA来调节对关键生物化学过程的控制重要的RNA剪接事件。已发现，TPP核糖开关存在于所检查的所有植物品种的硫胺素生物合成基因r好/C的3，非翻译区(UTR)。所述7H/CTPP核糖开关控制具有可变3，UTR长度的转录物的形成，这影响mRNA稳定性和蛋白产量。已发现，对核糖开关介导的可变3，末端加工的调节对r及/c表达的TPP依赖的反馈控制起关键作用。所述数据揭示了一种机制，其中代谢依赖的RNA折叠的改变控制mRNA的剪接和可变3，末端加工。TPP核糖开关存在于多种植物品种的硫胺素代谢基因r及/c的3'UTR中。具有可变3'UTR长度的r及/C转录物的形成依赖于核糖开关的功能，并根据细胞TPP水平的变化调节r及/c表达的反馈调控。所述数据表明，3'UTR长度与转录稳定性有关，从而建立了通过3，末端加工进行基因控制的基础。本发明给出了植物中TPP核糖开关的功能的详细机制(实施例1)，其包括r^H/CmRNA的剪接和不同3'末端加工的适体介导控制。前人(Sudarsanetal.，2003)已经报道了植物品种拟南芥(Jm^Vsto/w/yZ/r<i/iVi/m)、稻(Oo^i^rftVa)和偏生早熟稻(i\<iseci/m/")的TH/C基因的3，UTR中高度保守的TPP结合适体的存在。通it^t其他植物品种的r及/c基因的测序和进行符合所述TPP适体共有序列的核苷酸序列的数据库搜索扩大了植物TPP适体代表的收集。获得cDNA序列后，克隆品种的基因组DNA的相应区域并测序(具体见实验方法部分)，从而得到原始和加工后的mRNA分子的序列。所有可获得的植物TPP适体序列的比对揭示了由茎Pl-P5组成的核苷酸序列和二级结构的高度保守水平(图1A)。植物(图IB)和丝状真菌(Cheahetal.，2007)的真核TPP核糖开关适体与其在细菌和古细菌中的等价物(图1C)(Winkleretal.，2002;Rodionovetal.2002)相比的主要不同在于，细菌代表中通常总是缺少P3a茎，而真核生物中P3茎的长度是可变的。这两个区域都不参与TPP结合(EdwardsandFerre-D'Amare，2006;Serganovetal"2006;Thoreetal"2006;Cheahetal"2007)，因此这些不同应该不会影响配体结合的特异性。在所有已知的单子叶植物、双子叶植物和针叶火炬水>(P/w"stoe由)的T^/C实例的3，UTR中都发现了所述TPP适体。有趣的是，在莒藓小立碗藓(/mte"s)中，所述TPP适体存在于r〃/C的3，UTR中(Ppal)，并且也存在于与硫胺素生物合成基因THI4同源的两个基因的3，区(Ppa2，Ppa3)。后面的发现和真菌也具有与多种不同基因有关的TPP适体的发现(Cheahetal.，2007)表明，真核生物似乎使用同一类核糖开关的变型以根据一种关键代谢物的浓度变化来控制多个基因。植物TPP适体的一个显著特征是核苷酸序列的高度保守水平。在所有植物实例中大约80。/。的核苷酸(不包括P3茎)是保守的，相反，丝状真菌中只有不到40%是保守的。植物TPP适体之间的大多数区别都存在于所述P3茎中，其在长度和序列上都可发生变化。此外，所述P3茎的长度还在相同品种的TPP适体代表之间改变，如在小立碗藓中发现的(图1A)。r好/C中延长的P3茎和THI4中非常短的P3茎的存在表明，对所述适体的这一组分没有物种特异性的要求。对植物中TPP核糖开关的调控涉及到对mRNA转录物的剪接和可变3，末端加工的代谢物介导的控制(图7C)。当细胞中TPP浓度低时，所述适体与所述5，剪接位点相互作用并阻止剪接。此内含子带有一个允许转录物剪切和多腺苷酸化的主要加工位点。从此位点的加工生成带有3，UTR和产生7W/C基因高表达的rH/C-II转录物。当TPP浓度高时，TPP与所述适体的结合阻止与所述5，剪接位点配对。结果，所述5，剪接位点变得可接触，并用于除去所述主要加工位点的剪接事件。随后转录延长至lkb，并且位于下游的加工位点的使用产生带有长很多的3，UTR的RNA。所述长3，UTR使RNA降解增加，并且7^/C表达降低。前人的研究表明，延长的转录发生在无转录物加工的情况下，从而揭示了这些加工的相互关联性(Buratowski，2005;Proudfoot，2004;Proudfootetal"2002)。TPP核糖开关还在美国专利申请公开文本No.US-2005-0053951中被详述，No.US-2005-0053951的全部内容以援引的方式纳入本文，还具体以援引的方式纳入它对TTP核糖开关结构、功能和用途的描述。被明确考虑的是，美国专利申请公开文本No.US-2005-0053951的任何主题和描述，特别是美国专利申请公开文本No.US-2005-0053951中对TTP核糖开关结构、功能和用途的任何描述均可以具体地被包括或者排除在本文公开的其他主题之外。应理解，如不另外说明，公开的方法和组合物不限于特定合成方法、特定分析技术或具体试剂，因此可有所改变。还应理解本文所用的术语只是为了描述具体实施方案，而不意欲作出限制。材料本文公开了可用于所7>开的方法和组合物、可与之^:合使用、可用于其制备或作为其产品的材料、组合物和组分。本文公开了这些和其他材料,应理解当公开这些材料的组合、子集、相互作用、分组等时，虽然可能没有明确公开具体的这些化合物的各个体的和总体的组合以及排列的每一种，但每种都在本文中明确地考虑和描述。例如，如果公开和讨论了核糖开关或适体结构域并且讨论了对包括所述核糖开关或适体结构域的若干分子作出的若干修饰，那么除非特别作出相反的说明，否则每种核糖开关或适体结构域的组合和排列以及可能的修饰都会被具体考虑。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，还7>开了一个组合分子的实例A-D,那么即使没有单独提到每种组合，每种组合也都被独立和综合地考虑了。因此，在此实例中，才艮据A、B和C;D、E和F;以及实例组合A-D的公开内容，A画E、A-F、B國D、B-E、B画F、C-D、C國E和C-F组合的每一个都#皮具体地考虑并应认为被7>开。类似地，它们的任何子集或组合也被特别考虑和公开。因此，例如，根据A、B和C;D、E和F;以及实例组合A-D的公开内容，子集A-E、B-F和C-E被具体地考虑并应认为被公开。此概念适用于本申请所有方面，包括但不限于制备和使用所公开组合物的方法的步骤。因此，如果有多个可实施的其他步骤，应理解每个其他步骤都可与所公开方法的任何具体实施方案或实施方案组合一起实施，并且每个这种组合都被具体地考虑且应认为被公开。A.核糖开关核糖开关是作为待表达RNA分子的一部分并且与触发分子结合时会改变状态的表达控制元件。核糖开关一般可被分为两个独立结构域一个选择性地与把标结合(适体结构域)，而另一个影响基因控制(表达平台结构域)。这两个结构域之间的动态相互作用导致对基因表达的代谢物依赖的变构调控。公开了分离和重组的核糖开关、含有这种核糖开关的重组构建体、与这种核糖开关可操作地连接的异源序列以及包含这种核糖开关、核糖开关重组构建体和与异源序列可操作地连接的核糖开关的细胞和转基因生物体。例如，所述异源序列可为编码包含报告蛋白或肽在内的目的蛋白或肽的序列。优选的核糖开关是天然存在的核糖开关或衍生自于天然存在的核糖开关。例如，适体结构域可以是天然存在的核糖开关的适体结构域或衍生自于天然存在的核糖开关的适体结构域。所述核糖开关可以包括人工适体或者任选地排除人工适体。例如，人工适体包括经体外演化和/或体外选择设计或选择的适体。所述核糖开关可包含天然存在核糖开关的共有序列。多种核糖开关的共有序列记载于美国申请公开文本No.2005-0053951中，例如在图11中。植物TPP应答性核糖开关的共同序列示于图1B中，具体实例示于图1A中。本文公开了一种可调节的基因表达构建体，所述构建体包含一个编码如下一种RNA的核酸分子，所述RNA包含可操作地连接于一个编码区的核糖开关，其中所述核糖开关调节所述RNA的剪接，其中所述核糖开关和编码区是异源的，并且其中剪切调节影响所述RNA的加工。所述核糖开关可调节所述RNA的可变剪接。所述核糖开关可包含一个适体结构域和一个表达平台结构域，其中所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。所述RNA可进一步包含一个内含子。所述核糖开关可在所述RNA的3'非翻译区中。所述内含子可在所述RNA的3'非翻译区中。RNA加工位点可在所述内含子中。所述内含子的剪接可从RNA上除去所述RNA加工位点，从而影响所述RNA的加工。对所述RNA加工的影响可包括由所述RNA加工位点介导的所述RNA的加工的消除。对所述RNA加工的影响可包括转录终止中的改变。对所述RNA加工的影响可包括所述RNA的降解的增加。对所述RNA加工的影响可包括所述RNA的更新的增加。所述核糖开关可与所述内含子的3，剪接位点部分重叠。所述内含子的剪接可降低或消除所述核糖开关被激活的能力。所述剪接位点可为一个5，剪接位点。所述核糖开关可在所述RNA的一个内含子内。RNA加工也可不依赖或不参与剪接而被调节或影响。所述表达平台结构域可包括所述内含子中的剪接位点。所述表达平台结构域可包括在所述内含子末端的剪接位点(即5'剪接位点或3，剪接位点)。所述RNA可进一步包括一个内含子，其中所述表达平台结构域包括所述内含子中的分支位点。所述剪接点可在所述核糖开关被激活时具有活性。所述剪接点可在所述核糖开关未被激活时具有活性。所述核糖开关可被一个触发分子如焦磷酸硫胺素(TPP)激活。所述核糖开关可为TPP-应答性核糖开关。所述核糖开关可激活剪接。所述核糖开关可抑制剪接。所述核糖开关可改变所述RNA的剪接。所述RNA可具有分支结构。所述RNA可为前体mRNA。所述适体受剪接控制的区域可位于例如P4和P5茎中。所述适体受剪接控制的区域也可位于例如环5中。所述适体受剪接控制的区域也可位于例如P2茎中。因此，例如，表达平台结构域可与所述P4和P5序列、环5序列和/或P2序列相互作用。这些适体序列通常只在触发分子未结合于所述适体结构域时可与所述表达平台结构域相互作用。所述剪接位点和/或分支位点可位于例如相对于所述适体的5，末端的-130到-160之间的位置上。所述RNA可进一步包括第二个内含子，其中所述第二内含子的3，剪接位点位于相对于所述适体结构域的5'末端的-220到-270之间的位置。还公开了一种影响RNA加工的方法，包括将包含核糖开关的构建体引入所述RNA，其中所述核糖开关能够调节RNA的剪接，其中所述RNA包含一个内含子，其中剪接调控影响所述RNA的加工。核糖开关可包含一个适体结构域和一个表达平台结构域，其中所述适体结构域和表达平台结构域是异源的。所述核糖开关可在所述RNA的一个内含子内。所述核糖开关可被一个触发分子如TPP激活。所述核糖开关可为TPP-应答性核糖开关。所述核糖开关可激活剪接。所述核糖开关可抑制剪接。所述核糖开关可改变所述RNA的剪接。所述剪接可非天然地发生。所述适体受剪接控制的区域也可位于例如环5中。所述适体受剪接控制的区域也可位于例如P2茎中。所述剪接位点可位于例如相对于所述适体的5，末端的-130到-160之间的位置上。所述构建体可进一步包含所述内含子。还公开了一种影响基因表达的方法，所述方法包括使(a)—种包含一种构建体的细胞与(b)有效量的核糖开关的触发分子相接触，从而影响基因表达，所述构建体包含一个编码如下一种RNA的核酸分子，所述RNA包含可操作地连接于一个编码区的核糖开关，其中所述核糖开关调节所述RNA的剪接，其中所述核糖开关和编码区是异源的，并且其中剪切的调节影响所述RNA的加工。所述核糖开关可为TPP-应答性核糖开关。所述触发分子可为硫胺素或TPP。所述核糖开关可改变RNA的剪接。例如，所述核糖开关的活化可允许或促进剪接；允许或促进可变剪接；阻止或降低剪接或主要剪接；阻止或降低可变剪接；或者允许或促进剪接或主要剪接。再例如，失活的核糖开关或使所述核糖开关失活可允许或促进可变剪接；阻止或降低剪接或主要剪接；阻止或降低可变剪接；或者允许或促进剪接或主要剪接。通常，剪接调节的形式可通过所述RNA分子中的所述核糖开关与剪接位点、可变剪接位点和分支位点的物理关系确定。例如，核糖开关的活化/失活一般涉及RNA中可变二级结构(例如碱基配对的茎)的形成和/或破坏，这种结构变化可用于阻碍或暴露功能性RNA序列。核糖开关的表达平台结构域一般包含这种功能性RNA序列。因此，例如，通过以以下方式在核糖开关的表达平台结构域中包含一个剪接点或一个分支位点，可以调节或影响所述RNA的剪接，所述方式即所述剪接点或分支位点在所述核糖开关被激活或失活时交替地被阻碍或被暴露，反之亦然。剪接调控可影响剪接被调控的RNA的加工。例如，所述RNA中的内含子可包括RNA加工信号或位点。所述RNA的剪接可导致所述加工信号或位点的消除。例如，mRNA的3，UTR中的转录终止信号或RNA剪切位点如果位于一个被剪接出所述RNA的内含子中则可被除去。因此，通过本文所述的核糖开关对该内含子的剪接的调控可影响所述RNA的加工。作为另一个实例，可通过内含子或RNA加工系统的不同元件的剪接建立RNA加工信号或位点，可通过内含子的剪接将信号或位点引入一个可操作结构或从所述结构中除去。作为另一个实例，可将RNA加工信号或位点引入一个与所述RNA的其他元件毗邻的可操作结构或从所述结构除去。RNA加工也可被核糖开关直接影响而不受剪接调控的调节。例如，RNA加工信号或位点可位于一个核糖开关的表达平台结构域中。这样，通过所述核糖开关的激活对所述表达平台的结构关系的改变(以及并因此对所述RNA加工信号或位点的结构关系的改变)可通过影响所述RNA加工信号或位点的操作能力而影响加工。所述核糖开关可影响RNA加工。"影响RNA加工"是指所述核糖开关可直接或间接作用于RNA以允许、刺激、降低或阻止RNA加工发生。这可包括，例如，允许任何加工发生。与无核糖开关时发生的加工事件的数目相比，这可使加工增加或者减少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%,或者更多。RNA加工可包括，例如，转录终止、RNA的3，末端的形成、多聚腺苷酸化以及RNA的降解或更新。如本文所用，RNA加工信号或位点是RNA中起调节、发出信号作用或为任何RNA加工事件或条件所需的序列、结构或位置。例如，某些序列或结构可发出转录终止、RNA、剪切或多聚腺苷酸化信号。核糖开关可激活或抑制剪接。"激活剪接"的意思是，核糖开关可直接或间接地作用于RNA以使剪接发生。这可包括例如使任何剪接发生(例如相对于无剪接的单剪接)或者使可变剪接发生。与无核糖开关时发生的剪接事件的数目相比，这可使剪接增加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%,或者更多。"抑制剪接"的意思是，核糖开关可直接或间接地作用于RNA以抑制剪接。这可包括例如阻止任何剪接发生或者减少剪接发生(例如无剪接和单剪接)，或者阻止或减少可变剪接的发生。与无核糖开关时发生的可变剪接考;件的数目相比，这可使可变剪接减少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%,14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。核糖开关可激活或抑制可变剪接。"激活可变剪接"的意思是，核糖开关可直接或间接地作用于RNA以使可变剪接发生。与无核糖开关时发生的可变剪接事件的数目相比，这可使可变剪接增加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、560/0、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%,或者更多。"抑制可变剪接，，的意思是，核糖开关可直接或间接地作用于RNA以抑制可变剪接。与无核糖开关时发生的可变剪接事件的数目相比，这可使可变剪接减少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15。/o、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。核糖开关可影响RNA编码的蛋白的表达。例如，对剪接或可变剪接的调节可影响待翻译RNA的能力、改变编码区或改变翻译起始或终止。例如，可变剪接可导致不存在于正常加工的转录物中的起始密码子或终止密码子(或二者)出现于加工的转录物中。再例如，可变剪接可导致从加工的转录物去除正常的起始密码子或终止密码子。一种用于核糖开关调节的剪接以调节RNA编码蛋白的表达的有效模式为，在RNA的5'非翻译区的内含子中导入一个核糖开关，并包括或利用所述内含子中的起始密码子，使得内含子中的所述起始密码子为所述可变剪接RNA中的第一起始密码子。另一种用于核糖开关调节的剪接以调节RNA编码蛋白的表达的有效模式为，在RNA的5'非翻译区的内含子中导入一个核糖开关，并包括或利用所迷内含子中的短开放阅读框，使得所述阅读框首先出现在所述可变剪接RNA中。RNA分子可具有分支结构。例如，在真菌TPP核糖开关(Cheah2007)中，当TPP浓度低时，新转录的mRNA采用一种封闭第二5，剪接位点的结构，而是分支位点处于可剪接状态。从第一5，剪接位点剪接mRNA前体可的导致1-3型mRNA的产生及NMT1蛋白的表达。当TPP浓度高时，配体与TPP适体的结合可造成RNA折叠的变构改变，以增加所述第二5，剪接位点附近的结构柔性并且封闭所述分支位点附近的核苷酸。所公开的核糖开关，包括其衍生形式和重组形式，通常可来自任何来源，包括天然存在的核糖开关和从头设计的核糖开关。任何这种核糖开关都可用于所公开方法或与之一起使用，条件是它们已被确定可调节可变剪接。然而，可定义不同类型的核糖开关，并且某些这类子类型可用于特殊方法或与之一起使用(一般如本文其他部分所述)。核糖开关类型包括例如天然存在的核糖开关、天然存在的核糖开关的衍生物和修饰形式、嵌合核糖开关和重组核糖开关。天然存在的核糖开关是具有天然存在的核糖开关序列的核糖开关。这种天然存在的核糖开关可以是天然存在的核糖开关即自然界中出现的核糖开关的分离或重组形式。即，所述核糖开关具有相同的一级结构但已被分离或在新的基因或核酸环境中被工程改造。嵌合核糖开关例如可由任何类别或类型或者特定类别或类型的核糖开关的一部分和相同类别或类型或者任何不同类别或类型的不同核糖开关的一部分构成；可由任何类别或类型或特定类别或类型的核糖开关的一部分和任何非核糖开关序列或組分构成。重组核糖开关是已被分离或在新的基因或核酸环境中被工程改造的核糖开关。核糖开关可包含单个或多个适体结构域。包含多个适体结构域的核糖开关的适体结构域可表现出对触发分子的协同结合，也可不表现出对触发分子的协同结合(即所述适体不需表现协同结合)。对后一种情况，所述适体结构域可被称作独立结合物。含有多个适体的核糖开关可含有一个或多个表达平台结构域。例如，含有两个表现出对与其触发分子协同结合的平台结构域。含有多个适e体的核糖开关可含有一个或多个通过接头连接的适体。当这种适体表现出与触发分子协同结合时，所述接头可为协同接头。