Neutrokine－α和Neutrokine－α剪接变体的制作方法

专利名称：Neutrokine－α和Neutrokine－α剪接变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的已被称为Neutrokine-α的细胞因子。另外，已鉴别了一种Neutrokine-α的表观剪接变体，称为Neutrokine-αSV。在具体的实施方案中，本发明提供了编码Neutrokine-α和Neutrokine-αSV多肽的核酸分子。在另外的实施方案中，还提供了Neutrokine-α和Neutrokine-αSV多肽，以及载体，宿主细胞，以及生产它们的重组方法。相关技术人肿瘤坏死因子(TNF-α)和(TNF-β，或淋巴毒素)是一大类别的多肽介体的相关成员，该类别包括干扰素，白细胞介素和生长因子，统称为细胞因子(Beutler，B.和Cerami，A.免疫学分析研究7625-655(1989))。对细胞因子受体进行序列分析已阐述了一些膜蛋白的亚家族(1)Ig超家族，(2)血细胞生成素(细胞因子受体超家族)，和(3)肿瘤坏死因子(TNF/神经生长因子(NGF)受体超家族(参考TNF超家族，见于Gruss和Dower，血液85(12)3378-3404(1995)和Aggarwal和Natarajan，Eur.Cytokine Netw。7(2)93-124(1996))。TNF/NGF受体超家族含有至少10种不同的蛋白质(Gruss和Dower，如前)。这些受体的配体已经鉴别属于至少二种细胞因子超家族(Gruss和Dower，如前)。
肿瘤坏死因子(TNF-α和TNF-β的混合物)最初是由于它们的抗肿瘤活性而发现的，然而现在识别它们是具有多种生物活性的多效细胞因子，包括具有使一些转化的细胞系程序性死亡，介导细胞的活化和增殖，且在免疫调节和炎症中也起重要作用。
已知的TNF配体超家族的成员包括TNF-α，TNF-β(淋巴毒素-α)，LT-β，OX40L，Fas配体，CD30L，CD27L，CD40L，和4-IBBL。TNF配体超家族的配体是酸性的，在胞外域中具有大约20％(12％-36％范围)序列同源的类TNF分子，并主要呈现具有三聚体/多多聚体复合物的生物活性形式的膜结合形式。TNF配体超家族的可溶形式目前只鉴别有TNF，β-LT，和Fas配体(参见Gruss，H和Dower，S.k.，血液85(12)3378-3404(1995)，以它们的全部并入参考。这些蛋白质包含于细胞增殖，活化和分化的调节中，包括通过编程性细胞死亡或细胞毒性控制细胞的存活或死亡(Armstage，R.J.，Curr.Opin。Immund.b407(1994)和Smith，C.A.，细胞75959(1994).
肿瘤坏死因子-α(TNF-α，也称为恶液质素；后文称为“TNF”)最初是通过单核细胞和巨噬细胞对外毒素或其它刺激子应答而分泌的，是一种可溶的17 KD蛋白质亚单位的同源三聚体(Smith，R.A.等，生物化学杂志2626951-6954(1987)).也已阐述了一种TNF的膜结合的26 KD的前体形式(kriegIer，M。等，细胞5345-53(1988))。
所累积的研究结果表明TNF是一种具有多效生物活性的调节性细胞因子。这些活性包括抑制脂蛋白脂肪酶合成(“恶液质素”活性(Beutler，B.等，自然316552(1985)，激活多形核白细胞(Klebanoff，S.J.等，免疫学杂志1364220(1986)；Perussia，B。等，免疫学杂志138765(1987))，抑制细胞生长或刺激细胞生长(Vilcek，J.等，J.Exp.Med.163632(1986)；Sugarman，B.J.等，科学230943(1985)；Lachman.L.B.等，免疫学杂志1382913(1987))，对某些转化的细胞的细胞毒性作用(Laehman，L.B.等，如前；Darzynkiewicz，Z.等，癌症研究4483(1984)，抗病毒活性(Kohase，M.等，细胞45659(1986)；Wong，G.H.W.等，自然323819(1986)，刺激骨再吸收(Bertolini，D.R.等，自然319516(1986)；Saklatvala，J.，自然322547(1986)，刺激胶原酶和前列腺素F2产生(Dayer，J.-M.等，J.Exp.Med.1622163(1985)；和免疫调节活性，包括激活T细胞(Yokota，S.等，免疫学杂志140531(1988)，激活B细胞(Kehrl.J.H.等，J.Exp.Med.160786(1987))，激活单核细胞(Philip，R.等，自然32386(1986)，激活胸腺细胞(Ranges，G.E.等，J.Exp.Med.1671472(1988))，及刺激主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类分子在细胞表面表达(Couins，T.等，美国科学院院报83446(1986)；Pujol-Borrel，R.等，自然326304(1987))。
注意到TNF具有促炎症作用，导致组织损伤，如诱导血管内皮细胞上促凝作用(Pober，J.S.等，免疫学杂志1361680(1986)，提高嗜中性白细胞和淋巴细胞的黏附(Pober，J.S.等，免疫学杂志1383319(1987))，及刺激从巨噬细胞，嗜中性白细胞和血管内皮细胞中释放血小板激活因子(Camussi，G.等，J.Exp.Med.166；1390(1987).最近的研究结果是关于TNF在许多感染(Cerami.A等，现代免疫学928(1988))，免疫失调，致瘤性病理，如伴随一些恶性肿瘤的恶液质(Oliff，A等，细胞50555(1987))，及在自身免疫病理学和移植物对宿主病理学(Piguet，P.F.等，J Exp.Med.1661280(1987))中的病理作用。TNF与癌症和感染病理学的关系通常涉及宿主的分解代谢状态。癌症患者的一个主要问题是体重下降，一般与厌食有关。持续消耗下去的结果导致已知的“恶病质”(Kern，K.A.等，J.Parent.Enter.Nutr.12286-298(1988)).恶病质包括进行性体重下降，厌食，和恶性肿瘤生长导致持久侵蚀体质。因此恶病质状态与明显的病态相关，且与多数癌症死亡率相关，许多研究已推测TNF是癌症感染性病理中和其它分解代谢状态中的恶病质的一种重要介体。
TNF被认为在革兰氏阴性脓毒和内毒性休克的病理生理结果中起作用(Michie，H.R.等，Br.J.Surg.76670-671(1989)；Debets，J.M.H等，Second Vienna Shock Forum，P463-466(1989)；Simpson，S.Q.等Crit.Care.Clin 527-47(1989)，包括发热，身体不适，厌食和恶液。内毒素是一种潜在的单核细胞/巨噬细胞激活剂，刺激TNF(Kornbluth，S.K.等，免疫学杂志1372585-2591(1986))和其它细胞因子的产生和分泌。由于TNF能模拟许多内毒素的生物活性，被认为是与内毒素相关疾病的临床现象相关的主要介体。TNF和其它单核细胞衍生的细胞因子介导对内毒素的代谢性和神经激素性应答(Micdhie，H.R.等，N.Eng.J.Med.3181481-1486(1988))。将内毒素施用于人志愿者，产生具有类似流行性感冒症状的急性疾病，这些症状包括发热，心动过速，代谢率和应激激素释放增加(Revhauy，A.等，Arch.Surg.123162-170(1988))。也已发现在患有革兰氏阴性脓毒的患者体内循环TNF水平提高(Waage，A.等，Lancet1355-357(1987))；Hammerle，A.F等，Second Vienna Shock Forum p.715-718(1989)；Debets，J.M.H.等Crit.Core.Med.17489-497(1989)；Colandra T.等，J.Infec.Dis.161982-987(1990)).
旨在中和TNF水平的被动免疫治疗对革兰氏阴性脓毒和内毒血症具有令人满意的作用，如上述基于在这些病理状态中TNF产生增加及TNF水平提高。Cerami等(EPO专利公开0212 489，1987年3月4日)揭示了针对鉴别为恶液质素的“调节剂”(稍后发现与TNF相同)的抗体。这种抗体可用于诊断性免疫分析和治疗细菌感染中的休克。Rubrn等(EPO专利公开0218 868，1987年4月22日)揭示了人TNF的单克隆抗体，分泌这种抗体的杂交瘤，生产这种抗体的方法，及在TNF的免疫分析中这种抗体的使用。Yone等(Epo专利公开0288088，1988年10月26日)揭示了抗TNF抗体包括mAbs，及它们在病理尤其Kawasaki’s病理和细胞感染的免疫分析诊断中的作用。具有Kawasakis病理(小儿急性发热性粘膜与皮肤的淋巴结综合征；Kawasaki，T.，Auergg 16178(1967)；Kawasaki，T.，Shonica(Pediatrics)26935(1985)的患者体液含有的TNF水平提高，这与病理进程相关(Yone等，如前)。
其它研究人员阐述了特异于重组人TNF的mAbs，其在体外具有中和活性(Liang，C-M.等，生物化学生物生理学研究综述137847-854(1986)；Medger，A.等，杂交瘤6305-311(1987)；Hirai，M.等，免疫学方法杂志9657-62(1987)；Mouer，A.等，细胞因子2162-169(1990))。这些mAbs中有一些用于对人TNF的表位作图及开发酶免疫分析(Fendly等，如前；Hirai等，如前；Mouer等，如前)，以及助于纯化重组TNF(Bringman等，如前)然而，这些研究不能提供生产在体内有诊断或治疗作用的TNF中和抗体的基础，因为免疫原性，缺失特异性和/或药物适应性所致。
TNF的中和抗血清或mAbs以示出在除了男人之外的哺乳动物中，可消除不利的生理变化及防止在进行内毒血症和菌血症的实验性致死研究之后死亡。此作用已例如在啮齿动物致死性分析及灵长目动物病理模型系统中证实(Mathison，J.C.等临床研究杂志811925-1937(1988)；Beutler，B.等，科学229869-871(1985)；Tracey，K.J.等，自然330662-664(1987)；Shimamoto，Y.等，免疫学通信17311-318(1988)；Silva，A.T.等，感染性疾病杂志162421-427(1990)；Opal，S.M.等，感染性疾病杂志1611148-1152(1990)；Hinshaw，L.B.等，Circ.Shock 30279-292(1990)).
应注意在人体内用抗TNF mAb进行治疗的试验受到限制，但示出令人满意的治疗结果，例如在治疗关节炎和脓毒中.例如参见Elliott，M.J.等，Baillieres Clin.Rheumotol 9633-52(1995)；Feldmann M.等，Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 766272-8(1995)；Poll，T.等，休克31-12(1995)；Wheny等，Crit.Care.Med.21s436-40(1993)；Tyacey，K.J.等，Crit.Care.Med.21S415-22(1993)。
哺乳动物发育依赖于细胞的增殖和分化，以及通过编程性细胞死亡而发生程序细胞死亡L.Walker等，Methods Achiev.Exp.Pathol.1318(1988)。细胞程序死亡在识别自身抗原的免疫胸腺细胞的破坏中起关键作用。此正常消除过程失常可引起自身免疫性疾病(Gammon等，现代免疫学12193(1991)).
Itoh等(细胞66233(1991))阐述了一种细胞表面抗原，是介导细胞程序死亡且包含于T细胞克隆缺失中的Fas/CD95。Fas在活化的T细胞，B细胞，嗜中性粒细胞中表达，及除了在活化的T细胞，B细胞和嗜中性粒细胞之外在成年鼠的胸腺，肝，心和肺及卵巢中表达。在单克隆Ab与Fas交联的试验中，细胞程序性死亡是诱导的(Yonehare等，实验方法杂志1691747(1989)；Trauth等，科学245301(1989))，另外，有单克隆Ab与Fas结合在一定条件下刺激T细胞这样一个实例(Alderson等，实验方法杂志1782231(1993))。
Fas抗原是45Kd的相关MW的细胞表面蛋白。人和鼠的Fas基因已经由Watanabe-Fukunaga等(免疫学杂志1481274(1992))和Itoh等(细胞66233(1991))克隆。由这些基因编码的蛋白质均是与神经生长因子/肿瘤坏死因子受体超家族具有结构同源性的跨膜蛋白，该超家族包括二种TNF受体，低亲和性神经生长因子受体和CD40，CD27，CD30和OX40。
最近已经阐述了Fas配体(Suda等，细胞751169(1993))。氨基酸序列表明Fas配体是属于TNF家族的II型跨膜蛋白。因此，FAS配体多肽包含3个主要结构域在氨基末端的短胞内域，在羧基末端的较长胞外域，连接这二个结构域的亲水性跨膜域。Fas配体在脾细胞和胸腺细胞中表达，与T细胞介导的胞毒性相一致。纯化的Fas配体具有40Kd的MW。
近年来已证实Fas/Fas配体之间的相互作用是在T细胞活化之后的细胞程序性死亡所需的(Ju等，自然373444(1995)；Brunner等，自然373441(1995)).T细胞的活化诱导细胞表面的二种蛋白质。随后配体和受体之间的相互作用导致细胞程序性死亡。这支持了在正常免疫应答期间由Fas/Fas配体之间的相互作用而诱导的细胞程序性死亡这一可能的调节作用。
因此，需要提供参与病理症状中类似于TNF的细胞因子。这类新的细胞因子可用于生产结合这些类TNF细胞因子的新抗体或其它拮抗剂，以诊断及治疗与类TNF细胞因子相关的疾病。发明概述根据本发明的一个实施方案，提供了一种新的Neutrokine-α多肽的胞外域，和一种新的Neutrokine-αSV多肽的胞外域，以及其有生物活性的和诊断或治疗用途的片段，类似物和衍生物。
根据本发明的另一实施方案，提供了编码人Neutrokine-α或Neutrokine-αSV的分离的核酸分子，包括mRNA，DNA，cDNA，基因组DNA，以及其有生物活性的和诊断或治疗用途的片段和衍生物。
本发明提供的分离的核酸分子包含或由一种多核苷酸组成，该多核苷酸编码结构上与TNF和相关的细胞因子相似，且具有相似生物作用和活性的细胞因子及其表观剪接变体。此细胞因子称为Neutrokine-α，且本发明包括的Neutrokine-α多肽具有至少一部分图1A和1B(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列，或具有至少一部分由在1996年10月22日保藏在ATCC中，保藏号为97768的cDNA克隆(HNEDU15)编码的氨基酸序列。通过对保藏的Neutrokine-α克隆测序确定的核苷酸序列，示于图1A和1B(SEQ ID NO1)，其含有编码285个氨基酸残基的完整多肽的开放读框，该285个氨基酸包括N末端甲硫氨酸，大约46个氨基酸残基的推导的胞内域，大约26个氨基酸残基的推导的跨膜域，大约213个氨基酸的推导的胞外域，且推导此完整的蛋白质的分子量大约为31KDa。如其它II型跨膜蛋白一样，可溶形式的Neutrokine-α包括裂解自跨膜域的所有或部分胞外域，及包含缺失跨膜域的完整Neutrokine-α多肽的多肽，即连于胞内域的胞外域。
Neutrokine-α的表观剪接变体称为Neutrokine-αSV，且本发明包括的Neutrokine-αSV包含或由图5A和5B(SEQ ID NO19)所示氨基酸序列的至少一部分，或由1998年12月10日保藏在ATCC中保藏号为203518的cDNA克隆HDPMC52编码的氨基酸序列的至少一部分组成。通过对保藏的Neutrokine-αSV克隆进行测序确定的核苷酸序列示于图5A和5B(SEQ ID NO18)，其含有一编码266个氨基酸的完整多肽的开放读框，该266个氨基酸包括N末端甲硫氨酸，大约46个氨基酸的推定的胞内域，大约26个氨基酸的推定的跨膜域，大约194个氨基酸的推定的胞外域，且推导此完整的蛋白质的分子量大约29KDa。与其它II型跨膜蛋白一样，可溶形式的Neutrokine-αSV包括裂解自跨膜域的所有或一部分胞外域，和包含缺失跨膜域的完整Neutrokine-αSV多肽的多肽，即连于胞内域的胞外域。
因此本发明的一个实施方案提供了一种分离的核酸分子，其包含或由具有选自以下一组核苷酸序列的多核苷酸组成(a)编码全长Neutrokine-α多肽的核苷酸序列，该多肽具有图1A和1B所示(SEQ ID NO2)的或由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA克隆编码；(b)编码Neutrokine-α多肽推定的胞外域的核苷酸序列，该胞外域具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示的73-285位氨基酸序列，或由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA克隆编码；(c)编码具有Neutrokine-α功能活性(即生物活性)的(b)多肽的片段的核苷酸序列；(d)编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽包含Neutrokine-α胞内域(推定为图1A和1B(SEQ ID NO2)的大约1-46位连续氨基酸残基)，或由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA克隆编码；(e)编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽包含Neutrokine-α跨膜域(推定为图1A和1B(SEQ ID NO2)的大约47-72位连续氨基酸残基)，或由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA克隆编码；(f)编码具有胞外域和胞内域但缺失跨膜域的可溶性Neutrokine-α多肽的核苷酸序列；和(g)互补于以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施方案包括分离的核酸分子，其包含或由多核苷酸组成，该多核苷酸具有与以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)(f)或(g)中任何核苷酸序列有至少80％，85％或90％相同性，优选至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列，或者该多核苷酸在严格杂交条件下与以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)(f)或(g) 中的多核苷酸杂交。其杂交的多核苷酸在严格条件下不与具有只由A残基或只由T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。
本发明的另一实施方案提供了一种分离的核酸分子，其包含或由具有选自以下一组核苷酸序列的多核苷酸组成；(a)编码全长Neutrokine-αSV多肽的核苷酸序列，该多肽具有图5A和5B(SEQID NO19)所示完整氨基酸序列，或具有由在1998年12月10日保藏的ATCC保藏号203518的保藏物所含的cDNA，克隆编码；(b)编码Neutrokine-αSV多肽推定的胞外域的核苷酸序列，该胞外域具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示73-266位氨基酸序列或由在1998年12月10日保藏的ATCC保藏号203518的保藏物所含的cDNA克隆编码；(c)编码包含Neutrokine-αSV胞内域(推定为图5A和5B(SEQ ID NO19)的大约1-46位连续氨基酸残基)的多肽的多核苷酸序列，胞内域或由1998年12月10日保藏的ATCC保藏号203518的保藏物所含的cDNA克隆编码；(d)编码包含Neutrokine-αSV跨膜域(推定为图5A和5B(SEQ ID NO19)的大约47-72位连续氨基酸残基)的多肽的多核苷酸序列，跨膜域或由1998年12月10日保藏的ATCC保藏号203518的保藏物所含的cDNA克隆编码；(e)编码可溶性Neutrokine-αSV多肽的核苷酸序列，该多肽具有胞外域和胞内域但无跨膜域；和(f)互补于以上(a)，(b)，(c)，(d)，或(e)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的其它实施方案包括分离的核酸分子，其包含或由多核苷酸组成，该多核苷酸具有与以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任何核苷酸序列具有至少80％，85％或90％相同性，优选至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列，或者该多核苷在严格杂交条件下与以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中的多核苷酸杂交。其杂交的多核苷酸在严格杂交条件下不与具有只由A残基或只由T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。
在一个实施方案中，Neutrokine-α的表观剪接变体包含或由图5A和5B(SEQ ID NO19)所示序列Gly142-Leu266氨基酸的，或由1998年12月10日保藏在ATCC中保藏号为203518的cDNA克隆HDPMC52编码的氨基酸序列的至少一部分组成。
在其它实施方案中，本发明的核酸分子包含或由多核苷酸组成，该多核苷酸编码具有以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)(f)或(g)中氨基酸序列的Neutrokine-α或Neutrokine-αSV的携带表位部分的氨基酸序列。本发明的另一核酸实施方案涉及一种分离的核酸分子，其包含或由多核苷酸组成，该多核苷酸编码Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽的氨基酸序列，所述多肽具有含有至少1个但不超过50个，优选不超过40个，更优选不超过30个，最优选不超过20个氨基酸添加，取代和/或缺失的氨基酸序列。当然，尤为优选的是编码Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽的氨基酸序列的多核苷酸的氨基酸序列含有不超过10，9，8，7，6，5，4，3，2，或1或1-100，1-50，1-25，1-20，1-15，1-10或1-5个氨基酸添加，取代和/或缺失，优选保守取代。
本发明还涉及重组载体，其包括本发明分离的核酸分子，还涉及含有重组载体的宿主细胞，以及生产这种载体和宿主细胞的方法，以及用它们通过重组技术生产Neutrokine-α多肽的方法。
根据本发明的另一实施方案，提供了一种通过重组技术生产这种多肽的方法，包括在促进所述多肽表达的条件下，培养含有本发明Neutrokine-α或Neutrokine-αSV核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞，随后回收所述多肽。
本发明还提供了分离的Neutrokine-α多肽，其包含或由选自以下一组的氨基酸序列组成(a)具有图1A和1B所示完整氨基酸序列(即SEQ ID NO2的1-285位)，或由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA质粒编码的全长Neutrokine-α多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO2所示完整氨基酸序列除外N末端甲硫氨酸(即SEQ ID NO2的2-285位氨基酸序列)的全长Neutrokine-α多肽的氨基酸序列；(c)具有Neutrokine-α功能活性(即生物活性)的(b)多肽的片段；(d)Neutrokine-α多肽推定的胞外域的氨基酸序列，该胞外域具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示73-285位氨基酸序列，或由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA克隆编码；(e)编码Neutrokine-α多肽的核苷酸序列，具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列；(f)Neutrokine-α多肽胞内域的氨基酸序列(推定的图1A和1B(SEQ ID NO2)的大约1-46位连续氨基酸)，该胞内域或由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA质粒编码；(g)Neutrokine-α跨膜域氨基酸序列(推定的图1A和1B(SEQ ID NO2)中大约47-72位连续氨基酸残基)，此跨膜域或由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA质粒编码；(h)具有胞外域和胞内域但无跨膜域的可溶性Neutrokine-α多肽的氨基酸序列，其中所述这些结构域如上所限定；和(i)，(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)或(h)多肽的片段。本发明的多肽还包括与以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)或(i)氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％或90％，更优选至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列的多肽，以及具有与以上氨基酸序列有至少80％，85％，或90％，更优选至少95％相似性的氨基酸序列的多肽。本发明另外的实施方案涉及一种多肽，其包含或由具有以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(g)，(g)，(h)或(i)中所述氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的携带表位部分的氨基酸序列组成。本发明的Neutrokine-α多肽包括这种多肽的具有至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，优选至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少20个，至少25个，至少30个，至少40个，至少50个，更优选至少大约30-50个氨基酸的一部分，当然任何长度的直至包括本发明多肽全部氨基酸序列的携带表位的多肽也包括在本发明内。