如果适体结构域具有介于x和x-l之间的希尔(Hill)系数n——其中X是用于分析协同结合的适体结构域数目(或所述适体结构域上结合位点的数目)，则它们可被认为表现出协同结合。因此，例如，如含有两个适体结构域的核糖开关(如甘氨酸应答性核糖开关)的希尔系数在2和1之间，则所述核糖开关可被认为表现出协同结合。应理解所用x值取决于进行协同结合分析的适体结构域的数目，而不一定是核糖开关中存在的适体结构域数目。这是合理的，因为核糖开关可含有多个适体结构域，但只有某些表现协同结合。公开了含有异源适体结构域和表达平台结构域的嵌合核糖开关。即，嵌合核糖开关由一种来源的适体结构域和另一种来源的表达平台结构域构成。所述异源来源可来自例如不同的具体核糖开关、不同类型的核糖开关或不同类别的核糖开关。所述异源适体也可来自非核糖开关适体。所述异源表达平台也可来自非核糖开关来源。经修饰的或衍生的核糖开关可使用体外选择和进化技术生产。通常，用于核糖开关的体外进化技术包括产生一系列变种核糖开关，其中核糖开关序列的一(几)部分发生改变而该核糖开关的其他部分保持不变。然后可对所述系列的变种核糖开关的激活、失活或阻断(或其他功能或结构标准)进行评估，符合目的标准的变种核糖开关被选用或进行进一步演化。(consensusriboswitch)。共有核糖开关可用于指出改变核糖开关的哪一(些)部分来进行体外选择和演化。植物TPP应答性核糖开关的共同序列示于表1B。还公开了调节发生改变的被修饰核糖开关。核糖开关的调节可通过将一个适体结构域可操作地连接至所述核糖开关(其是一个嵌合核糖开关)的表达平台结构域而被改变。然后所述适体结构域可通过例如触发分子对所述适体结构域的作用来介导核糖开关的调节。适体结构域可以任何合适的方式与核糖开关的表达平台结构域可操作地连接，包括例如通过用新的适体结构域替换所述核糖开关正常或天然的适体结构域。通常，任何可激活、灭活或阻断适体结构域所来源的核糖开关的化合物或条件都可用于激活、灭活或阻断所述嵌合核糖开关。还公开了失活的核糖开关。核糖开关可通过共价方式(通过例如使部活。通过这种方式的核糖开关失活是由于例如防止核糖开关与触发分子结合的改变，防止核糖开关与触发分子结合时其状态发生变化的改变，或防止核糖开关在与触发分子结合时其表达平台结构域影响表达的改变。还公开了生物传感器核糖开关。生物传感器核糖开关是在其关联触发分子(cognatetrigger)存在的情况下产生可检测信号的工程改造的核糖开关。可用的生物传感器核糖开关可由阈水平或高于阈水平的触发分子触发。生物传感器核糖开关可被设计以在体内或体外应用。例如，可操作地连接至编码用作信号或参与产生信号的蛋白的报告RNA的生物传感器核糖开关，可通过对细胞或生物体进行工程改造使其包含编码所述核糖开关/报告RNA的核酸构建体从而在体内应用。体外应用生物传感器核糖开关的一个实例是包含构象依赖标签的核糖开关，所述标签的信号根据所述核糖开关的激活状态而变化。这种生物传感器核糖开关优选地使用取自或衍生自天然存在的核糖开关的适体结构域。生物传感器核糖开关可用于多种情况和平台。例如，生物传感器核糖开关可与固体支持物如盘、片、带和孔一起使用。还公开了可识别新触发分子的经修饰的或衍生的核糖开关。识别新触发分子的新核糖开关和/或新适体可通过筛选得到、设计得到或从已知核糖开关衍生得到。这可通过例如以下的步骤实现产生一系列核糖开关的适体变种，在目的化合物存在下评估所述变种核糖开关的激活情况，选择被激活的变种核糖开关(或者，例如被最大程度地或最具有选择性地激活的核糖开关)和重复这些步骤直到产生具有所需活性、特异性、活性和特异性的组合或其他性质的组合的变种核糖开关。通常，通过设计或改变表达平台结构域中的被调控链使其与适体结构域的控制链互补，可使任何适体结构域适合与任何表达平台结构域一起使用。或者，可改变所述适体的序列和适体结构域的控制链，从而使所述控制链与表达平台中的具有重要功能的序列互补。公开了包含异源核糖开关和编码区的RNA分子。即，这种RNA分子由来自一个来源的核糖开关和来自另一个来源的编码区构成。所述异源的源可来自例如，不同RNA分子、不同转录物、来自不同基因的RNA或转录物、来自不同细胞的RNA或转录物、来自不同生物体的RNA或转录物、来自不同物种的RNA或转录物、天然序列;s^工或工程改造的序列、特定的核糖开关、不同类型的核糖开关或者不同类别的核糖开关。本文公开的术语"编码区"是指编码氨基酸的核酸的任何区域。这可以包括包含密码子或密码子模板的核酸链，以及这种核酸链在双链的核酸分子情况下的互补序列。不是编码区的核酸区域可被称作非编码区。转录的信使RNA分子一般在5'端和3'端都包括非编码区。真核mRNA分子还可以包括内部非编码区，例如内含子。一些类型的RNA分子可不包括功能性编码区，例如tRNA和rRNA分子。1.适体结构域适体是可与特定化合物和特定类别的化合物选择性结合的核酸区段和结构。核糖开关具有在与触发分子结合时可导致该核糖开关的状态或结构发生改变的适体结构域。在功能性核糖开关中，当触发分子与适体结构域结合时，连接至所述适体结构域的表达平台结构域的状态或结构会发生改变。核糖开关的适体结构域可从任何来源获得，包括例如核糖开关的天然适体结构域，人工适体，经工程改造、选择、演化或衍生得到的适体或适体结构域。核糖开关中的适体的至少一部分通常可与相连的表达平台结构域的一部分例如通过形成茎结构发生相互作用。与触发分子结合时可形成或破坏这种茎结构。多种天然核糖开关的共有适体结构域显示于美国申请公开文本No.2005-0053951的图11和本文他处。这些适体结构域(包括其中包含的所有直接变种)可用于核糖开关。共有序列和结构可明示序列和结构中的变异情况。明示的变异范围内的适体结构域在本文中称为直接变种。这些适体结构域可被修改以产生被修改的适体结构域或变种适体结构域。保守性改变。中度修改包括茎或环(其长度或长度范围被明示)的长度改变小于或等于明示长度范围的20%。在共有结构显示出特定长度的茎或环，或列出或示出长度范围的情况下，环和茎被认为是"明示的"。中度修改包括茎或环(其长度或长度范围未,皮明示)的长度改变小于或等于明示长度范围的40%。中度修改还包括适体结构域未明示部分的功能性变种。公开的核糖开关的适体结构域也可作为适体用于任何其他目的和任何其他环境。例如，在结构变化会影响RNA的功能的情况下，适体可被用于控制核酶、其他分子开关和任何RNA分子。2.表达平台结构域表达平台结构域是核糖开关的一部分，其影响含有所述核糖开关的RNA分子的表达。表达平台结构域通常有至少一部分可与相连的适体结构域的一部分相互作用，如通过形成茎结构。与触发分子结合时可形成或破坏这种茎结构。通常情况下，所述茎结构要么就是表达调控结构，要么防止形成表达调控结构。表达调控结构是可允许、阻止、加强或抑制含有该结构的RNA分子的表达的结构。实例包括SD(Shine-Dalgarno)序列、起始密码子、转录终止子，以及稳定信号和加工信号，例如RNA剪接点和控制元件或多聚腺苷酸化信号和3'终止信号。对于剪接的调节，在表达平台结构域中将包括剪接点、可变剪接点和/或内含子的分支位点包括在内是有用的。这种平台表达结构域与核糖开关的适体结构域中的序列的相互作用可由所述表达平台结构域和所述适体结构域之间的互补序列介导。B.调控构建体如本文其他部分所述，核糖开关可用于调控或影响RNA分子的表达。所述表达平台结构域可被可操作地连接以允许、调节或帮助这种调节和控制。将特定部分序列和结构置于所述表达平台结构域序列之中、附近或与其结合是有用的。例如，公开的TPP核糖开关可在RNA的3，UTR中并与内含子所述3，UTR的一个内含子相连。这些结合序列可称为核糖开关调控的构建体或调控构建体。在本文中，所述调控构建体可包括所述核糖开关(包括适体结构域和表达平台结构域)、所述调控内含子(其可包括表达平台结构域和部分所述适体结构域)和其他外源3'UTR序列。所述外源3，UTR序列任选地包括来自所述核糖开关的序列。这可倚赖于例如所述核糖开关和调控构建体的设计、对所述内含子是否发生剪接或如何影响RNA加工。为方便，所述选项之一——"所述RNA的活'性和/或主要形式中的3，UTR序列，可称为活性3，UTR序列。作为一个实例，所述rH/CII型RNA的3，UTR序列是这些RNA的活性3，UTR序列。由于所公开的核糖开关和构建体可调控和影响RNA加工，因此所述调控构建体也可包括并非是所述核糖开关、所述内含子或所述活性3，UTR序列的一部分的其他序列。例如，所公开的rH/CRNA包括活性3，UTR序列的3'末端序列和所述核糖开关的适体结构域之间的序列(见图8)。这些序列可称为间隔3，UTR序列。所公开的构建体和RNA可包含核糖开关、内含子、活性3，UTR序列和间隔3，UTR序列。如上面和本文其他部分所述，这些元件和序列的某些可部分重叠。这些构建体的实例在实施例1中描述并示于图8。图8显示这些调控构建的天然形式的实例。使用同一天然调控构建体的核糖开关、内含子、活性3，UTR序列和间隔3，UTR序列是有用的。因此，例如，天然基因中从终止密码子到所述核糖开关的3，末端的整个区域可一起用于与异源编码序列可操作地连接的调控构建体中。实施例l描述了这些构建体的实例。或者，来自不同调控构建体的不同序列可被替代，或者不同或衍生的核糖开关或适体结构域可与其他内含子、活性3，UTR序列和/或间隔3，UTR序列结合。例如，共有或衍生的适体结构域可用于调控构建体。C.触发分子触发分子是可激活核糖开关的分子和化合物。这包括核糖开关的天然或正常的触发分子和其他可激活核糖开关的化合物。天然或正常触发分子是给定的天然核糖开关本来就有的触发分子，或者对于某些非天然核糖开关而言是这样的触发分子该核糖开关针对该触发分子被设计或该核糖开D.化合物还公开了可激活、灭活或阻断核糖开关的化合物和含有这些化合物的组合物。核糖开关通过结合或去除触发分子来起到控制基因表达的作用。化合物可用于激活、灭活或阻断核糖开关。核糖开关的触发分子(以及其他激活化合物)可用于激活核糖开关。触发分子以外的化合物通常可用于灭活或阻断核糖开关。核糖开关也可通过例如从所述核糖开关所在处除去触发分子而失活。核糖开关可通过例如与不激活该核糖开关的触发分子类似物结合而被阻断。还公开了(例如通过改变所述RNA的剪切或加工)改变RNA分子或编码RNA分子的基因的表达的化合物，其中所述RNA分子包含核糖开关。这可通过使化合物与所述RNA分子接触来实现。核糖开关通过结合或去除触发分子来起到控制基因表达的作用。因此，将包含核糖开关的目的RNA分子置于激活、灭活或阻断所述核糖开关的条件下，可(例如通过改变所述RNA的剪切或加工)改变所述RNA的表达。表达可因例如转录被终止或核糖体与所述RNA的结合受到阻断而改变。与触发分子的结合可减少或阻止所述RNA分子的表达，或者可促进或增加所述RNA分子的表达，这取决于核糖开关的性质。还公开了用于调节RNA分子或编码RNA分子的基因的表达的化合物。还公开了通过激活、灭活或阻断合物。如果所述基因对含有它的细胞或生物体的存活是必需的，那么激活、灭活或阻断所述核糖开关可导致所述细胞或生物体的死亡、瘀滞或虚弱。还公开了通过激活、失活或阻断核糖开关来调节经分离、工程改造或重组得到的含有所述核糖开关的基因或RNA的表达的化合物。由于本文公开的核糖开关可控制可变剪接，所以激活、灭活或阻断所述核糖开关可调节基因表达。核糖开关作为对这种调节的一级控制的一个优点是核糖开关触发分子可以是非抗原小分子。还公开了识别可激活、灭活或阻断核糖开关的化合物的方法。例如，述核糖开关的激活情况来识别。如果所述核糖开关被激活，那么所述测试化合物就被识别为可激活所述核糖开关的化合物。可用任何合适的方式评估核糖开关的激活情况。例如，核糖开关可被连接至一个报告RNA，然后在存在和不存在所述测试化合物的情况下测量所述报告RNA的表达、表达水平或表达水平的变化。作为另一个实例，所述核糖开关可包括一个构象依赖标签，其信号根据所述核糖开关的激活状态而改变。这种核糖开关优选地使用取自或衍生自天然存在的核糖开关的适体结构域。可以看出，对核糖开关的激活情况进^f亍评估^^用或不^^用对照测定或测量均可。识别灭活核糖开关的化合物的方法可按类似方式进行。对阻断核糖开关的化合物的识别可通过任何合适的方法来完成。例如，可在已知可激活或灭估所述核糖开关的激活或失活的测定。如果未观察到在所述测试化合物不存在的情况下可观察到的激活或失活，那么所述测试化合物被识别为阻断所述核糖开关被激活或灭活的化合物。还公开了通过识别可激活、灭活或阻断核糖开关的化合物和并所识别出的化合物而制得的化合物。这可以通过例如将本文其他部分公开的化合物识别方法与生产所识别出的化合物的方法结合使用而实现。例如，可通过下述方法制备化合物使待测化合物和核糖开关相接触，评估核糖开关的激活，以及如果核糖开关被待测化合物激活，则制备该激活核糖开关的待测化合物作为所述化合物。还公开了通过检测某种化合物对核糖开关的激活、灭活或阻断作用并生产该经检测的化合物而制得的化合物。这可以通过例如将本文其他部分公开的化合物激活、灭活或阻断评估方法与生产经检测的化合物的方法结合使用而实现。例如，可通过下述方法制^f匕合物使待测化合物和核糖开关相接触，评估核糖开关的激活，以及如果核糖开关被待测化合物激活，则制备该激活核糖开关待测化合物作为所述化合物。检测化合物激活、灭活或阻断核糖开关的能力指的是对以前并不知道可否激活、灭活或阻断核糖开关的化合物的鉴定，以及对已知可激活、灭活或阻断核糖开关的化合物的激活、灭活或阻断核糖开关的能力的评估。还公开了用于激活核糖开关的具体化合物。可用于TPP应答性核糖开关的化合物包括具有下式的化合物该化合物可结合TPP应答性核糖开关或其衍生物，其中R，带正电，其中R2和R3每一个均独立地为C、O或S，其中R4为CH3、NH2、OH、SH、H或不存在，其中Rs为CH3、NH2、OH、SH或H，其中&为C或N,并且其中每个"=，，独立地代表单键或双鍵。还考虑了在按上述定义的化合物中其中Ri为磷酸根、二磷酸根或三磷酸根的情况。在上述定义范围内的每一种化合物都意图在并应被认为是在本文中具体地公开。此外，在上述定义范围内可识别的每个亚群都意图在并应被认为是在本文中具体地公开。因此，特别考虑了任何化合物或化合物的亚群可具体包括在用途中或从用途中排除，或者包括在化合物列表中或从化合物列表中排除。例如，作为一种选择，如果有某一组化合物，其中每种化合物都符合上述定义但并不是TPP、TP或硫胺素，那么该组也是^皮考虑到的。作为另一个实例，如果有某一组化合物，其中每种化合物都符合上述定义而且能激活TPP应答性核糖开关，那么该组也是被考虑到的。硫胺素焦磷酸(TPP)是TPP-应答性核糖开关的触发分子，可激活TPP-应答性核糖开关。吡夂硫胺素焦磷酸可激活TPP-应答性核糖开关。吡啶硫胺素和吡咬硫胺素焦磷酸可独立地及具体地包括在本文公开的化合物、触发分子和方法中，或者从本文公开的化合物、触发分子和方法排除。硫胺素和硫胺素焦磷酸可独立地及具体地包括在本文公开的化合物、触发分子和方法中，或者从本文公开的化合物、触发分子和方法排除。E.构建体、载体和表达系统所公开的核糖开关可在任何合适的表达系统中使用。重组表达可以使用例如质粒等载体来有效实现。载体可包括与核糖开关编码序列可操作地连接的启动子和待表达的RNA(例如，编码蛋白的RNA)。载体还可包括转录和翻译所需的其他元件。本文所述的载体指的是包含外源DNA的任何栽体。因此，载体是可将外源核酸不降解地转移至细胞中的媒介，它包括启动子，可在它转入的细胞中表达所述核酸。栽体包括但不限于质粒、病毒核酸、病毒、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒和人工染色体。可以生产多种适于携带核糖开关调节的构建体的原核和真核的表达载体。这类表达栽体包括例如pET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUC和酵母载体。载体可在例如各种体内和体外环境中使用。病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒、疱渗病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经营养病毒(neuronaltrophicvirus)、辛德毕斯病毒(Sindbis)和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的那些病毒。还可使用与上述病毒具有共同的使其适于用作载体的性质的任何病毒家族。由Verma(1985)描述的逆转录病毒载体包括鼠类马罗尼白血病病毒MMLV和表现MMLV作为载体所需性质的逆转录病毒。通常，病毒栽体包括非结构性早期基因、结构性晚期基因、RNA聚合酶EI转录物、复制和壳体化必需的反向末端重复序列以及控制病毒基因组的转录和复制的启动子。当被基因工程改造用作载体时，通常要移除病毒的一个或多个早期基因，并将一个基因或基因/启动子盒插入到病毒基因组中代替被移除的病毒DNA。"启动子"通常为位于与转录起始位点相对固定的位置发挥功能的一个或多个DNA序列。"启动子，，包括与RNA聚合酶发生基本相互作用所需的核心元件和转录因子，还可包括上游元件和应答元件。"增强子"通常指的是为位于与转录起始位点相对不固定的位置发挥功能的DNA序列，它可以在转录单位的5，(Laimins，1981)或3，(Luskyetal.，1983)。此外，增强子除了可以在编码序列本身之中(Osborneetal.，1984)，也可以在内含子中(Banerjieta1.，1983)。它们的长度通常为10bp至300bp之间，并且以顺式方式发挥作用。增强子的功能是增加邻近的启动子的转录。增强子与启动子类似，也经常含有介导转录的调节的应答元件。增强子经常对表达的调节有决定性作用。用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或有核细胞)中的表达载体还可包括可以影响mRNA表达的转录终止所必需的序列。这些区域在编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中以多腺苷酸化区段的形式被转录。3，非翻译区还包括转录终止位点。优选地，转录单位也包括多腺苷酸化区域。这一区域的一个优点是它增加了被转录的单位像mRNA—样被加工和转运的可能性。多腺苷酸化信号在表达构建体中的鉴定和用途已经广为人知。优选地，在转基因构建体中使用同源的多腺苷酸化信号。载体可包括编码标记物产物的核酸序列。使用这种标记物产物来确定基因是否被送递至细胞以及在送递后是否被表达。优选的标记物基因为编码p-半乳糖普酶的大肠杆菌lacZ基因和绿色荧光蛋白。在一些实施方案中，标记物可为筛选标记物。当这类筛选标记物被成功地转移至宿主细胞中时，如果将宿主细胞置于筛选压力下，则被转化的宿主细胞可以存活。目前广泛使用的有两类不同的筛选策略。第一类A^于细胞代谢，使用离开添加培养基就不能生长的突变细胞系。第二类为显性筛选，它指的是在任何细胞类型中都可使用而不必使用突变细胞系的筛选方案。这些方案通常使用抑制宿主细胞生长的药物。