本发明尤其优选的实施方案涉及核酸分子，其包含或由一种多核苷酸组成，该多核苷酸具有的核苷酸序列与编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少80％，85％，90％相同性，优选具有至少95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同性，Neutrokine-α多肽具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列。本发明优选的实施方案涉及包含或由多核苷酸组成的核酸分子，该多核苷酸具有的核苷酸序列与编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列具有至少90％相同性，Neutrokine-α多肽具有图1A和1B(SEQ IDNO2)所示134-285位氨基酸序列。本发明更为优选的实施方案涉及包含或由多核苷酸组成的核酸分子，该多核苷酸具有的核苷酸序列与编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列具有至少95％相同性，Neutrokine-α多肽具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列。本发明更为优选的实施方案涉及包含或由多核苷酸组成的核酸分子，该多核苷酸具有的核苷酸序列与编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列具有至少96％相同性，Neutrokine-α多肽具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列。
另外，本发明更为优选的实施方案涉及包含或由多核苷酸组成的核酸分子，该多核苷酸具有的核苷酸序列与编码具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列具有至少97％相同性。另外，本发明更为优选的实施方案涉及包含或由多核苷酸组成的核酸分子，该多核苷酸具有的核苷酸序列与编码具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列具有至少98％相同性。另外，更为优选的实施方案是涉及包含或由多核苷酸组成的核酸分，该多核苷酸具有的核苷酸序列与编码具有图1A和1B(SEQID NO2)所示134-285位氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列具有至少99％相同性。
本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的以上多核苷酸序列。由这些多核苷酸和核酸分子编码的多肽也包含在本发明内。
本发明进一步提供了分离的Neutrokine-αSV多肽，其包含或由选自以下一组的氨基酸序列组成(a)全长Neutrokine-αSV多肽的氨基酸序列，该多肽具有图5A和5B所示完整氨基酸序列(即SEQ ID NO19的1-266位氨基酸)，或由1998年12月10日保藏在ATCC中保藏号为203518的cDNA克隆编码；(b)全长Neutrokine-αSV多肽的氨基酸序列，该多肽具有SEQ ID NO19所示除N末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO19的2-266位氨基酸)；(c)Neutrokine-αSV多肽的推定胞外域的氨基酸序列，该胞外域具有图5A和5B(SEQ ID NO19)所示73-266位氨基酸序列，或由1998年12月10日保藏在ATCC中保藏号为203518的cDNA克隆编码；(d)Neutrokine-αSV多肽胞内域的氨基酸序列，该胞内域推定是图5A和5B(SEQ ID NO19)所示大约1-46位连续氨基酸残基，或由1998年12月10日保藏在ATCC No.203518的cDNA克隆编码；(e)Neutrokine-αSV跨膜域的氨基酸序列，该跨膜域推定是图5A和5B(SEQ ID NO19)所示大约47-72位连续氨基酸残基，或由1998年12月10日保藏在ATCC No.203518的cDNA克隆编码；(f)可溶性Neutrokine-αSV多肽的氨基酸序列，该多肽具有胞外域和胞内域但无跨膜域，其中每个结构域如上所限定；和(g)以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，或(f)多肽的片段。本发明的多肽还包括具有与以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)或(g)所述序列有至少80％，优选至少85％或90％，更优选至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列的多肽，以及具有与上述序列有至少80％，85％或90％相似性，优选至少95％相似性的氨基酸序列的多肽。本发明另一实施方案涉及一种多肽，该多肽包含或由Neutrokine-α SV多肽的携带表位部分的氨基酸序列组成，该多肽具有以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)或(g)中所述氨基酸序列。具有本发明Neutrokine-αSV多肽的携带表位部分的氨基酸序列的肽或多肽，包括这种多肽的具有至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，优选至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少20个，至少25个，至少30个，至少40个，至少50个，更优选至少30-50个氨基酸的一部分，当然任何长度的直至包括本发明多肽全部氨基酸序列的携带表位的多肽也包括在本发明内。
本发明的一些非限制性的实施方案涉及一种多肽，其具有Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽的携带表位部分的氨基酸序列，该Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽具有以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(g)，(g)，(h)或(i)中所述氨基酸序列。在其它实施方案中，本发明提供了分离的抗体，其特异性(即唯一地)结合具有以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(g)，(g)，(h)或(i)中所述氨基酸序列的Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽。
本发明还提供了分离抗体的方法，该抗体特异地(即唯一地)结合具有以上所述氨基酸序列的Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽。这种抗体如下所述用于诊断或治疗。
本发明还提供了药物组合物，其包含可溶的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽，尤其人Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽，和/或抗Neutrokine-α抗体和/或抗Neutrokine-αSV抗体，它们可以用于，例如治疗，预防，预后和/或诊断肿瘤和肿瘤转移，细菌感染，病毒及其它寄生虫感染，免疫缺陷，炎症，淋巴腺疾病，自身免疫疾病，移植物对宿主疾病，刺激外周耐受性，破坏一些转化的细胞系，介导细胞活化，存活和增殖，以介导免疫调节和炎症应答，及增强或抑制免疫应答。
在一些实施方案中，施用本发明可溶性的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或其激动剂，以治疗，预防，预后和/或诊断免疫缺陷疾病(例如X连锁重度联合免疫缺损(SCID)，常染色体SCID，腺苷脱氨酶缺损(ADA缺损)，X连锁血中丙球蛋白过少(XLA)，Bruton’s病，先天性血中丙球蛋白过少，X连锁小儿血中丙球蛋白过少，获得性血中丙球蛋白过少，成年发作血中丙球蛋白过少，晚期发作血中丙球蛋白过少，反常的血中丙球蛋白过少，血丙球蛋白过少，小儿暂时性血丙球蛋白过少，非特异的血中丙球蛋白过少，血中丙球蛋白过少，普通可变性免疫缺陷(CVID)(获得性)，Wiskott-Aldrich综合征(WAS)，X连锁高IgM免疫缺陷，非X连锁高IgM免疫缺陷，选择性IgA缺陷，IgG亚类缺陷(有或无IgA缺陷)，具有正常或增高水平IgS的抗体缺陷，胸腺瘤免疫缺陷，Ig重链缺失，K链缺损，B细胞淋巴增殖性疾病(BLPD)，选择性IgM免疫缺陷，隐性血中丙球蛋白过少(Swiss型)，网状细胞发育不全，新生儿嗜中性白细胞减少症，重度先天性白细胞减少，胸腺淋巴组织发育不全一发育不全或发育异常免疫缺陷，运动失调性毛细血管扩张，短肢侏儒，X连锁淋巴增殖综合征(XLP)，Nezolf联合IgS免疫缺陷综合征，嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺损，MHC II类缺损(Bare淋巴细胞综合征)，和重度联合免疫缺损)，或与免疫缺陷相关的疾病。
在一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或它们的激动剂，以治疗，预防，预后和/或诊断普通可变性免疫缺陷。
在一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或它们的激动剂，以治疗，预防，预后和/或诊断X连锁血中丙球蛋白过少症。
在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或它们的激动剂，以治疗，预防，预后和/或诊断重度联合免疫缺陷(SCID)。
在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或它们的激动剂，以治疗，预防，预后和/或诊断Wiskott-Aldrich综合征。
在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或它们的激动剂，以治疗，预防，预后和/或诊断X连锁高IgM水平的Ig缺陷。
在另一实施方案中，施用Neutrokine-α拮抗剂和/或Neutrokine-αSV拮抗剂(例如抗Neutrokine-α抗体)，以治疗，预防，预后和/或诊断自身免疫疾病(例如风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，原发性血小板减少性紫癜，自身免疫性溶血性贫血，抗磷脂(antiphospholipid)综合征，皮炎，过敏性脑脊髓炎，心肌炎，复发性多软骨炎，风湿性心脏病，肾小球肾炎(例如IgA肾病)，多发性硬化，神经炎，眼色素层炎眼病，紫癜(如Henloch-Scoenlein紫癜)，Reiter′s病，Stiff-Man综合征，自身免疫性肺炎，格林巴利综合征，胰岛素依赖型糖尿病，和自身免疫性眼炎，自身免疫性甲状腺疾病，甲状腺功能减退(即Hashimoto′s甲状腺疾病)，Goodpasture′s综合征，天疱疮，受体自身免疫性如(a)Grave′s病，(b)Myasthenia Grave，和(c)胰岛素抗性，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性血小板性紫癜，抗胶原抗体schleroderma，结缔组织疾病，多肌炎/皮肌炎，恶性贫血，原发性Addison′s病，不孕症，肾小球肾炎如原发性肾小球肾炎和IgA肾病，大疱性天疱疮，Siogren′s综合征，糖尿病，和类肾上腺素药物抗性(包括哮喘或胆囊纤维化的肾上腺素类药物抗性)，慢性活动性肝炎，原发性胆囊硬化，其它内分泌腺失调，白癜风，脉管炎，MI后，心切开术综合征，风疹，特异性皮炎，哮喘，炎症性肌病，和其它炎症，granulamatous，退化，和萎缩)或与自身免疫疾病相关的疾病。在一特异的优选实施方案中，用本发明的抗Neutrokine-α抗体和/或抗Neutrokine-αSV抗体和/或其它拮抗剂治疗，预防，预后和/或诊断风湿性关节炎。在另一特异的优选实施方案中，用抗Neutrokine-α抗体和/或抗Neutrokine-αSV抗体和/或抗Neutrokine-αSV抗体和/或其它的拮抗剂治疗，预防，预后和/或诊断系统性红斑狼疮。在另一优选实施方案中，用抗Neutrokine-α抗体和/或抗Neutrokine-αSV抗体和/或其它拮抗剂治疗，预防，预后和/或诊断原发性血小板性紫癜。在另一优选的实施方案中，用本发明的抗Neutrokine-α抗体和/或抗Neutrokine-αSV抗体和/或其它拮抗剂治疗，预防，预后和/或诊断IgA肾病。在一优选的实施方案中，用抗Neutrokine-α抗体和/或抗Neutrokine-αSV抗体治疗，预防，预后和/或诊断与以上疾病和功能失调相关的自身免疫性疾病，和功能失调和/或病变。
本发明进一步提供了一种组合物，其包含Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多核苷酸，Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽，和/或抗Neutrokine-α抗体或抗Neutrokine-αSV抗体，施用于体外的细胞，来自体内的细胞，体内的细胞，或多细胞生物体。在优选的实施方案中，本发明的组合物包含Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸，以在宿主机体内表达Neutrokine-α多肽和/或Neutrokine-αSV多肽，从而治疗疾病。在一更优选的实施方案中，本发明的组合物包含Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸，以在宿主机体内表达Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽，从而治疗免疫缺陷性疾病或与免疫缺陷相关的疾病。尤为优选的是在病人体内表达以治疗与Neutrokine-α或Neutrokine-αSV基因异常内源性活性相关的功能失调，(例如通过增加B细胞数或提高B细胞寿命而增强异常B细胞功能的表达)。
本发明还提供了一种筛选方法，以鉴别能增强或抑制由Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV诱导的细胞应答的化合物，该方法包括表达Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的细胞与侯选的化合物相接触，分析细胞应答，并与标准细胞应答相比较，标准应答是在没有候选化合物的情况下分析的；从而细胞应答高与标准应答表明此化合物是一激动剂，细胞应答低于标准应答表明此化合物是一拮抗剂。
在另一实施方案中，提供了一种鉴别Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体的方法，以及用这种受体筛选分析激动剂和拮抗剂的方法。该分析包括确定候选化合物对Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体的影响。特别地，此方法包括将Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体与本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽及候选化合物相接触，并确定由于存在候选化合物，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽与Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体的结合是提高还是降低。拮抗剂可用于预防败血症休克，炎症，脑疟，HIV病毒活化，移植物/宿主排斥，骨再吸收，风湿性关节炎，恶病质(消耗性或营养不良性)，免疫系统功能失调，淋巴瘤，和自身免疫性功能失调(例如风湿性关节炎和系统性红斑狼疮)。
本发明人还揭示了Neutrokine-α不仅在单核细胞系表达，也在肾，肺，外周血细胞，骨髓，T细胞淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，活化的T细胞，骨癌，平滑肌，巨噬细胞，和脐带血组织中表达。本发明人进一步揭示Neutrokine-αSV呈现只在原始树状细胞中高表达。这些组织和细胞的一些失调，如肿瘤和肿瘤转移，细菌，病毒和其它寄生虫感染，免疫缺陷(如慢性可变性免疫缺陷)，败血症休克，炎症，脑虐，HIV病毒活化，移植物/宿主排斥，骨再吸收，风湿性关节炎，自身免疫性疾病(如风湿性关节炎，和系统性红斑狼疮)，和恶液质(消耗性或营养不良性)。可以确信在取自具有这种失调的个体一些组织(如骨髓)或体液(如血清，血浆，尿，浸液或脑脊液)中可检测到明显较高或较低水平的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因表达，“标准”Neutrokine-α或Neutrokine-αSV基因表达水平即是在取自无这种失调的个体的组织或体液中的表达水平。因此，本发明提供了在诊断疾病期间所用的诊断方法，包括(a)分析在个体细胞或体液中Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因表达水平；(b)将此表达水平与标准Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因表达水平相对比，对比结果比标准水平高或低表明疾病的存在。
本发明的其它实施方案涉及一种治疗需要提高或保持体内Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性水平的个体的方法，包括对这种个体施用一种组合物，该组合物包含治疗有效量的本发明的分离的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或它们的激动剂。
本发明的另一实施方案涉及一种治疗需要降低体内Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性水平的个体的方法，包括对这种个体施用一种组合物，该组合物包含治疗有效量的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV拮抗剂。用于本发明的优选的拮抗剂是Neutrokine-α特异性抗体和/或Neutrokine-αSV特异性抗体。附图简述以下附图举例说明本发明的实施方案，而不限制本发明权利要求范围。
图1A和1B示出Neutrokine-α的核苷酸(SEQ ID NO1)和推导的氨基酸(SEQ ID NO2)序列。1-46位氨基酸代表推定的胞内域，47-72位氨基酸代表推定的跨膜域(下划双线处)，73-285位氨基酸代表推定的胞外域(其余的序列)。潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点在图1A和1B中用黑体的天冬酰胺符号(N)在Neutrokine-α氨基酸序列中表示，编码Neutrokine-α核苷酸序列中天冬酰胺残基的第一个核苷酸上有黑体的#号。潜在的N连接的糖基化序列发现在Neutrokine-α氨基酸序列的以下位置N124-Q127(N-124，S-125，S-126，Q-127)和N242-C245(N-242，N-243，S-244，C-245)。
Neutrokine-α，Neutrokine-αSV，TNF-α，TNF-β，LT-β，和密切相关的Fas配体之间高度相同的区域(图2示出这些序列的对比)在图1A和1B中下划线。这些区域不是限制性的，在图1A和1B中标记作保守的结构域(CD)-I，CD-II，CD-III，CD-IV，CD-V，CD-VI，CD-VII，CD-VIII，CD-IX，CD-X，和CD-XI。
图2A和2B示出Neutrokine-α(SEQ ID NO2)和Neutrokine-αSV(SEQ ID NO19)，和TNF-α(图2A和2B中“TNF-α”，GenBank No.Z15026；(SEQ ID NO3)，TNF-β(图2A和2B中“TNF-β”，GenBank No.Z15026；SEQ ID NO4)，淋巴毒素-β(图2A和2B中“LT-β”，GenBank No.L11016；SEQ ID NO5)，和FAS配体(图2A和2B中“FASL″，GenBankNo.U1182I；SEQ IDNO6)的氨基酸序列之间相同的区域，其通过“MegAlign”程序确立，该程序是称作“DAN*STAR″计算机程序的一部分。与共有序列匹配的残基用阴影表示。
图3示出Neutrokine-α氨基酸序列分析。用所述计算机程序的默认参数对SEQ ID NO2的氨基酸序列进行推定，示出α区，β区，转角区和卷曲区；亲水性和疏水性；两亲区；柔性区；抗原指数和表面概率。在“抗原指数-Jameson-Wolf″图中，指明了Neutrokine-α的高抗原性区域的位置，该区即从中可获得本发明携带表位肽的区域。抗原性多肽包括SEQ ID NO2的大约Phe115～Leu147，Ile150～Tyr163，Ser171～Phe194，Glu223～Tyr246，Ser271～Phe278。
图3中的数据也以表形式在表1中示出。列用“残基”，“位置”和罗马数字I-XIV标记。列的标记指图3和表1中所示氨基酸序列的以下特征“残基”指SEQ ID NO2和图1A和1B的氨基酸残基；“位置”指SEQ ID NO2和图1A和1B内相应残基的位置；Iα区-Garnier-Robson；IIα区-Chou-Fasman；IIIβ区-Garnier-Robson；IVβ区-Chou-Fasman；V转角区-Garnier-Robson；VI转角区-Chou-Fasman；VII卷曲区-Garnier-Robson；VIII亲水性图-Kyte-Doolittle；IX疏水性图-Hopp-Woods；Xα两亲区-Eisenberg；XIβ两亲区-Eisenberg；XII柔性区-Karplus-Schulz；XIII抗原指数-Jameson-Wolf；和XIV表面概率图-Emini。
图4A，4B和4C示出被称为HSOAD55(SEQ ID NO7)，HSLAH84(SEQ ID NO8)和HLTBM08(SEQ ID NO9)的本发明相关的人cDNA克隆，与从保藏在ATCC No.97768的人cDNA克隆中确定的Neutrokine-α核苷酸序列的序列对比。
图5A和5B示出Neutrokine-αSV蛋白的核苷酸序列(SEQ IDNO18)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO19)。1-46位氨基酸代表推定的胞内域，47-72位氨基酸代表推定的跨膜域(下划双线)，73-266位氨基酸代表推定的胞外域(其余部分序列)。潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点在图5A和5B中用黑体的天冬酰胺符号(N)在Neutrokine-αSV氨基酸序列中标记，在编码Neutrokine-αSV核苷酸序列中天冬酰胺残基的第一个核苷酸之上以黑体#号标出。潜在的N连接的糖基化序列发现在Neutrokine-αSV氨基酸序列中的以下位置N124～Q127(N124，S125，S126，Q127)，和N223～C226(N223，N224，S225，C226)。抗原性多肽包括SEQ ID NO19氨基酸序列的大约Pro32～Leu47，Glu116～Ser143，Phe153-Tyr173，Pro218-Tyr227，Ala232-Gln241，Ile244-Ala249，和Ser252-Val257。
Neutrokine-α，Neutrokine-αSV，TNF-α，TNF-β，LT-β，和密切相关的Fas配体之间高度相同性区域(这些序列的对比示于图2)在图1A和1B中下划线处。(Neutrokine-α和Neutrokine-αSV的)这些保守的区域在图5A和5B中标记为保守域(CD)-I，CD-II，CD-III，CD-V，CD-VI，CD-VII，CD-VIII，CD-IX，CD-X，和CD-XI。Neutrokine-αSV不含有图1A和1B


中所述的CD-IV序列。
Neutrokine-α多肽序列(SEQ ID NO2)与APRIL，TNF-α，LT-α的序列对比示于图7A。在图7A中，示出β折叠区，其如下述在图7A

中描述。
图6示出Neutrokine-αSV氨基酸序列分析，用所述计算机程序的默认参数推定SEQ ID NO19的氨基酸序列的α区，β区，转角区和卷曲区；亲水性和疏水性；两亲区；柔性区；抗原指数和表面概率。Neutrokine-α蛋白的高抗原性区域的位置在“抗原性指数-Jameson-Wolf”图中示出，该区域即是从中可获得本发明携带表位肽的区域。抗原性多肽包括但非限于包含SEQ ID NO19的氨基酸序列的以下氨基酸的多肽约Pro32-Leu47，约Glu116-Ser143，约Phe153-Tyr173，约Pro218-Tyr227，约Ser252-Thr258，约Ala232-Gln241，约Ile244-Ala249，约Ser252-Val257。
图6所示数据可以类似于表1所示数据的表格形式代表。这种代表图6所示精确数据的表格可用DNA*STAR计算机序列分析程序包的MegAligh组分，设立默认参数而产生。这与用于产生图3和图6的程序相同。
图7ANeutrokine-α的氨基酸序列，及其推定的配体结合域与APRIL，TNF-α，LT-α的配体结合域的序列对比(具体地，人APRIL多肽(SEQ ID NO20；ATCC保藏号No.AF046888)的115-250位氨基酸残基，TNF-α(SEQ ID NO3；GenBankNo.Z15026)的88-233位氨基酸残基，和LT-α(也称作TNF-β，SEQ IDNO4)的62-205位氨基酸残基；GenBankNo.Z15026)。示出Neutrokine-α的推定的跨膜区，且Neutrokine-α的裂解位点用斜体字表示。下划线的序列(A-H)代表推定的β折叠区域。
图7BNeutrokine-αmRNA表达。用Neutrokine-α开放读框作探针，在得自一系列人组织类型和所选择的癌细胞系的聚(A)+RNA印迹(Clonetech)上，进行Northern杂交分析。检测到一个2.6Kb的Neutrokine-αmRNA在胎盘，心脏，肺，胎肝，胸腺和胰腺中高水平表达。此2.6Kb的Neutrokine-αmRNA也在HL-60和K562细胞系中检测到。
图8A和8B在通过IFN-γ激活人单核细胞后，Neutrokine-α的表达提高。图8A在体外培养的单核细胞上，Neutrokine-α蛋白表达的流式细胞计量分析。纯化的细胞在有或无IFN-γ(100U/ml)的情况下培养3天。然后将细胞用Neutrokine-α特异性mAb(2E5)(实线)或同种型匹配的对照(IgG1)(点划线)染色。用在三个独立的试验中纯化自三个不同供体的单核细胞获得可比结果。图8B制备Neutrokine-α特异性TagMan引物，并用于确定在未刺激的及IFN-γ(100U/ml)处理的单核细胞中，Neutrokine-αmRNA的相对表达水平。TagMan引物的核苷酸序列如下(a)探针5′-CCA CCA GCT CCA GGA GAA GGC AAC TC-3′(SEQ ID NO24)；(b)5′扩增引物5′-ACC GCG GGA CTG AAA ATC T-3′(SEQID NO25)；和(c)3′扩增引物5′-CAC GCT TAT TTC TGC TGTTCT GA-3′(SEQ ID NO26)。
图9A和9BNeutrokine-α是一种潜在的B淋巴细胞刺激剂。图9A在标准B淋巴细胞联合刺激分析中，利用金黄色葡萄球菌cowan 1(SAC)作引导剂，确定Neutrokine-α的生物活性。单用SAC产生1427±316的背景计数。所报道的数值是在三份孔中所得结果的平均值±偏差。用纯化自稳定的CHO转染体和瞬时转染的HEK293T细胞的重组Neutrokine-α获得相似结果。图9B用Neutrokine-α和其与抗IgM联合刺激扁桃体B细胞的增殖。如用SAC进行分析所述进行生物分析，除了各个孔用山羊抗人IgM抗体预先包被，抗体浓度为10μg/ml PBS.