含有新基因的那些细胞可以表达使细胞具有药物抗性的蛋白质，从而可以在筛选中存活。这类显性筛选的实例中使用的药物有新霉素(SouthernandBerg，1982)、霉酚酸(MulliganandBerg，1980)或潮霉素(Sugdenetal"1985)。可以使用遗传物质的直接转移来获得基因转移，所述遗传物质包括在质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒和人工染色体中，但不限于此，或者通过细胞或载体例如阳离子脂质体中的遗传物质的转移来获得基因转移。这类方法为本领域所熟知，并且可以很容易的使之适用于本文所述的方法。转移载体可为任何可将基因送递至细胞内的核苷酸构建体(例如质粒)，或者作为送递基因的总体策略的一部分，例如作为重组逆转录病毒或重组腺病毒的一部分(Rametal.CancerRes.53:83-88，(1993))。用于转染的合适手段包括病毒栽体、化学转染子或物理-机械方法例如电穿孔和DNA的直接扩散，这些手段描述于例如，Wolff,J.A.，etal.，Science,247，1465-1468，(1990);和Wolff，J.A.Nature,352，815-818，(1991)。1.病毒栽体优选的病毒载体为腺病毒、腺伴随病毒、疱渗病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经营养病毒、辛德毕斯病毒和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的那些病毒。还优选的是与上述病毒具有共同的使其适于用作载体的性质的任何病毒家族。优选的逆转录病毒包括鼠类马罗尼白血病病毒MMLV和表现MMLV作为载体所需性质的逆转录病毒。逆转录病毒载体可以比其他载体病毒携带更大的基因载量，即携带转基因或标记物基因，因此是常用的载体。但是它们不能用于非增殖细胞。腺病毒载体相对稳定并易于操作、具有高滴度、可在气溶胶制剂中送递并可以转染非分裂细胞。Pox病毒载体较大并具有多个可插入基因的位点，它们对热稳定，可在室温下储存。优选的实施方案为经过基因工程改造的病毒载体，这样可以抑制宿主生物由病毒抗原引起的免疫反应。优选的这种类型的栽体应携带白细胞介素8或10的编码区域。病毒栽体与大多数将基因导入细胞的化学或物理方法相比，具有更高的处理能力(导入基因的能力)。通常，病毒栽体包括非结构性早期基因、结构性晚期基因、RNA聚合酶m转录物、复制和壳体化必需的反向末端重复序列以及控制病毒基因组的转录和复制的启动子。当被基因工程改造用作载体时，通常要移除病毒的一个或多个早期基因，并将一个基因或基因/启动子盒插入到病毒基因组中代替被移除的病毒DNA。这种类型的构建体可以携带最多达约8kb的外源遗传物质。被移除的早期基因的必需功能通常由经过基因工程改造而反式表达早期基因的基因产物的细胞系提供。i.逆转录病毒载体38逆转录病毒为属于逆转录病毒科的动物病毒，包括任何类型、亚科、属或向性。Verma，I.M.，Retroviralvectorsforgenetransfer.InMicrobiology-1985，AmericanSocietyforMicrobiology,pp.229-232，Washington,(1985)总体描述了逆转录病毒栽体，上述文献以援引的方式纳入本文。将逆转录病毒载体用于基因疗法的方法的实例描述于美国专利No.4,868,116和4,980,286;PCT申请WO90/02806和WO89/07136;以及Mulligan,(Science260:926-932(1993))等文献中，以上文献中的教导以援引的方式纳入本文。逆转录病毒本质上是一个包装，它将核酸负栽包裹在内。核酸负载携带有包装信号，这使得复制出的子代分子可以被有效地包装在包衣中。除了包装信号以外，还有许多复制和复制病毒的包装所需要的顺式作用分子。通常逆转录病毒基因组包括参与蛋白质衣壳形成的gag、pol和env基因。通常使用待转入靶细胞的外源DNA来替代gag、pol和env基因。逆转录病毒载体通常包括用于掺入至包衣的包装信号，起动gag转录单位的信号序列，逆转录必需的元件(包括引物结合位点以结合逆转录的tRNA引物)，在DNA合成过程中引导RNA链转换的末端重复序列，作为DNA合成中第二链合成起始位点的富含嘌呤的序列5，至3，LTR，以及可使DNA状态的逆转录病毒插入到宿主基因组中的LTR末端附近的特异性序列。gag、pol和env基因的移除可以使得约8kb的外源序列被插入到病毒基因组中、,iL^转录以及在复制后被包装到新的逆转录病毒颗粒中。根据每种转录物的大小，上述核酸量足够送递一至多个基因。优选地，在插入物中与其他基因一起含有阳性或阴性的筛选标记物。由于在大多数逆转录病毒载体中，复制机制和包装蛋白(gag、pol和env)已经被移除，通常通过将载体置于包装细胞系中来生产载体。包装细胞系为已被含有复制和包装机制但不含任何包装信号的逆转录病毒转染或转化的细胞系。当携带所选DNA的栽体被转染到这些细胞系中时，包含目的基因的栽体通过辅助细胞提供的顺式机制而被复制并包装到新的逆转录病毒颗粒中。而具有该机制的基因组因为没有必需的信号而不被包装。ii.腺病毒载体对于复制缺陷型腺病毒的构建，前人已有所描述(Berkneretal.，J.Virology61:1213-1220(1987);Massieetal"mol.Cell.Biol.6:2872-2883(1986);Haj-Ahmadetal"J.Virology57:267-274(1986);Davidsonetal"J.Virology61:1226-1239(1987);Zhang"Generationandidentificationofrecombinantadenovirusbyliposome-mediatedtransfectionandPCRanalysis"BioTechniques15:868-872(1993))。使用这些病毒作为载体的优点是它们散播至其他细胞类型的程度是有限的，因为它们可以在初始感染的细胞中复制，但是它们不能形成新的感染性病毒颗粒。重组腺病毒在直接体内送递至下列组织时已表现出可获得很高的基因转移效率气道上皮、肝细胞、血管内皮、CNS实质以及多种其他组织位点(Morsy，J.Clin.Invest.92:1580-1586(1993);Kirshenbaum,J.Clin.Invest.92:381-387(1993);Roessler，J.Clin.Invest.92:1085-1092(1993);Moullier，NatureGenetics4:154-159(1993);LaSalle,Science259:988-990(1993);Gomez-Foix，J.Biol.Chem.267:25129-25134(1992);Rich,HumanGeneTherapy4:461-476(1993);Zabner，NatureGenetics6:75-83(1994);Guzman,CirculationResearch73:1201-1207(1993);Bout,HumanGeneTherapy5:3-10(1994);Zabner，Cell75:207-216(1993);Caillaud，Eur.J.Neuroscience5:1287-1291(1993);和Ragot，J.Gen.Virology74:501-507(1993))。重组腺病毒与野生型或复制缺陷型腺病毒一样，通过结合特异性细胞表面受体而完成基因转导，然后病毒通过受体介导的胞吞作用而内化(ChardonnetandDales,Virology40:462-477(1970);BrownandBurlingham，J.Virology12:386-396(1973);SvenssonandPersson,J.Virology55:442-449(1985);Seth,etal"J.Virol.51:650-655(1984);Seth，etal"mol.Cell.Biol.4:1528-1533(1984);Vargaetal"J.Virology65:6061-6070(1991);Wickhametal"Cell73:309-319(1993))。一种优选的病毒栽体为基于移除了El基因的腺病毒的载体，这些病毒在例如人类293细胞的细胞系中产生。在另一个优选的实施方案中，El和E3基因都被从腺病毒基因组中移除。另一类病毒载体是基于腺伴随病毒(AAV)。这种缺陷型细小病毒是一种优选的载体，因为它可以感染许多种细胞类型，并且对人类没有致病性。AAV型栽体可以转运4至5kb的基因，并且已知野生型AAV可以稳定地插入到第19号染色体上。具有这种位点特异性整合性质的载体为优选的。这种载体的一种特别优选的实施方案是由Avigen，SanFrancisco,CA生产的P4.1C载体，它可包含单纯疱瘆病毒胸苷激酶基因、HSV-tk和/或标记物基因，例如编码绿色荧光蛋白GFP的基因。在病毒和逆转录病毒中插入的基因经常含有启动子和/或增强子以辅助对所需基因产物的表达的控制。启动子通常为位于与转录起始位点相对固定的位置时可以发挥功能的一个或多个DNA序列。"启动子"包含与RNA聚合酶发生基本相互作用所需的核心元件和转录因子，还可包含上游元件和应答元件。2.病毒启动子和增强子得，例如，诸如下列病毒的基因组多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，最优选巨细胞病毒；或者来源于异源哺乳动物启动子例如p肌动蛋白启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子可以方便地以同样包括SV40病毒复制起始位点的SV40限制性片段的形式获得(Fiersetal.，Nature,273:113(1978))。人类巨细胞病毒的即时早期启动子可以方便地以HindmE限制性片段的形式获得(Greenway，PJ.etal.，Gene18:355-360(1982))。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子也在此有用。"增强子"通常指的是为位于与转录起始位点相对不固定的位置发挥功能的DNA序列，它可以在转录单位的5，(Laimins，L.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.78:993(1981))或3，(Lusky，M丄.，etal"Mol.Cellbio.3:1108(1983))。此外，增强子除了可以在编码序列本身之中(Osborne，T.R，etal.，mol.Cellbio.4:1293(1984))，也可以在内含子中(Banerji,J.L.etal"Cell33:729(1983))。它们的长度通常为10bp至300bp之间，并且以顺式方式发挥作用。增强子的功能是增加邻近的启动子的转录。增强子还经常含有介导转录的调节的应答元件。增强子还经常含有介导转录的调节的应答元件。增强子经常对表达的调节有决定性作用。虽然许多来自哺乳动物基因的增强子的序列是已知的(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)，但是通常还是使用来自真核细胞病毒的增强子。优选的实例为在复制起点下游(lateside)的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点下游的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。启动子和/或增强子可以被能触发它们功能的光或特异性化学事件特异性地激活。可以用例如四环素和地塞米;^等试剂来调节系统。也有一些方法通ii暴露于例如y辐照的辐照方法或烷基化化疗药物来增强病毒载体的基因表达。优选地，启动子和/或增强子区域在所有真核细胞类型中都是有活性的。这种类型的一种优选的启动子为CMV启动子(650个碱基)。其他优选的启动子为SV40启动子、巨细胞病毒(全长启动子)和逆转录病毒载体LTF。已显示所有的特异性调节元件都可被克隆和用于构建在特定细胞类型例如黑素瘤细胞中选择性表达的表达载体。神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子已被用于在神经胶质来源的细胞中选择性表达基因。用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或有核细胞)中的表达载体还可包含可以影响mRNA表达的转录终止所必需的序列。这些区域在编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中以多腺苷酸化区段的形式被转录。3，非翻译区还包括转录终止位点。优选地，转录单位也包括多腺苷酸化区域。这一区域的一个优点是它增加了被转录的单位像mRNA—样被加工和转运的可能性。多腺苷酸化信号在表达构建体中的鉴定和用途已经广为人知。优选地，在转基因构建体中使用同源的多腺苷酸化信号。在转录单位的一个优选实施方案中，多腺苦酸化区域来自SV40早期多腺苷酸化信号，由大约400个碱基组成。还优选地，转录单位单独包括其他标准序列或包括其他标准序列和上述序列，改进构建体的表达或稳定性。3.标记物栽体可包括编码标记物产物的核酸序列J吏用这种标记物产物来确定基因是否被送递至细胞以及在送递后是否M达。优选的标记物基因为编码P-半乳糖苷酶的大肠杆菌lacZ基因和绿色荧光蛋白。在一些实施方案中，标记物可为筛选标记物。用于哺乳动物细胞的筛选标记物的实例为二氲叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素和噤呤霉素。当这类筛选标记物被成功地转移至哺乳动物宿主细胞中时，如果将宿主细胞置于筛选压力下，则被转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。目前广泛使用的有两类不同的筛选策略。第一类是基于细胞代谢，使用离开添加培养基就不能生长的突变细胞系。两个实例为CHODHFR-细胞和小鼠LTK-细胞。这些细胞在不添加如胸苷或次黄嘌呤营养物的情况下就不能生长。由于这些细胞缺乏完整的核苷酸合成途径中必需的某些基因，因此除非在添加培养基中提供那种没有的核苷酸，否则细胞就不能存活。另一种补充培养基的方式是将完整的DHFR或TK基因导入缺乏相应基因的细胞中，由此改变它们的生长需求。未被DHFR或TK基因转化的细胞将不能在非添加培养基上生长。第二类为显性筛选，它指的是在任何细胞类型中都可使用而不必使用突变细胞系的筛选方案。这些方案通常使用抑制宿主细胞生长的药物。那些细胞可以表达使细胞具有药物抗性的蛋白质，从而可以在筛选中存活。这类显性筛选的实例中使用的药物有新霉素(SouthernP.andBerg,P.，J.Molec.Appl.Genet.1:327(1982))、霉酚酸(Mulligan，R.C.andBerg，P.Science209:1422(1980))或潮霉素(Sugden，B.etal"mol.Cell.Biol.5:410-413(1985))。这三个实例使用了真核控制下的细菌基因来分别赋予细胞对于合适的药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其他的还有新霉素类似物G418和噤呤霉素。F.生物传感器核糖开关还公开了生物传感器核糖开关。生物传感器核糖开关是经过基因工程改造的核糖开关，它们在存在它们的同种触发分子时产生可检出的信号。可用的生物传感器核糖开关可以在触发分子达到或超过阈值水平时被触发。生物传感器核糖开关可被设计为体内应用或体外应用。例如，与编码作为信号的蛋白质或参与产生信号的蛋白质的报告RNA可操作地连接的控制可变剪接的核糖开关可通过基因工程改造细胞或生物，使其含有编码该核糖开关的核酸构建体从而在体内应用。用于体外的生物传感器核糖开关的一个实例是包括构象依赖性标签的核糖开关，由该标签产生的信号随核糖开关的激活状态而变化。优选地，这种生物传感器核糖开关使用天然存在的核糖开关的适体结构域或由天然存在的核糖开关衍生的适体结构域。G报告蛋白和报告肽为评估核糖开关或生物传感器核糖开关的激活，可以使用报告蛋白或报告肽。报告蛋白或报告肽可以由通过核糖开关调节其表达的RNA编码。实施例中描述了一些特异性报告蛋白的使用。报告蛋白和报告肽的使用已为人所熟知，并可以容易地适于与核糖开关一起使用。报告蛋白可为任意可检出的或产生可检出信号的蛋白质或肽。优选地，该蛋白质或肽的存在可以用标准技术(例如放射免疫测定、放射性标记、免疫测定、酶活性测定、吸附、荧光、发光和蛋白质印迹)检测。更优选地，即使在报告蛋白的水平比较低的情况下，仍然可以使用标准技术对其水平定量。可用的报告蛋白包括萤光素酶、绿色荧光蛋白以及它们的衍生物，例如北美萤火虫(Photinuspyralis)的萤火虫萤光素酶(FL)和海参(Renillareniformis)的海参萤光素酶(RL)。H.构象依赖性标签构象依赖性标签指的是具有下述性质的所有标签:在标签所连接的分子或化合物(例如核糖开关)的形式或构象发生改变的基础上，该标签可以产生荧光强度或波长的变化。在使用探针和引物的情况下，使用的构象依赖性标签的实例包括分子信标(molecularbeacon)、Amplifluors、FRET探针、可切割的FRET探针、TaqMan探针、蝎形引物(scorpionprimer)、焚光三聚体寡聚物(fluorescenttriplexoligos)包括但不限于三聚体分子信标或三聚体FRET探针、荧光水溶性缀合聚合物、PNA探针和QPNA探针。这类标"g——具体而言它们的功能原理——可适于与核糖开关一起使用。一些类型的构象依赖性标签综述于SchweitzerandKingsmore,Curr.Opin.Biotech.12:21-27(2001)中。茎淬灭标签是构象依赖性标签的一种形式，它是位于核酸上的荧光标签，这样当茎结构形成时淬灭部分会接近荧光标签以使得标签发出的荧光被淬灭。当茎结构被破坏时(例如当含有标签的核糖开关被激活时)，淬灭部分就不再接近荧光标签，荧光就会增强。这种效应的实例可见于分子信标、荧光三聚体寡聚物、三聚体分子信标、三聚体FRET探针和QPNA探针中，它们的操作原理也可适于与核糖开关一起使用。茎激活标签是构象依赖性标签的一种形式，它是通过茎结构的形成可以增强或改变荧光的标签或标签对。茎激活标签可包括受体荧光标签和供体部分，当受体和供体相互接近时(当包括标签的核酸链形成茎结构时)，荧光共振能量由供体向受体的转移会使受体发荧光。茎激活标签通常为位于核酸分子(例如核糖开关)上的标签对，这样当核酸分子中形成茎结构时受体和供体就会相互接近。如果茎激活标签的供体部分本身就是荧光标签，那么当它不与受体接近时(也就是未形成茎结构时)它就会以荧光的形式释放能量(通常这种荧光的波长与受体荧光的波长不同)。当茎结构形成时，总体的效果是供体荧光减少和受体荧光增加。FRET探针为使用茎激活标签的一个实例，它的操作原理也可适于与核糖开关一起^L用。I.检测标签为帮助对核糖开关的激活、失活或阻断进行检测和量化，或对核糖开关的激活、失活或阻断后产生的核酸或蛋白质的表达进行检测和量化，可以在检测探针或者检测分子中导入检测标签，或者在表达的核酸或蛋白质中直接导入检测标签。本文中所述的检测标签为可以与核酸或蛋白质直接或间接地相连接、并由此直接或间接地产生可以测量的可检测信号的任何分子。许多这种标签均为本领域技术人员所已知。可用于所公开方法的合适的检测标签的实例为放射性同位素、荧光分子、磷光分子、酶、抗体和配体。合适的荧光标签的实例包括异硫氰酸荧光素(FITC)、5,6-羧甲基荧光素、德克萨斯红(Texasred)、硝基苯-2-氧杂-l，3-二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹酰氯、罗丹明、氨基曱基香豆素(AMCA)、曙红、藻红、BODIPY、CascadeBlue、OregonGreen、芘、丽丝胺(lissamine)、加氧杂蒽(xanthenes)、吖啶、噁溱、藻红蛋白、镧系金属离子的大环螯合物例如量子染料TM、荧光能量转移染料例如噻唑橙乙啡啶异源二聚体、以及花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。其他特异性荧光标签的实例包括3-羟基芘5，8，10-三磺酸、5-羟色胺(5-HT)、酸性品红、茜素*酮、茜素红、别藻蓝蛋白、M香豆素、蒽l^y旨酸、阿斯屈拉崇(Astrazon)亮红4G、阿斯屈拉崇橙R、阿斯屈拉崇红6B、阿斯屈拉崇黄7GLL、阿的平(Atabrine)、金胺(Anramine)、Aurophosphine、AurophosphineG、BAO9(双氨基苯基噁二唑)、BCECF、硫酸小檗碱、双苯酰胺、布兰科福尔(Blancophor)FFG溶液、BlancophorSV、BodipyFl、亮磺基黄素FF(BrilliantSulphoflavinFF)、钙黄绿素蓝(CalcienBlue)、钙绿(CalciumGreen)、卡尔科弗卢尔(Calcofluor)RW溶液、卡尔科弗卢尔白(CalcofluorWhite)、尔科弗卢尔白ABT溶液、尔科弗卢尔白标准溶液、Carbostyryl、CascadeYellow、儿茶酚胺、查纳克林(Chinacrine)、科里膦O、香豆素-鬼笔环肽、CY3.18、CY5.18、CY7、Dans(l画二曱基氨基-萘國5-磺酸)、Dansa(二^J^^t酸)、丹酰NH-CH3，二M苯基噁二唑(DAO)、二曱基氨基-5-磺酸、二吡咯亚曱基二氟化硼、联苯亮黄素7GFF、多巴胺、藻红ITC、吖咬橙(Euchrysin)、FIF(曱醛谦导荧光)、FlazoOrange、Fluo3、荧光胺、Fura-2、Genacryl亮红B、Genacryl亮黄IOGF、Genacryl粉红3G、Genacryl黄5GF、GloxalicAcid、粒状蓝(GranularBlue)、血吟淋(Haematoporphyrin)、Indo誦l、IntrawhiteCf液体、雷可福(Leucophor)PAF、雷可福SF、雷可福WS、丽丝胺罗丹明B200(RD200)、萤黄CH(LuciferYellowCH)、萤黄VS、苏丹红(MagdalaRed)、MarinaBlue、麦西隆(Maxilon)亮黄素10GFF、麦西隆亮黄素8GFF、MPS(MethylGreenPyronineStilbene，甲基绿焦宁均二苯乙烯)、光神霉素、NBD胺、硝基苯并噁二唑(Nitrobenzoxadidole)、去曱肾上腺素、核坚牢红(NuclearFastRed)、核黄(NuclearYellow)、尼龙山(Nylosan)亮黄素E8G、噁二唑、Pacific蓝、碱性副品红(Feulgen)、PhorwiteAR溶液、PhorwiteBKL、PhorwiteRev、PhorwiteRPA、膦3R、酞菁(Phthalocyanine)、藻红蛋白R、PolyazaindacenePontochromeBlueBlack、p卜啉、Primuline、普施安黄(ProcionYellow)、焦宁(Pyronine)、焦宁B、Pyrozal亮黄素7GF、芥奎吖因(QuinacrineMustard)、罗丹明123、罗丹明5GLD、罗丹明6G、罗丹明B、罗丹明B200、罗丹明BExtra、罗丹明BB、罗丹明BG、罗丹明WT、5-羟色胺、塞夫隆(Sevron)亮红2B、塞夫隆亮红4G、塞夫隆亮红B、塞夫隆橙、塞夫隆黄L、SITS(Primuline)、SITS(均二苯乙烯异硫磺酸，StilbeneIsothiosulphonicacid)、均二苯乙烯、Snarf1、磺基罗丹明BCanC、磺基罗丹明GExtra、四环素、瘗漆红R、硫黄素S、硫黄素TCN、硫黄素5、Thiolyte、ThiozolOrange、TinopolCBS、纯蓝(TrueBlue)、Ultralite、荧光素钠(Uranine)B、优微添(Uvitex)SFC、二曱^^(XyleneOrange)和XRITC。可用的荧光标签为荧光素(5-氣基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、罗丹明(5，6-四曱基罗丹明)和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。这些荧光染料的最大吸收和发射波长分别为FITC(490nm;520nm)、Cy3(554nm;568nm)、Cy3.5(581nm;588nm)、Cy5(652nm;672nm)、Cy5.5(682nm;703nm)、Cy7(755nm;778nm)，这l吏得它们可以同时被检测。荧光素染料的其他实例包括6-氯基荧光素(6-FAM)、2，，4，，1，4，-四氯荧光素(TET)、2，，4，，5，，7，，1，4-六氯荧光素(HEX)、2',7，國二甲氧基-4，，5，-二氯-6-羧基罗丹明(JOE)、2，-氯-5，-氟-7，，8，-稠苯-1，4-二氯-6-絲荧光素(NED)和2，-氯-7，-苯基-l，4-二氯-6-絲荧光素(VIC)。荧光标签可由各种来源商购获得，包括AmershamPharmaciaBiotech，Piscataway,NJ;MolecularProbes,Eugene,OR;和ResearchOrganics,Cleveland,Ohio。所关注的其他标签包括那些仅当它们所连接的探针与靶分子特异性46结合时产生信号的标签，其中这类标签包括Tyagi&Kramer,NatureBiotechnology(1996)14:303和EP0070685Bl中所述的"分子信标"。所关注的其他标签包括美国专利No.5,563,037、国际申请WO97/17471和WO97/17076中所述的那些标签。被标记的核苷酸是检测标签的一种可用形式，可以在合成过程中直接导入被表达的核酸中。可以直接导入核酸中的检测标签的实例包括核苷酸类似物例如BrdUrd(5-溴脱氧尿苷，HoyandScWmke，MutationResearch2卯:217-230(1993))、氨基烯丙基脱氧尿苷(Henegariuetal:，NatureBiotechnology18:345-348(2000))、5-甲基胞嘧啶(Sanoetal"Biochim.Biophys.Acta951:157-165(1988))、溴尿核苷(Wansicketal，J.CellBiology122:283-293(1993))和经生物素修饰的核苷酸(Langeretal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:6633(1981))或经过例如地高辛抗原(digoxygenin)的合适的半抗原修饰的核苷酸(Kerkhof，Anal.Biochem.205:359-364(1992))。合适的荧光标记的核苷酸有异硫氰酸荧光素-dUTP、花青國3画dUTP和花青-5-dUTP(Yuetal，NucleicAcidsRes"22:3226-3232(1994))。对于DNA而言优选的核苦酸类似物检测标签为BrdUrd(溴脱氧尿苷、BrdUrd、BrdU、BUdR,Sigma誦AldrichCo)。其他用于将检测标签导入DNA的可用的核苷酸类似物为AA-dUTP(氨基烯丙基脱氧尿苷三磷酸，Sigma-AldrichCo.)和5-曱基-dCTP(RocheMolecularBiochemicals)。一种用于将检测标签导入RNA的可用的核苷酸类似物为生物素-16-UTP(生物素-16-尿苷-5，-三磷酸，RocheMolecularBiochemicals)。可将荧光素Cy3和Cy5连接至dUTP上用于直接标记。Cy3.5和Cy7可以以抗生物素蛋白或抗地高辛抗原缀合物的形式用于带有生物素或地高辛抗原标签的探针的二级检测。被导入核酸的例如生物素的检测标签，随后可以使用本领域公知的灵敏方法进行检测。例如，使用链亲和素-碱性磷酸酶缀合物(Tropix，Inc.)可以检测生物素，这种缀合物可以与生物素结合并随后通过适当底物的化学发光进行检测(例如，化学发光底物CSPD:3-(4-甲氧基螺-[l，2，-二环氧丙烷-3-2，-(5，-氯)三环[3.3丄13，7]癸烷1-4-基)苯基磷酸二钠(disodium，3画(4國methoxyspiro國[l，2，—dioxetane-3國2，画(5，-chloro)tricycl0[3.3丄l3，7]decane]画4画yl)phenylphosphate);Tropix，Inc.)。标签也可以是可检测的酶，例如碱性磷酸酶、大豆过氧化物酶、辣纟艮过氧化物酶和聚合酶，检测例如使用化学信号放大法或使用能发光的酶的底物(例如化学发光的1，2-二环氧丙烷底物)或能产生荧光信号的酶的底物。结合了两个或多个上述检测标签的分子也可被认为是检测标签。任何已知的检测标签都可与本发明公开的探针、标签、分子和方法一起使用，以便标记和检测本发明公开方法所产生的激活的或失活的核糖开关或核酸或蛋白质。用于检测和测量检测标签产生的信号的方法也是本领域技术人员已知的。例如，可以通过闪烁计数或直接显示法来检测放射性同位素；可用荧光分光光度计来检测荧光分子；可用分光光度计或直接照相显示的方法检测磷光分子；可通过检测或可视化酶促反应的产物来检测酶。可通过检测与抗体偶联的二级检测标签来检测抗体。本文所述的检测分子为偶联了一个或多个检测标签的与待测化合物或组合物相互作用的分子。J.序列相似性应当理解的是，本文所使用的术语同源性和同一性的含义是相同的，都是指相似性。因此，例如，如果在两个序列(例如非天然序列)之间使用同源性这一词语，应当理解这并不一定是指着两个序列之间的进化关系，而是着眼于它们的核酸序列之间的相似性或关联性。为了测量序列的相似性，确定两个进化上相关的分子之间相似性的很多方法都可以常规地应用于两个或多个核酸或蛋白质，而无需考虑它们在进化上是否相关。总体而言，应当理解的是，为了定义本文所公开的核糖开关、适体、表达平台、基因和蛋白质的已知变体和衍生物或可能出现的种类，一种方法是通过定义变体和衍生物与特定已知序列的同源性。本文公开的具体序列的这种同一性在本文其他部分也有所讨论。总体而言，本文所公开的核糖开关、适体、表达平台、基因和蛋白质的变体与指定序列或天然序列通常有至少约70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同k间的同源性。例如:可以在序列比;并使同源性达到^高水平后i"T算同源性。计算同源性的另一种方法可以通过乂〉开的算法进行。可^:用下列算法进行用于比较的序列优化比对Smi也andWatermanAdv.Appl.Math.2:482(1981)中所述的局部同源性算法；NeedlemanandWunsch，J.MoLBiol.48:443(1970)中所述的同源性比对算法；PearsonandLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)中所述的相似性检索方法；或者这些算法的计算机实现形式(WisconsinGenetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI);或者通过审查的方式进行。通过例如Zuker，M.Sc/e"ce244:48-52，1989;Jaegeretal.TV"汰颠&86:7706-7710，1989;Jaegeretal.Me也odsEnzymol.183:281-306,1989中公开的算法，可以获得核酸的相同类型的同源性，上述文献中至少与核酸比对有关的素材以援引的方式纳入本文。应当理解的是，通常可以使用任何方法，而在某些情况下这些不同的方法所得到的结果可能不同，但是本领域技术人员能够理解，如果使用上述方法中的至少一种发现了同一性，则该序列可被称为具有指定的同一性。例如，如本文所使用的，所述的具有与另一序列相比的特定百分比同源性的序列，是指具有由上述任意一种或多种计算方法所计算出的所述同源性的序列。例如，如果使用Zuker计算方法，第一序列被计算为与第二序列具有80%的同源性，即使按照其他任何计算方法都计算出该第一序列与第二序列不具有80%的同源性，那么，如本文所定义的，第一序列与第二序列仍具有80%的同源性。另一个实例，如果使用Zuker计算方法和Pearson和Lipman计算方法，第一序列被计算为与第二序列具有80%的同源性，即使通过Smith和Waterman计算方法、Needleman和Wunsch计算方法、Jaeger计算方法或任意其他计算方法计算，第一序列与第二序列不具有80%的同源性，那么，如本文所定义的，第一序列与第二序列仍具有80%的同源性。再一个实例，如果使用每一种计算方法，第一序列都被计算为与第二序列具有80%的同源性(尽管实际上不同的计算方法常得到不同的计算的同源性百分比)，那么如本文所定义的，第一序列与第二序列具有80%的同源性。K.杂交和选择性杂交术语杂交通常意为至少两种核酸分子例如引物或探针与核糖开关或基因间的序列驱动的相互作用。序列驱动的相互作用意为以核苷酸特异用。例如G与C相互作用和A与T相互作用即为序列驱动的相互作用。通常序列驱动的相互作用发生于核苷酸的沃森-克里克面或Hoogsteen面。两种核酸的杂交受到本领域技术人员所知的许多条件和参数的影响。例如盐浓度、pH和反应温度均会影响两种核酸分子是否会杂交。两种核酸分子间的选择性杂交的参数为本领域技术人员所熟知。例如,在一些实施方案中选择性杂交条件可被定义为严格杂交的条件。例如，杂交的严格性是通过杂交和/或洗涤步骤的温度和盐浓度共同控制的。例如实现选择性杂交的杂交条件可包括在比Tm(解链温度，在该温度下一半的分子与其杂交配对的另一部分解离)低大约12-25。C的温度下，在高离子强度溶液(6xSSC或6xSSPE)中杂交，然后在所选的温度和盐浓度的组合的条件下洗涤，此时洗涤温度为比Tm低大约5'C至20。C。在预实验中，可根据经验容易地确定温度和盐浓度条件，在该实验中使固定在滤膜上的参照DNA的样品与带标记的目的核酸杂交，然后在不同严格度的条件下洗涤。对于DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交而言杂交温度通常较高一些。可4吏用如上所述的或本领域已知的(Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989;Kunkeletal.MethodsEnzymol.1987:154:367，1987，上述文献中至少与核酸杂交相关的素材通过援引的方式纳入本文)条件以达到严格度。优选的DNA:DNA杂交的严格条件可以是在约68°C(水溶液中)，在6xSSC或6xSSPE中杂交，之后在68。C洗涤。如果需要，当所需的互补程度降低时，杂交和洗涤的严格性可作相应减小，并且还根据寻找可变性的任何区域中的G-C或A-T的丰富程度而定。同样，如果需要，当所需的同源性增大时，杂交和洗涤的严格性可作相应增加，并且还根据需要高同源性的任何区域中的G-C或A-T的丰富程度而定，所有这些均为本领域已知。另一种定义选择性杂交的方法是通过着眼于一种核酸与另一核酸结合的量(百分比)。例如，在一些实施方案中选择性杂交的条件可以为至少约60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的限量核酸与非限量核酸结合时的条件。通常非限量核酸要过量例如10或100或1000倍。这类测定可在限量核酸和非限量核酸均比它们的kd低例如10倍或100倍或1000倍时的条件下进行，或者只是一种核酸分子为比它的kd低例如10倍或100倍或1000倍时的条件下进行，或两50种核酸分子之一或两者均在kd之上时的条件下进行。另一种定义选择性杂交的方法是通过着眼于这样一种核酸的百分比，所述核酸是在需要杂交以促进所需的酶操作的条件下得到酶操作的核酸。例如，在一些实施方案中选择性杂交条件可以是至少约60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100。/。的核酸在促进酶操作的条件下进行酶操作时的条件，例如，如果酶操作是DNA延伸，那么选择性杂交条件可以是至少约60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的核酸分子被延伸时的条件。优选的条件还包括厂商所建议的或本领域所指出的适于酶进行操作的条件。正如同源性一样，应当理解本文公开的用于确定两种核酸分子间的杂交水平的方法有许多种。应当理解这些方法和条件可提供两种核酸分子间的不同杂交百分比，但是除非另外指明，否则满足任何方法的参数都是足够的。例如，如果需要80%杂交并且只要在这些方法的任意一种中所要求的参数内发生杂交，就认为它在本文得到了公开。应当理解，本领域技术人员知道，如果组合物或方法满足用于单独或联合确定杂交的这些标准的任意一条，那么它就是本文所公开的组合物或方法。L.核酸本文公开了基于核酸的多种分子，包括例如核糖开关、适体以及编码核糖开关和适体的核酸。所公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物构成。本文讨论了这些分子及其他分子的非穷尽性实例。应当理解，例如当载体在细胞中表达时，表达的mRNA通常由A、C、G和U组成。同样，应当理解，如果核酸分子通过例如外源性送递被导入细胞或细胞环境中，那么核酸分子由核苷酸类似物构成是有利的，这样可减少核酸分子在细胞环境中的降解。只要保留了它们相关的功能，核糖开关、适体、表达平台以及任何其他寡核苷酸和核酸都可以由经修饰的核苷酸(核苷酸类似物)构成或含有经修饰的核苷酸(核苷酸类似物)。很多经修饰的核苷酸是已知的，并可被用于寡核苷酸和核酸之中。核苦酸类似物是含有对碱基、糖或磷酸部分的一些类型的修饰的核苷酸。