图10A和10BNeutrokine-α受体在正常人外周血单核细胞和肿瘤细胞系中的表达。图10A人外周血成核细胞得自正常志愿者，并通过密度梯度离心分离。细胞用生物素酰化的Neutrokine-α染色，随后用PE缀合的链亲和素和FITC或PerCP偶联的特异于CD3，CD20，CD14，CD56和CD66b的mAbs染色。在Becton DickinsonFACScan上用CellQuest软件分析细胞。数据代表4个独立试验之一。图10BNeutrokine-α与组织细胞细胞系U-937和骨髓瘤细胞系IM-9的结合。
图11A，11B，和11C在BALB/cAn NCR小鼠体内施用Neutrokine-α的体内效应。图11A将福尔马林固定的脾用石腊包埋，并将5微米的切片用苏木精和伊红染色(上面一组)。下面一组是取自相同动物的切片，该动物用抗CD45R(B220)mAb染色，并用辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠Ig(小鼠吸附的)和底物四盐酸二氨基联苯胺(DAB)显色。玻片用Mayer′s苏木精负染。CD45R(B220)表达细胞呈褐色。图11B用PE-CD45R(B220)和FITC-ThB(LybD)染色的正常(左侧一组)和Neutrokine-α处理的(右侧一组)的流式细胞计量分析。图11C在正常和Neutrokine-α处理的小鼠中血清IgM，IgG和IgA的水平。详细描述本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸，该多肽具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列，此序列是通过对cDNA克隆测序而确定的。图1A和1B所示的核苷酸序列(SEQ ID NO1)是通过对HNEDU15克隆测序而得的，该克隆在1996年10月22日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号ATCC No.97768，ATCC位于弗吉尼亚州马纳萨斯市大学道20110-2209，邮编10801。保藏的克隆包含于pBluescriptSK(-)质粒(Stratagene，La Jolla，CA)中。
本发明还提供了分离的核酸分子，其包含编码Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸，该多肽具有图5A和5B(SEQ ID NO19)所示氨基酸序列，此序列是通过对cDNA克隆测序而确定的。图5A和5B所示的核苷酸序列(SEQ ID NO18)是通过对HDPMC52克隆测序而得的，该克隆在1998年12月10日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号ATCC No.203518。保藏的克隆包含于pBluescript SK(-)质粒(Stratagene，La Jolla，CA)中。
本发明的Neutrokine-α和Neutrokine-αSV多肽与TNF-α，TNF-β，LT-β，Fas配体，APRIL和LT-α的人mRNAs的翻译产物呈序列同源(见图2A，2B和7A)。如上所示，TNF-α被认为是在细胞毒性，坏死，细胞程序性死亡，共同刺激，增殖，淋巴管形成，免疫球蛋白类别转换，分化，抗病毒活性，和调节粘着分子及其它细胞因子和生长因子中起作用的一个重要细胞因子。
核酸分子除非特别指出，所有通过对本文中DNA分子测序而确定的核苷酸序列是用自动DNA测序仪(如Model 373型，Applied Brosystems，Inc，Foster City，CA)确定的，且由本文确定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列是通过翻译以上确定的DNA序列而推定的。因此，本领域已知如同通过这种自动方法确定的任何DNA序列一样，在此确定的任何核苷酸序列可存在一些误差。自动方法确定的核苷酸序列典型地与测序的DNA分子的真正核苷酸序列有至少大约90％，更典型地有至少大约95％～99.9％的相同性。真实序列可更精确地通过其它方法确定，包括本领域熟知的人工DNA测序法。本领域也已知，与真正序列相比，确定的核苷酸序列中一个单一的插入或缺失，将导致在核苷酸翻译中移码，由此从这种插入或缺失的那一点开始，由确定的核苷酸序列编码的推定的氨基酸序列将完全不同于由测序的DNA分子编码的真实氨基酸序列。
核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”，就DNA分子或多核苷酸而言是脱氧核糖核苷酸序列，就RNA分子或多核苷酸而言是相应的核糖核苷酸序列(A，G，C和U)，其中特异的脱氧核糖核苷酸序列中的每个胸苷(T)脱氧核糖核苷酸由核糖核苷酸尿苷(U)置换。
利用本文所提供的信息，如图1A和1B中的核苷酸序列，编码Neutrokine-α多肽的本发明的核酸分子可用标准克隆和筛选方法获得，如用mRNA作起始物克隆cDNA的方法。如本发明所示，图1A和1B所述核酸分子(SEQ ID NO1)是在衍生自嗜中性粒细胞的cDNA文库中发现的。相应于Neutrokine-αcDNA一部分的表达序列标记也发现在肾，肺，外周血白细胞，骨髓，T细胞淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，活化的T细胞，胃癌，平滑肌，巨噬细胞，和脐带血组织中。另外，用图5A和5B中提供的核苷酸信息，编码Neutrokine-αSV多肽的本发明的核酸分子可用标准克隆和筛选方法获得，如用mRNA作起始物克隆cDNA的方法。如本发明所示，图5A和5B所示核酸分子(SEQ ID NO18)是在衍生自原始树状细胞的cDNA文库中发现的。
ATCC保藏号97768的Neutrokine-α质粒HNEDU15含有一个编码有大约285个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，一个大约46个氨基酸的推定的胞内域(图1A和1B(SEQ ID NO2)的大约1-46位氨基酸残基)，一个大约26个氨基酸的推定的跨膜域(图1A和1B(SEQ ID NO2)中大约47-72位下划线的氨基酸残基)，一个大约213个氨基酸的推定的胞外域(图1A和1B(SEQ ID NO2)中大约73-285位氨基酸)；推导的分子量为大约31KDa。图(1A和1B(SEQ ID NO2)中所示Neutrokine-α多肽与人TNF-α有大约20％相似性和大约10％相同性，TNF-α在GenBank中登记号为No.339764。
ATCC保藏号203518的Neutrokine-αSV质粒HDPMC52含有一个编码大约有266个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，一个大约46个氨基酸的推定的胞内域(图5A和5B(SEQ ID NO19)中大约1-46位氨基酸残基)，一个大约26个氨基酸的推定的跨膜域(图5A和5B(SEQ ID NO19)中大约47-72位下划线的氨基酸残基)，一个大约194个氨基酸的推定的胞外域(图5A和5B(SEQ ID NO19)中大约73-266位氨基酸残基)；推导的分子量为大约29KDa。图5A和5B(SEQ ID NO19)所示Neutrokine-αSV多肽与在GenBank中登记号为339764的人TNF-α有大约33.9％相似性和大约22.0％相同性。
熟练技术人员知道，由于如上所述测序可能存在误差，分别包含大约285和266个氨基酸的，由保藏的cDNA编码的真实完整的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽有时可稍短。特别地，确定的Neutrokine-α和Neutrokine-αSV编码序列含有一个普通的第二个甲硫氨酸密码子，其可作为开放读框翻译的起始密码子，该密码子位于图1A和1B(SEQ ID NO18)所示64-66位核苷酸。更一般地，真正开放读框可在推定自图1A和1B(SEQ ID NO1)和图5A和5B(SEQ ID NO18)所示N末端第一个或第二个甲硫氨酸密码子的±20个氨基酸，尤其±10个氨基酸的范围内的任何位置。应进一步意识到，本文所述多肽结构域是由计算机分析确定，因此，根据用于鉴别各种结构域的分析标准，Neutrokine-α和Neutrokine-αSV多肽的胞外域，胞内域和跨膜域的准确位置可以有所不同。例如，图1A和1B(SEQ ID NO2)和图5A和5B(SEQID NO19)中Neutrokine-α和Neutrokine-αSV胞外域的准确位置根据所用限定结构域的标准可有轻微变化(例如，位置可以“移动”大约1-20个残基，尤其大约1-5个残基)。在这种情况下，跨膜域的终端和胞外域的起点在鉴别以上所示位置中疏水氨基酸序列的基础上加以推定，如图3和6及表1所示。如下所述，本发明进一步提供了具有各种缺失自完整多肽N末端和/或C末端的各种残基的多肽，包括缺失一或多个本文所述胞外域N末端氨基酸的多肽，其构成可溶形式的Neutrokine-α和Neutrokine-αSV多肽的胞外域。
本发明的核酸分子和多核苷酸可以是RNA形式，如mRNA，或DNA形式，包括通过克隆或合成产生而获得的cDNA和基因组DNA。此DNA可以是双链或单链的。单链DNA或RNA可以是编码链，也称为有义链，或可以是非编码链，也称作反义链。
“分离”的核酸分子是指从其天然环境中分离出的核酸分子(DNA或RNA)。例如，本发明载体中包含的重组DNA分子被认为是分离的。分离的DNA分子另外例如包括保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子，或溶液中纯化(部分或基本纯化的)DNA分子。分离的RNA分子包括本发明DNA分子的体内或体外RNA转录物。然而，包含在克隆中的核酸，或分离或移自细胞或细胞裂解物的染色体(如核型“染色体涂片”)在本发明中不是分离的，所述克隆是未与文库中其它成员(如含有此克隆及其它文库成员的同源溶液形式)分离的文库(如基因组或cDNA文库)成员。如本发明进一步所述，根据本发明的分离的核酸分子可以是天然，重组或合成产生的。
本发明分离的核酸分子包括DNA分子，此DNA分子包含或由具有图1A和1B(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列的147-149位的起始密码子的开放读框(ORF)组成。另外，本发明分离的核酸分子包括的DNA分子包含或由基本不同于以上所述序列，但由于遗传密码的简并性，仍编码Neutrokine-α蛋白的序列组成。当然，遗传密码是本领域熟知的。因此，本领域技术人员可常规产生上述简并的变体。在另一实施方案中，本发明提供的分离的核酸分子包含或由编码Neutrokine-α多肽的序列组成，Neutrokine-α多肽具有由ATCC保藏号97768的质粒中包含的cDNA编码的氨基酸序列。优选地，此核酸分子包含或由编码多肽的胞外域或多肽的成熟或可溶多肽序列组成，该多肽由ATCC保藏号97768的质粒中的cDNA编码。
本发明的分离的核酸分子还包括这样的DNA分子，其包含具有图5A和5B(SEQ ID NO18)所示核苷酸序列的1-3位的起始密码子的开放读框(ORF)。另外，本发明分离的核酸分子包括的DNA分子包含或由基本不同于以上所述序列，但由于遗传密码的简并性，仍编码Neutrokine-αSV多肽的序列组成。当然，遗传密码是本领域熟知的。因此，本领域技术人员可常规生产上述简并变体。在另一实施方案中，本发明提供的分离的的核酸分子包含或由编码Neutrokine-αSV多肽的序列组成，Neutrokine-αSV多肽具有由ATCC保藏号203518的质粒中包含的cDNA编码的氨基酸。优选地，此核酸分子包含或由编码多肽胞外域或成熟可溶多肽序列的序列组成，该多肽由ATCC保藏号203518的质粒中包含的cDNA编码。
本发明进一步提供的核酸分子包含或由图1A和1B(SEQ IDNO1)所示核苷酸序列，或包含于ATCC No.97768的质粒中的Neutrokine-αcDNA的核苷酸序列，或具有互补于以上序列之一的序列的核苷酸序列组成。另外，本发明提供的分离的核酸分子包含或由图5A和5B(SEQ ID NO18)所示核苷酸序列，或包含于ATCC No.203518的质粒中的Neutrokine-αSV cDNA的核苷酸序列，或具有互补于以上序列之一的序列的核苷酸序列组成。这种分离的分子尤其DNA分子，具有包括但非限于作为通过与染色体原位杂交进行基因作图的探针，及例如通过Northern或Western印迹分析，检测人组织中Neutrokine-α和Neutrokine-αSV的表达等作用。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SEQ ID NO22所示序列组成。SEQ ID NO22所示序列从得自GenBank的一些重叠小鼠EST序列(AI 182472，AA 422749，AA 25047和AI 122485)构建。对EST序列进行对比产生SEQ ID NO22所示类Neutrokine-α多核苷酸序列。得自SEQ ID NO22翻译的氨基酸序列如SEQ IDNO23所示。SEQ ID NO22和SEQ ID NO23所示序列的片段，变体和衍生物也涵盖在本发明内。
在另一实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SEQ ID NO27所示序列，和/或编码SEQ ID NO28所示氨基酸序列的序列，其片段，变体和衍生物组成。这些多核苷酸也涵盖在本发明内。例如，本发明的一些实施方案涉及的多核苷酸包含或由编码一多肽序列的序列组成，此多肽序列与SEQ ID NO28的68-219位氨基酸有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性。得自SEQ ID NO27翻译的氨基酸序列如SEQ ID NO28所示。包含或由SEQ ID NO28的氨基酸序列组成的多肽和SEQ ID NO28所示序列的片段，变体和衍生物也包涵在本发明内。例如，本发明的一些实施方案涉及的多肽包含或由与SEQ ID NO28的68-219位氨基酸具有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多肽序列组成。具有SEQ ID NO27所示序列的核酸分子是通过RT-PCR经二种简并引物从cyanomologous猴(即Macaea irus)PBMC中获得。简而言之，总RNA通过用Trizol(购自Life Technologies，Inc，Rockville，MD)根据生产商的指导制备自cyanomologous猴PBMC。然后，用寡-dT引物从cyanomologous猴PBMC制备物中用标准方法合成单链的cDNA。Neutrokine-α特异性引物基于鼠和人Neutrokine-α分子(分别为SEQ ID NO22和1)之间的保守区域进行设计。然后通过PCR用cDNA模板组合以下两种简并的寡核苷酸引物产生cyanomologous猴Neutrokine-α核酸分子。5′引物5′-TAC CAG ITG GCI GCC ITG CAA G-3′(SEQID NO35)和3′引物5′-GTI ACA GCA GTT TIA IIG CAC C-3′(SEQ ID NO36)。在简并的引物序列中(SEQ ID NO35和36)，“I″代表脱氧肌苷或二脱氧肌苷。
在另一实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SEQ ID NO29所示序列，和/或编码SEQ ID NO30所示氨基酸序列的序列，其片段，变体和衍生物组成。这些多核苷酸也涵盖在本发明范围内。例如，本发明的一些实施方案涉及的多核苷酸包含或由编码与SEQ IDNO30所示序列68-219氨基酸有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多肽序列的序列组成。得自SEQ IDNO29翻译的氨基酸序列如SEQ ID NO30所示。包含或由SEQ IDNO30所示氨基酸序列，和SEQ ID NO29和SEQ ID NO30所示序列的片段，变体和衍生物也涵盖在本发明内。例如，本发明的一些实施方案涉及的多肽包含或由与SEQ ID NO30的68-219位氨基酸有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多肽序列。具有SEQ ID NO29所示序列的核酸分子是通过RT-PCR，用两种简并引物从猕猴PBMC中获得的。简而言之，总RNA通过用Trizol(购自Life Technologies，Inc，Rockviue，MD)，根据生产商的指导，从猕猴PBMC中制备。然后，用寡dT引物从猕猴PBMC制备物中，用标准方法合成单链cDNA。Neutrokine-α特异性引物是基于鼠和人Neutrokine-α分子(分别为SEQ ID NO22和1)之间的保守区域进行设计。然后，猕猴Neutrokine-α核酸分子是通过PCR，用cDNA模板组合以下两种简并的寡核苷酸引物产生。5′引物5′-TAC CAG ITG GCI GCC ITG CAA G-3′(SEQ IDNO35)和3′引物5′-GTI ACA GCA GTT TIA IIG CAC C-3′(SEQID NO36)。在简并的引物的序列中(SEQ ID NO35和36)，“I″代表脱氧肌苷或二脱氧肌苷。
本发明还提供了一种核酸分子，其具有与SEQ ID NO1和SEQID NO18的延伸部分相关的核苷酸序列，所述核苷酸序列已从以下相关的cDNA克隆中确定HSOAD 55(SEQ ID NO7)，HSLAH84(SEQ ID NO8)，和HLTBM08(SEQ ID NO9)。
本发明进一步涉及编码本文所述核苷酸序列一部分的核酸分子，以及该分离的核酸分子的片段。在一实施方案中，本发明提供了具有代表SEQ ID NO1的一部分的核苷酸序列的多核苷酸，该部分由SEQ ID NO1的1-1001位核苷酸组成。在另一实施方案中，本发明提供了具有代表SEQ ID NO18的一部分的核苷酸序列的多核苷酸，该部分由SEQ ID NO18的1-798位核苷酸组成。
本发明进一步涉及本文所述核酸分子(即多核苷酸)的片段。具有例如以下核苷酸序列的核酸分子片段是指长度为至少15个，优选至少20或25个，更优选至少30个，最优选至少40，50，100，150，200，250，300，325，350，375，400，450，或500个核苷酸，所述核苷酸序列例如是ATCC保藏号97768的质粒中包含的cDNA的核苷酸序列，编码由ATCC保藏号97768的质粒中包含的cDNA编码的多肽序列的核苷酸序列，SEQ ID NO1的核苷酸序列，编码SEQ ID NO2的多肽序列的核苷酸序列，ATCC保藏号203518的质粒中包含的cDNA的核苷酸序列，SEQ ID NO18的核苷酸序列，编码SEQ IDNO20多肽序列的核苷酸序列，或它们的互补链。这些片段有许多用途，包括但非限于如本文所述的诊断探针和引物。当然，较大的片段如长度为501-1500个核苷酸的片段根据本发明也是有用的，该片段相当于大多数(如果不是全部)以下核苷酸序列ATCC保藏号97768的质粒中包含的cDNA的核苷酸序列，SEQ ID NO1的核苷酸序列，ATCC保藏号203518的质粒中包含的cDNA的核苷酸序列，和SEQ ID NO18的核苷酸序列。本发明优选的核酸片段包括编码一种多肽的核酸分子，该多肽包含或由图1A和1B(SEQ IDNO2)和图5A和5B(SEQ ID NO19)中分别示出的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的携带表位部分组成，并见以下详述。由这些多核苷酸片段编码的多肽也涵盖在本发明内。
具有例如以下核苷酸序列的核酸分子片段是指长度至少为15个，优选至少20或25个，更优选至少30个，最优选至少40，50，100，150，200，250，300，325，350，375，400，450或500个核苷酸，所述核苷酸序列例如是SEQ ID NO21的核苷酸序列，SEQ ID NO22的核苷酸序列，SEQ ID NO27的核苷酸序列，SEQ ID NO29的核苷酸序列，编码SEQ ID NO23的多肽序列的核苷酸序列，编码SEQ ID NO28的多肽序列的核苷酸序列，编码SEQ ID NO30的多肽序列的核苷酸序列或它们的互补链。这些片段有许多用途，包括包括但非限于如本文所述用作诊断探针和引物。当然，较大的片段如长度为501-1500个核苷酸的片段根据本发明也是有用的，此片段相当于以下大多数(如果不是全部)核苷酸序列SEQ ID NO21的核苷酸序列，SEQ ID NO22的核苷酸序列，SEQ ID NO27的核苷酸序列，SEQ ID NO29的核苷酸序列，编码SEQ ID NO23的多肽序列的核苷酸序列，编码SEQ ID NO28的多肽序列的核苷酸序列，编码SEQ ID NO30的多肽序列的核苷酸序列，或它们的互补链。由这些多核苷酸片段编码的多肽也涵盖在本发明内。
本发明的Neutrokine-α多核苷酸片段的代表性片段例如包括包含或由SEQ ID NO1的或其互补链或ATCC保藏号97768的cDNA的大约1-50，51-100，101-146，147-200，201-250，251-300，301-350，351-400，401-450，451-500，501-550，551-600，600-650，651-700，701-750，751-800，800-850，851-900，901-950，951-1000，1001-1050和/或1051-1082位核苷酸序列组成的片段。文中“大约”包括特别指出的范围，以及在任一端或两端比此范围稍多或稍少几个(5，4，3，2，或1个)核苷酸的范围。
本发明的Neutrokine-αSV多核苷酸片段的代表性片段例如包括包含或由SEQ ID NO18的或其互补链，或ATCC保藏号203518的cDNA的大约1-50，51-100，101-146，147-200，201-250，251-300，301-350，351-400，401-450，451-500，501-550，551-600，601-650，651-700，701-750，751-800，801-850，和/或851-900位核苷酸序列组成。文中“大约”包括特指的范围，以及在任一端或两端比此范围稍多或稍少几个(5，4，3，2，或1个)核苷酸的范围。
在某些优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SEQ IDNO1的571-627，580-627，590-627，600-627，610-627，571-620，580-620，590-620，600-620，571-610，580-610，590-610，571-600，580-600和/或571-590位核苷酸残基组成。
在某些其它优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SEQID NO18的以下核苷酸残基组成1-879，25-879，50-879，75-879，100-879，125-879，150-879，175-879，200-879，225-879，250-879，275-879，300-879，325-879，350-879，375-879，400-879，425-879，450-879，475-879，500-879，525-879，550-879，575-879，600-879，625-879，650-879，675-879，700-879，725-879，750-879，775-879，800-879，825-879，850-879，1-850，25-850，50-850，75-850，100-850，125-850，150-850，175-850，200-850，225-850，250-850，275-850，300-850，325-850，350-850，375-850，400-850，425-850，450-850，475-850，500-850，525-850，550-850，575-850，600-850，625-850，650-850，675-850，700-850，725-850，750-850，775-850，800-850，825-850，1-825，25-825，50-825，75-825，100-825，125-825，150-825，175-825，200-825，225-825，250-825，275-825，300-825，325-825，350-825，375-825，400-825，425-825，450-825，475-825，500-825，525-825，550-825，575-825，600-825，625-825，650-825，675-825，700-825，725-825，750-825，775-825，800-825，1-800，25-800，50-800，75-800，100-800，125-800，150-800，175-800，200-800，225-800，250-800，275-800，300-800，325-800，350-800，375-800，400-800，425-800，450-800，475-800，500-800，525-800，550-800，575-800，600-800，625-800，650-800，675-800，700-800，725-800，750-800，775-800，1-775，25-775，50-775，75-775，100-775，125-775，150-775，175-775，200-775，225-775，250-775，275-775，300-775，325-775，350-775，375-775，400-775，425-775，450-775，475-775，500-775，525-775，550-775，575-775，600-775，625-775，650-775，675-775，700-775，725-775，750-775，1-750，25-750，50-750，75-750，100-750，125-750，150-750，175-750，200-750，225-750，250-750，275-750，300-750，325-750，350-750，375-750，400-750，425-750，450-750，475-750，500-750，525-750，550-750，575-750，600-750，625-750，650-750，675-750，700-750，725-750，1-725，25-725，50-725，75-725，100-725，125-725，150-725，175-725，200-725，225-725，250-725，275-725，300-725，325-725，350-725，375-725，400-725，425-725，450-725，475-725，500-725，525-725，550-725，575-725，600-725，625-725，650-725，675-725，700-725，1-700，25-700，50-700，75-700，100-700，125-700，150-700，175-700，200-700，225-700，250-700，275-700，300-700，325-700，350-700，375-700，400-700，425-700，450-700，475-700，500-700，525-700，550-700，575-700，600-700，625-700，650-700，675-700，1-675，25-675，50-675，75-675，100-675，125-675，150-675，175-675，200-675，225-675，250-675，275-675，300-675，325-675，350-675，375-675，400-675，425-675，450-675，475-675，500-675，525-675，550-675，575-675，600-675，625-675，650-675，1-650，25-650，50-650，75-650，100-650，125-650，150-650，175-650，200-650，225-650，250-650，275-650，300-650，325-650，350-650，375-650，400-650，425-650，450-650，475-650，500-650，525-650，550-650，575-650，600-650，625-650，1-625，25-625，50-625，75-625，100-625，125-625，150-625，175-625，200-625，225-625，250-625，275-625，300-625，325-625，350-625，375-625，400-625，425-625，450-625，475-625，500-625，525-625，550-625，575-625，600-625，1-600，25-600，50-600，75-600，100-600，125-600，150-600，175-600，200-600，225-600，250-600，275-600，300-600，325-600，350-600，375-600，400-600，425-600，450-600，475-600，500-600，525-600，550-600，575-600，1-575，25-575，50-575，75-575，100-575，125-575，150-575，175-575，200-575，225-575，250-575，275-575，300-575，325-575，350-575，375-575，400-575，425-575，450-575，475-575，500-575，525-575，550-575，1-550，25-550，50-550，75-550，100-550，125-550，150-550，175-550，200-550，225-550，250-550，275-550，300-550，325-550，350-550，375-550，400-550，425-550，450-550，475-550，500-550，525-550，1-525，25-525，50-525，75-525，100-525，125-525，150-525，175-525，200-525，225-525，250-525，275-525，300-525，325-525，350-525，375-525，400-525，425-525，450-525，475-525，500-525，1-500，25-500，50-500，75-500，100-500，125-500，150-500，175-500，200-500，225-500，250-500，275-500，300-500，325-500，350-500，375-500，400-500，425-500，450-500，475-500，1-475，25-475，50-475，75-475，100-475，125-475，150-475，175-475，200-475，225-475，250-475，275-475，300-475，325-475，350-475，375-475，400-475，425-475，450-475，1-450，25-450，50-450，75-450，100-450，125-450，150-450，175-450，200-450，225-450，250-450，275-450，300-450，325-450，350-450，375-450，400-450，425-450，1-425，25-425，50-425，75-425，100-425，125-425，150-425，175-425，200-425，225-425，250-425，275-425，300-425，325-425，350-425，375-425，400-425，1-400，25-400，50-400，75-400，100-400，125-400，150-400，175-400，200-400，225-400，250-400，275-400，300-400，325-400，350-400，375-400，1-375，25-375，50-375，75-375，100-375，125-375，150-375，175-375，200-375，225-375，250-375，275-375，300-375，325-375，350-375，1-350，25-350，50-350，75-350，100-350，125-350，150-350，175-350，200-350，225-350，250-350，275-350，300-350，325-350，1-325 ， 25-325，50-325，75-325，100-325，125-325，150-325，175-325，200-325，225-325，250-325，275-325，300-325，1-300，25-300，50-300，75-300，100-300，125-300，150-300，175-300，200-300，225-300，250-300，275-300，1-275，25-275，50-275，75-275，100-275，125-275，150-275，175-275，200-275，225-275，250-275，1-250，25-250，50-250，75-250，100-250，125-250，150-250，175-250，200-250，225-250，1-225，25-225，50-225，75-225，100-225，125-225，150-225，175-225，200-225，1-200，25-200，50-200，75-200，100-200，125-200，150-200，175-200，1-175，25-175，50-175，75-175，100-175，125-175，150-175，1-150，25-150，50-150，75-150，100-150，125-150，1-125，25-125，50-125，75-125，100-125，1-100，25-100，50-100，75-100，1-75，25-75，50-75，1-50，25-50，和/或1-25在另外一些优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SEQID NO1的以下核苷酸残基组成400-627，425-627，450-627，475-627，500-627，525-627，550-627，575-627，600-627，400-600，425-600，450-600，475-600，500-600，525-600，550-600，575-600，400-575，425-575，450-575，475-575，500-575，525-575，550-575，400-550，425-550，450-550，475-550，500-550，525-550，400-500，425-500，450-500，475-500，400-475，425-475，450-475，400-450，425-450，571-800，600-800，625-800，650-800，675-800，700-800，725-800，750-800，775-800，571-775，600-775，625-775，650-775，675-775，700-775，725-775，750-775，571-750，600-750，625-750，650-750，675-750，700-750，725-750，571-725，600-725，625-725，650-725，675-725，700-725，571-700，600-700，625-700，650-700，675-700，571-675，600-675，625-675，650-675，571-650，600-650，625-650，571-625，600-625，和/或571-600在另一些优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SEQID NO1的以下核苷酸残基组成147-500，147-450，147-400，147-350，200-500，200-450，200-400，200-350，250-500，250-450，250-400，250-350，300-500，300-450，300-400，300-350，350-750，350-700，350-650，350-600，350-550，400-750，400-700，400-650，400-600，400-550，425-750，425-700，425-650，425-600，425-550，450-1020，450-1001，450-950，450-900，450-850，450-800，450-775，500-1001，500-950，500-900，500-850，500-800，500-775，550-1001，550-950，550-900，550-850，550-800，550-775，600-1001，600-950，600-900，600-850，600-800，600-775，650-1001，650-950，650-900，650-850，650-800，650-775，700-1001，700-950，700-900，700-850，700-800，700-775，825-1082，850-1082，875-1082，900-1082，925-1082，950-1082，975-1082，1000-1082，1025-1082，和/或1050-1082优选地，本发明的多核苷酸片段编码表明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性的多肽。具有“功能活性”的多肽是指能显示一或多种与全长和/或分泌的Neutrokine-α多肽和/或Neutrokine-αSV多肽相关的已知功能活性的多肽。这种功能活性包括但非限于生物活性(如刺激B细胞增殖，存活分化和/或激活的能力)，抗原性〔结合(或与Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽竞争性结合)抗Neutrokine-α和/或抗Neutrokine-αSV抗体的能力〕，免疫原性(产生结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的抗体的能力)，与本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽形成多聚体的能力，及结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽受体或配体的能力。
在其它特异的实施方案中，本发明的多核苷酸片段编码的多肽包含或由Neutrokine-α推定的胞内域(SEQ ID NO2的1-46位氨基酸)，推定的跨膜域(SEQ ID NO2的47-72位氨基酸)，推定的胞外域(SEQ ID NO2的73-284位氨基酸)，推定的TNF保守域(SEQ ID NO2的191-284位氨基酸)组成。在另一实施方案中，本发明的多核苷酸片段包含或由1，2，3或全部4个上述结构域的任意组合组成。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。
在另一特异的实施方案中，本发明的多核苷酸片段编码的多肽包含或由Neutrokine-αSV的推定的胞内域(SEQ ID NO19的1-46位氨基酸)，推定的跨膜域(SEQ ID NO19的47-72位氨基酸)，推定的胞外域(SEQ ID NO19的73-266位氨基酸)，或推定的TNF保守域(SEQ ID NO19的172-265位氨基酸)组成。在另外的实施方案中，本发明的多核苷酸片段编码的多肽包含或由1，2，3或全部4个上述结构域的任意组合组成。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。
在另一实施方案中，本发明的多核苷酸片段包含或由一种多核苷酸组成，该多核苷酸编码选自SEQ ID NO2的Met 1-Lys113，Leu114-Thr141，Ile142-Lys160，Gly161-Gln198，Val199-Ala248和Gly250-Leu285的氨基酸序列。另外，编码2，3，4，5或更多个这些氨基酸序列的任意组合的多核苷酸也涵盖在本发明内。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。
在另一实施方案中，本发明的多核苷酸片段包含或由一种多核苷酸组成，该多核苷酸编码选自SEQ ID NO19的Met 1-Lys113，Leu114-Thr141，Gly142-Gln179，Val180-Ala229，Gly230-Leu266残基的氨基酸序列。另外，编码2，3，4，5或更多个这些氨基酸序列的任意组合的多核苷酸也涵盖在本发明内。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。
在另一实施方案中，本发明的多核苷酸片段包含或由一种多核苷酸组成，该多核苷酸编码选自SEQ ID NO23的Met1-Lys106，Leu107-Thr134，Glu135-Asn165，Ile167-Lys184，Gly185-Gln224，Val225-Ala272和Gly273-Leu309残基的氨基酸序列。另外，编码2，3，4，5或更多个这些氨基酸序列的任意组合的多核苷酸也涵盖在本发明内。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。
在另一实施方案中，本发明的多核苷酸片段包含或由一种多核苷酸组成，该多核苷酸编码选自SEQ ID NO28的Tyr1-Lys47，Leu48-Thr75，Ile76-Lys94，Gly95-Gln132，Val133-Ala182和Gly183-Ala219残基的氨基酸序列。另外，编码2，3，4，5或更多个这些氨基酸序列的任意组合的多核苷酸也涵盖在本发明内。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。
在另一实施方案中，本发明的多核苷酸片段包含或由一种多核苷酸组成，该多核苷酸编码选自SEQ ID NO30的Tyr1-Lys47，Leu48-Thr75，Ile76-Lys94，Gly95-Gln132，Val133-Ala182和Gly183-Ala219残基的氨基酸序列。另外，编码2，3，4，5或更多个这些氨基酸序列的任意组合的多核苷酸也涵盖在本发明内。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。
在另一实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SEQ ID NO21所示序列组成。SEQ ID NO21所示序列编码一种多肽，该多肽起始甲硫氨酸残基及相连的SEQ ID NO2所示Neutrokine-α多肽序列的Ala134-Leu285残基的组成。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。
在某些其它的优选实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SEQID NO21的以下核苷酸残基组成 1-459，15-459，30-459，45-459，60-459，75-459，90-459，105-459，120-459，135-459，150-459，165-459，180-459，195-459，210-459，225-459，240-459，255-459，270-459，285-459，300-459，315-459，330-459，345-459，360-459，375-459，390-459，405-459，420-459，435-459，450-459，1-450，15-450，30-450，45-450，60-450，75-450，90-450，105-450，120-450，135-450，150-450，165-450，180-450，195-450，210-450，225-450，240-450，255-450，270-450，285-450，300-450，315-450，330-450，345-450，360-450，375-450，390-450，405-450，420-450，435-450，1-435，15-435，30-435，45-435，60-435，75-435，90-435，105-435，120-435，135-435，150-435，165-435，180-435，195-435，210-435，225-435，240-435，255-435，270-435，285-435，300-435，315-435，330-435，345-435，360-435，375-435，390-435，405-435，420-435，1-420，15-420，30-420，45-420，60-420，75-420，90-420，105-420，120-420，135-420，150-420，165-420，180-420，195-420，210-420，225-420，240-420，255-420，270-420，285-420，300-420，315-420，330-420，345-420，360-420，375-420，390-420，405-420，1-405，15-405，30-405，45-405，60-405，75-405，90-405，105-405，120-405，135-405，150-405，165-405，180-405，195-405，210-405，225-405，240-405，255-405，270-405，285-405，300-405，315-405，330-405，345-405，360405，375-405，390-405，1-390，15-390，30-390，45-390，60-390，75-390，90-390，105-390，120-390，135-390，150-390，165-390，180-390，195-390，210-390，225-390，240-390，255-390，270-390，285-390，300-390，315-390，330-390，345-390，360-390，375-390，1-375，15-375，30-375，45-375，60-375，75-375，90-375，105-375，120-375，135-375，150-375，165-375，180-375，195-375，210-375，225-375，240-375，255-375，270-375，285-375，300-375，315-375，330-375，345-375，360-375，1-360，15-360，30-360，45-360，60-360，75-360，90-360，105-360，120-360，135-360，150-360，165-360，180-360，195-360，210-360，225-360，240-360，255-360，270-360，285-360，300-360，315-360，330-360，345-360，1-345，15-345，30-345，45-345，60-345，75-345，90-345，105-345，120-345，135-345，150-345，165-345，180-345，195-345，210-345，225-345，240-345，255-345，270-345，285-345，300-345，315-345，330-345，1-330，15-330，30-330，45-330，60-330，75-330，90-330，105-330，120-330，135-330，150-330，165-330，180-330，195-330，210-330，225-330，240-330，255-330，270-330，285-330，300-330，315-330，1-315，15-315，30-315，45-315，60-315，75-315，90-315，105-315，120-315，135-315，150-315，165-315，180-315，195-315，210-315，225-315，240-315，255-315，270-315，285-315，300-315，1-300，15-300，30-300，45-300，60-300，75-300，90-300，105-300，120-300，135-300，150-300，165-300，180-300，195-300，210-300，225-300，240-300，255-300，270-300，285-300，1-285，15-285，30-285，45-285，60-285，75-285，90-285，105-285，120-285，135-285，150-285，165-285，180-285，195-285，210-285，225-285，240-285，255-285，270-285，1-270，15-270，30-270，45-270，60-270，75-270，90-270，105-270，120-270，135-270，150-270，165-270，180-270，195-270，210-270，225-270，240-270，255-270，1-255，15-255，30-255，45-255，60-255，75-255，90-255，105-255，120-255，135-255，150-255，165-255，180-255，195-255，210-255，225-255，240-255，1-240，15-240，30-240，45-240，60-240，75-240，90-240，105-240，120-240，135-240，150-240，165-240，180-240，195-240，210-240，225-240，1-225，15-225，30-225，45-225，60-225，75-225，90-225，105-225，120-225，135-225，150-225，165-225，180-225，195-225，210-225，1-210，15-210，30-210，45-210，60-210，75-210，90-210，105-210，120-210，135-210，150-210，165-210，180-210，195-210，1-195，15-195，30-195，45-195，60-195，75-195，90-195，105-195，120-195，135-195，150-195，165-195，180-195，1-180，15-180，30-180，45-180，60-180，75-180，90-180，105-180，120-180，135-180，150-180，165-180，1-165，15-165，30-165，45-165，60-165，75-165，90-165，105-165，120-165，135-165，150-165，1-150，15-150，30-150，45-150，60-150，75-150，90-150，105-150，120-150，135-150，1-135，15-135，30-135，45-135，60-135，75-135，90-135，105-135，120-135，1-120，15-120，30-120，45-120，60-120，75-120，90-120，105-120，1-105，15-105，30-105，45-105，60-105，75-105，90-105，1-90，15-90，30-90，45-90，60-90，75-90，1-75，15-75，30-75，45-75，60-75，1-60，15-60，30-60，45-60，1-45，15-45，3045，1-30，和/或15-30。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。
因此，本发明的特异实施方案涉及编码一种多肽的多核苷酸，该多肽包含或由图7A和实施例6中所示β折叠区A，A′，B，B′，C，D，E，F，G或H的氨基酸序列组成。本发明的其它实施方案涉及编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸，该多肽包含或由1，2，3，4，5，6，7，8，9或所有10个图7A和实施例6所示β折叠区A-H的任意组合组成。本发明另外优选的实施方案涉及一种多肽，该多肽包含或由图7A和实施例6中所示β折叠区A，A′，B，B′，C，D，E，F，G或H的Neutrokine-α氨基酸序列组成。本发明的另外实施方案涉及Neutrokine-α多肽，其包含或由图7A和实施例6所示1，2，3，4，5，6，7，8，9或所有10个β折叠区A-H的任意组合组成。
在某些其它的优选实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SEQID NO21的34-57，118-123，133-141，151-159，175-216，232-255，280-315，328-357，370-393和/或430-456位核苷酸残基组成。这些多核苷酸和多肽相当于图7A中所示推定的β折叠区。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由与编码1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个上述β折叠区的多核苷酸序列有至少90％ 95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸组成。本发明还涵盖融合异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内。在另一实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，其包含在严格杂交条件下与1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个上述本发明的β折叠多核苷酸杂交的多核苷酸。在此所用的“严格条件”如前所述。
在另外优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SEQ IDNO1的576-599，660-665，675-683，693-701，717-758，744-803，822-857，870-899，912-935，和/或972-998位核苷酸残基组成。由这些多核苷酸片段编码的多肽也涵盖在本发明内。这些多核苷酸和多肽片段相当于图7A所示推定的β折叠区。
在另外优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SFQ IDNO18的457-462，472-480，490-498，514-555，571-600，619-654，667-696，699-732和/或769-795位核苷酸残基组成。由这些多核苷酸片段编码的多肽也涵盖在本发明内。这些多核苷酸和多肽片段相当于图7A所示推定的β折叠区。
在另外优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含或由SEQ IDNO22的124-129，139-147，157-165，181-222，238-267，286-321，334-363，376-399和/或436-462位核苷酸残基组成。由这些多核苷酸片段编码的多肽也涵盖在本发明内。这些多核苷酸和多肽片段相当于图7A所示推定的β折叠区。包含或由1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或全部这些区域的任意组合的氨基酸序列组成的多肽也涵盖在本发明内。
鼠Neutrokine-α(SEQ ID NO22和SEQ ID NO23)的几个内含子/外显子边界的相对位置是基于鼠基因组DNA的序列分析而确定。鼠Neutrokine-α基因组克隆5′末端的表观第二个外显子(预先称为“外显子2”)，由SEQ ID NO23所示序列Tyr187-Gln222组成。鼠Neutrokine-α基因组克隆5′末端的表观第三个外显子(预先称为“外显子3”)包含SEQ ID NO23所示序列的Val 223-Gly273。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含或由SEQ ID NO23的Tyr187-Gln222的氨基酸序列组成。本发明还涉及一种核酸分子，其包含或由与编码上述鼠Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸序列组成。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含或由SEQ ID NO23的Val223-G1y273残基的氨基酸序列组成。本发明还涉及包含或由与编码上述鼠Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸序列组成的核酸分子。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内。
另外，人Neutrokine-α(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)中相应内含子/外显子边界的相对位置是基于鼠和人Neutrokine-α多肽的序列对比确定的。人Neutrokine-α5′末端的表观第二个外显子(也预先称为“外显子2”)由SEQ ID NO2所示序列的Tyr163-Gln198组成。人Neutrokine-α5′末端的表观第三个外显子(也预先称为“外显子3”)由SEQ ID NO2所示序列的Val199-Gly249组成。
因此，在一个实施方案中，本发明提供编码包含或由SEQ IDNO2所示Tyr163-Gln198氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。本发明还涉及一种核酸分子，其包含或由与编码上述Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸序列组成。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含或由SEQ ID NO2的Val199-Gly249氨基酸序列组成。本发明还涉及一种核酸分子，其包含或由与编码上述Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸序列组成。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内。
Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽，及其片段，变体衍生物，和类似物的功能活性，可通过本文所述的及本领域熟知的各种方法分析。
例如，在一个实施方案中，就分析结合或与全长Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽竞争性结合抗Neutrokine-α和/或抗Neutrokine-αSV抗体，或结合B细胞上Neutrokine-α受体和/或Neutrokine-αSV受体的能力而言，可使用本领域已知各种免疫分析，包括但非限于用以下方法的竞争性和非竞争性分析放射免疫分析，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫分析，免疫放射分析，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散分析，原位免疫分析(用例如胶体金，酶或放射性同位素标记)，Westem印迹，沉淀反应，凝集分析(如凝胶凝集分析，血凝分析)，补体固定分析，免疫荧光分析，A蛋白分析，和免疫电泳分析等。在一实施方案中，抗体结合是通过检测原始抗体上的标记而检测的。在另一实施方案中，一抗是通过检测二抗和试剂与一抗的结合而检测的。在又一实施方案中，二抗是标记的。本领域已知许多检测免疫分析中结合的方法，并在本发明范围内。
在另一实施方案中，当鉴别Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV配体，或评价本发明多肽片段，变体或衍生物多聚体化的能力时，可对结合进行分析，例如通过本领域熟知方法如还原或非还原凝胶层析，蛋白质亲和性层析，和亲和印迹。见Phizicky，E.等，1995，微生物学研究5994-123。在另一实施方案中，对Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV结合其底物的生理相关性进行分析。
另外，本文所述的分析(如见实施例6和7)及本领域已知其它分析可常规地用于测定Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽及其片段，变体衍生物和类似物激发Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV相关的生物活性的能力(如刺激或抑制(在Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV拮抗剂的情况下)B细胞增殖，分化和/或活化和/或延长B细胞在体外或体内的存活)。
本领域技术人员熟知其它方法并也包括在本发明内。
在另外的实施方案中，本发明的多核苷酸编码具有Neutrokine-α和Neutrokine-αSV的功能特点的多肽。为此目的的本发明优选的实施方案包括包含或由Neutrokine-α和Neutrokine-αSV多肽的以下区域组成的片段α螺旋和α螺旋形成区(“α区”)，β折叠和β折叠形成区(“β区”)，转角和转角形成区(“转角区”)，卷曲和卷曲形成区(“卷曲区”)，亲水区，疏水区，α两亲区，β两亲区，柔性区，表面形成区和高抗原指数区。
可以确信图7A中所示Neutrokine-α的一或多个β折叠区对二聚体化和Neutrokine-α及其配体间相互作用是重要的。
为此目的的一些优选的区域示于图3(表1)。图3和表1所示数据仅代表当用DNA*STAR计算机程序的默认参数分析SEQ IDNO2的氨基酸序列时获得的相同结果的不同形式。
图3和表1所示上述优选的区域包括但非限于通过分析图1A和1B所示氨基酸序列鉴别的前述各类型区域。如图3和表1所示，这种优选的区域包括Gamier-Robsonα区，β区，转角区，和卷曲区，Chou-Fasmanα区，β区和卷曲区，Kyte-Doolittle 亲水区和疏水区，Eisenbergα和β两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Emini表面形成区，和Jameson-Wolf高抗原指数区。非常优选的多核苷酸是那些编码由Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的区域组成的多肽的多核苷酸，所述区域组合了上述一些(如1，2，3，或4种)特点。
另外，表1的VIII，IX，XIII和XIV列中的数据可常规用于确定呈高度潜在抗原性的Neutrokine-α的区域(表1的VIII列代表根据Kyte-DooLittle的亲水性；表1的IX列代表根据Hopp-Woods的疏水性；表1的XIII列代表根据Jameson-Wolf的抗原指数；表1的XIV列代表根据Emini的表面概率)。高抗原性的区域是从VIII，IX，XIII，和/或XIV所示数据中，通过选择代表在一定环境中易于在多肽表面暴露的多肽区域的数值而确定，所述环境是在免疫应答初始可发生抗原识别的环境。图6所示数据也可常规地用相似的表形式代表，通过用设定默认参数的DNA*STAR模式和程序简便地检测图6(SEQ ID NO19)中所示氨基酸序列而得。如上所述，图6中所示氨基酸序列也可用于确定呈高度潜在抗原性的Neutrokine-α的区域，可以以图(如图6)或以表(如表1)形式代表。