对碱基部分的修饰可以包括对A、C、G和T/U的天然性或合成性修饰，以及使用不同的噤呤或嘧啶碱，例如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基(I)和2-氨基腺嘌呤-9-基。经修饰的碱基包括但不限于5-曱基胞嘧啶(5-me-C);5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺噤呤和鸟嘌呤的6-曱基或其他烷基衍生物；腺噤呤和鸟嘌呤的2-丙基或其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-囟素尿嘧啶和5-卣素胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮基尿嘧啶、6-偶氮基胞嘧啶和6-偶氮基胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；腺噤呤和鸟噪呤的8-卤素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基以及其他8-取代物；尿嘧啶和胞嘧啶的5-囟素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他的5-取代物；7-曱基鸟嘌呤和7-曱基腺噤呤；8-氮杂鸟噤呤和8-氮杂腺噤呤；7-脱氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)和7-脱氮腺噪呤和3-脱氮鸟噤呤和3-脱氮腺嘌呤。其他的碱基修饰物可见于例如美国专利No.3，687，808、Englischetal.，AngewandteChemie，InternationalEdition,1991,30，613、Sanghvi,Y.S.，Chapter15，AntisenseResearchandApplications,第289-302页、Crooke，S.T.andLebleu，B.ed.，CRCPress,1993。某些核苷酸类似物例如5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧咬和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺噤呤、5-丙炔基尿嘧咬、5-丙炔基胞嘧啶和5-曱基胞嘧啶，可以增加双链体形成的稳定性。其他经修饰的g是那些有通用威基功能的碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基可取代正常的碱基，但在碱基配对上没有偏好性。也就是说通用碱基可以与其他任何g进行碱基配对。碱基修饰经常可与例如糖修饰结合使用，例如2，-0-曱氧基乙基，以获得独特的属性例如提高的双链体稳定性。有多个美国专利具体描述了很多4^修饰，例如4,845,205、5,130,302、5，134，066、5，175，273、5,367,066、5,432,272、5，457，187、5,459,255、5，484，卯8、5,502,177、5，525，711、5，552，540、5，587，469、5,594,121、5,596,091、5，614，617和5,681,941。以上各专利文献的每一篇的全部内容都以援引的方式纳入本文，并且特别是这些文献中关于g修饰及其合成、使用和将其导入寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式纳入本文。核苷酸类似物还可包括糖部分的修饰。对糖部分的修饰可包括核糖和脱氧核糖的天然性修饰及合成性修饰。糖修饰包括但不限于在2'位置的下列修饰OH;F;O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的Cl至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。2，糖修饰还包括但不限于-0[(CH2)nO]mCH3、-0(CH2)nOCH3、-0(CH2)nNH2、-0(CH2)nCH3、-0(CH2)n-ONH2和-0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m在1至大约10之间。在2'位置的其他修饰包括但不限于Cl至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、S02CH3、ON02、N02、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基JL^、取代的曱硅烷基、RNA切割基团、报告基团、插入剂、可提高寡核苷酸药物动力学性质的基团或可提高寡核苷酸药效学性质的基团和其他具有类似性质的基团。还可以在糖的其他位置进行类似的修饰，特别是在3'端核苷酸上或2，-5，连接的寡核苷酸中的糖的3，位置，和在5，端核苷酸的5，位置。经<务饰的糖可含有那些在环氧桥位置用例如CH2和S进行的修饰。核苷酸糖类似物还可具有糖模拟物，例如用环丁基部分代替五碳呋喃糖。有许多美国专利都教导了这类经修饰的糖结构的制备，例如4,981,957、5，118，800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5，466，786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5，591，722、5，597，卯9、5，610，300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5，658，873、5,670,633和5,700,920，以上各专利文献的每一篇的全部内容都以援引的方式纳入本文，并且特别是这些文献中关于经修饰的糖结构及其合成、使用和将其导入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式纳入本文。核苷酸类似物可以在磷酸部分加以修饰。经修饰的磷酸部分包括但不限于可经过修饰而使得在两个核苷酸之间的连接部分含有下列结构的磷酸部分，所述结构包括硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨烷基磷酸三酯；磷酸曱酯和其他磷酸烷基酯，包括磷酸3，-烯基酯和手性磷酸酯；次膦酸酯(phosphinate);氨基磷酸酯，包括3，-氨基氨基磷酸酯(3，-aminophosphoramidate)和氨烷基氨基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)、硫^f^氨基磷酸酉旨(thionophosphoramidates)、硫代烷基磷酸酉旨(thionoalkylphosphonates)、硫代烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)和硼坑碌酸酉旨(boranophosphates)。应当理解的是，在两个核苷酸之间的这些磷酸连接或经修饰的磷酸连接可以通过3，-5，连接或2，-5，连接，连接可以包括极性的倒转，例如3，-5，至5，-3，或者2，-5，至5，-2，。还包括各种盐形式、混合盐形式和游离酸形式。许多美国专利教导了如何制备和使用含有经修饰磷酸的核苷酸，包括但不限于3,687,808、4，469，863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5，278，302、5，286，717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5，466，677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5，550，111、5，563，253、5,571,799、5，587，361和5，625，050，以上各专利文献的每一篇的全部内容都以援引的方式纳入本文，并且特别是这些文献中关于经修饰的磷酸及其合成、使用和将其导入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式纳入本文。应当理解的是，核苷酸类似物仅需要包括一种修饰，但是也可以在一个部分或几个不同部分中包括多种修饰。核苷酸替代物为与核苷酸具有类似功能特性但不含有磷酸部分的分子，例如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物分子可以以Watson-Crick方式或Hoogsteen方式识别互补性核酸并与互补性核酸杂交(碱基配对)，但是它们通过非磷酸的部分连接起来。核普酸替代物在与合适的把核酸相互作用时能够形成双螺旋型结构。物。核苷酸替代物不包括^准的;原子:磷酸的替代物可为;么短链烷基或环烷基核苷间连接物、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间连接物、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接物。这些连接物可包括具有下列结构的连接物吗啉代连接物(形成核苷的糖部分的一部分)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚曱基曱酰基和硫曱酰基骨架；含烯烃骨架；M磺酸盐骨架；亚曱基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其他带有混合的N、O、S和CH2组成部分的连接物。许多美国专利公开了如何制备和使用这些种类的磷酸替换物，包括但不限于5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5，216，141、5,235,033、5，264，562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5，610，289、5,602,240、5,608,046、5，610，289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，以上各专利文献的每一篇的全部内容都以援引的方式纳入本文，并且特别是这些文献中关于磷酸替换物及其合成、使用和将其导入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式纳入本文。应当理解的是，在核苷酸替代物中核普酸的糖部分和磷酸部分都可以被例如酰胺型连接物(氨基乙基甘氨酸)(PNA)所替换。美国专利5,539,082、5,714,331和5,719,262教导了如何制备和使用PNA分子，上述文献的每一篇都以援引的方式纳入本文。(还可参见NielsenW"/.，5Wewce254:1497-1500(1991))。寡核苷酸和核酸可以由核苷酸构成，并可以由不同类型或相同类型的核苷酸构成。例如，在寡核苷酸中，一个或多个核苷酸可以是核糖核苷酸、2，-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2，-0-甲基核糖核苷酸的混合物；大约10%至约50%的核苷酸可以是核糖核苷酸、2，-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2，-0-曱基核糖核苷酸的混合物；大约50%或50%以上的核苷酸可以是核糖核苷酸、2，-0-曱基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2，-0-曱基核糖核苷酸的混合物；或者全部核苷酸可以是核糖核苷酸、2，-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2，-0-甲基核糖核苷酸的混合物。这类寡核苷酸和核酸可被称为嵌合寡核苷酸和嵌合核酸。M.固体支持物固体支持物为可连接分子(例如触发分子)和核糖开关(或其他由所公开的方法产生的或在所公开的方法中使用的组件)的固态基质或支持物，可以与支持物相连接。核糖开关和其他分子可以直接或间接地与固体支持物相连接。例如，分析物(例如触发分子，待测化合物)可以结合到固体支持物表面或与固定在固体支持物上的捕获试剂(例如结合分析物的化合物或分子)相连接。作为另一个实例，核糖开关可以结合到固体支持物表面或与固定在固体支持物上的探针相连接。多个核糖开关、探针或其他分子以阵列、网格或其他组织形式连接到固体支持物上构成阵列。可用于固体支持物的固态基质可以包括可以与组件直接或间接连接的任何固体材料。这包括下述材料，例如丙烯酰胺、琼脂糖、纤维素、硝酸纤维素、玻璃、金、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚氧乙烯、聚硅酸盐、聚碳酸酯、特氟隆(聚四氟乙烯树脂)，碳氟化合物、尼龙、硅橡胶、聚肝、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、官能化硅烷、聚丙基延胡索酸盐(polypropylfumerate)、胶原、糖胺聚糖和聚氨基酸。固态基质可为任何可用的形式，包括薄膜、膜、瓶、盘、纤维、编织纤维、成型聚合物、颗粒、珠粒、微颗粒或它们的组合。固态基质和固体支持物可为有孔的和无孔的。芯片是一小片长方形或正方形的材料。优选的固态基质的形式为薄膜、珠粒或芯片。一种可用于固态基质的形式是微量滴定板。在一些实施方案中，可以使用多孔栽玻片。阵列可包括多个固定于固体支持物的确定位置或预定位置的核糖开关、触发分子、其他分子、化合物或探针。固体支持物上的每个预定位置通常具有一种类型的组件(即在该位置的所有组件都是相同的)。或者，在固体支持物上的同一预定位置可以固定化多种类型的组件。每一位置可以具有给定组件的多个拷贝。在固体支持物上的不同组件的空间隔离使得可以进4亍分别的检测和识别。固体支持物为一个单独的单位或结构虽然是有用的，但不是必需的。一系列的核糖开关、触发分子、其他分子、化合物和/或探针可以分布于任意数目的固体支持物上。例如，一种极端的情况是每一个组件可被固定于分离的反应管或容器中，或在分离的珠粒或微颗粒上。将寡核苷酸固定化于固态基质的方法已很成熟。可使用已知的偶联方法将包括定位探针(addressprobe)和检测探针的寡核苷酸偶联至基质上。例如，合适的附着方法描述于PeaseCa/,iVoc.iVarf.t/&491(11):5022腸5026(1994)和Khrapko"r/.，Mo/广f/51S影25:718-730(1991)。一种将3，-胺寡核苷酸固定于酪蛋白包被的栽玻片上的方法描述于Stimpson"A^^/.爿c"fif.5W.t/S<492:6379-6383(1995)。一种将寡核苦酸附着于固态基质上的可用的方法描述于Guo"a/,iV"c/e/""Vfe/^.22:5456-5465(1994)。固定于固体支持物上的每一组件(例如，核糖开关、触发分子或其他分子)可以位于固体支持物的不同预定区域。不同的位置可以是不同的反应室。每一不同的预定区域可以与其他不同的预定区域在物理上彼此分离。固体支持物上的不同预定区域之间的距离可以是固定的，也可以是可变的。例如，在阵列中每一组件可以彼此之间以固定距离排列，而与珠粒相连接的组件就不会有固定的空间关系。特别地，多个固体支持物单位(例如多个珠粒)的使用方式会导致不同的距离。组件可以以任何密度连接于或固定于固体支持物上。组件固定于固体支持物上的密度可以超过每立方厘米400个不同組件。组件的阵列可以有任何数目的组件。例如，阵列可以具有至少1，000个固定于固体支持物的不同组件、至少10,000个固定于固体支持物的不同组件、至少IOO，OOO个固定于固体支持物的不同组件或至少l，OOO，OOO个固定于固体支持物的不同组件.N.试剂盒上文所述的材料和其他材料可以以任意合适的组合被包装在一起，作为用于进行或辅助进行所公开方法的试剂盒。如果给定试剂盒中的试剂盒组件被设计和调整为在所公开的方法中一起使用则是有用的。例如公开了用于检测化合物的试剂盒，该试剂盒包括一种或多种生物传感器核糖开关。该试剂盒还可包括检测核糖开关的激活的试剂和标签。o.混合物公开了通过实施或准备实施所公开方法而形成的混合物。例如，公开了包括核糖开关和触发分子的混合物。不论何时，只要方法包括使组合物或组件或试剂混合或相接触，实行该方法就会产生多种不同的混合物。例如，如果方法包括3个混合步骤，如果各步骤分别进行，则在上述步骤的每一步之后都会形成一种特有的混合物。此外，不论各步骤如何进行，在所有步骤完成之后也会形成一种混合物。本发明的公开内容考虑了由实施所公开方法所获得的这些混合物，以及含有例如本文所/〉开的试剂、组合物或组件的混合物。P.系统公开了用于实施或辅助实施所公开方法的系统。系统通常包括制造的物品的组合例如结构、机械、装置等，以及组合物、化合物、材料等。这些组合为已公开的或从公开的内容可以显而易见，这些组合均被考虑。例如，公开了和考虑了包括生物传感器核糖开关、固体支持物和信号读取装置的系统。Q.数据结构和计算机控制公开了所公开方法中使用的、由所公开方法产生的或从所公开方法中产生的数据结构。数据结构通常为在组合物或介质中采集、编组、储存和/或体现的任何形式的数据、信息和/或对象。以例如RAM或存储磁盘的电子形式储存的核糖开关的结构和激活测量结果就是一种类型的数据结輪。所公开的方法或其任意部分或由该方法制备的制品，都可以通过计算机控制来进行控制、管理或辅助。这类计算机控制可以通过计算机控制过程或方法来实现，可以使用和/或产生数据结构，并可以使用计算机程序。这类计算机控制、计算机控制的过程、数据结构和计算机程序都被考虑到并应理解为在本文中被/>开。方法本文公开了影响RNA加工的方法，包括将包含一种核糖开关的构建体导入所述RNA，其中所述核糖开关能够调节RNA的剪接，其中剪切调节能够影响所述RNA的加工。例如，所述核糖开关能够调节可变剪接。所述核糖开关可包含一个适体结构域和一个表达平台结构域，其中所述适体结构域和所述表达平台结构域是异源的。所述核糖开关可在所述RNA的内含子内。所述核糖开关可由触发分子例如TPP激活。所述核糖开关可以是一种TPP-应答性核糖开关。所述核糖开关可激活可变剪接。所述核糖开关可抑制可变剪接。所述剪接可以非天然地发生。控制可变剪接的适体区域可出现于例如环5。控制可变剪接的适体区域可出现于例如茎P2。所述剪接位点例如可位于相对于所述适体5，端的-130至-160之间的位置。"调节RNA剪接"是指核糖开关可控制RNA剪接，从而造成不同mRNA分子的形成，以及可能的(但不总是)不同蛋白的形成。例如，所述核糖开关可以调节可变剪接。"影响RNA加工"是指核糖开关可影响RNA加工，从而导致不同RNA分子形成并可能(尽管不总是)改变所述RNA表达。所述核糖开关可调控例如转录终止、RNA的3，末端的形成或RNA的多聚腺苷酸化。进一步公开了用于激活、灭活或阻断调节RNA剪接和/或影响RNA加工的核糖开关的方法。