表1残基位置I II III IVVVI VII VIIIIX XXI XII XIIIXIVMet1A......0.73-0.71 ... 0.951.39Asp2A....T.1.12-0.66 *.. 1.151.56Asp3A....T.1.62-1.09 *.. 1.152.12Ser4A....T.2.01-1.51 ... 1.154.19Thr5A....T.2.40-2.13 ..F 1.304.35Glu6AA.....2.70-1.73 **F 0.904.51Arg7AA.....2.81-1.34 **F 0.904.51Glu8AA.....2.00-1.73 **F 0.906.12Gln9AA.....1.99-1.53 **F 0.902.91Ser10 A..B...2.00-1.04 **F 0.902.15Arg11 A..B.. 1.33-0.66 **F 0.901.66Leu12 A..B...0.41-0.09 **F 0.450.51Thr13 A..B...0.460.20 **F -0.15 0.32Ser14 AA.....0.50-0.19 **. 0.300.32Cys15 AA.....0.91-0.19 **. 0.300.78Leu16 AA.....0.80-0.87 **F 0.901.06Lys17 AA.....1.61-1.36 .*F 0.901.37Lys18 AA.....1.32-1.74 .*F 0.904.44Arg19 AA.....1.67-1.70 .*F 0.905.33Glu20 AA.....1.52-2.39 .*F 0.905.33Glu21 AA.....2.38-1.70 .*F 0.902.20Met22 AA.....2.33-1.70 .*F 0.902.24Lys23 AA.....1.62-1.70 **F 0.902.24Leu24 AA.....0.66-1.13 **F 0.750.69Lys25 AA.....0.36-0.49 .*F 0.450.52Glu26 AA.B...-0.53 -0.71 **. 0.600.35Cys27 AA.B...-0.74 -0.03 **. 0.300.30Val28 AA.B...-1.00 -0.03 **. 0.300.12Ser29 AA.B...-0.08 0.40 **. -0.30 0.11Ile30 A..B...-0.08 0.40 **. -0.30 0.40Leu31 A..B...-0.08 -0.17 *.. 0.451.08Pro32 ...B..C0.29-0.81 *.F 1.101.39Arg33 ....T..0.93-0.81 .*F 1.502.66Lys34 ....T..0.93-1.07 ..F 1.844.98Glu35 ......C0.97-1.37 **F 1.984.32Ser36 .....TC1.89-1.16 **F 2.521.64Pro37 .....TC1.80-1.16 **F 2.861.60Ser38 ....TT.1.39-0.77 *.F 3.401.24Val39 A....T.1.39-0.39 .*F 2.361.24Arg40 A......1.39-0.77 **F 2.461.60Ser41 A......1.34-1.20 **F 2.462.00Ser42 ....TT.1.60-1.16 .*F 3.062.67Lys43 ....TT.1.09-1.80 .*F 3.062.72Asp44 ....TT.1.13-1.11 **F 3.401.67-Gly45 A....T.0.43-0.81 **F 2.661.03Lys46 AA.....0.14-0.70 ..F 1.770.52Leu47 AA.....0.13-0.20 *.. 0.980.31Leu48 AA.....-0.72 0.29 *.. 0.040.46Ala49 AA.....-1.53 0.54 .*. -0.60 0.19Ala50 AA.....-2.00 1.23 ... -0.60 0.19Thr51 AA.....-2.63 1.23 ... -0.60 0.19Leu52 AA.....-2.63 1.04 ... -0.60 0.19Leu53 AA.....-2.63 1.23 ... -0.60 0.15Leu54 AA.....-2.34 1.41 ... -0.60 0.09Ala55 AA.....-2.42 1.31 ... -0.60 0.14Leu56 AA.....-2.78 1.20 ... -0.60 0.09Leu57 A....T.-2.78 1.09 ... -0.20 0.06
表1(续)残基位置 III III IV VVI VII VIII IX X XIXU XIII XIVSer58A....T.-2.281.09... -0.20 0.05Cys59A....T.-2.321.07... -0.20 0.09Cys60A....T.-2.591.03... -0.20 0.08Leu61..BB...-2.080.99... -0.60 0.04Thr62..BB...-1.970.99... -0.60 0.11Val63..BB...-1.911.20... -0.60 0.17Val64..BB...-1.241.39... -0.60 0.33Ser65..BB...-1.431.10... -0.60 0.40Phe66A..B...-1.211.26... -0.60 0.4Tyr67A..B...-1.491.11... -0.60 0.54Gln68A..B...-1.440.97... -0.60 0.41Val69A..B...-0.591.27... -0.60 0.39Ala70A..B...-0.630.89... -0.60 0.43Ala71A..B...0.07 0.56.*. -0.60 0.25Leu72A....T.-0.500.16.*. 0.10 0.55Gln73A....T.-1.090.20..F 0.25 0.45G1y74A....T.-0.530.20..F 0.25 0.45Asp75A....T.-0.760.09.*F 0.25 0.73Leu76AA.....-0.060.09.*F -0.15 0.35Ala77AA.....0.17 -0.31 .*. 0.30 0.69Ser78AA.....0.17 -0.24 .*. 0.30 0.42Leu79AA.....-0.30-0.24 .*. 0.30 0.88Arg80AA.....-0.30-0.24 .*. 0.30 0.72Ala81AA.....0.17 -0.34 .*. 0.30 0.93Glu82AA.....0.72 -0.30 .*. 0.45 1.11Leu83AA... ...0.99 -0.49 .*. 0.30 0.77Gln84AA.....1.21 0.01.*. -0.15 1.04Gly85AA.....1.10 0.01**. -0.30 0.61His86AA.....1.73 0.01**. -0.15 1.27His87AA.....0.92 -0.67 .*. 0.75 1.47Ala88AA.....1.52 -0.39 .*. 0.45 1.22Glu89AA.....0.93 -0.39 ... 0.45 1.39Lys90AA.....0.93 -0.39 *.F 0.60 1.03Leu91A....T.0.38 -0.46 *.. 0.85 1.01Pro92A....T.0.07 -0.46 ... 0.70 0.59Ala93A....T.0.07 -0.03 ... 0.70 0.29Gly94A....T.-0.140.47... -0.20 0.36Ala95A......-0.140.21.*. -0.10 0.36Gly96A......0.08 -0.21 ..F 0.65 0.71Ala97A......-0.06-0.21 ..F 0.65 0.72Pro98A......-0.28-0.21 .*F 0.65 0.71Lys99AA.....0.07 -0.03 ..F 0.45 0.59Ala100 AA.....0.66 -0.46 ..F 0.60 1.01Gly101 AA.....0.41 -0.96 ..F 0.90 1.13Leu102 AA.....0.79 -0.89 ..F 0.75 0.57Glu103 AA.....0.41 -0.46 *.F 0.45 0.88Glu104 AA.....-0.49-0.46 *.F 0.45 0.89Ala105 AA.....-0.21-0.24 ... 0.30 0.81Pro106 AA.....-0.46-0.44 ... 0.30 0.67Ala107 AA.....0.01 0.06... -0.30 0.39Val108 AA.....-0.800.49.*. -0.60 0.38Thr109 AA.....-0.760.67.*. -0.60 0.20Ala110 AA.....-1.060.24**. -0.30 0.40Gly111 AA.....-1.540.43**. -0.60 0.38Leu112 AA.....-0.960.57**. -0.60 0.23Lys113 .AB....-0.310.09**. -0.30 0.39lie114 .AB....-0.210.01*.. -0.30 0.61
表1(续)残基位置 III III IV VVI VII VIII IXX XI XII XIII XIVPhe115.AB....-0.210.01 * ..0.15 1.15Glu116.A....C-0.08-0.17 * .F1.25 0.58Pro117.A....C0.39 0.26 * *F1.10 1.28Pro118......C0.34 -0.00 ..F2.20 1.47Ala119.....TC0.89 -0.79 .*F3.00 1.47Pro120.....TC1.59 -0.36 .*F2.25 0.94Gly121....TT.1.29 -0.39 .*F2.15 0.98Glu122....TT.1.20 -0.43 ..F2.00 1.30Gly123......C1.41 -0.54 ..F1.60 1.12Asn124.....TC2.00 -0.57 ..F1.50 1.97Ser125.....TC1.91 -0.60 .*F1.50 1.82Ser126.....TC2.37 -0.21 .*F1.54 2.47Gln127.....TC2.37 -0.64 .*F2.18 3.01A5n128......C2.76 -0.64 ..F2.32 3.61Ser129.....TC2.87 -1.03 ..F2.86 5.39Arg130....TT.2.58 -1.41 *.F3.40 6.09Asn131....TT.2.02 -1.31 *.F3.06 3.83Lys132....TT.2.02 -1.07 *.F2.72 2.12Arg133....T..1.68 -1.06 *.F2.18 1.88Ala134.. .....C1.77 -0.63 *.F1.64 1.15Val135......C1.66 -0.60 *.F1.49 0.89Gln136......C1.66 -0.60 *.F1.83 0.79Gly137.....TC1.30 -0.60 *.F2.52 1.35Pro138.....TC0.33 -0.61 *.F2.86 2.63Glu139....TT.0.61 -0.61 *.F3.40 1.13Glu140A....T.1.47 -0.53 *.F2.66 1.64Thr141A......1.47 -0.56 ..F2.12 1.84Val142A......1.14 -0.99 ... F1.78 1.77Thr143A....T.0.54 -0.41 ..F1.19 0.55Gln144A....T.0.54 0.27 *.F0.25 0.31Asp145A....T.-0.270.19 *.F0.25 0.73Cys146A....T.-0.840.23 *..0.10 0.42Leu147AA.....-0.580.43 *..-0.600.17Gln148AA.....-0.270.53 *..-0.600.10Leu149AA.....-0.570.53 **.-0.300.32Ile150AA.....-0.570.34 *..0.30 0.52Ala151.A....C-0.21-0.34 .*.1.40 0.52Asp152....TT.0.39 -0.26 .*F2.45 0.91Ser153.....TC0.08 -0.51 ..F3.00 2.00Glu154.....TC-0.00-0.71 ..F2.70 2.86Thr155.....TC0.89 -0.53 *.F2.40 1.20Pro156...B..C1.52 -0.13 *.F1.56 1.55Thr157...BT..1.18 -0.51 *.F1.92 1.79Ile158A..B...1.18 -0.09 ..F1.08 1.23Gln159....TT.0.93 -0.19 ..F2.04 1.07Lys160....TT.0.93 0.14 *.F1.60 1.16Gly161....TT.0.44 0.14 *.F1.44 2.38Ser162....TT.-0.100.24 *.F1.28 1.19Tyr163.... BT..0.58.0.49 *..0.12 0.44Thr164..BB...0.29 0.91 *..-0.440.69Phe165..BB...-0.571.40 *..-0.600.54Val166..BB...-1.031.70 ...-0.600.29Pro167..BB...-1.031.63 ...-0.600.16Trp168A..B...-1.491.53 .*.. -0.600.25Leu169A..B...-1.131.53 *..-0.600.29Leu170A..B...-0.320.89 *..-0.300.38
表1(续)残基位置 I II III IVV VI VII VIIIIXXXI XII XIII XIVTer171A......0.19 0.46 *..0.20 0.71Phe172....T..0.10 -0.03 *..1.80 0.85Lys173....TT.-0.20 -0.33 *.F2.60 1.38Arg174.....TC-0.20 -0.51 ..F3.00 1.04Gly175.....TC0.61 -0.21 ..F2.25 0.99Ser176A....T.0.91 -1.00 *.F2.05 0.86Ala177AA.....1.66 -1.00 *.F1.35 0.76Leu178AA.....1.61 -1.00 ..F1.20 1.54Glu179AA.....1.50 -1.43 ..F0.90 1.98Glu180AA.....1.89 -1.41 *.F0.90 3.16Lys181AA.....1.30 -1.91 *.F0.90 7.66Glu182AA.....1.08 -1.91 ..F0.90 3.10Asn183AA.....1.03 -1.23 **F0.90 1.48Lys184AA.....1.08 -0.59 *.F0.75 0.55Ile185AA.....1.08 -0.59 **.0.60 0.63Leu186AA.....0.72 -0.59 **.0.60 0.68Val187AA.....0.38 -0.50 .*.0.30 0.49Lys188AA.....0.13 -0.07 **F0.45 0.69Glu189A....T.-0.61 0.00 **F0.40 132Thr190....TT.-0.42 0.10 .*F0.80 1.54Gly191....TT.-0.50 0.24 *.F0.65 0.67Tyr192....TT.0.11 0.93 **.0.20 0.27Phe193..BB...-0.28 1.69 ...-0.60 0.29Phe194..BB...-0.28 1.63 .*.-0.60 0.29Ile195..BB...-0.82 1.60 ...-0.60 0.32Tyr196..BB...-1.29 1.49 ...-0.60 0.28Gly197...BT..-1.29 1.39 ...-0.20 0.26Gln198...BT..-0.90 1.36 ...-0.20 0.59Val199...B..C-0.20 1.16 ...-0.40 0.54Leu200...B..C0.73 0.40 ...-0.10 0.92Tyr201....TT.0.67 0.03 ...1.25 1.06Thr202....TT.0.77 0.06 ..F0.80 2.06Asp203....TT.0.18 0.17 ..F0.80 3.91Lys204A....T.0.43 -0.01 ..F1.00 2.52Thr205AA.....0.90 -0.16 ..F0.60 1.73Tyr206AA.....1.11 -0.21 ...0.45 1.03Ala207AA.....0.61 0.29 ...-0.30 0.70Met208AA.....-0.28 0.97 ...-0.60 0.40Gly209AA.B...-0.32 117*..0.60 0.18His210AA.B...0.10 0.81 *..-0.60 0.31Leu211AA.B...0.39 -0.30 ...-0.30 0.61Ile212AA.B...1.02 -0.30 ...0.45 1.22Gln213AA.B...0.77 -0.73 .*.0.75 1.80Arg214AA.B...1.08 -0.59 .*F0.90 1.62Lys215AA.B...0.26 -0.77 **F0.90 3.14Lys216AA.B...0.37 -0.81 .*F0.90 1.35Val217.ABB...0.91 -0.43 **.0.30 0.60His218.ABB...0.91 -0.00 .*.0.30 0.29Val219.ABB...0.80 -0.00 **.0.30 0.25Phe220..BB...-0.06 -0.00 *..0.30 0.57G1y221A..B...-0.40. 0.04 .*.-0.30 0.35Asp222A......-0.36 -0.07 *..0.50 0.63Glu223A... ....-1.18 -0.03 *..0.50 0.60Leu224A..B...-0.63 -0.17 ...0.30 0.45Ser225A..B...-0.74 -0.11 ...0.30 0.39Leu226A..B...-1.10 0.57 .*.-0.60 0.18Val227A..B...-0.99 1.36 .*.-0.60 0.19
表1(续)残基位置 III III IV VVI VII VIII IX XXI XII XIII XIVThr228A..B...-1.660.67 **.-0.60 0.28Leu229A..B...-1.730.86 *..-0.60 0.18Phe230A..B...-1.430.86 *..-0.60 0.17Arg231A..B...-0.620.61 *..-0.60 0.21Cys232...BT..-0.370.53 *..-0.20 0.41Ile233...BT..-0.270.46 *..-0.20 0.46Gln234...BT..0.54 0.10 *..0.10 0.37Asn235...B..C0.93 0.10 *..0.05 1.19Met236...B..C0.01 0.01 *.F0.20 2.44Pro237...B..C0.47 0.01 *.F0.44 1.16Glu238....T..1.36 0.04 *.F1.08 1.12Thr239......C1.36 0.04 *.F1.12 1.82Leu240......C1.06 -0.17*.F1.96 1.89Pro241....T..0.99 -0.21..F2.40 1.46Asn242....T..0.96 0.36 ..F1.41 0.54Asn243....TT.0.66 0.63 ..F1.22 1.03Ser244....TT.0.38 0.33 ..F1.13 0.89Cys245....TT.0.84 0.40 ...0.74 0.56Tyr246....TT.0.17 0.43 ...0.20 0.35Ser247A......-0.420.71 ...-0.40 0.18Ala248AA.....-0.380.83 ...-0.60 0.34G1y249AA.....-0.890.26 ...-0.30 0.43Ile250AA.....-0.220.19 *..-0.30 0.27Ala251AA.....0.02 -0.20*..0.30 0.46Lys252AA.....-0.02-0.70...0.60 0.80Leu253AA.....0.57 -0.70..F0.90 1.13Glu254AA.....0.91 -1.39..F0.90 1.87Glu255AA.....0.99 -1.89..F0.90 1.62Gly256AA.....1.58 -1.20.*F0.90 1.62Asp257AA.....0.72 -1.49.*F0.90 1.62Glu258AA.....0.94 -0.80**F0.75 0.77Leu259AA.....0.06 -0.30**.0.30 0.79Gln260AA.....-0.16-0.04*..0.30 0.33Leu261AA.....0.30 0.39 *..-0.30 0.30Ala262AA.....0.30 0.39 *..-0.30 0.70Ile263AA.....0.30 -0.30.*.0.30 0.70Pro264A....T.0.52 -0.30.*F1.00 1.37Arg265A....T.0.52 -0.49.*F1.00 1.37Glu266A....T.0.44 -0.59**F1.30 3.38Asn267A....T.0.73 -0.59**F1.30 1.53Ala268A......0.81 -0.63**.0.95 1.05Gln269A......1.02 0.06 **.-0.10 0.50Ile270A......0.57 0.06 .*.0.15 0.52Ser271......C0.57 0.09 .*.0.60 0.51Leu272......C-0.29-0.41.*F1.60 0.49Asp273....TT.-0.01-0.17.*F2.25 0.52Gly274....TT.-0.71-0.37.*F2.50 0.56Asp275....TT.-0.520.03 .*F1.65 0.59Val276A....T . -0.570.13 .*F1.00 0.30Thr277A..B...-0.340.56 .*.-0.10 0.30Phe278A..B...-1.160.63 .*.-0.35 0.18Phe279A..B...-0.771.31 .*.-0.60 0.20Gly280AA.....-1.580.67 .*.-0.60 0.28Ala281AA.....-1.530.87 .*.-0.60 0.27Leu282AA.....-1.610.77 *..-0.60 0.26Lys283AA.....-1.300.41 *..-0.60 0.33Leu284AA.....-0.990.41 ...-0.60 0.42Leu285AA.....-1.030.34 *..-0.30 0.65
本发明其它优选的核酸片段包括包含或由编码一或多个Neutrokine-α的携带表位部分的序列组成的核酸分子。尤其本发明这种核酸片段包括包含或由编码选自以下多肽的序列组成的核酸分子SEQ ID NO2氨基酸序列的大约Phe115-Leu147，Ile150-Tyr163，Ser170-Phe194，Glu223-Tyr246，Ser271-Phe278。文中“大约”指特定的范围以及在氨基和羧基端一端或两端多或少5，4，3，2，或1个氨基酸残基的此范围。由这些核酸分子编码的多肽也涵盖在本发明内。携带Neutrokine-α的抗原性表位的多肽片段，可用上述Jameson-Wolf抗原指数分析由本领域技术人员轻易确定，如图3所示。确定其它这种Neutrokine-α的表位携带部分的方法详见下述。
本发明其它优选的核酸片段包括包含或由编码一或多个Neutrokine-α SV的表位携带部分的序列组成的核酸分子。尤其本发明的这种核酸片段包括包含或由编码选自以下多肽的序列组成的核酸分子SEQ ID NO19氨基酸序列的大约Pro32-Leu47，Glu116-Ser143，Phe153-Tyr173，Pro218-Tyr227，Ser252-Thr258，Ala232-Gln241，Ile244-Ala249，Ser252-Val257。文中“大约”指特定的范围，以及在氨基端和羧基端一端或两端多或少5，4，3，2，或1个氨基酸残基的此范围。携带Neutrokine-α抗原性表位的多肽片段可用上述Jameson-Wolf抗原指数分析，由本领域技术人员轻易确定。确定其它这种Neutrokine-αSV的携带表位部分的方法详见下述。
在特异的实施方案中，本发明的多核苷酸长度小于100,000kb，50,000kb，10,000kb，1,000kb，500kb，400kb，350kb，300kb，250kb，200kb，175kb，150kb，125kb，100kb，75kb，50kb，40kb，30kb，25kb，20kb，15kb，10kb，7.5kb，或5kb。
在另一实施方案中，本发明的多核苷酸包含Neutrokine-α编码序列的至少15，至少30，至少50，至少100或至少250，至少500，至少1000个连续核苷酸，但由在图1A和1B(SEQ ID NO1)或图5A和5B(SEQ ID NO18)所示5′或3′编码核苷酸旁侧的少于或等于1000kb，500kb，250kb，200kb，150kb，100kb，75kb，50kb，30kb，25kb，20kb，15kb，10kb或5kb的基因组DNA组成。在另一实施方案中，本发明的多核苷酸包含Neutrokine-α编码序列的至少15，至少30，至少50，至少100或至少250，至少500，或至少1000个连续核苷酸，但不包含任何Neutrokine-α内含子的全部或部分。在另一实施方案中，包含Neutrokine-α编码序列的核酸不含有基因组侧翼基因的编码序列(即基因组中Neutrokine-α基因的5′或3′序列)。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸不含有超过1000，500，250，100，50，25，20，15，10，5，4，3，2或1个基因组侧翼基因的编码序列。
在另一实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，其包含在严格条件下与上述本发明核酸分子中多核苷酸的一部分杂交的多核苷酸，例如互补于图1A和图1B(SEQ ID NO1)所示的编码和/或非编码序列，ATCC保藏号97768的cDNA克隆的序列，互补于图5A和5B(SEQ ID NO18)所示的编码和/或非编码序列，保藏在ATCC保藏号203518的cDNA克隆的序列，互补于SEQ ID NO21所示的编码和/或非编码序列，(即转录的，未翻译的)的序列，互补于SEQ ID NO22所示的编码和/或非编码序列的序列，互补于SEQ ID NO27所示的编码和/或非编码序列的序列，互补于SEQ IDNO29所示的编码和/或非编码序列的序列，或这些序列的片段(例如其开放读框或片段)。“严格杂交条件”是指在含有以下物质的溶液中在42℃温育过夜，随后在大约65℃用0.1xSSC冲洗滤膜，所述溶液包含50％甲酰胺，5xSSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(PH7.6)，5X Denhard′s液，10％葡聚糖硫酸酯，和20μg/ml变性剪切鲑精DNA与多核苷酸“一部分”杂交的多核苷酸是指与长度为至少15个，优选至少20个，更优选至少30个，最优选至少30～70(如40，50，或60个)，特别优选30～70或80～150范围内任何整数个核苷酸，甚至优选全长参照多核苷酸杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。这些多核苷酸的用途包括但非限于用作诊断探针和引物，并详见下述。长度“至少为大约20个核苷酸”的多核苷酸的一部分，例如是指包括特定的范围。大于或小于参考多核苷酸的核苷酸序列的一端或两端的5，4，3，2，1或0个氨基酸(如两个保藏的cDNA的任一或二个序列，图1A和1B(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列的互补链，图5A和5B(SEQ ID NO18)所示核苷酸序列的互补链，SEQ ID NO21所示核苷酸序列的互补链，SEQ ID NO22所示核苷酸序列的互补链，SEQ ID NO27所示核苷酸序列的互补链，和/或SEQ ID NO29所示核苷酸序列的互补链)。当然，仅与以下序列杂交的多核苷酸不包括在本发明用于杂交本发明核酸的一部分的多核苷酸内，因为这种多核苷酸会杂交含有聚(A)序列或其互补序列的任何核酸分子(如，实际上用寡dT作引物产生的任何双链cDNA克隆)，所述序列是聚(A)序列(如图1A和1B(SEQ ID NO1)所示Neutrokine-αcDNA的3′末端聚(A)序列段，图5A和5B(SEQ ID NO18)所示Neutrokine-αSV cDNA的3′末端聚(A)序列段，或SEQ IDNO22所示Neutrokine-αSV cDNA的3′末端聚(A)序列段)，或者是一段T(或U)残基互补序列。
如上所示，编码Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽的本发明的核酸分子可以包括但非限于本身编码相应多肽胞外域的氨基酸序列的多核苷酸；相应多肽的胞外域的编码序列及额外序列，如编码胞内域和跨膜域序列的序列，或前蛋白，蛋白原或前蛋白原序列；有或无前述额外编码序列的相应多肽胞外域的编码序列。
本发明核酸还编码具有额外的非编码序列的上述蛋白质序列，例如包括但非限于内含子和非编码的5′和3′序列，如在转录，mRNA加工包括剪接和聚腺苷酸化信号中例如染色体结合及mRNA稳定性方面起作用的转录的、未翻译的序列；额外的编码序列，编码额外的氨基酸，如那些提供额外功能的氨基酸。
因此，编码多肽的序列可融合于标记序列，如编码促进融合多肽纯化的肽的序列。在本发明的一些优选的实施方案中，标记氨基酸序列是6-组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN，Inc，9259 Eton，Averue，Chatsworth，CA，91311)中提供的标签，其中许多可商购。如Gentz等，在美国科学院院报86821-824(1989)中所述，6-组氨酸使融合蛋白常规纯化。“HA”标签是另一种用于纯化的肽，其相当于衍生自流感血凝素蛋白的表位，以由Wilson等阐述，细胞37767(1984)。如下所述，其它这种融合蛋白包括在N或C末端融合于Fc的Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽。
本发明还涉及本发明核酸分子的变体，其编码SEQ ID NO2的Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽的一部分，类似物或衍生物。变体可以是天然发生的，如天然等位基因变体。“等位基因”变体是指占据机体染色体上给定基因座的基因的一些变化形式之一。见基因II，Lewin，B.ed，John Wiley & Sons，纽约(1985)。非天然发生的变体可用本领域已知的诱变方法产生，包括但非限于寡核苷酸介导的诱变，丙氨酸扫描，PCR诱变，定点诱变(例如见Carter等，核酸研究134331(1986)；和Zoller等，核酸研究106487(1982)，盒诱变(例如见Wells等，基因34315(1985))，限制性选择诱变(例如见Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317415(1986))。