这类方法可包括例如^吏核糖开关和可激活、灭活或阻断该核糖开关的化合物或触发分子相接触。核糖开关通过触发分子的结合或移除来发挥控制基因表达的功能。化合物可用于激活、灭活或阻断核糖开关。核糖开关的触发分子(以及其他的激活化合物)可被用于激活核糖开关。通常可使用除触发分子以外的化合物来灭活或阻断核糖开关(例如TPP)。还可以通过例如从核糖开关所在处移除触发分子来灭活核糖开关。因此，所公开的灭活核糖开关的方法可以包括例如移除核糖开关所在处的或与核糖开关接触的触发分子(或其他激活化合物)。可以还公开了通过使一化合物与RNA分子相接触来改变该RNA分子或编码该RNA分子的基因的表达的方法，其中所述RNA分子包括调节剪接的核糖开关。所述核糖开关可调节例如所述RNA分子的可变剪接和/或影响所述RNA分子的加工。核糖开关通过结合或者去除触发因子来发挥控制基因表达的功能。因此，将包含核糖开关的目的RNA分子置于激活、灭活或者阻断该核糖开关的条件下，可用于改变所述RNA的表达。表达可因例如转录被终止或核糖体与所述RNA的结合受到阻断而改变。与触发分子的结合可减少或防止所述RNA分子的表达，或者促进或者增加所述RNA分子的表达，这取决于核糖开关的性质及发生的剪接或加工的类型。还公开了通过激活、灭活或者阻断可调控剪接的核糖开关来调控含有所述核糖开关的天然存在的基因或RNA的表达的方法。例如，所述核糖开关可调节所述RNA的可变剪接。如果所述基因对于含有它的细胞或者生物体的生存是必需的，那么激活、灭活或阻断所述核糖开关会造成所述细胞或者生物体的死亡、瘀滞或虚弱。例如，激活植物存活所必需的天然开关的i活控制可^剪接和/或影响,RNA加工，而所述剪接或加工转上调或下调关键蛋白)。还公开了选择和识别可激活、灭活或阻断调节剪接的核糖开关的化合物的方法。例如，所述核糖开关可调节可变剪接。核糖开关的激活是指核糖开关结合触发分子时其状态的变化。核糖开关可由除触发分子以外的化合物并以不同于与触发分子结合的方式被激活。术语触发分子在本文中用来指可激活核糖开关的分子和化合物。这包括核糖开关的天然或正常的触发分子以及其他可以激活核糖开关的化合物。天然或正常的触发分子是给定的天然核糖开关本来就有的触发分子，或者对于某些非天然核糖开关而言是这样的触发分子该核糖开关针对该触发分子被设计或该核糖开关通过该触发分子被选择(正如在例如体外选择或体外进化技术中那样)。不是天然的触发分子可被称为非天然触发分子。还公开了识别激活、失活或阻断调节剪接和/或影响RNA加工的核糖59开关的化合物的方法。例如，激活核糖开关的化合物可通过以下途径识别将测试化合物和核糖开关相接触，并且通过测量所述RNA的剪接和/或加工，或者通过测量作为所述剪接和/或加工事件结果表达的蛋白差异水平评估所述核糖开关的激活情况。如果所述核糖开关被激活，则该测试化合物被识别为可激活核糖开关的化合物。核糖开关的激活可以任何合适的方式被评估。例如，核糖开关可被连接到一报告RNA上，并在存在或不存在所述测试化合物的情况下可测量所述才艮告RNA的表达、表达水平或表达水平的变化。再如，核糖开关可包含一个构象依赖标签，来自该构象依赖标签的信号随所述核糖开关的激活状态而改变。这种核糖开关优选^^用来自或者衍生自天然存在的核糖开关的适体结构域。可以看出，对核糖开关的激活情况进行评估使用或不使用对照测定或测量均可。识别灭活核糖开关的化合物的方法可用类似方式进行。除了本文其他部分公开的方法，对阻断可调节剪接和/或影响RNA加工的核糖开关的化合物的识别可以任何合适的方式完成，例如，在已知可评估^糖开关^激活或失活的分析。如果一未观察到在所述测试化合:不存在时可观察到的激活或失活，那么所述测试化合物被确定为阻断所述核糖开关激活或者失活的化合物。还公开了使用调节可变剪接的生物传感器核糖开关检测化合物的方法。该方法可包括使一测试样本和生物传感器核糖开关接触以及评估所述生物传感器核糖开关的激活情况。生物传感器核糖开关的激活表示在测试样品中存在生物传感器核糖开关的触发分子。生物传感器核糖开关是在其关联触发分子存在的情况下可产生可检测信号的工程化改造的核糖开关。有用的生物传感器核糖开关可由阈水平或高于阈水平的触发分子触发。生物传感器核糖开关可被设计成体内或体外使用。例如，调节可变结合的生物传感器核糖开关可以被可操作地连接到编码用作信号或者参与产生信号的蛋白的报告RNA,可通过对细胞或者生物体进行工程改造使其包含编码所述核糖开关/报告RNA的核酸构建体从而在体内使用。生物传感器核糖开关体外应用的一个实例是包含构象依赖标签的核糖开关，来自该核糖开关的信号的变化取决于核糖开关的激活状态。这种生物传感器核糖开关优选使用来自或者衍生自天然存在的TPP核糖开关的适体结构域。还公开了通过识别激活、灭活或阻断核糖开关的化合物以及制造所识别出的化合物制成的化合物。这可通过例如将如文中其他部分所公开的化合物的识别方法与制造所识别出的化合物的方法相结合来完成。例如，化合物可通过如下步骤制备使一测试化合物和一核糖开关相接触，评估所述核糖开关的激活情况，并且如果所述核糖开关被所述测试化合物激活，则制造所述激活核糖开关的测试化合物作为所述化合物。还公开了通过以下方式制备的化合物检测一化合物对一核糖开关的激活、灭活或阻断并制造所述被检测的化合物。这可以通过例如将本文其他部分所公开的化合物激活、失活或阻断的评估方法与制造被检测的化合物的方法相结合来完成。例如，可通过如下步骤制备化合物使一测试化合物和一核糖开关相接触，评估所述核糖开关的激活情况，并且如果所述核糖开关被所述测试化合物激活，则制造所述激活核糖开关的测试化合物作为所述化合物。检测化合物激活、灭活或阻断核糖开关的能力既指识别之前未知可激活、灭活或阻断核糖开关的化合物，也指在已知某种化合物可激活、灭活或阻断核糖开关时，评估所述化合物激活、灭活或者阻断核糖开关的能力。如果存在某一化合物时的核糖开关测定与不存在该化合物时同样的核糖开关测定相比(即与对照测定相比)，信号增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%，则该化合物可识别为可激活核糖开关或确定具有核糖开关激活活性。所述核糖开关测定可使用任何合适的核糖开关构建体进行。对于核糖开关激活测定特别有用的核糖开关构建体在本文其他地方描述。可激活核糖开关或具有核糖开关激活活性的化合物的识别可依据一个或多个具体核糖开关、核糖开关构建体或者核糖开关类别进行。为方便起见，被识别为可激活控制可变剪接的核糖开关的化合物可依此识别为针对具体核糖开关的化合物。实施例A.实施例l:通过mRNA的可变3，末端加工对植物中基因表达的核糖开关控制从全部三种生命领域的生物体中发现的最广泛分布的核糖开关类别对辅酶焦磷酸硫胺素(TPP)是应答性的，其中TPP是维生素Bl的衍生物。发现TPP核糖开关存在于所有被测植物品种的硫胺素生物合成基因rH/C的3，非翻译区(UTR)中。T^/CTPP核糖开关控制具有可变3，UTR长度的转录物的形成，所述长度影响mRNA的稳定性和蛋白生产。已证明，可变3，末端加工的核糖开关介导的调控对TPP依赖的r/r/c表达的反馈控制起关键作用。数据揭示了以下机制，其中代谢物依赖的RNA折叠的改变控制mRNA的剪接和可变3'末端加工。这些发现强调了植物中核糖开关对代谢物感应的重要性，并进一步揭示了可变3，末端加工作为真核生物中基因控制机制的重要性。核糖开关是一般位于信使RNA非编码部分的代谢物感应的控制元件。细菌中核糖开关的感应小的有机化合物(包括辅酶、氨基酸和和核苷酸4^(MandalandBreaker,2004;SoukupandSouk叩，2004;WinklerandBreaker,2005;Fuchsetal"2006;Rothetal"2007))或者锰离子(Cromieetal.，2006)的12种结构类别时至今日已祐束征。在大多数情况下，核糖开关可分为分别负责配体结合和基因控制的适体和表达平台区域，其代表两种功能上不同但物理上部分重叠的结构域。基于通过对若干核糖开关类型的x射线晶体法鉴定的原子分辨率模型的检查，由适体和它们的配体识别机制形成的结构的复杂度是明显的，所述核糖开关类型包括结合鸟噤呤和腺噤呤(Bateyetal.，2004;Serganovetal"2004)、S-腺苷甲硫氨酸(MontangeandBatey，2006)、TPP(EdwardsandFerre-D'Amare，2006;Serganovetal"2006;Thoreetal"2006)和葡糖胺画6-磷酸(KlineandFerre-D，Amare，2006;Cochraneetal"2007)的类型。每种适体类别的配体结合核心和支持结构的核苷酸序列在不同物种之间是高度保守的，这是因为它们需要只用四类核苷酸构成一个特异配体的精确受体。相反，核糖开关的表达平台结构域可在物种之间，乃至在单个生物体的多种核糖开关类型之间发生很大的变化。适体的高度保守水平使得研究者可采用生物信息学方法识别新的核糖开关候选物(如GrundyandHenkin，1998;Gelfandetal.，1999;Barricketal"2004;Corbinoetal"2005;Weinbergetal"2007)，并测定已知核糖开关类型在不同生物体中的分布(如Rodionovetal.，2002;Vitreschaketal.,2003;Nahvietal"2004;Abreu-GoodgerandMerino,2005)。目前，这些研究已经揭示，只有TPP感应核糖开关类型的成员存在于全部三种生命领域中(Sudarsaneta1.，2003)。在真核生物中，TPP适体存在于植物和丝状真菌的硫胺素代谢基因中，但核糖开关功能的机制仍有待研究(Kuboderaetal.，2003;Sudarsanetal.，2003)。在真菌粗糙链孢霉(A^wras/w/Yicnwstf)中，TPP适体残基位于7VAf77mRNA的5，区内的内含子中，最近已发现TPP结合所述适体通过控制可变剪接而调控基因表达(Cheaheta1.，2007)。具体地，TPP结合所述核糖开关阻止带有上游开放阅读框(阻止主要ORF表达的uORF)的内含子序列的除去。于此，已报道TPP核糖开关存在于多种植物品种中的硫胺素代谢基因r好/C的3，UTR中。具有可变3，UTR长度的r及/c转录物的形成倚赖于核糖开关功能并根据细胞TPP水平的改变调节rH/c表达的反馈调控。数据表明3，UTR长度与转录稳定性相关，从而建立了通过可变3，末端加工进行基因控制的^。本文给出了一种植物中rK/CTPP核糖开关功能的详细机制，包括rJWCmRNA的剪接和可变3，末端加工的适体介导的控制。此研究进一步揭示了不同生命领域的生物体中核糖开关控制的多样性，并拓展了之前未知的真核生物基因调控方面的知识。l.结果和讨论i.TPP适体广泛分布于植物品种中前人已经报道了在植物品种拟南芥、稻和偏生早熟禾的r及/c基因的3，UTR中存在高度保守的TPP结合适体(Sudarsanetal.，2003)。对植物TPP适体代表的收集通过对其他植物品种的r好/c基因测序和对符合TPP适体共有序列的核苷酸序列进行数据库搜索而扩大。获得cDNA序列之后，克隆每个物种的基因组DNA的相应区域并测序(细节参见实验方法部分)，从而获得原始和加工后的mRNA分子的序列。所有可获得的植物TPP适体序列的比对揭示了由茎Pl-P5组成的核苷酸序列和二级结构的高度保守性(图1A)。植物(图1B)和丝状真菌(Cheahetal.，2007)的真核TPP核糖开关适体与其在细菌和古细菌中的等价物(图1C)(Winkleretal.,2002;Rodionovetal.2002)相比的主要不同在于，细菌代表中通常总是缺少P3a茎，而真核生物中P3茎的长度是可变的。这两个区域都不参与TPP结合(EdwardsandFerre-D'Amare，2006;Serganovetal.，2006;Thoreetal.，2006;Cheahetal.，2007)，因此这些不同应该不会影响配体结合的特异性。在所有已知的单子叶植物、双子叶植物和针叶火炬爭^的rH/c实例的3'UTR中都发现了所述TPP适体。有趣的是，在莒藓小立碗藓中，所述TPP适体存在于rH/C的3，UTR中(Ppal)，并且也存在于与硫胺素生物合成基因THI4同源的两个基因的3，区(Ppa2，Ppa3)。后面的发现和真菌也具有与多种不同基因有关的TPP适体的发现(Cheahetal.，2007)表明，真核生物似乎使用同一类核糖开关的变型以根据一种关键代谢物的浓度变化来控制多个基因。植物TPP适体的一个显著特征是核普酸序列的高度保守水平。在所有植物实例中大约80。/。的核苷酸(不包括P3茎)是保守的。相反，丝状真菌中只有不到40%是保守的。植物TPP适体之间的大多数区别都存在于所述P3茎中，其在长度和序列上都可发生变化。此外，所述P3茎的长度还在相同品种的TPP适体代表之间改变，如在小立碗藓中发现的(图1A)。r好/C中延长的P3茎和THI4中非常短的P3茎的存在表明，对所述适体的这一组分没有物种特异性的要求。ii.长度和序列不同的7WJC3，UTR从六个植物品种中克隆或从GenBank获得(稻)的7^/CmRNA的3，区的核普酸序列进行分析(图8;细节还可参见实验方法部分)。有趣的是，r好/C基因的3，区的基因组结构在这7个物种中是保守的，并且总能观察到具有不同3，UTR长度的三种主要类型的加工后的RNA转录物的形成(图2A)。rH/CORF的终止密码子后面通常有一个通常以全部三种RNA类型被剪接的内含子。I型(r好/C-I)RNA带有完整的适体并可在其3，末端延伸不同的长度。III型(r好/C-III)RNA与除去所述TPP适体一部分的另一个内含子剪接后的i型一致，而n型(r及jc-n)RNA在所述适体的上游终止。这些物种的7W/C3'UTR内的不同区域(标注为1-6)的长度的定量揭示，某些区域(2-5)显示了所述UTR内与关键特征有联系的核苷酸数目的高度保守(图2B)。相反，第一个内含子(区域1)的长度和r及/c-i和rw/c-n的3'末端部分(区域6)的长度是高度可变的。例如，r好jc和rW/C-II可在其3，末端延伸超过1kb。某些3，UTR特征之间的长度的保守对TPP-介导的基因调控可起重要作用。使用反向转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)以确定7W/C转录物类型的量。使用多聚t引物和对所述ny/c开放阅读框特异的引物(扩增全部r好/c转录物类型)进行的rt-pcr主要获得r好/c-n的扩增(图2C)。这说明在全部检测的物种中短转录物形式是最丰富的。用与r好/CmRNA的编码区结合的探针进行的RNA印迹分析也获得一个与拟南芥的7^JC-II大小一致的主要信号(参见下面的进一步讨论)。用对延伸的3，区特异并不识别RNA的反向引物通过rt-pcr检测rH/c-i和r好/c-ni(图2D)。每个物种最少的pcr产物带对应r好/c-in，而其他带代表源自仍保留一或两个3，UTR内含子的7w/c-i的产物，或代表少量剪接变体。用对拟南芥的r/r/c-i和r好/c-ni的3，UTR特异的探针进行的RNA印迹分析证实，这些转录物类型以低拷贝数存在(参见下面的进一步讨论)并还揭示了转录物长度的异质性。为评估拟南芥中的多种转录类型的3，末端加工是否不同，用允许所述转录物的特定区域扩增的引物进行RT-PCR。用多聚T或随机六聚物引物产生的cdna未显示r好/c-n(数据未显示)和T7y/c-ni(图2E)的扩增的不同。然而，在用随机六聚物引物产生的cDNA扩增后rH/C-IPCR产物的相对丰度相对用多聚T衍生的cDNA显著地上升(图2E)。这表明大多数r好/C-IRNA不是聚腺苷酸化的，并因此代表未加工的r好jc前体转录物。另外，用与所述适体序列的远端下游结合的引物产生的cDNA获得的PCR扩增产物(图2E)，表明7H/C-I和r好/C-HI可向拟南芥T^JC的标记末端的下游延伸超过1kb。根据Genbank中的全长cDNA注释(AK068703、AK065235、AK120238)，也在水稻中观察到了具有很长3，UTR的相当的r好/CmRNA。具有长3，UTR的mRNA的形成表明3，末端加工障碍和转录终止。m.硫胺素影响r好/c转录物水平7B7C转录物通过使用定量RT-PCR(qRT-PCR)获得以确定转录物水平是否对增加的硫胺素浓度有所反应。向拟南芥幼苗添加不同量的硫胺素，并用特异引物组合检测不同ZH7C转录物类型。所述扩增rw/c-n的引物组合也可与已进行第一个3'UTR内含子的剪接的r好/C-IRNA的子集结合。然而，后一个增产产物的贡献是较小的，因为r好/c-i转录物很不丰富，并且在cDNA是用多聚T引物产生时几乎检测不到(图2E)。幼苗在含有lmM硫胺素的培养基上生长后，7THC转录物的总量降低到幼苗在无硫胺素添加下生长时的约20%(图3A)。T^/C-II转录物表现同等降低，但r好/c-i和r开/c-in转录物的拷贝数显示变化很小或无变化。相同样品的rna印迹分析用于确认r及/c-n水平降低和r好/c-i和RNA水平保持相对不变(图3B)。通过用硫胺素溶液对拟南芥幼苗喷雾后在几个时间点进行r/r/c转录物的qRT-PCR,来评估硫胺素介导的转录物水平的改变发生的时间间隔(图3C)。施用硫胺素后4小时，总r及/CRNA和的量降低到不添加硫胺素而测得的量的50%。26小时后，这些水平进一步降低。有趣的是，当在所述培养基中加入硫胺素时，在此分析中观察到的的适度增加(图3A)在所述反应的早期阶段更加显著。由于不同的转录类型对硫胺素处理表现相应的反应，因此所述控制机制最可能参与RNA加工，并且所述反馈机制不太可能在启动子调控的水平上起作用。实际上，由拟南芥转基因系的rH/C启动子驱动的报告子基因的表达在添加硫胺素后无变化(图9)。预计被细胞吸收的大多数硫胺素通过成功的磷酸化反应而转化为TPP，以产生比未磷酸化的维生素浓度高得多的此辅酶的浓度(Ajjawietal.，印刷中)。因此，观察到的rHJCRNA水平总量的降低可能反映核糖开关介导的对增加的TPP浓度的应答，假如TPP与植物适体的结合已知会发生的话(Sudarsanetal.，2003;Thoreetal.，2006)。在这种情况下，当所述TPP浓度相对于在未添加硫胺素的培养基中生长的植物中的浓度降低时(假设所述核糖开关的动态范围跨越此TPP浓度范围)，应该出现相应效果。这通过比较野生型(WT)拟南芥植物和带有硫胺素焦磷酸激酶(TPK)的双敲除的拟南芥中的r好/c表达进行检测。这些突变体缺乏拟南芥中的两种TPK异构体，因此不能将硫胺素转化为TPP(Ajjawietal.，印刷中)。已经发现，TPK双敲除(TPK-KO)植物在发芽的两周内大量地消耗储存在种子中的TPP,所述植物依靠TPP补充来完成它们的生命周期(Ajjawietal,，印刷中)。如预期的，12天大的TPK-KO幼苗的7W/CRNA的qRT-PCR分析揭示了相对于WT,的量的增加和rF/C-HI的显著降^f氐(图3D)。另外值得注意的是，幼苗中的r及/c表达遵循一种昼夜节律，所述节律在将植物从典型日夜周期转移至连续光照后仍然保留，并且此节律不受硫胺素处理的影响(图10)。