这种变体包括那些通过核苷酸取代，缺失或添加而产生的变体。此取代，缺失或添加可包含一或多个氨基酸。变体可以是在编码区，非编码区或这二区内变化。编码区内变化可产生保守或非保守氨基酸取代，缺失或添加。其中尤为优选的是沉默取代，添加和缺失，其不改变Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或其一部分的性质和活性。同样尤为优选的是保守氨基酸取代。
本发明其它的实施方案涉及分离的核酸分子，其包含编码如下Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的氨基酸序列的多核苷酸，该多肽的氨基酸序列含有至少1个但不超过50个，优选不超过40个，更优选不超过30个，尤其优选不超过20个，10-20个，5-10个，1-5个，3-5个，或1-3个保守氨基酸取代。当然，优选次序依次是编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的含有不超过10，9，8，7，6，5，4，3，2，或1个保守氨基酸取代的氨基酸序列的多核苷酸。
其它的实施方案包括分离的核酸分子，其包含或由与选自以下一组多核苷酸有至少80％，85％或90％相同性，优选至少95％，96％，97％，98％，或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸组成(a)编码具有图1A和1B所示完整氨基酸序列(即SEQ ID NO2的1-285位)的Neutrokine-α多肽的核苷酸序列；(b)编码具有图1A和1B所示除N末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO2的2-285位氨基酸)的Neutrokine-α多肽的核苷酸序列；(c)具有Neutrokine-α功能活性(如抗原性或生物活性)的(b)多肽的片段；(d)编码具有图1A和1B(SEQ ID NO2)中73-285位氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的推定的胞外域的核苷酸序列；(e)编码具有图1A和1B(SEQ ID NO2)中134-285位氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的核苷酸序列；(f)编码Neutrokine-α多肽的核苷酸序列，该多肽具有由保藏在ATCC保藏号97768的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列；(g)编码Neutrokine-α多肽胞外域的核苷酸序列，该多肽具有由保藏在ATCC保藏号97768的cDNA编码的氨基酸序列；和(h)互补于以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)或(h)的任何核苷酸序列的核苷酸序列。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些多核苷酸和核酸分子编码的多肽也涵盖在本发明内。
本发明尤为优选的实施方案涉及核酸分子，其包含或由具有与编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少80％，85％，90％相同性，优选至少95％，96％，97％，98％，99％或100％相同性的核苷酸序列的多核苷酸组成，所述Neutrokine-α多肽具有图1A和1B(SEQ ID NO2)中134-285位氨基酸序列。本发明优选的实施方案涉及核酸分子，其包含或由具有与编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少90％相同性的核苷酸序列的多核苷酸组成，所述Neutrokine-α多肽具有图1A和1B(SEQ ID NO2)中134-285位氨基酸序列。本发明更优选的实施方案涉及核酸分子，其包含或由具有与编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸组成，所述Neutrokine-α多肽具有图1A和1B(SEQ ID NO2)中134-285位氨基酸序列。本发明更优选的实施方案涉及核酸分子，其包含或由具有与编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少96％相同性的核苷酸序列的多核苷酸组成，所述Neutrokine-α多肽具有图1A和1B(SEQ ID NO2)中134-285位氨基酸序列。
另外，本发明更优选的实施方案涉及核酸分子，其包含或由具有与编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少97％相同性的核苷酸序列的多核苷酸组成，所述Neutrokine-α多肽具有图1A和1B(SEQ ID NO2)中134-285位氨基酸序列。本发明更优选的实施方案涉及核酸分子，其包含或由具有与编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少98％相同性的核苷酸序列的多核苷酸组成，所述Neutrokine-α多肽具有图1A和1B(SEQ ID NO2)中134-285位氨基酸序列。本发明更优选的实施方案涉及核酸分子，其包含或由具有与编码Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸组成，所述Neutrokine-α多肽具有图1A和1B(SEQ ID NO2)中134-285位氨基酸序列。
本发明另一实施方案涉及包含多核苷酸的分离的核酸分子，该多核苷酸编码Neutrokine-αSV多肽的氨基酸序列(如本文所述Neutrokine-αSV多肽片段)含有至少1个但不超过50个，优选不超过40个，更优选不超过30个，最优选不超过20个保守氨基酸取代。当然，特别优选的多核苷酸是编码Neutrokine-α多肽氨基酸序列的，具有含有不超过7-10，5-10，3-7，3-5，2-5，1-5，1-3，10，9，8，7，6，5，4，3，2，或1个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
其它实施方案包括包含或由多核苷酸组成的分离的核酸分子，该多核苷酸具有与选自以下一组多核苷酸有至少80％，85％，90％相同性，优选至少95％，96％，97％，98％，或99％相同性的核苷酸序列(a)编码具有图5A和5B所示完整氨基酸序列(即SEQ IDNO19的1-266位)的Neutrokine-αSV多肽的核苷酸序列；(b)编码具有图5A和5B所示除N末端甲硫氨酸之外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO19的2-266位)的Neutrokine-αSV多肽的核苷酸序列；(c)编码具有5A和5B(SEQ ID NO19)中73-285位氨基酸序列的的Neutrokine-αSV多肽的推定的胞外域的核苷酸序列；(d)编码Neutrokine-αSV多肽的核苷酸序列，该Neutrokine-αSV多肽具有由保藏在ATCC保藏号203518的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列；(e)编码Neutrokine-αSV多肽胞外域的核苷酸序列，该胞外域具有由保藏在ATCC保藏号203518的cDNA克隆编码的氨基酸序列；和(f)互补于上述(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
另外，本发明包括的多核苷酸包含或由至少90％或95％等同于图1A和1B(SEQ ID NO1)中1-1082核苷酸序列的至少大约10，20，25或30个连续核苷酸，优选至少大约40或50个连续氨基酸的任何部分的序列组成，优选不包括从上述4个cDNA克隆中确定的核苷酸序列及797-1082，810-1082，和346-542位核苷酸序列。本发明也包括一种多核苷酸，其包含或由至少90％或95％等同于图5A和5B(SEQ ID NO18)所示序列的大约10，20，25或30个连续核苷酸，优选至少大约40或50个核苷酸的任何部分的序列组成，优选不包括从上述4个cDNA克隆中确定的核苷酸序列。本发明还包括一种多核苷酸，其包含或由至少90％或95％等同于SEQID NO21所示序列的大约10，20，25或30个连续核苷酸，优选至少大约40或50个连续核苷酸的任何部分的序列组成，优选不包括从上述4个cDNA克隆中确定的核苷酸序列。本发明还包括一种多核苷酸，其包含或由至少90％或95％等同于SEQ ID NO22所示序列的大约10，20，25或30个连续核苷酸，优选至少大约40或50个连续核苷酸的任何部分的序列组成，优选不包括从上述4个cDNA克隆中确定的核苷酸序列。本发明还包括一种多核苷酸，其包含或由至少90％或95％等同于SEQ ID NO27所示序列的至少大约10，20，25或30个连续核苷酸，优选至少大约40或50个连续核苷酸的任何部分的序列组成，优选不包括从上述4个cDNA克隆中确定的核苷酸序列。本发明还包括一种多核苷酸，其包含或由至少90％或95％等同于SEQ ID NO29所示序列的至少大约10，20，25或30个连续核苷酸，优选至少大约40或50个连续核苷酸的任何部分的序列组成，优选不包括从上述4个cDNA克隆中确定的核苷酸序列。文中“大约”包括特定的范围，以及在一端或两端多或少几个(即5，4，3，2或1个)氨基酸。
具有与编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的参照核苷酸序列有例如至少95％“相同性”的核苷酸序列的多核苷酸，是指此多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，除了此多核苷酸序列可以包括编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的参照序列的每100个核苷酸中有5个以上的错配。换而言之，为获得具有与参照序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中接近5％的核苷酸可缺失或用其它核苷酸取代，或者占参照序列总核苷酸数目5％的核苷酸可插入参照序列中。参照序列中的这些突变可发生在参照核苷酸序列的5′或3′末端位置，或在这些末端位置之间的任何部位，分散在参照序列中各个核苷酸或者一或多个连续组之间。参照(参比)序列可以是编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的全部核苷酸序列，分别如图1A和1B(SEQ ID NO1)和图5A和5B(SEQ ID NO18)所示，或者是任何Neutrokine-α例如SEQ ID NO21，22，27，28所示Neutrokine-α多核苷酸，或者是任何本文所述的Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多核苷酸的片段。
实际上，任何特定的核酸分子是否至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％等同于例如图1A和1B所示核苷酸序列，或图5A和5B所示核苷酸序列，或保藏的cDNA克隆的核苷酸序列，或任何Neutrokine-α多核苷酸如SEQ ID NO21，22，27或28所示Neutrokine-α多核苷酸或其片段，可常规地用已知计算机程序确定(Wisconsin序列分析程序包，Version 8 for Unix，遗传学计算机小组，大学研究园，575 Seience Drive，Madison，WI 53711)。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源序列对比程序发现两个序列间的最佳同源节段(应用数学进展2482-489(1981))。当使用Bestfit或任何其它序列对比程序以确定特定序列是否与本发明的参照序列具有例如95％相同性时，当然要设定参数，从而在全长参照核苷酸序列之上计算相同性百分率，且允许参照序列中有占总核苷酸数5％的同源缺口。
在一特异的实施方案中，参照(参比)序列(本发明的序列)和目标序列之间的相同性，也称作整体序列对比，是用基于Brutlag及其同事的序列对比的FAS TDB计算机程序确定的(Comp.App.Biosci 6237-245(1990))。在一序列对比中，参比序列与目标序列均是DNA序列。RNA序列可通过将U转换为T而加以对比。所述整体序列对比的结果以相同性百分率表示。用于DNA序列的FASTDB序列对比以计算相同性百分率的优选参数是Matrix＝Unitary，k-tuple＝4，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝30，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或目标核苷酸序列长度，取更短的。根据此实施方案，如果目标序列因为5′或3′缺失而非因为内在缺失而比参比序列短，要对结果进行人工调整，因为FASTDB程序在计算相同性百分率时，未考虑到目标序列5′和3′截短。就相对于参比序列在5′和3′末端截短的目标序列而言，通过计算目标序列的5′和3′的参比序列的未匹配/对比的碱基数占参比序列总碱基数的百分比来调整相同性百分率。确定核苷酸是否是匹配/对比是通过FASTDB序列对比结果而确定。然后将此百分率从用特定参数通过上述FASTDB程序计算出的相同性百分率中减去，得到最后的相同性百分率。此调整的结果用于此实施方案的目的。只有通过FASTDB序列对比显示在目标序列的5′和3′碱基之外的，未与参比序列匹配/对比的碱基，需要计算以人工调整相同性百分率结果。例如，90个碱基的目标序列与100个碱基的参比序列对比确定相同性百分率。缺失发生在目标序列的5′末端，因而FASTDB序列对比未示出在5′末端前10个碱基的匹配/对比。此10个未配对的碱基代表10％的序列(在5′和3′端未匹配的碱基数/参比序列总碱基数)，因此这10％应从通过FASTDB程序计算的相同性百分率结果中减去。如果剩余的90个碱基充分匹配，则最终相同性百分率为90％。在另一实施例中，90个碱基的目标序列与100个碱基的参比序列相对比。这次缺失是内在缺失，因此在目标序列的5′和3′端设有未与参比序列匹配/对比的碱基。在这种情况下，由FASTDB计算的相同性百分率不需要人工调整。同样，只有目标序列的5′和3′碱基未与参比序列匹配/对比，才需要人工调整。此实施方案不需要进行其它人工调整。
本发明涉及与本文揭示的核酸序列(即多核苷酸)有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的核酸分子，不论它们是否编码具有Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性(如生物活性)的多肽，本文所揭示的核酸序列例如是图1A和1B(SEQ ID NO1)所示序列或保藏的cDNA的核苷酸序列。另外，本发明还涉及与图5A和5B(SEQ ID NO18)所示核酸序列或保藏的cDNA的核酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的核酸分子，不论它们是否编码具有Neutrokine-αSV活性的多肽。另外，本发明还涉及与SEQ ID NO21，22，27或28所示核酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的核酸分子，不论它们是否编码具有Neutrokine-α活性的多肽。这是因为即使一特定核酸分子不编码具有Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性的多肽，本领域技术人员也知道怎样使用此核酸分子例如作为杂交探针或聚合酶链反应(PCR)引物。本发明的不编码具有Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性的多肽的核酸分子的用途包括(1)在cDNA文库中分离Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因或其等位基因变体；(2)与中期染色体涂片原位杂交(如“FISH″)，以提供Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因的准确染色体位置，如Verma等，人染色体基本方法手册，Pergamon出版社，纽约(1988)中所述；及用于Northern印迹分析以检测Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSVmRNT在特异组织中的表达。
然而，优选的与本文所揭示的核酸序列(如图1A和1B(SEQ IDNO1)所示核苷酸序列，或和保藏的cDNA的核酸序列，或它们的片段)有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的核酸分子，并且其事实上编码具有Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽功能活性(如生物活性)的多肽。同样优选的有与图5A和5B(SEQ ID NO18)所示的核酸序列，或保藏的cDNA的核酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的核酸分子，并且其事实上编码具有Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽功能活性(如生物活性)的多肽。同样优选的是具有与SEQ ID NO21，22，27，或28所示核酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，或98％相同性的序列的核酸分子，并且其事实上编码具有Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽功能活性(如生物活性)的多肽。
“具有Neutrokine-α多肽功能活性(如生物活性)的多肽”和“具有Neutrokine-αSV多肽功能活性(如生物活性)的多肽”，是指在特定的功能分析(如免疫学或生物学分析)中测定的，与本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的胞外域或全长多肽的活性呈现基本相似，但不必相同的活性的多肽。例如，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的功能活性可通过所述多肽序列与完整的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV或者Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的胞外域形成多聚体(如同源二聚体和同源三聚体)的能力，及结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽配体的能力而测定。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽功能活性也可通过确定本发明多肽诱导淋巴细胞(如B细胞)增殖，分化或活化和/或延长B细胞存活时间的能力而测定。这些功能分析可用本文所述方法(例如见实施例6)和本领域已知其它方法常规进行。另外，本发明的Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽调节细胞增殖，胞毒性，细胞存活及细胞死亡。可通过使用本领域熟知的且通常可购买的检测细胞复制和/或死亡的试剂进行体外细胞增殖，胞毒性，细胞存活及细胞死亡分析，以测定蛋白质对某些细胞的作用。例如，许多对TNF相关蛋白活性的这种分析见于各种参考文献中。简而言之，这种分析例如包括收集人或动物(如鼠)细胞，并将它们与(1)含有Neutrokine-α蛋白(或候选多肽)的转染的宿主细胞上清，或(2)对照的未转染的宿主细胞上清混合，在温育一定时间之后，测定对细胞数目或生存力的影响。这种在此类分析中可测定的细胞增殖和/或存活调节活性可用于治疗肿瘤，肿瘤转移，感染，自身免疫疾病，炎症和其它免疫相关的疾病。
Neutrokine-α在上述分析中，以剂量依赖性方式调节细胞增殖和分化。因此，优选的“具有Neutrokine-α多肽功能活性(如生物活性)的多肽”，包括在上述分析中以剂量依赖性方式也呈现任何一些细胞调节(尤其免疫调节)活性的多肽。尽管剂量依赖性活性的程度不需要等同于Neutrokine-α多肽，但优选地“具有Neutrokine-α多肽功能活性的多肽”与Neutrokine-α多肽相对比，在给定的活性中基本呈现相似的剂量依赖性(即候选多肽比参考的Neutrokine-α多肽呈现较高活性，或不低于25倍优选不低于10倍活性)。
在某些优选的实施方案中，“具有Neutrokine-α多肽功能活性(如生物活性)的多肽”和“具有Neutrokine-αSV多肽功能活性(如生物活性)的多肽”，包括也呈现图8A，8B，9A，9B，11，10，12A和12B和实施例6中所述任何相同B细胞(或其它细胞)调节(尤其免疫调节)活性的多肽。
与TNF家族其它成员相似，Neutrokine-α呈现对血细胞例如包括单核细胞，淋巴细胞(如B细胞)和中性粒细胞起作用。因此，Neutrokine-α在诱导这些细胞增殖，分化和迁移中是活性的。这种活性用于免疫增强或抑制，骨髓保护，干细胞迁移，控制急性和慢性炎症，及治疗白血病。本领域已知测定这种活性的方法。例如见Peters等，现代免疫学17273(1996)；Young等，实验方法杂志1821111(1995)；Caux等，自然390258(1992)；和Santiago-Schwarz等，生物学实验方法进展3787(1995)所述。
当然，由于遗传密码的简并性，本领域技术人员将立即认识到大量核酸分子将编码“具有Neutrokine-α多肽功能活性(如生物活性)”的多肽，所述核酸分子具有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％等同于ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA克隆包含的核酸序列，或图1A和1B(SEQ ID NO1)所示核酸序列，或它们的片段的序列。本领域技术人员也将立即意识到大量核酸分子编码“具有Neutrokine-αSV多肽功能活性(如生物活性)的多肽”，所述核酸分子具有与ATCC保藏号203518的cDNA克隆中包含的核酸序列，或图5A和5B(SEQ ID NO18)中所示核酸序列，有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列。事实上，由于这些核苷酸序列的简并变体都编码相同多肽，即使不进行上述对比分析，本领域技术人员也清楚这一点。本领域进一步意识到不是简并变体的这种核酸分子，有一些也编码具有Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性的多肽。这是因为本领域技术人员充分意识到氨基酸取代几乎不明显影响或不明显影响蛋白质功能(如用另一个脂族氨基酸置换一个脂族氨基酸)，详见下述。
相似地，编码含有全部或部分SEQ ID NO2的V142-K160区域的多肽的多核苷酸，似乎是检测和/或改变Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多核苷酸表达的有诊断和治疗价值的多核苷酸。另外，跨越SEQ ID NO19所示Neutrokine-αSV多肽T141和G142氨基酸残基结合部(在之间明显地插入Neutrokine-α的V142-K160氨基酸序列)的多核苷酸，似乎也有诊断和治疗作用。这种T141/G142跨越多核苷酸呈现与Neutrokine-αSV多核苷酸杂交比与Neutrokine-α多核苷酸更高的可能性。由本发明的多核苷酸编码的这种Neutrokine-αSV的部分非限制性非排除性例子包含或由选自以下的氨基酸序列组成SEQ ID NO19的G121-E163；E122-E163；G123-E163；N124-E163；S125-E163；S126-E163；Q127-E163；N128-E163；S129-E163；R130-E163；N131-E163；K132-E163；R133-E163；A134-E163；V135-E163；Q136-E163；G137-E163；P138-E163；E139-E163；E140-E163；T141-E163；G142-E163；S143-E163；Y144-E163；T145-E163；F146-E163；U147-E163；P148-E163；W149-E163；L150-E163；L151-E163；S152-E163；F153-E163；K154-E163；R155-E163；G156-E163；S157-E163；A158-E163；L159-E163；E160-E163；E161-E163；K162-E163；G121-K162；G121-E1 61；G121-E160；G121-L159；G121-A1 58；G121-S157；G121-G156；G121-R155；G121-K154；G121-F153；G121-S152；G121-L151；G121-L150；G121-W149；G121-P148；G121-V147；G121-F146；G121-T145；G121-Y144；G121-S143；G121-G142；G121-T141；G121-E140；G121-E139；G121-P138；G121-G137；G121-Q136；G121-V135；G121-A134；G121-R133；G121-K132；G121-N131；G121-R130；G121-S129；G121-N128；G121-Q127；G121-S126；G121-S125；G121-N124；G121-G123；和G121-E122。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。载体和宿主细胞本发明还涉及一种包括本发明分离的DNA分子的载体，用此重组载体基因工程化的或其它方式工程化的产生本发明多肽的宿主组载体基因工程化的或其它方式工程化的产生本发明多肽的宿主细胞，及通过重组或合成方法生产Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的方法。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸与载体(如克隆或表达载体)连接。载体例如可以是噬菌体，质粒，病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是能复制的或复制缺陷的。在后者的情况下，病毒增殖一般只发生在互补的宿主细胞中。多核苷酸可与含有可选择的标记的载体连接以在宿主中增殖。将载体构建体导入宿主细胞可通过本领域已知技术进行，包括但非限于磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，阳离子脂质体介导的转染，电穿孔，转导，感染或其它方法。这些方法见于许多标准实验手册中所述，如Davis等，分子生物学基本方法(1986)。
一般地，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞转化的选择标记，如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和啤酒糖酵母TRP1基因，及衍生自高表达基因的指导下游结构序列的转录的启动子。这种启动子可衍生自编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，α因子，酸性磷酸酶，或热休克蛋白等操纵子。异源结构序列以具有翻译起始和终止序列，优选能直接将翻译的蛋白质分泌入周质空间或胞外培养基中的前导序列的适当状态进行装配。任选地，异源序列可编码一种融合蛋白，其包括具有所需特征的N末端鉴别肽，例如稳定或简便地纯化表达的重组产物。
在一个实施方案中，本发明的DNA与适当的异源调节因子(如启动子或增强子)相结合，如λ-噬菌体PL启动子，大肠杆菌Lac，Trp，PhoA和tac启动子，SV40早期和晚期启动子，和逆转录病毒LTRs的启动子等。本领域也已知其它适当启动子。
如上所述，表达载体优选包括至少一个选择标记。这种标记包括针对真核细胞培养的二氢叶酸还原酶，G418或新霉素抗性基因和针对大肠杆菌和其它细菌培养的四环素，卡那霉素或氨苄氢霉素抗性基因。适当宿主例如包括但非限于细菌细胞如大肠杆菌，链霉菌属，鼠伤寒沙门氏杆菌；真菌细胞如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤氏酵母(ATCC No.201178))；昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9细胞；动物细胞如CHO，COS，293和Bowes黑素瘤细胞；及植物细胞。本领域已知上述宿主细胞的适当的培养基和培养条件。
宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞(例如人衍生的细胞)，或低等真核细胞如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞如细菌细胞。可选择以所需特殊方式调节插入的基因序列的表达，或修饰和加工基因产物的宿主菌株。可在存在某些诱导物的情况下提高从某些启动子中的表达；因此基因工程化的多肽的表达可以控制。另外，不同的宿主细胞具有翻译和翻译后加工和修饰(如磷酸化，裂解)蛋白的特征和特殊机制。可选择适当的细胞系以增强外源表达的蛋白质的所需修饰和加工。在宿主细胞中表达的适当载体和启动子的选择是本领域所熟知的，且表达载体构建，将载体导入宿主并在宿主中表达的必需方法本领域技术人员也已知。
用于细菌的有效的表达载体是通过将编码所需蛋白的结构DNA序列，与适当的翻译起始和终止信号一起插入具有功能性启动子的可操纵阅读相而构建。载体包含一或多个表型选择标记和一个复制起点以维持载体，且如果需要，则提供在宿主内扩增。进行转化的适当原核细胞宿主包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒杆菌，和假单胞菌属，链霉菌属和葡萄球菌属内的各种菌种，尽管其它菌种也可选择应用。用于细胞的表达载体代表性而非限制性地可包含一个选择标记和细菌复制起点，细菌复制起点衍生自商购的包含熟知的克隆载体pBR 322(ATCC 37017)的遗传因子的质粒。这种购买的载体例如包括pKK 223-3(Pharmacia Fine Chemicds，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分与适当的启动子和被表达的结构序列组合。优选的用于细菌的载体包括购自QIAGEN公司的pHE4-5(ATCCNO.209311；及其变异体)，pQE70，pQE60，和pQE-9；购自Stratagene的pBS载体，Phagescript载体，Bluescript载体，pNH8A，pNH16A，pNH18A，pNH46A；购自Pharmacia的ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。用于酵母系统的优选表达载体包括但非限于pYES2，pYD1，pTEF1/Zeo，pYES2/GS，pPICZ，pGAPZ，pGAPZα，pPIC9，pPIC3.5，pHIL-D2，pHIL-S1，pPIC3.5K，pPIC9K，和PAO815(均可购自Invitrogen，Carlsbad，CA)。优选的真核细胞载体是购自Stratagene的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG；和购自Pharmaeia的pSVK3，pBPV，pMSG，和pSVL。其它适当载体本领域技术人员也已知。