在总7W/CRNA和r及/c-ni中观察到了同一种节律；表明核糖开关介导的反馈控制不影响所述THIIC表达的昼夜节律。iv.3'UTR长度限定基因表达水平66不同r好/CRNA类型的存在和它们应答不同硫胺素水平的丰度变化表明TPP适体可控制RNA加工和具有不同的3，UTR的转录物可差别表达。前人已经发现，拟南芥的全长适体与TPP以约50nM的表观离解常数(KD)结合(Sudarsanetal.，2003)，并且其三级结构(Thoreetal.，2006)与细菌TPP适体的三级结构相似(EdwardsandFerre-D'Amare，2006;Serganovetal.，2006)。前体RNA,rH/C-l，带有所述完整适体并因此预计会与TPP结合。相反，7W/C-ni包含大部分所述共有TPP适体序列，但5，末端的前7个核普酸由于3'UTR中的第二个内含子的剪接被除去，并被不同的核苷酸所替换(图4A，灰色阴影内的序列)。使用直读探测以测定这种改变的适体是否保留了TPP结合活性。前人已使用此试验通过监测RNA与代谢物结合时的自发降解的改变模式来揭示TPP适体中的结构改变(Sudarsanetal.，2003;Winkleretal.，2002)。所述TPP改变适体的表观KD为约60jiM(图4B和4C)，其比配体结合亲和力损失了三个以上的数量级。此外，硫胺素不与所述改变适体结合(数据未显示)，并且似乎其他硫胺素衍生物也不能被此适体结合，因为所述适体通过剪接交换的的区域不直接参与配体识别(EdwardsandFerre誦D'Amare，2006;Serganovetal.，2006;Thoreetal.，2006)。这些发现表明，一旦3'UTR的第二个内含子的剪接发生，7^/C-III中的TPP适体的剩余部分就不再行使功能。为评估所述两种主要3，UTR形式的可能的作用，将拟南芥的7^/C-II(188个核苷酸)和7KTC-I11(408个核苷酸)的3，UTR序列融合到荧光素酶(LUC)的编码区，并且^f吏这些构建体在组成型启动子和终止元件的控制下在植物中表达。rFJC-ni可在3'末端延伸多种长度，但使用最丰富的最短形式用于所述表达分析。r好jc-m可在3，端延伸不同的长度，但是丰度最高的最短形式(对应于GenBank编号NM179804)用于表达分析。包含rH/c-ni3'utr的融合构建体与带有r好/c-n3'utr的构建提相比，LUC活性仅为约10%(图4D)。通过引入完全阻止TPP结合但不抑制LUC表达的突变Ml和M2而排除所述III型构建体中的改变TPP适体参与的可能。并且，使用7^/C-III3，UTR的反向互补序列不明显改变LUC活性。这些数据表明，是所延伸的长度而不是所改变的TPP适体对抑制包含III型RNA的3，UTR的构建体起抑制作用。用包含代替LUC的报告基因的构建体获得等同的结果，并且沉默抑制子P19的共表达排除了所观察到的不同是由于所述报告系统中沉默作用的可能性(图11)。还评估了报告基因活性的不同是否也反映在转录物的量中。使用qRT-PCR测定了包含拟南芥或本塞姆氏烟草(TV.6e/i幼"/mVi/ffl)的r及/c-n或的3，UTR的报告基因转录物的相对量(图4E)。带有两个品种的III型RNA的长3，UTR的的构建体以低于带有短3，UTR的构建体的丰度存在。由于所有报告基因构建体都是在组成型启动子和终止子的控制下表达的，因此转录起始和终止对所用构建体都应该是相同的。所述发现表明长3，UTR导致转录物更新的增加。因此，促进具有延长3，UTR的mRNA产生的核糖开关介导的RNA加工的重定向会降4氐r好JC表达。此假设与前人的研究一致，所述研究表明长3，UTR诱导酵母(MuhlradandParker,1999)和植物(Kerteszetal.，2006)中无义介导的衰变(NMD)。在后一个研究中，见察到了3'UTR长度在200个核苷酸以上的mRNA的丰度的降低，这是3'UTR长度和NMD效率之间的关系。此外，所述结果表明此机制不仅参与mRNA质量监视(FaskenandCorbett，2005)，而且在植物中基因表达的调控中起作用。v.硫胺素反馈应答中的核糖开关功能尽管剪接修饰的tpp适体不影响加工后的r孖/c-inRNA的表达，然而未改变的TPP适体可为可单独调控r好/CmRNA转录物的加工以产生具有不同3，UTR长度的RNA的核糖开关的一部分。这种探索通过分析在稳定转染的拟南芥植物中包含与rw/c的完整基因组3'区(终止密码子下游~2.2kb)融合的五GFP的报告基因构建体的表达来进行。硫胺素应用导致莲座期叶子中EGFP荧光的降低(图5A和5B)。使用qRT-PCR分析，已发现在给予硫胺素后EGF户和内源T^/C转录物的量都降低至对照水平的约20%(图5C)，这与对拟南芥幼苗的观察相似(图3)。通过RT-PCR扩增来自转化体的五GFP融合体和T及/C转录物的3'UTR序列，克隆并测序。序列分析确认了五(^P和T^/C的等价转录物加工类型的形成(也参见图2)。T^/C和五GF尸的总转录物量的不同可使用控制所述转基因的强启动子来解释。因为所述报告基因构建体和T^/C之间的硫胺素应答和加工后的RNA是相同的，因此可得出结论，没有与融合的区域的其他上游序列参与所述基因控制机制。为确定硫胺素调控的作用是否通过TPP核糖开关介导，将降低TPP结合亲和力的突变M2、M3和M4引入所述适体中(图6A)。M2和M4突变分别妨碍所述TPP适体的茎P5和P2的形成。对M3，3个已知参与与TPP的嘧t基团直接相互作用的核苦酸(EdwardsandFerre-D，Amare，2006;Serganovetal，2006;Thoreetal.，2006)被突变。将带有这些变体的JH/C的3'区与五Gi，F融合并稳定转染到拟南芥植物中。如预料的，包含带有所述突变适体的报告基因构建体的植物与WT构建体相比表现出对给予硫胺素的应答的降低(M2)或完全丧失(M3和M4)(图6B)。这些发现通过使用qRT-PCR测量转录物的相对水平而被证实。此外，包含可恢复P2形成的补偿突变的M4报告构建体变型表现出与WT相似的活性(数据未显示)。这些结果表明，TPP结合所述适体对于介导对细胞中变化TPP水平的应答是必需的。然而，由所述M2构建体表现的适度硫胺素应答表明此突变可影响核糖开关功能而非仅消除所述适体对TPP的亲和力(参见下面的进一步讨论)。从五GF尸-核糖开关融合体生成的mRNA的3'末端的RT-PCR分析揭示了所述突变构建体保持II型RNA的高水平表达(图6D)，这在WT构建体中是典型的。然后，突变和WT核糖开关之间I型和III型RNA的两种主要差别是明显的。首先，III型RNA的量在M2构建体中相当大地降低并在M3构建体中检测不到(图6E)。其次，在两种突变体中都观个核苷酸的条带，也参见图5E中的WT)。这些结果揭示了正确的核糖开关功能对与具有不同3，UTR序列和长度的mRNA的产生是必需的，这导致硫胺素依赖的基因表达的下调。vi.核糖开关功能的机制使用直读探测以探索所述TPP核糖开关如何控制拟南芥7H/CmRNA的3，末端加工。包括第二个3'UTR内含子的5，剪接位点上游14个核苷酸的适体构建体显示了TPP依赖的紧接所述剪接位点的上游8个核苷酸的结构调节(图7A)。具体地，添加TPP导致所述5，剪接位点附近的核苷酸的结构弹性的增加。因此，配体结合可增加所述剪接位点到所述剪接体的可达性，从而使得可除去此内含子。对若千种植物的T好/C基因的调节5，剪接位点核苷酸和适体核苷酸的序列之间的碱基配对潜能进行了研究。在检查的全部物种中，P4-P5茎的5，端与紧接(有时是包含)所述5，剪切位点上游的核苷酸是互补的(图7B)。这种碱基配对潜能的保守表明，所述核糖开关通过互相排斥地形成在低TPP浓度下掩盖所述5，剪切位点或者在高TPP浓度下露出所述5，剪切位点的结构而控制剪接(图7C)。的部分硫胺素应答性)一致。M2带有两个破坏所述适体的P5茎的突变(图6A)，它们可削弱M2与TPP的相互作用并破坏碌b胺素应答性。然而，这些突变也削弱与所述5，剪接位点区域的威基配对，这可使得TPP结合与此可变配对有效地竟争，尽管预测TPP亲和力是降低的。植物TPP核糖开关的一个显著性质是受核糖开关控制的5'剪接位点位于所述TPP适体的互补区的超过200个核苷酸的上游。所述互补区域之间的序列的复杂结构组织(图12)对于使这些位点在空间上靠近在一起以促进它们的相互作用具有重要作用，这也可揭示不同植物的rH/CUTR特征之间的长度的保守性(图2A)。有趣的是，TPP核糖开关也部分通过5，剪接位点附近的核苷酸和未占用的TPP适体的P4-P5区之间形成配体调节的碱基配对而控制真菌7VM77基因的可变剪接。与这些真核生物实例相反，细菌通常使用P1茎上的核苷酸以连接位于所述适体下游的表达平台(Sudarsanetal.，2005;Winkleretal.，2002)。假定TPP适体结合配体时结构发生重大改变，令人惊讶的是只有部分P1和P4-P5茎用于控制目前所研究的TPP核糖开关的表达平台功能。其中一个原因可能是需要预組织某些适体亚结构以促进快速配体感应。vii.植物中TPP核糖开关功能的模型更早的研究表明，与细菌中的转录终止子类似的转录终止子也存在于真核生物中(Proudfoot，1989)。有趣的是，一段多聚尿苷区域紧接在植物所有已知TPP核糖开关实例的适体后(见图8)，并且此元件可能参与聚合酶的释放，与细菌中的内在转录终止子一样(YarnellandRoberts,1999;GusarovandNudler，1999)。然而，没有识别出与如果真细菌样转录终止发生预期的产物一致的RNA转录物。对参与mRNA转录物的剪接和可变3'末端加工的代谢物调节的控制的植物中TPP核糖开关调控提出了一种不同的模型(图7C)。当细胞中TPP浓度低时，所述适体与所述5，剪接位点相互作用并阻止剪接。此内含子带有一个允许转录物剪切和多腺苷酸化的主要加工位点。从此位点的加工生成带有3，UTR和产生7H/C基因高表达的r好/C-II转录物。当TPP浓度高时，TPP与所述适体的结合阻止与所述5，剪接位点配对。结果，所述剪接位点变得可接触，并用于除去所述主要加工位点的剪接事件。随后转录延长至最高达1kb,并且位于下游的加工位点的使用产生带有长很多的3，UTR的RNA。所述长3，UTR使RNA降解增加，并且7W/C表达降低。前人的研究表明，延长的转录发生在无转录物加工的情况下，从而揭示了这些加工的相互关联(Buratowski，2005;Proudfoot，2004;Proudfootetal"2002)。对真核生物中的转录加工和转录终止如何偶联提出了两种不同的模型。"抗终止子"模型指出，终止位点的转录导致转录复合物发生导致终止的构象改变(Loganeta1,1987)。相反，"鱼雷"模型指出，剪切事件是转录终止的前提(ConnellyandManley，1988)。其他转录终止机制也可能存在。最近的报道指出，发生在某些基因的加工位点下游的共转录剪切事件，可在控制终止中起重要作用(DyeandProudfoot,2001;Proudfoot,2004;Proudfootetal.，2002)。此外，已经证实，自身催化的RNA剪切可参与转录物3'末端的形成(Teixeiraetal.，2004;Vaderetal.，1999)。尽管不能排除其他机制，但是r及/ctpp核糖开关控制可调控转录终止的剪接和加工位点的现象与所述鱼类模型一致。viii.结论所述结果揭示了一种关于TPP感应性核糖开关如何在植物中控制基因表达和反馈控制如何维持TPP水平的机制。此外，4^研究进一步拓展了核糖开关用于调控基因表达的已知机制的多样性。拟南芥的TPP核糖开关管理代谢物结合以控制RNA剪接，其决定可变3，末端加工，并最终决定mRNA的稳定性。多种植物的T^/C基因内的序列、结构元件和重要3，UTR特征之间的间隔的广泛保守性表明此核糖开关机制保持在多种植物品种中。独立于核糖开关介导的调控，通过调控可变3，末端加工而控制基因的可能性似乎很大，因此这种一般机制可非常广泛地存在于真核生物中。初步结果表明r/y/c过表达在植物中引起有害效果。这突出了在植物中控制硫胺素产生的重要性，并可与最狄现的硫胺素作为植物疾病抗性的激活因子的作用联系起来(Ahnetal.，2005;Ahnetal.，2007;Wangetal.，2006)。植物中疏胺素生物合成的控制的更深的理解也可用于代谢工程目的，这是由于植物充当维生素Bi的初始营养来源。植物基因的3，区的TPP核糖开关与它们在真菌和细菌中的位置相比的独特位置可反映对不同生物体的具体调控需要的适应。几乎所有已知的核糖开关都位于细菌的5'UTR(MandalandBreaker,2004;SoukupandSoukup，2004;WinklerandBreaker,2005)或真菌的5'UTR或编码区的内含子中(Cheahetal.，2007)，并经常几乎完全抑制基因表达。然而，在植物中观察到了更精细的核糖开关调控。尽管植物可充分吸收碌u胺素，然而大部分需要必须通过内源合成供给。与植物的自给营养生命周期不同，真菌和细菌有时在通过输入满足它们对化合物如硫氨素的完全需要的富足条件下生长，因此对在不同生命领域的生物体中发现的不同程度的调控提出了某种解释。2.实验方法i.植物和植物l且织在16/8(光/暗)光照周期和60%湿度(除非另外指出)的生长室中在23。C下用土壤培育拟南芥生态型Columbia-0植抹。对于幼苗实验，在添加有2%蔗糖和不同浓度硫胺素的基础MS培养基(MurashigeandSkoog，1962)上并在连续光照下(除非另外指出)培育植抹。在连续光照下在土壤中培育本塞姆氏烟草植林3-5周以用于叶侵染试验。其他物种的植物材料来自从商业可购得的种子培育出的幼苗。ii.RNA分离和RT-PCR分析根据厂商说明用RNeasyPlantMini试剂盒(QIAGEN)从冷冻的植物组织中提取总RNA。对2-5jig总RNA进行DNase处理，随后根据厂商说明用SuperscriptTMII反转录酶(Invitrogen)进行反转录。对于cDNA生成，使用基因特异引物或(除非另外指出)多聚T引物。cDNA用作rW/C*和EGFP报告基因转录物的PCR扩增的模板。将获得的所有产物克隆到TOPO-TA克隆栽体(Invitrogen)中并通过测序(HHMIKeckFoundationBiotechnologyResourceCenteratYaleUniversity)分析。用AppliedBiosystems7500实时PCR系统和PowerSYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystems)进行qRT-PCR。所述模板进行连续稀释以确定所有引物组合的引物效率。每个反应重复3次，并通过琼脂糖凝胶电泳和熔解曲线分析检测所述扩增产物。用相对标准曲线方法分析数据并72将标靶转录物的丰度标准化为前人报道(Czechowskietal.，2005)的来自基因爿77(7"3M(PP2A催化亚基)、^r5(76ft卯(EF國la)和爿"G"^^(GAPDH)的参照转录物。iii.植物r好/C转录物和基因组序列的扩增用多聚T引物和针对终止密码子附近的编码区的保守部分的简并引物克隆rH/C-IIRNA的3，UTR。对于7H/C-III转录物，用特异引物组合根据多聚T生成的cDNA将3，UTR扩增为两个片段。用一个针对所述编码区的简并引物和一个针对所述TPP适体的引物PCR扩增每个3，UTR的5，部分。通过^:用一个针对所述适体的引物和一个多聚T引物获得每个3，UTR的3'部分。克隆PCR产物(TOPO-TA)并测序若干独立克隆。使用结合的序列信息以设计扩增相应基因组序列的引物对。根据厂商说明用植物DNAzol试剂(GibcoBRL)分离基因组DNA并将获得的PCR产物克隆并测序。iv.RNA印迹分析如前人所述(Newmanetal.，1993)通过RNA印迹分析拟南芥幼苗的转录物。探针是对rEK:编码区、I型和II型RNA的延伸3，UTR或对照转录物EJi^A上的区域特异的。v.农杆菌介导的叶侵染试验为进行瞬时基因表达分析，如CazzonelliandVelten，2006所述通过叶侵染试验转染本塞姆氏烟草叶。具有多个报告基因构建体的农杆菌系在LB培养基中生长过夜、离心、并将沉淀细胞重悬浮于H20中。将具有不同构建体的细胞的OD6oo校正至相同的值(-0.8)，并将等量的农杆菌混合，以共转染构建体。用萤火虫(i^W,Vi附/^^//《)或海肾(/^"///re/Mybr附/s)的荧光素酶或荧光蛋白EGFP和DsRed2作为报告蛋白。用双荧光素酶报告试验系统(Promega)测量荧光素酶活性。通常在侵染后60小时收集叶材料并冷冻于液氮中(每份样品约100mg)。研磨后，加入100jil1X被动裂解緩沖液(PassiveLysisBuffer)(Promega)并与样品充分混合。将样品在水上培育l小时，然后在13000g离心20分钟。将获得的上清液以l:40稀释，再加入双荧光素酶检测緩冲液在读板光度计(Wallac)中测量荧光素酶活性。将萦火虫荧光素酶的活性标准化为共表达的海肾荧光素酶的活性(反之亦然)，或用Bradford蛋白试剂(BioRad)相对总蛋白量定量。为进行荧光定量，在侵染后用TyphoonTrio+激光扫描器(AmershamBiosciences)在若干时间点扫描叶子。对EGFP的设置为在488nm下M和在520nmBP40下检测。DsRed2在532nm下^L和在580nmBP30下检测。叶子未被扫描明显破坏，将其切开后与叶柄一起在水中培育。vi.通过FloralDip法对拟南芥的稳、定转染通过前人所述(CloughandBent，1998)的FloralDip法转染拟南芥。转染后，种子在在无菌条件下生长，所用培养基含有50jig/ml卡那霉素以选捧转化体，并含有200jig/ml头孢瘗將以防止细菌感染。在2-3周后将存活植林移植到土壤中并在进一步生长后测定转基因的表达。vii.DNA构建体的克隆所有报告基因构建体都基于质粒pBinAR(H6fgenandWillmitzer，1992)，所述质粒包含组成型启动子CaMV35S启动子。用引物DNA44和DNA45扩增荧火虫荧光素酶的编码序列，在用BamHl和Sail限制性内切之后，克隆到pBinAR的合适位点以获得pBinARFLUC。在pBinARFLUC中，荧光素酶C末端的过氧化物体把序列被^J^^列"IAV"替换以防止过氧化物酶定位。为制备pBinARFLUC，用引物DNA46和DNA47扩增海肾的含有荧光素酶的内含子(CazzonelliandVelten，2003)，并在限制性内切后克隆到pBinAR的BamHI/SalI位点。为制备包含荧光蛋白作为报告基因的荧光蛋白，分别用引物DNA48/49和DNA50/51扩增EGFP和DsRed2的编码序列。用BamHI/Sa11限制性内切子后，将产物克隆到pBinAR的合适位点。分别用引物DNA2/52和DNA2/3扩增拟南芥r及JCII型和III型RNA的3'UTR序列并克隆到pBinAR报告基因质粒的Sall位点。