在适当的宿主菌株转化及生长至适当细胞密度之后，通过适当方法诱导选择的启动子(如温度变换或化学诱导)，并将细胞另外培养一段时间。细胞通过离心收获，通过物理或化学方法破坏，并保留所得粗提物以进一步纯化。
用于蛋白质表达的微生物细胞可通过任何常规方法破坏，包括冷冻-融化循环，超声处理，机械破坏，或使用细胞裂解剂，这些方法本领域技术人员是熟知的。
在一个上述实施方案中，巴斯德毕赤氏酵母用于真核细胞系统中表达Neutrokine-α蛋白。巴斯德毕赤氏酵母是一种甲基营养酵母，能代谢作为其唯一的碳源的甲醇。甲醇代谢途径中的一个主要步骤是甲醇与O2氧化为甲醛。此反应通过醇氧化酶催化。为代谢作为其唯一的碳源甲醇，巴斯德毕赤氏酵母必须产生高水平的醇氧化酶，因为醇氧化酶与O2的亲和性较低。所以，在甲醇作为主要碳源的生长培养基中，一或二个醇氧化酶基因(AOX1)的启动子区是高活性的。在存在甲醇的情况下，产自AOX1基因的醇氧化酶包含巴斯德毕赤氏酵母中总可溶蛋白的约30％以上。见Ellis，S.B.等，细胞分子生物学51111-21(1985)；Koutz，P.J.等，酵母5167-77(1989)；Tschopp，J.F.等，核酸研究153859-76(1987)。因此，异源编码序列如本发明的Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽，在全部或部分AOX1调节序列的转录调节下，在存在甲醇的情况中生长的毕赤氏酵母中以罕见的高水平表达。
在一个实施例中，质粒载体pPIC 9K用于在毕赤氏酵母系统中表达编码Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽的DNA，毕赤氏酵母酵母系统基本如“毕赤氏酵母方案分子生物学方法”，D.R.Higgins和J.Cregg编辑，Humana出版社，Totowa，NJ，1998所述。此表达载体借助于与位于多克隆位点上游的巴斯德毕赤氏酵母碱性磷酸酶(PHO)分泌信号肽(即引导序列)连接的强AOX1启动子，使本发明的Neutrokine-α或Neutrokine-αSV蛋白质表达和分泌。
本领域技术人员意识到许多其它酵母载体可用于置换pPIC9K，如pYES2，pYD1，pTEF1/Zeo，pYES2/GS，pPICZ，pGAPZ，pGAPZα，pPIC9，pPIC3.5，pHIL-D2，pHIL-S1，pPIC3.5K，和PAO815，只要所提议的表达构建体提供了转录，翻译，分泌(如果需要)等的适当的定位信号，包括所需的框内AUG。
在一个实施方案中，异源编码序列如本发明的Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多核苷酸的高水平表达，可通过将本发明的异源多核苷酸克隆入表达载体如pGAPZ或pGAPZα中，并在无甲醇情况下培养酵母物而获得。
编码本发明多肽的DNA通过高等真核生物的转录，通过将增强子序列插入载体而得以提高。增强子是DNA的顺式作用因子，通常长度为10-300bp，其作用于启动子以提高其转录。例如包括在复制起点晚期一侧100-270个bp的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制起点晚期一侧的多瘤病毒增强子，和腺病毒增强子。
各种哺乳动物细胞培养系统也可用于表达重组蛋白。哺乳动物表达系例如包括由Gluzman所述的猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系(细胞23175(1981))，和能表达相容性载体的其它细胞系，例如C127，3T3，CHO，Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含一个复制起点，一个适当的启动子和增强子，及任何必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5′侧翼未转录的序列。衍生自SV40剪接体的DNA序列，及聚腺苷酸化位点也可用于提供所需的未转录的遗传因子。
在一特异的实施方案中，优选表达Neutrokine-α的胞外域的一部分(如Ala 134-Leu285氨基酸残基)的构建体。本领域技术人员能使用分别由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2或SEQ ID NO18和SEQ ID NO19所示的多核苷酸和多肽序列设计多核苷酸引物以产生这种表达构建体。
在另一实施方案中，优选表达Neutrokine-α的全部推定的胞外域(即Gln73-Leu285氨基酸残基)的构建体。本领域技术人员能使用分别由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2或SEQ ID NO18和SEQID NO19所示的多核苷酸和多肽序列设计多核苷酸引物以产生这种表达构建体。
除了涵盖含有所述载体构建体的宿主细胞之外，本发明还涵盖了原代，继代，和无限增殖的脊椎动物来源的，尤其哺乳动物来源的宿主细胞，该宿主细胞已经工程化缺失或置换内源性遗传物质(如Neutrokine-α编码序列)，和/或包括遗传物质(如异源多核苷酸序列)，该遗传物质与本发明的Neutrokine-α多核苷酸相关，并激活，改变和/或扩增Neutrokine-α多核苷酸。例如，本领域已知方法可用于通过同源组合可操纵地结合异源控制区(如启动子和/或增强子)和内源性Neutrokine-α多核苷酸序列(例如见1997年6月24日颁发的美国专利No.5641670；1996年9月26日公布的国际出版物No.WO 96/29411；1994年8月4日公布的国际出版物No.WO 94/12650；Koller等，美国科学院院报868932-8935(1989)；和Zijtstra等，自然342435-438(1989)，以所示文献的全部并入参考)。
前述宿主细胞可以常规方式使用，以产生由重组序列编码的基因产物。或者，无细胞翻译系统也可用衍生自本发明的DNA构建体的RNA产生本发明的多肽。
本发明的多肽可以修饰的形式表达或合成，如融合蛋白(包括通过肽键与(不同蛋白质)的异源蛋白质序列结合的多肽)，且可以不仅包括分泌信号，也包括另外的异源功能区。这种融合蛋白可通过将本发明的多核苷酸与编码所需氨基酸序列的所需核酸序列在适当读框中彼此连接，并通过本领域已知方法表达融合蛋白产物。或者，这种融合蛋白可通过蛋白质合成方法生产，如使用肽合成仪。因此，例如额外的氨基酸区域，尤其极性氨基酸，可以加入多肽的N末端以在纯化期间，或在随后的保持和储存期间改良稳定性和持续性。同样，肽组成成分可加入多肽中以促进纯化。这种区域可在最终制备多肽之前除去。在多肽中加入肽组分以产生分泌或排泄，或改良稳定性及促进纯化等，是本领域熟知并常用的方法。
在一个实施方案中，编码本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸可融合于pelB果胶酸酯裂合酶信号序列，以提高在革兰氏阴性细菌中这种多肽的表达和纯化效力。见美国专利No.5576195和5846818，以它们的全部并入参考。
一优选的融合蛋白包含免疫球蛋白的一异源区域，其用于稳定和纯化蛋白质。例如EP-A-0464533(加拿大对应申请2045869)揭示了包含免疫球蛋白分子的恒定区的各部分及其它人体蛋白或其部分的融合蛋白。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分用于治疗和诊断是非常有利的，因而例如改良药物动力学性质(EP-A 0232262)。另一方面，在融合蛋白已经以上述有利方式表达，检测及纯化之后，需要能将此Fc部分除去。这是在当Fc部分成为治疗与诊断中的障碍的情况中，例如当融合蛋白用作免疫接种的抗原时。在药物开发中，例如人体蛋白如hIL-5已与Fc部分融合，用于高产量筛选分析以鉴别hIL-5的拮抗剂。见D.Bennett等，分子识别杂志852-58(1995)和K.Johanson等，生物化学杂志2709459-9471(1995)。
本发明的多肽包括天然纯化的产物，化学合成的产物，和通过重组方法从原核或真核宿主中产生的产物，宿主例如包括细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞。根据重组生产方法中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化或非糖基化的。另外，本发明的多肽也可包括由宿主介导的加工所致的初始修饰的甲硫氨酸残基。
本发明的多肽可用本领域已知技术化学合成(例如Creighton，1983，蛋白质结构和分子学原理，W.H.Freeman &Co.，N.y.，和Hunkapiller，M.，等，1984，自然310105-111)。例如，相当于本发明完整Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽的片段的肽，可使用肽合成仪合成。另外，如果需要，非经典的氨基酸或化学氨基酸类似物可作为取代物或添加物导入Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多核苷酸序列。非经典的氨基酸包括但非限于普通氨基酸的D异构体，2，4-二氨基丁酸，a-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，正瓜氨酸，胱氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯甘氨酸，环己基丙氨酸，b-丙氨酸，氟代氨基酸，设计者(designer)氨基酸如b-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸，和氨基酸的一般类似物。另外，氨基酸可以是D(右旋的)或L(左旋的)。
本发明涵盖了在翻译期间或之后特异修饰的Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽，例如通过糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知保护/阻断基团的衍生化，蛋白酶切，与抗体分子或其它细胞配体连接等。任何化学修饰可通过已知方法进行，包括但非限于通过溴化氰，胰蛋白酶，靡蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4化学裂解，乙酰化，甲酰化，氧化，还原，在存在衣霉素的情况下代谢合成等。
本发明涵盖的其它翻译后修饰例如包括N-连接的或O-连接的碳水化合物链，N或C末端的加工，化学组分附着于氨基酸骨架，N连接或O连接的碳水化合物链的化学修饰，及由于原核生物宿主细胞表达所致N末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。多肽也可用可检测标记修饰，如可检测及分离蛋白质的酶标记，荧光素标记，同位素或亲和性标记。另外，本发明的多肽可通过碘化作用而修饰。
在一个实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽也可用生物素标记。在另外一相关的实施方案中，生物素酰化的本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽，例如可用作鉴别一或多种Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体或其它共同受体或共同配体分子的显影剂或工具。
本发明还提供了Neutrokine-α或Neutrokine-αSV的化学修饰的衍生物，其具有额外的优点如增加可溶性，稳定性和多肽的体内或体外循环时间，或降低免疫原性(见美国专利No.4179337)。用于衍生化的化学组分可选自水溶性聚合物如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇等。多肽可在分子内的随机位置修饰，或在分子内预定位置修饰，且可包括1，2，3，或多个附着的化学组分。
聚合物可以是任何分子量的，且可以有分支或无分支。就聚乙二醇而言，优选的分子量在大约1-100KDa之间(术语“大约”指在聚乙二醇的制备中，一些分子重或轻于标准分子量)以易于使用及生产。根据所需治疗原则(如所需持续释放的持续时间，对生物活性的影响，易于使用，抗原性的程度或丧失，及聚乙二醇对治疗性蛋白质或类似物的已知作用)，可使用其它大小的聚乙二醇。例如聚乙二醇的平均分子量可以是大约200，500，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10,000，10,500，11,000，11,500，12000，12500，13000，13500，14000，14500，15000，15500，16000，16500，17000，17500，18000，18500，19000，19500，20000，25000，30000，35000，40000，50000，55000，60000，65000，70000，75000，80000，85000，90000，95000或100,000KDa。
如上所示，聚乙二醇可具有分支结构。分支的聚乙二醇例如由美国专利No.5643 575；Morpurgo等，生物化学生物技术应用5659-72(1996)；Vorobjev等，核苷核苷酸182745-2750(1999)；和Caliceti等，生物缀合化学10638-646(1996)所述，所述文献以其全部并入参考。
聚乙二醇分子(或其它化学组分)附着于蛋白质上时应考虑其对蛋白质功能域或抗原性结构域的影响。本领域已知许多附着方法，如EPO 401 384(PEG与G-CSF偶合)，也见于Malik等，Exp.Hematol.201028-1035(1992)(用tresyl chloride对GM-CSF进行pegylation)所述。例如，聚乙二醇可以通过反应基团如游离氨基或羧基共价结合氨基酸残基。反应基团是那些活化的聚乙二醇分子可以结合的基团。具有游离氨基的氨基酸残基可例如包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；具有游离羧基的氨基酸残基可包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。巯基也可用作附着聚乙二醇分子的反应基团。治疗目的优选的是在氨基附着，如附着在N末端或赖氨酸基团。
如上所示，聚乙二醇可通过与任何氨基酸连接而附着于蛋白质。例如，聚乙二醇可通过与赖氨酸，组胺，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸的共价键而连于蛋白质上。一或多种反应化学性可用于聚乙二醇附着于蛋白质的特异的氨基酸残基(如赖氨酸，组织胺，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸)，或蛋白质的一种以上氨基酸残基(如赖氨酸，组织胺，天冬氨酸，谷氨酸或半胱氨酸及其组合)人们可以特别地需求在N末端化学修饰的蛋白质。以聚乙二醇为例，可选择各种聚乙二醇分子(通过分子量，分支等)，聚乙二醇分子与蛋白质(或肽)分子在反应混合物中的比例，进行PEG化(pegylation)反应的类型，获得选择的N末端PEG化蛋白质的方法。获得N末端PEG化制备物的方法(即如果需要从其它单PEG化的组分中分离此组分)可以是通过将N末端PEG化物质从PEG化的蛋白质分子群中纯化。在N末端修饰的化学修饰的选择的蛋白质可通过还原烷化反应而达到，该反应利用适于在特殊蛋白质中衍生化的不同类型的原始氨基团(相对N末端的赖氨酸)的不同反应性。在适当的反应条件下，基本达到蛋白质在N末端用含有聚合物的羰基团的选择性衍生化。
如上所示，本发明蛋白质的PEG化可通过许多方法达到。例如，聚乙二醇可直接或通过间插接头附着于蛋白质。将聚乙二醇附着于蛋白质的接头系统见于Delgado等，Crit.Rev.Thera.Drug CarrierSys，9249-304(1992)；Francis等，Intern.J of Hematol.681-18(1998)；美国专利No.4002531；美国专利No.5349052；WO95/060 58；和WO98/32466所述。上述文献以其全部并入参考。
一个将聚乙二醇不用间插接头而直接附着于蛋白质的氨基酸残基的系统利用tresylated的MPEG，tresylated的MPEG是用2，2，2-三氟乙烷磺酰氯(ClSO2CH2CF3)修饰单甲氧基聚乙二醇(MPEG)而产生的。基于蛋白质与tresylated MPEG的反应，聚乙二醇直接附着于蛋白质的胺基团。因此，本发明包括通过本发明的蛋白质与具有2，2，2-三氟乙烷磺酰基团的聚乙二醇分子反应而产生的蛋白质-聚乙二醇缀合物。
聚乙二醇也可用许多不同的间插接头附着于蛋白质。例如美国专利No.5612460(以其全文并入参考)揭示了将聚乙二醇与蛋白连接起来的尿烷接头。在其中聚乙二醇是通过接头附着于蛋白质的蛋白质-聚乙二醇缀合物，也可通过蛋白质与化合物反应而产生，所述化合物如MPEG-琥珀酰亚氨基琥珀酸酯，用1，1′-羰基二咪唑活化的MPEG，MPEG-2，4，5-三氯苯基碳酸酯，MPEG-对硝基苯酚碳酸酯，和各种MPEG-琥珀酸酯衍生物。另外一些聚乙醇附着于蛋白质的聚乙二醇衍生物和反应化学过程见WO98/32466所述，以其全文并入参考。用本文所述化学反应过程产生的PEG化蛋白质产物包括在本发明内。
附着于本发明每种蛋白质的聚乙二醇组成成分的数目(即取代程度)也可以变化。例如，本发明PEG化的蛋白质平均可连接1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，17，20，或更多个聚乙二醇分子。相似地，平均取代程度在如1-3，2-4，3-5，4-6，5-7，6-8，7-9，8-10，9-11，10-12，11-13，12-14，13-15，14-16，15-17，16-18，17-19，或18-20个聚乙二醇组分/蛋白质分子。确定取代程度的方法见Delgado等，Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9249-304(1992)所述。
Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽可通过已知方法回收和纯化，所述方法包括但非限于硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和性层析，羟磷灰石层析，和凝集素层析。优选高效液相层析(“HPLC″)用于纯化。
Neutrokine-α多肽本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽可以是单体或多聚体(即二聚体，三聚体，四聚体，及更高的多聚体)。因此，本发明涉及本发明Neutrokine-α和Neutrokine-αSV多肽的单体和多聚体，它们的制备及包含它们的组合物(优选药物组合物)。在特异的实施方案中，本发明的多肽是单体，二聚体，三聚体或四聚体。在另外的实施方案中，本发明的多聚体至少是二聚体，三聚体或四聚体。
本发明涵盖的多聚体可以是同源聚合物或异源聚合物。本文所用术语“同源聚合物”是指只含有本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽(包含Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的片段，变体和融合蛋白)的多聚体。这些同源聚合物可含有具有相同或不同氨基酸序列的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽。在一特异的实施方案中，本发明的同源聚合物是只含有具有相同氨基酸序列的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的多聚体。在另一特异的实施方案中，本发明的同源聚合物是含有具有不同氨基酸序列的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的多聚体。在特异的实施方案中，本发明的多聚体是同源二聚体(如含有具有相同或不同氨基酸序列的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽)，或同源三聚体(如含有具有相同或不同氨基酸序列的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽)。在一优选的实施方案中，本发明的多聚体是同源三聚体。在另一实施方案中，本发明的同源多聚体至少是同源二聚体，同源三聚体或同源四聚体。
文中所用术语“异源聚合物”是指含有除本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽之外，含有异源多肽(即不同蛋白质的多肽)的多聚体。在一特异的实施方案中，本发明的多聚体是异源二聚体，异源三聚体或异源四聚体。在另外的实施方案中，本发明的异源聚合物至少是异源二聚体，异源三聚体或异源四聚体。在另一未除外的实施方案中，本发明的异源聚合物含有CD40配体多肽序列，或其有生物活性的片段或变体。
本发明的多聚体可以是疏水的，亲水的，离子的和/或共价缔合和/或可以是间接连接的，例如通过脂质体形成连接。因此在一个实施方案中，本发明的多聚体如同源二聚体，或同源三聚体，是在当本发明的多肽在溶液中与另一多肽接触时形成的。在另一的实施方案中，本发明的异源聚合物如异源三聚体或异源四聚体，是在当本发明的多肽在溶液中与本发明多肽的抗体(包括本发明融合蛋白中异源多肽序列的抗体)接触时形成的。在其它实施方案中，本发明的多聚体是通过与和/或本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽之间的共价关系而形成的。这种共价关系可包含一或多个包含于多肽序列中的氨基酸残基(多肽序列如是SEQ ID NO2或SEQID NO19所示序列或与本发明相关的保藏的cDNA克隆编码的多肽的序列)。在一种情况下，共价缔合是位于多肽序列中在天然(即天然发生的)的多肽中相互作用的半胱氨酸残基之间的交联。在另一种情况下，共价缔合是化学或重组操作的结果。或者，这种共价关系可包含Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV融合蛋白中的异源多肽序列所包含的一或多个氨基酸残基。在一个实施例中，共价缔合是本发明融合蛋白中包含的异源序列之间的共价缔合(见例如美国专利No.5478925所述)。在一特异的实施例中，共价缔合是本发明Neutrokine-α-Fc和/或Neutrokine-αSV-Fc融合蛋白中包含的异源序列间的共价缔合。在另一特异的实施例中，本发明融合蛋白的共价缔合是来自另一TNF家族配体/受体成员的异源多肽序列间的共价缔合，所述异源多肽序列能形成共价缔合的多聚体，例如oseteoprotegerin(见国际公布No.WO 98/49305所述，其内容全部并入参考)。在另一特异的实施方案中，本发明融合蛋白的共价缔合是来自CD40L或其可溶性片段的异源多肽序列之间的共价缔合。在另一实施方案中，二或多个本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽是通过合成接头(如肽，碳水化合物或可溶的聚合物接头)连接的。这些肽接头例如由美国专利No.5073627所述(并入参考)。包含通过肽接头分离的多个Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的蛋白质可用常规重组DNA方法产生。
制备本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的多聚体的另一方法，包括使用融合于亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽。亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链结构域是促进在其中发现拉链结构的蛋白质多聚体化的多肽。亮氨酸拉链最初是在一些DNA结合蛋白中鉴别的(Landschulz等，科学2401759(1988))，且已在许多不同的蛋白质中发现。已知的亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链是天然发生二聚体或三聚体化的肽及其衍生物。适于产生可溶的多聚体的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白质的亮氨酸拉链例如由并入参考的PCT申请wo94/10308所述。包含融合于在溶液中二聚体或三聚体化的肽的可溶的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的重组融合蛋白在适当的宿主细胞中表达，并用本领域已知方法从培养物上清中回收所得可溶的多聚体化的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV。
蛋白质TNF家族的一些成员确信呈三聚体形式(Beutler和Huffel，科学264667，1994；Banner等，细胞73431，1993)。因此，三聚体化的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV具有增强的生物活性。优选的亮氨酸拉链组分是优先形成三聚体的那些组分。如Hoppe等(FEBS通信344191，(1994)和美国专利申请系列No.08/446 922所述，揭示了一个衍生自肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链。其它衍生自天然发生的三聚体蛋白的肽可用于制备三聚体化的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV。
在另一实施例中，本发明的蛋白是通过包含于Flag_-Neutrokine-α或Flag_-Neutrokine-αSV融合蛋白中的Flag_多肽序列间的相互作用而联系的。在另一实施方案中，本发明的蛋白是通过包含于Flag_-Neutrokine-α或Flag_-Neutrokine-αSV融合蛋白的异源多肽序列与抗Flag_抗体之间的相互作用而缔合的。
本发明的多聚体可用本领域已知的化学方法产生。例如，需包含在本发明多聚体中的多肽可用本领域已知的接头分子和接头分子长度最佳化方法而化学交联(见并入参考的美国专利No.5478925)。另外，本发明的多聚体可用本领域已知的方法产生，所述方法是在位于需包含于多聚体中的多肽的序列中的半胱氨基残基之间，形成一或多个分子内交联。(见并入参考的美国专利No.5478925)。另外，本发明的多肽可通过在多肽的C或N末端加入半胱氨酸或生物素而常规修饰，且可用本领域已知的方法产生含有一或多个这些修饰的多肽的多聚体(见并入参考的美国专利No.5478925)。另外，可用本领域已知的方法产生含有需包含在本发明多聚体中的多肽组分的脂质体(见并入参考的美国专利No.5478925)。
或者，本发明的多聚体可用本领域已知的基因工程方法产生。在一实施方案中，包含在本发明多聚体中的多肽是用本文所述的融合蛋白方法或本领域已知其它方法重组产生的(见并入参考的美国专利No.5478925)。在一特异的实施方案中，编码本发明同源二聚体的多核苷酸是通过将编码本发明多肽的多核苷酸序列与编码接头多肽的序列连接，然后从起点C末端至N末端反方向(缺失引导序列)连接于编码多肽翻译产物的合成的多核苷酸(见并入参考的美国专利No.5478925)。在另一实施方案中，用本文所述的重组方法或本领域已知其它方法产生本发明的重组多肽，该多肽含有跨膜域并可通过膜重建方法掺入脂质体中(见并入参考的美国专利No.5478925)。
在一实施方案中，本发明提供了分离的Neutrokine-α多肽，该多肽具有由ATCC保藏号97768的cDNA克隆编码的氨基酸序列，或具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列，或者本发明提供了分离的包含上述多肽一部分(即片段)的多肽。在另一实施方案中，本发明提供了分离的Neutrokine-αSV多肽，该多肽具有由ATCC保藏号203518的cDNA克隆编码的氨基酸序列，或具有图5A和5B(SEQ ID NO19)所示氨基酸序列，或者提供了包含上述多肽一部分与(即片段)的多肽。
本发明的多肽片段包括一种多肽，该多肽包含或由(SEQ IDNO2)所示氨基酸序列，由ATCC保藏号97768的质粒中cDNA编码的氨基酸序列，或由与保藏的克隆中包含的核苷酸序列或图1A和1B(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列互补链杂交(如在严格杂交条件下)的核酸编码的氨基酸序列组成。
另外，本发明的多肽片段包括一种多肽，该多肽包含或由(SEQID NO19)所示的氨基酸序列，由ATCC保藏号203518的质粒中包含的cDNA编码的氨基酸序列，或由与保藏的克隆中包含的核苷酸序列或图5A和5B(SEQ ID NO18)所示核苷酸序列互补链杂交(如在严格杂交条件下)的核酸编码的氨基酸序列组成。
另外，本发明的多肽片段包括一种多肽，该多肽包含或由与SEQID NO21所示核苷酸序列互补链杂交(如在严格杂交条件下)的核酸编码的氨基酸序列组成。
本发明的多肽片段还包括一种多肽，该多肽包含或由与SEQ IDNO23所示氨基酸序列，或由与SEQ ID NO22所示核苷酸序列互补链杂交(如在严格杂交条件下)的核酸编码的氨基酸序列组成。
另外，本发明的多肽片段包括一种多肽，该多肽包含或由SEQ IDNO28所示氨基酸序列，或由与SEQ ID NO27所示核苷酸序列互补链杂交(如在严格杂交条件下)的核酸编码的氨基酸序列组成。
另外，本发明的多肽片段包括一种多肽，该多肽包含或由SEQ IDNO30所示氨基酸序列，或由与SEQ ID NO29所示核苷酸序列互补链杂交(如在严格杂交条件下)的核酸编码的氨基酸序列组成。
本发明的多肽片段包括一种多肽，该多肽包含或由SEQ ID NO2所示氨基酸序列，由保藏的克隆中包含的cDNA编码的氨基酸序列，或由与保藏的克隆中包含的、或图1A和1B(SEQ ID NO1)所示的、或其互补链的核苷酸序列杂交(如在严格杂交条件下)的核酸编码的氨基酸序列。蛋白质片段可以是“自由存在的”，或包含在较大的多肽中，片段形成多肽的一部分或一个区域，优选作为一个单独的连续区域。本发明的多肽片段代表性地例如包括包含或由SEQ ID NO2的1-50，51-100，101-150，151-200，201-250，和/或251-285位氨基酸残基组成的片段。另外，多肽片段的长度可以是至少10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，175或200个氨基酸。
在特异的实施方案中，本发明的多肽片段包含或由图1A和1B(SEQ ID NO2)所示序列的1-46，31-44，47-72，73-285，73-83，94-102，148-152，166-181，185-209，210-221，226-237，244-249，253-265和/或277-284位氨基酸残基组成。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本领域技术人员将意识到定向于本发明Neutrokine-α多肽的一区域的突变可影响到Neutrokine-α多肽的所观测到的生物活性，所述区域涵盖了在Neutrokine-αSV多肽序列中未发现的19个氨基酸的插入体(即图1A和1B及SEQ ID NO2所示序列的Val142-Lys160氨基酸残基)。更特别地，可定向诱变的Neutrokine-α多肽序列的这种残基非限制性地包括SEQ ID NO2所示Neutrokine-α多肽的以下氨基酸残基V142；T143；Q144；D145；C146；L147；Q148；L149；I150；A151；D152；S153；E154；T155；P156；T157；I158；Q159和K160。编码在SEQ ID NO2的V142-K160区域内有一或多个突变的Neutrokine-α多肽的多核苷酸是所期望的。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明范围内。