为克隆基于本塞姆氏烟草的rWJC序列的相应构建体，分别用引物DNA53/54和DNA53/55扩增II型和III型RNA的3'UTR。通过测序证实报告基因融合构建体中r好JC3'UTR的序列和方向。为(在III型RNA的基础上)生成所述适体突变体Ml和M2，用DNA2和DNA3扩增拟南芥的的野生型3，UTR序列并用TOPOTA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆。对所述TOPOTA载体中的TH/C-III3，UTR进行PCR诱变并通过测序证实所述核苷酸改变。随后，通过用Sail限制性内切使所述载体释放出3'UTR序列并克隆到所述才艮告基因质粒的合适位点。为制备包含THIC基因组中核糖开关的构建体，用引物DNA60和DNA61从拟南芥基因组DNA中扩增起始自的转录终止密码子的2242bp的片段并克隆到所述TOPOTA载体中。因为pBinAR包含农杆菌源的章鱼碱合成酶(OCS)终止子，其可妨碍核糖开关功能，因此用Sail和HindIII通过限制内切除去所述OCS序列，用由两段互补寡核苷酸(DNA62，DNA63)构成的具有合适限制位点的连接序列重新连接所述栽体获得载体pBinAR-term。使用这种无所述终止子序列的载体进行随后的克隆。用引物DNA48和DNA49扩增EGFP的编码序列，在用BamHl和Sail限制性内切之后，克隆到pBinAR-term的合适位点。在第二步中，通过Sail消化使基因组rK/C片段从所述TOPOTA中释放并克隆到pBinAREGFP-term的Sail位点。通过测序证实所述片段的序列和方向。为生成适体突变体M2、M3和M4，对含有所述r及/C3，片段的TOPOTA质粒进行PCR诱变，在测序证实后将所述Sail片段克隆到pBinAREGFP-term的合适位点。再次通过测序证实所述rW/C片段的序歹'J和方向。viii.RNA的直读探测直读探测基本如前人所述进行(Sudarsanetal，2003;Winkleretal.，2002)。通过从cDNA的PCR扩增获得体外转录的DNA模板并通过包含T7启动子的正向引物引入T7启动子。体外转录、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的RNA纯4匕和所述RNA的5'32P标i己如前人所述进4亍(Seetharamanetal.，2001)。为进行直读探测分析，在室温下将标记RNA在无TPP或含有各种TPP浓度的50mMTris画HCl(23。C，pH8.3)、20mMMgCl2和100mMKC1中培育40分钟。用变性10%PAGE解析剪切产物，用磷光成像仪(Phosphorlmager，GEHealthcare)观察，并用ImageQuant软件定量，通过标准化的切割RNA分数与TPP浓度的对数值作图，来测定表观Ko值，其反映最大调节RNA结构所需的TPP的一半浓度。表1.DNA引物的序列(SEQIDNO:55-131)拟南芥THIC的RT-PCR分析<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>"*"标识,皮引入以增加qRT-PCR中的引物组合和探针的效力的核苷酸。正向和反向引物分别被简写为"for"和"rev"。应理解，所公开的方法和组合物不限于所述的具体方法、方案和试剂，因而它们可有所变化。还应理解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案而不意欲限制本发明的范围，本发明的范围只被所附的权利要求所限制。必须注意的是，除非上下文中另外明确指出，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式的"一"、"一种"和"该"包括复数指代对象。因此，例如，提及"一种核糖开关"包括多个这样的核糖开关，提及"该核糖开关"是指本领域技术人员已知的一个或多个核糖开关及其等价物，等等。"任选的，，或"任选地"是指后面描述的事件、情况或材料可能发生或存在，也可能不发生或不存在，且该描述包括所述事件、情况或材料发生或存在以及不发生或不存在的情形。范围在本文中可被表示为从"大约"一个具体值，和/或到"大约"另一个具体值。当表示为这样一个范围时，除非上下文另外特别指出，否则也具体地考虑和认为公开了从前述的一个具体值和/或到前述的另一个具体值的范围。类似地，当通过在前面使用"大约"将数值表示为近似值时，除非上下文另外特别指出，否则应理解成该具体数值可形成另一个应认为被公开的具体考虑的实施方案。还应理解，除非上下文另外特别指出，每个范围的端点在与另一个端点相关或独立于另一个端点时都是有意义的。最后，应该理解的是，除非文中另外特别说明，否则在明确公开的范围中所包括的所有单个的数值和子范围也被特别考虑和认为被公开。不论在具体的情况下这些实施方案的全部或部分是否被明确地公开，上述的原则都适用除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都具有与所公开方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文合物的实施或检测，但是本文仍然描述了特别有用的方法、设备和材料。本文引用的出版物和因其而被引用的内容在此特别地以援引的方式纳入本文。本文不应被解释为承认本发明不能先于在先发明的这些公开内容。且并非承认任何参考文献都构成现有技术。参考文献的讨论说明了它们的作者的论断，但是本申请人保留怀疑所引用文献的正确性和相关性的权利。可以清楚地理解，虽然本文中提及了许多出版物，但是这些参考文献并不表示承认任何这些文件都构成本领域的公知常识的一部分。'在通篇本申请的说明书和权利要求中，词语"包含"和该词的变化形式如"包括"和"含有"意指"包括但不限于"，而不意欲排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。本领域的技术人员仅使用常规的实验即可认识到或能够确定本文所述方法和组合物的具体实施方案的许多等价方案。这种等价方案意欲被随附的权利要求所涵盖。参考文献Abreu-Goodger,C.，andMerino,E.,(2005).RibEx:awebserverforlocatingriboswitchesandotherconservedbacterialregulatoryelements.NucleicAcidsRes.W690-692.Ahn,I.P.，Kim，S.，andLee，Y.H.(2005).VitaminBlfunctionsasanactivatorofplantdiseaseresistance.PlantPhysiol.，，1505-1515.Barrick，J.E.，Corbino，K.A.,Winkler,W.C.,Nahvi，A.，Mandal，M.，Collins,J"Lee，M.,Roth,A.，Sudarsan,N.，Jona,I.,a/.(2004).NewRNAmotifssuggestanexpandedscopeforriboswitchesinbacterialgeneticcontrol.Proc.Natl.Acad.Sci.USA渭,6421-6426.Batey，R.T.,Gilbert,S.D.&MontangeR.K.Structureofanaturalguanine-responsiveriboswitchcomplexedwiththemetabolitehypoxanthine.A/ia/mt-e432，411-415(2004).Blencowe,B.J.Alternativesplicing:newinsightsfromglobalanalyses.Ce//126，37-47(2006).Borsuk,P.，a/,L-ArginineinfluencesthestructureandfimctionofarginasemRNAin却一〃wsm腐應.5z'o/.CTew.388，135-144(2007).Buratowski,S.(2005).ConnectionsbetweenmRNA3'endprocessingandtranscriptiontermination.Curr.Opin.CellBiol.77,257-261.Buratti,E.&Baralle，F.E.InfluenceofRNAsecondarystructureonthepre-mRNAsplicingprocess.Mo/.Ce〃5z'o/.24，10505-10514(2004).Cazzondli,C.I.，andVelten，J.(2003).Constructionandtestingofanintron-containingluciferasereportergenefromRenillareniformis.PlantMolBiolRep27，271-280.Cazzonelli，C丄，andVelten,J.(2006).Aninvivo,luciferase-based，Agrobacterium-infiltrationassaysystem:implicationsforpost-transcriptionalgenesilencing.Planta"《582-597.Cheah，M.T.，Wachter,A.，Sudarsan,N.,andBreaker,R.R.(2007).ControlofalternativeRNAsplicingandgeneexpressionbyeukaryoticriboswitches.Nature(z'mClough,S,J.，andBent,A.R(1998).Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.76,735-743.Cochrane,J.C.,Lipchock,S.V.，andStrobel,S.A.(2007).StructuralinvestigationoftheglmSribozymeboundtoitscatalyticcofactor.Chem.Biol.14,97-105.Colot,H.V.，Loros,J.J.&Dunlap，J.C.Temperature-modulatedalternativesplicingandpromoteruseinthecircadianclockgenefrequency.JWo/.5z'o/.Ce//16，5563-5571(2005).81Connelly,S"andManley,J丄.(1988).AfunctionalmRNApolyadenylationsignalisrequiredfortranscriptionterminationbyRNApolymeraseII.GenesDev2，440-452.Corbino，K.A"Barrick，J.E.,Lim,J"Welz,R.，Tucker,B丄，Puskarz,I"Mandal,M.，Rudnick,N.D.，andBreaker,R.R.(2005).EvidenceforasecondclassofS-adenosylmethionineriboswitchesandotherregulatoryRNAmotifsinalpha-proteobacteria.GenomeBiol.6，R70.Cromie，M.J.，Shi,Y.,Latifi,T.，andGroisman,E.A.(2006).AnRNAsensorforintracellularMg(2+).Cell725,71-84.Czechowski，T.,Stitt，M.,Altmann，T.,Udvardi，M.K"andScheible,W.R.(2005).Genome-wideidentificationandtestingofsuperiorreferencegenesfortranscriptnormalizationinArabidopsis.PlantPhysiol.7现5-17.DavisR.H.A/ewras/ora:Contributionsofamodelorganism.C/"z'vera办尸固，NewYork,NY(2000).Dye,M丄,andProudfoot,N,J.(2001).Multipletranscriptcleavage.precedespolymerasereleaseinterminationbyRNApolymeraseII.Cell7^5，669-681.Ebbole，D.&Sachs,M.S.ArapidandsimplemethodforisolationofiVewrasporacras犯homokaryonsusingmicroconidia.jp""ga/Ge"eZ.A/ews/.37，17-18(1990).Eddy,S.R.&Durbin,R.RNAsequenceanalysisusingcovariancemodels.M/c/ez'cj"'^s及es.22,2079-2088(1994).Eddy,S.R.INFERNALVersion0.55.Distributedbytheauthor.DepartmentofGenetics,WashingtonUniversitySchoolofMedicine.St.Louis,Missouri.Edwards,T.E.&Ferr6-D'Amar6，A.R.Crystalstructuresofthe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利要求4-19任一项的构建体，其中所述内含子在所述RNA的3'非翻译区中。21.权利要求4-20任一项的构建体，其中一个RNA加工位点在所述内含子中。22.权利要求21的构建体，其中所述内含子的剪接从所述RNA上除去所述RNA加工位点从而影响所述RNA的加工。23.权利要求22的构建体，其中对所述RNA加工的影响包括消除由所述RNA加工位点介导的所述RNA的加工。24.权利要求22或23的构建体，其中对所述RNA加工的影响包括转录终止中的变化。25.权利要求22-24任一项的构建体，其中对所述RNA加工的影响包括增加所述RNA的降解。26.权利要求22-24任一项的构建体，其中对所述RNA加工的影响包括增加所述RNA的更新。27.权利要求4-26任一项的构建体，其中所述核糖开关与所述内含子的3，剪接位点部分重叠。28.权利要求27的构建体，其中所述内含子的剪接降低或消除所述核糖体被激活的能力。29.权利要求3-28任一项的构建体，其中所述适体结构域受剪接控制的区域位于P4和P5茎。30.权利要求29的构建体，其中所述适体结构域受剪接控制的区域也位于环5。31.权利要求29或30的构建体，其中所述适体结构域受剪接控制的区域也位于P2茎。32.权利要求3-31任一项的构建体，其中所述剪接位点位于相对于所述适体结构域的5，末端的-130到-160之间的位置。33.权利要求3-31任一项的构建体，其中所述RNA进一步包括第二个内含子，其中所述第二内含子的3'剪接位点位于相对于所述适体结构域的5，末端的-220到-270之间的位置。34.权利要求3-31任一项的构建体，其中所述剪接位点是一个5'剪接位35.—种影响RNA加工的方法，包括将包含核糖开关的构建体引入所述RNA，其中所述核糖开关能够调节RNA的剪接，其中所述RNA包含一个内含子，其中剪接调控影响所述RNA的加工。36.权利要求35的方法，其中所述核糖开关包括一个适体结构域和一个表达平台结构域，其中所述适体结构域和表达平台结构域是异源的。37.权利要求36的方法,其中所述表达平台结构域包括一个剪接位点。38.权利要求35-37的方法，其中所述剪接位点在所述内含子中。39.权利要求37或38的方法，其中所述剪接位点是一个可变剪接位点。40.权利要求37的方法，其中所述剪接位点在所述内含子的末端。41.权利要求37-40任一项的方法，其中所述剪接位点在所述核糖开关被激活时具有活性。42.权利要求37-40任一项的方法，其中所述剪接位点在所述核糖开关不被激活时具有活性。43.权利要求35-42任一项的方法，其中所述核糖开关被一个触发分子所激活。44.权利要求43的方法，其中所述触发分子是TPP。45.权利要求35-44任一项的方法，其中所述核糖开关是一个TPP应答性核糖开关。46.权利要求35-45任一项的方法，其中所述核糖开关激活剪接。47.权利要求35-45任一项的方法，其中所述核糖开关激活可变剪接。48.权利要求35-45任一项的方法，其中所述核糖开关抑制剪接。49.权利要求35-45任一项的方法，其中所述核糖开关抑制可变剪接。50.权利要求35-49任一项的方法，其中所述剪接不天然发生。51.权利要求36-50任一项的方法，其中所述适体结构域受剪接控制的区域位于环5。52.权利要求35-51任一项的方法，其中所述构建体进一步包括所述内含子。53.权利要求35-52任一项的方法，其中所述核糖开关在所述RNA的3'非翻译区中。54.权利要求35-53任一项的方法，其中所述内含子在所述RNA的3'非翻译区中。55.权利要求35-54任一项的方法，其中一个RNA加工位点在所述内含子中。56.权利要求55的方法，其中所述内含子的剪接从所述RNA上除去所述RNA加工位点从而影响所述RNA的加工。57.权利要求56的方法，其中对所述RNA加工的影响包括消除由所述RNA加工位点介导的所述RNA的加工。58.权利要求56或57的方法，其中对所述RNA加工的影响包括转录终止中的变化。59.权利要求56-58任一项的方法，其中对所述RNA加工的影响包括增加所述RNA的降解。60.权利要求56-58任一项的方法，其中对所述RNA加工的影响包括增加所述RNA的更新。61.权利要求37-60任一项的方法，其中所述核糖开关与所述内含子的3，剪接位点部分重叠。62.权利要求61的方法，其中所述内含子的剪接降低或消除所述核糖体被激活的能力。63.权利要求36-62任一项的方法，其中所述适体结构域受剪接控制的区域位于P2茎。64.权利要求36-63任一项的方法，其中所述剪接位点位于相对于所迷适体结构域的5，末端的-130到-160之间的位置。65.权利要求36-63任一项的方法，其中所述RNA进一步包括第二个内含子，其中所述第二内含子的3'剪接位点位于相对于所述适体结构域的5，末端的-220到-270之间的位置。66.权利要求36-63任一项的方法，其中所述剪接位点是一个5'剪接位点。67.权利要求35-66任一项的方法，还包括使一种触发分子与所述核糖开关接触从而影响所述RNA的加工。全文摘要本文公开了与控制可变剪接的核糖开关有关的方法和组合物。文档编号C12Q1/68GK101688251SQ200880024174公开日2010年3月31日申请日期2008年5月29日优先权日2007年5月29日发明者A·瓦赫特,R·R·布雷克申请人:耶鲁大学