多肽片段可以是“自由存在的”，或包含在较大多肽内，片段形成多肽的一部分或区域，优选作为一单独的连续区域。本发明的多肽片段代表性地例如包括包含或由SEQ ID NO2所示氨基酸序列的大约1-15，16-30，31-46，47-55，56-72，73-104，105-163，163-188，186-210和210-284位氨基酸残基组成的片段。本发明的多肽片段另外例如包括包含或由SEQ ID NO19所示氨基酸序列的大约1-143，1-150，47-143，47-150，73-143，73-150，100-150，140-145，142-148，140-150，140-200，140-225和140-266位氨基酸残基组成的片段。另外多肽片段的长度可以是至少10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，175或200个氨基酸。文中“大约”是指特定的范围，以及在氨基端或羧基端或氨基端和羧基端的多或少一些，几个，5，4，3，2，1个氨基酸残基的此范围。编码这些多肽片段的多核苷酸也涵盖在本发明内其它优选的实施方案涵盖的多肽片段包含或由以下结构组成Neutrokine-α推定的胞内域(SEQ ID NO2的1-46位氨基酸残基)，Neutrokine-α的推定的跨膜域(SEQ ID NO2的47-72位氨基酸残基)，Neutrokine-α的推定的胞外域(SEQ ID NO2的73-285位氨基酸残基)，Neutrokine-α的推定的TNF保守的结构域(SEQ ID NO2的191-284位氨基酸残基)，和包含或由Neutrokine-α的融合于推定胞外域的推定胞内域(即SEQ ID NO2的1-46位氨基酸残基融合于73-285位氨基酸残基)组成的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
另外优选的实施方案涵盖的多肽片段包含或由以下结构组成Neutrokine-αSV的推定的胞内域(SEQ ID NO19的1-46位氨基酸残基)，Neutrokine-αSV的推定的跨膜域(SEQ ID NO19的47-72位氨基酸残基)，Neutrokine-αSV的推定的胞外域(SEQ IDNO19的73-266位氨基酸残基)，Neutrokine-αSV的推定的TNF保守的结构域(SEQ ID NO19的172-265位氨基酸残基)，和包含或由αSV-Neutrokine的推定胞内域与胞外域的融合体(SEQ IDNO19的1-46位氨基酸残基与73-266位氨基酸残基融合)组成的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明另一些实施方案涵盖的多肽片段包含或由图7A中鉴别的推定的β折叠区域组成。本发明的这些多肽片段包含或由SEQ IDNO2的Gln144-Ala151，Phe172-Lys173，Ala177-Glu179，Asn183-Ile185，Gly191-Lys204，His210-Val219，Leu226-Pro237，Asn242-Ala251，Gly256-Ile263和/或Val276-Leu284位氨基酸残基组成。在另外的一些实施方案中，本发明的这些多肽片段还包含或由SEQID NO19的Phe153-Lys154，Ala158-Glu160，Asn164-Ile166，Gly172-Lys185，His191-Val200，Leu207-Pro218，Asn223-Ala232，Gly237-Ile244，和/或Val257-Leu256位氨基酸残基组成，及由SEQ ID NO23的Phe42-Lys43，Ala47-Glu49，Asn53-Ile55，Gly61-Pro74，His80-Val89，Leu96-Pro107，Asn112-Ala121，Gly126-Ile133和/或Asp146-Leu154位氨基酸残基组成。在另一些实施方案中，本发明的这些多肽片段还包括或包含SEQ ID NO28的Gln78-Ala85，Phe106-Lys107，Ala111-Glu113，Asn117-Ile119，Gly125-Lys138，His144-Val153，Leu160-Pro171，Asn176-Ala185，Gly190-Ile197，和/或Val210-Leu218位氨基酸残基组成，及由SEQ ID NO30的Gln78-Ala85，Phe106-Lys107，Ala111-Glu113，Asn117-Ile119，Gly125-Lys138，His144-Val153，Leu160-Pro171，Asn176-Ala185，Gly190-Ile197，和/或Val210-Leu218位氨基酸残基组成。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明的一些多肽非限性地例如包含或由本发明的氨基酸序列的组合组成，例如包括SEQ ID NO2的[Met1-Lys113]和[Leu114-Thr141]和[Ile142-Lys160]和[Gly161-Gln198]和[Val199-Ala248]和[Gly250-Leu285]的融合体；SEQ ID NO2的[Met1-Lys113]和[Ile142-Lys160]和[Gly161-Gln198]和[Val199-Ala248]和[Gly250-Leu285]的融合体；或SEQ ID NO2的[Met1-Lys113]和[Leu114-Thr141]和[Ile142-Lys160]和[Gly161-Gln198]和[Val199-Ala248]和[Gly250-Leu285]的融合体。或SEQ ID NO2的[Met1-Lys113]和[Leu114-Thr141]和[Ile142-Lys160]和[Gly161-Gln198]和[Gly250-Leu285]的融合体。其它组合可包括除上述组合之外的多肽片段(如SEQ ID NO2的[Leu114-Thr141]和[Val199-Ala248]和[Gly250-Leu285]和[Ile142-Lys160]的融合体)。其它组合也可包括本文所述的异源多肽片段和/或本发明的其它多肽或多肽片段(如SEQ ID NO2的[Met1-Lys113]和[Leu114-Thr141]和[Ile142-Lys160]和[Gly161-Gln198]和[Gly250-Leu285]与FLAG标记的融合体)。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
另外，本发明的多肽非限性地例如包括或由氨基酸序列组合组成，例如包括SEQ ID NO19的[Met1-Lys113]和[Leu114-Thr141]和[Gly142-Gln179]和[Val180-Ala229]和[Gly230-Leu266]的融合体；SEQ ID NO19的[Met1-Lys113]和[Gly142-Gln179]和[Val180-Ala229]和[Gly230-Leu266]的融合体；或SEQ ID NO19的[Met1-Lys113]和[Leu114-Thr141]和[Gly142-Gln179]和[Gly230-Leu266]的融合体。其它组合可包括除上述组合之外的多肽片段(如SEQ ID NO19的[Leu114-Thr141]和[Val180-Ala229]和[Gly230-Leu266]和[Gly142-Gln179]的融合体)。其它组合还可包括本文所述的异源多肽片段和/或本发明的其它多肽或多肽片段(如SEQ IDNO19的[Met1-Lys113]和[Leu114-Thr141]和[Gly142-Gln179]和[Gly230-Leu266]与FLAG标记的融合体)。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明的多肽另外非限性地例如包含或由氨基酸序列组合组成，例如包括SEQ ID NO23的[Met1-Lys106]和[Leu107-Thr134]和[Ile167-Lys184]和[Gly185-Gln224]和[Val225-Ala272]和Gly273-Leu309]的融合体；SEQ ID NO23的[Met1-Lys106]和[Glu135-Asn165]和[Ile167-Lys184]和[Gly185-Gln224]和[Val225-Ala272]和[Gly273-Leu309]的融合体，或SEQ ID NO23的[Met1-Lys106]和[Leu107-Thr134]和[Glu135-Asn165]和[ne167-Lys184]和[Gly185-Gln224]和[Gly273-Leu309]的融合体。其它组合可包括除上述组合之外的多肽片段(如SEQ ID NO23的[Met1-Lys106]和[Gly185-Gln224]和[Ile167-Lys184]和[Val225-Ala272]和[Leu107-Thr134]和[Gly273-Leu309]的融合体)。其它组合还可包括本文所述的异源多肽片段和/或本发明的其它多肽或多肽片段(如SEQ IDNO23的[Met1-Lys106]和[Glu135-Asn165]和[Ile167-Lys184]和[Gly185-Gln224]和[Val225-Ala272]和[Gly273-Leu309]与FLAG标记的融合体)。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明的多肽另外非限性地例如包含或由氨基酸序列组合组成，例如包括SEQ ID NO28的[Tyr1-Lys47]和[Leu48-Thr75]和[Ile76-Lys94]和[Gly95-Gln132]和[Val133-Ala182]和[Gly183-Ala219]的融合体；SEQ ID NO28的[Tyr1-Lys47]和[Leu48-Thr75]和[Ile76-Lys94]和[Val133-Ala182]的融合体；或SEQ ID NO28的[Tyr1-Lys47]和[Leu48-Thr75]和[Ile76-Lys94]和[Val133-Ala182]和[Gly183-Ala219]的融合体。其它组合可包括除上述组合之外的多肽片段(如SEQ ID NO28的[Tyr1-Lys47]和[Gly183-Ala219]和[Val133-Ala182]和[Leu48-Thr75]的融合体)。其它组合还可包括本文所述的异源多肽片段和/或本发明的其它多肽或多肽片段(如SEQ ID NO28的[Leu48-Thr75]和[Ile76-Lys94]和[Gly95-Gln132]和[Val133-Ala182]与Fc受体标记的融合体)。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明的多肽另外非限性地例如包含或由氨基酸序列组合组成，例如包括SEQ ID NO30的[Tyr1-Lys47]和[Leu48-Thr75]和[Ile76-Lys94]和[Gly95-Gln132]和[Val133-Ala182]和[Gly183-Ala219]的融合体；SEQ ID NO30的[Tyr1-Lys47]和[Leu48-Thr75]和[Ile76-Lys94]和[Val133-Ala182]的融合体；或SEQ ID NO30的[Tyr1-Lys47]和[Ile76-Lys94]和[Val133-Ala182]和[Gly183-Ala219]的融合体。其它组合可包括除上述组合之外的多肽片段(如SEQ ID NO30的[Tyr1-Lys47]和[Gly183-Ala219]和[Val133-Ala182]和[Leu48-Thr75]的融合体)。其它组合还可包括本文所述的异源多肽片段和/或本发明的其它多肽或多肽片段(如SEQ IDNO30的[Leu48-Thr75]和[Ile76-Lys94]和[Gly95-Gln132]和[Val133-Ala182]与Fc受体标记的融合体)。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明的其它实施方案涵盖的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽片段包含或由本发明多肽的功能区域组成，如Garnier-Robaon的α区，β区，转角区和卷曲区，Chou-Fasman的α区，β区和卷曲区，Kyte-Doolittle亲水区和疏水区，Eisenberg的α和β两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Emini表面形成区和Jameson-Wolf高抗原指数区，如图3，6及表1所示。在一优选的实施方案中，本发明的多肽片段是抗原性的。表1中的VIII，IX，XIII和XIV列所示数据可用于常规确定呈高度潜在抗原性的Neutrokine-α的区域。高抗原性区域是通过从VIII，IX，XIII和/或IV列所示数据中，选择代表在一定环境下易于在多肽表面上暴露的多肽区域的数值而确定，所述环境是在其中抗原识别可发生在免疫应答初始的过程中。本发明尤为优选的片段是那些包含组合了一些结构特点如上述的一些(如1，2，3或4)特点的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的区域的片段。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
在另一实施方案中，本发明提供了包含或由本发明多肽的携带表位部分组成的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。多肽的表位部分是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指当整个蛋白质是免疫原时激发抗体应答的蛋白质的一部分。另一方面，“抗原性表位”是指抗体可结合的蛋白质分子的区域。蛋白质的免疫原性表位数目一般少于抗原性表位数目。例如见于Geysen等，美国科学院院报813998-4002(1983)。
为选择携带抗原性表位的多肽(即含有抗体可结合的蛋白质分子的区域)，本领域熟知模拟部分蛋白质序列的相对短的合成肽，通常能激发与部分模拟蛋白反应的抗血清。例如见Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learrer，R.A(1983)“与蛋白质上预定位点反应的抗体”，科学219660-666所述。能激发蛋白质反应性血清的肽通常在蛋白质的一级序列中体现，可通过一些简便化学规则定性，并限定为既不是完整蛋白的免疫优势区域(即免疫性表位)，也不是氨基或羧基末端。本发明携带抗原性表位的肽或多肽因此用于产生抗体，包括特异结合本发明多肽的单克隆抗体。例如参见Wilson等，细胞37767-778(1984)，在p777页。
本发明携带抗原性表位的肽或多肽优选含有至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，优选至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少20个，至少25个，至少30个，至少40个，至少50个，更优选在大约15-30个包含在本发明多肽的氨基酸序列内的氨基酸组成的序列。包含免疫原性或抗原性表位的优选的多肽的长度为至少10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100个氨基酸残基。其它优选的抗原性表位包括本文所揭示的抗原性表位以及其一部分。
可用于产生Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性地例如包括包含或由图1A和1B(SEQID NO2)所示大约Phe115-Leu147位氨基酸残基组成的多肽；包括或由图1A和1B(SEQ ID NO2)所示大约Ile150-Tyr163位氨基酸残基组成的多肽；包括或由图1A和1B(SEQ ID NO2)所示大约Ser171-Phe194位氨基酸残基组成的多肽；包括或由图1A和1B(SEQID NO2)所示Glu223-Tyr246位氨基酸残基组成的多肽；包括或由图1A和1B(SEQ ID NO2)所示大约Ser271-Phe278位氨基酸残基组成的多肽；。文中“大约”是指特定的范围，以及在此范围内在氨基端或羧基端或二端的多或少一些，几个，5，4，3，2或1个氨基酸。这些多肽片段通过Jameson-Wolf抗原指数分析，已确定携带Neutrokine-α多肽的抗原性表位，如图3和表1所示。
可用于产生Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV特异性抗体的抗原性多肽或肽非限制性地例如包括包含或由图5A和5B(SEQID NO19)所示大约Pro32-Leu47位氨基酸残基组成的多肽；包含或由图5A和5B(SEQ ID NO19)所示大约Glu116-Ser143位氨基酸残基组成的多肽；包含或由图5A和5B(SEQ ID NO19)所示大约Phe153-Tyr173位氨基酸残基组成的多肽；包含或由图5A和5B(SEQID NO19)所示大约Pro218-Tyr227位氨基酸残基组成的多肽；包含或由图5A和5B(SEQ ID NO19)所示大约Ala232-Gln241位氨基酸残基组成的多肽；包含或由图5A和5B(SEQ ID NO19)所示大约Ile244-Ala249位氨基酸残基组成的多肽；包含或由图5A和5B(SEQID NO19)所示大约Ser252-Val257位氨基酸残基组成的多肽。文中“大约”是指特定的范围，以及此范围内在氨基端或羧基端或二端多或少一些，几个，5，4，3，2或1个氨基酸残基。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。这些多肽片段通过Jameson-Wolf抗原指数分析已确定携带Neutrokine-αSV多肽的抗原性表位，如图6所示和由DNA*STAR计算机程序的Protean组件产生的表形式的数据所示。
本发明的携带表位的肽和多肽可通过任何常规方法生产。例如见Houghten，R.A.(1985)快速固相合成大量肽的一般方法在个体氨基酸水平抗原-抗体相互作用的特异性，美国科学院院报825131-5135；“同时多种肽合成(SMPS)″的方法Houghten等(1986)的见美国专利No.4631211所述。
本发明的携带表位的肽和多肽的用途包括但非限于根据本领域熟知方法诱导抗体。例如见Sutcliffe等，如前；Wilson等，如前；Chow，M.等，美国科学院院报82910-914；和Bittle，F.J.等，基因病毒杂志662347-2354(1985)。本发明携带免疫原性表位的肽，即当整个蛋白质是免疫原时，激发抗体应答的蛋白质的一部分，是根据本领域已知方法鉴别的。例如见Geysen等，如前述。另外，Geysen的美国专利No.5194392阐述了一种检测或确定单体(氨基酸或其它化合物)序列的方法，该单体是互补于相应抗体的特殊抗原互补位(抗原结合位点)的表位的拓扑等价物(即mimotope)。Geysen(1989)的美国专利阐述了一种检测或确定单体序列的方法，该单体是互补于相应特殊受体的配体结合位点的配体的拓扑等价物。相似地，Houghten，R.A.等(1996)关于过烷基化的寡肽混合物的美国专利No.5480971，揭示了线性C1-C7-烷基-过烷基化的寡肽及这种肽的文库，以及用这种寡肽文库确定优先与相应受体分子结合的过烷基化的寡肽序列的方法。因此，本发明携带表位的肽的非肽类似物也可通过这些方法常规生产。
本发明涵盖一种多肽，其包含或由以下多肽的表位组成具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，或由ATCC保藏号97768的保藏物所含的的克隆中包含的多核苷酸序列编码的多肽，或由与SEQID NO1的序列或ATCC保藏号97768中包含的cDNA序列的互补序列杂交(如在所述杂交条件下)的多核苷酸编码的多肽。本发明还涵盖了多核苷酸序列，其包含或由编码本发明多肽表位的序列(如SEQ ID NO1所示序列)，编码本发明表位的多核苷酸序列的互补链的多核苷酸序列，和与互补链杂交(在所述杂交条件下)的多核苷酸序列组成。
本发明还涵盖了一种多肽，其包含或具有SEQ ID NO19所示氨基酸序列的多肽的表位，或由ATCC保藏号203518所包含的多核苷酸序列编码的多肽序列的表位，或由与SEQ ID NO18所示序列的互补序列或ATCC保藏号203518包含的cDNA序列杂交(如在所述杂交条件下)的多核苷酸编码的多肽序列的表位组成。本发明还涵盖了一种多核苷酸序列，其包含或由编码本发明多肽(如SEQ IDNO18所示序列)的表位，编码本发明表位的多核苷酸序列的互补链的多核苷酸序列，和与互补链杂交(如在所述杂交条件下)的多核苷酸序列。
文中所用术语“表位”是指在动物，优选哺乳动物，更优选在人体内具有抗原性或免疫原性活性的多肽的一部分。在一优选的实施方案中，本发明涵盖了一种包含表位的多肽以及编码这种多肽的多核苷酸。“免疫原性表位”是指激发动物体内抗体应答的蛋白质的一部分，如通过本领域已知任何方法确定，例如通过如前述产生抗体的方法(见例如Geysen等，美国科学院院报813998-4002(1983)所述)。术语“抗原性表位”是指抗体能免疫特异性结合其抗原的蛋白质的一部分，如通过本领域熟知的任何方法确定，例如通过所述的免疫分析确定。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但不是必须不包括与其它抗原的交叉反应性。抗原性表位非必须是免疫原性的。
作为表位的片段可通过任何常规方法生产(见例如Houghten，美国科学院院报825131-5135(1985)，另外见于美国专利No.4631211所述)在本发明中，抗原性表位优选含有至少4个，至少5个，着色6个，至少7个，更优选至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少20个，至少25个，至少30个，至少40个，至少50个，最优选大约15-30个氨基酸的序列。优选包含免疫原性或抗原性表位的多肽长度至少为10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90或100个氨基酸残基。其它优选的抗原性表位包括本文所揭示的抗原性表位，以及2，3，4，5或多个这些抗原性表位的任何组合。抗原性表位可用作免疫分析中的靶分子(例如Wilson等，细胞37767-778(1984)；Sutcliffe等，科学219660-666(1983)所述)。
相似地，免疫原性表位例如根据本领域熟知方法可用于诱导抗体(见例如Sutcliffe等，如前；Wilson等，如前；Chow等，美国科学院院报82910-914；和Bittle等，基因病毒杂志662347-2354(1985)所述)。优选的免疫原性表位包括本文揭示的免疫原性表位，以及2，3，4，5或多个这些免疫原性表位的组合。包含一或多个免疫原性表位的多肽可与载体蛋白如白蛋白一起存在，以激发动物系的(如兔或鼠)的抗体应答，或者如果多肽是足够长的(至少大约25个氨基酸)，此多肽可不用载体。然而，包含少如8-10个氨基酸的免疫原性表位已示出有效产生能结合至少变性的多肽中的线性表位的抗体。(如在Western印迹中)。
本发明携带表位的多肽可根据本领域熟知方法用于诱导抗体，所述方法包括但非限于体内免疫接种，体外免疫接种和噬菌体展示方法。见例如Sutcliffe等，如前；Wilson等，如前；和Bittle等，基因病毒杂志662347-2354(1985)。如果使用体内免疫接种法，动物可用游离肽接种；然而，抗肽抗体滴度可通过将肽与大分子载体偶联而加强，所述载体如是匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)或破伤风毒素。例如，含有半胱氨酸残基的肽可用接头如间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)偶联于载体，而其它肽可用更一般的连接剂如戊二醛偶联于载体。动物如兔，大鼠和小鼠用游离肽或与载体偶联的肽免疫接种，例如通过腹膜内和/或皮内注射一种乳液而接种，所述乳液含有大约100mg肽或载体蛋白和Freud′s佐剂或任何其它已知刺激免疫应答的佐剂。需要进行一些加强注射，例如每隔大约二周进行一次，以提供有效滴度的抗肽抗体，该抗体例如可通过使用吸附于固体表面的游离肽经ELISA分析而检测。免疫接种的动物血清中抗肽抗体的滴度可通过选择抗肽抗体而提高，例如通过将肽吸附于固体支持物上并根据本领域熟知方法洗脱选择的抗体。
本领域技术人员意识到及如上所述，包含免疫原性或抗原性表位的本发明的多肽可融合于其它多肽序列。例如，本发明的多肽可与免疫球蛋白(IgA，IgE，IgG，IgM)的恒定区，或其一部分(CH1，CH2，CH3或其任意组合及其一部分)融合产生嵌合多肽。这种融合蛋白易于纯化并且体内的半衰期可提高。已示出嵌合蛋白由人CD4多肽的前两个结构域和哺乳动物重链或轻链的恒定区的各种结构域组成。例如见于Ep394827；Tyaunecker等，自然，33184-86(1988)所述。抗原穿过上皮屏障输送至免疫系统增强已示出抗原(如胰导素)与FcRn结合配偶体如IgG或Fc片段缀合(见例如PCT公布WO96/22024和WO99/04813)。由于IgG部分的脱硫键而具有二硫键连的二聚体结构的IgG融合蛋白，也已发现比单体的多肽或其片段具有更有效的结合及中和其它分子的能力。见例如Fountoulakis等，生物化学杂志2703958-3964(1995)。编码上述表位的核酸也可与作为表位标记的相应基因(如血凝素(HA)标记或flag标记)重组，以助于检测和纯化表达的多肽。例如，由Janknecht等阐述的一系统易于纯化在人细胞系表达的未变性的融合蛋白(Janknecht等，美国科学院院报8889072-897)。在此系统中，相应的基因被亚克隆入痘苗重组质粒中，这样此基因的开放读框经翻译融合于由6个组氨酸残基组成的氨基端标记。该标记作为融合蛋白的基质结合域。将用重组痘苗病毒感染的细胞的提取物加样于Ni2+次氮基乙酸琼脂糖层析柱上，且组氨酸标记的蛋白质可选择性地用含有咪唑的缓冲液选择性洗脱。
在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽及其携带表位的片段是与异源抗原(如多肽，碳水化合物，磷脂或核酸)融合的。在特异的实施方案中，异源抗原是免疫原。
在更特异的实施方案中，异源抗原是HIV的gp120蛋白或其片段。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽及其携带表位的片段，是与另一TNF配体家族成员的多肽序列(或其生物活性片段或其变体)融合的。在一特异的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽是与CD40L多肽序列融合的。在优选的实施方案中，CD40L多肽序列是可溶的。
基因改组，基序改组，外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的方法，可用于调节Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的活性，从而有效地产生Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的激动剂与拈抗剂。见美国专利No.5605793，5811238，5830721，5834252，和5837458，及Patten，P.A.等，生物技术通用意见8724-33(1997)；Harayama，S.生物技术趋势16(2)76-82(1998)；Hansson，L.O，等，分子生物学杂志287265-76(1999)；和Lorenzo，M.M.和Blasco，R.生物技术24(2)308-13(1998)所述，所述文献均并入参考。在一实施方案中，对Neutrokine-α和或Neutrokine-αSV多核苷酸和相应多肽进行改动可通过DNA改组而进行。DNA改组包括通过同源性或位点特异性重组，将两或多个DNA区段装配入所需的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV分子中。在另一实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和相应多肽可通过在重组之前经易错聚合酶链反应随机诱变，随机插入核苷酸或其它方法而加以改变。在另一实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的一或多个组分，基序，区段，部分，结构域，片段等可与一或多个异源分子的一或多个组分，基序，区段，部分，结构域，片段等重组。在优选的实施方案中，异源分子例如是TNF-α，淋巴毒素-α(LT-α，也称为TNF-β)，LT-β(在异源三聚体LT-α2-β复合物中发现的)，OPGL，FasL，CD27L，CD30L，CD40L，4-1BBL，DcR3，OX40L，TNF-γ(国际公开No.WO96/14328)，AIM-I(国际公开WO97/33899)，AIM-II(国际公开WO97/34911)，APRIL(实验方法杂志188(6)1185-1190)，endokine-α(国际公开WO98/07880)，OPG，OX40，和神经生长因子(NGF)，和可溶形式的Fas，CD 30，CD27，CD40和4-IBB，TR2(国际公开WO96/34095)，DR3(国际公开WO97/33904)，DR4(国际公开WO98/32856)，TR5(国际公开WO98/30693)，TR6(国际公开WO98/30694)，TR7(国际公开WO98/41629)，TRANK，TR9国际公开WO98/56892)，TR10国际公开WO98/54202)，312C2(国际公开WO98/06842)，TR12，CDA和V-FLIP。在另一些实施方案中，异源分子是TNF家族的任何成员。
在优选的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽(包括其生物活性片段或变体)与可溶的CD40L多肽或其生物活性片段或变体融合。
为改良或改变Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的特征，可进行蛋白质工程。在本领域技术人员已知的重组DNA方法可用于产生新的突变体蛋白或“突变蛋白”，其包括一个或多个氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。这种修饰的多肽可显示例如增强的活性或提高的稳定性。另外，它们与相应天然的多肽相比，至少在某些纯化和储存条件下，可以高产量纯化并较好的稳定性。例如，就许多蛋白质而言，包括成熟形式的分泌蛋白的胞外域，本领域已知N末端或C末端可缺失一或多个氨基酸而基本不丧失生物功能。例如，Ron等，生物化学杂志，2682984-2988(1993)报道了修饰的KGF蛋白，其即使丢失3，8或27个氨基端氨基酸，但仍具有肝素结合活性。
由于本发明的蛋白质是TNF多肽家族成员，图1A和1B(SEQ IDNO2)的N末端氨基酸直至191位的Gly(G)残基的缺失，仍可保留一些生物活性如刺激淋巴细胞(如B细胞)增殖，分化和/或活化，及对适当靶细胞具有胞毒性的能力。具有进一步N末端包括Gly(G)残基缺失的多肽不期望保留生物活性，因为已知TNF相关多肽中的此残基是生物活性所需的保守结构域的起点。然而，即使蛋白质N末端缺失一或多个氨基酸而丧失了蛋白质的一或多种功能，其它功能活性仍可保留。因此，缩短的蛋白质诱导和/或结合识别完整蛋白质或其胞外域的抗体的能力，当完整蛋白质或其胞外域的少部分残基自N末端除去时，仍可保留。缺失完整蛋白N末端残基的特殊多肽是保留这种免疫活性，可通过本文所述常规方法及本领域已知其它方法确定。
因此，本发明进一步提供了一种多肽及编码这种多肽的多核苷酸，所述多肽具有缺失自图1A和1B(SEQ ID NO2)所示Neutrokine-α的氨基酸序列氨基端直至191位甘氨酸残基(氨基端的Gly191)的一或多个残基。尤其地，本发明提供的多肽包含或由SEQ ID NO2的n1-285位残基的氨基酸序列组成，其中n1是SEQ ID NO2所示氨基酸序列的2-190位氨基酸位置中的一个整数。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。更特别地，本发明提供的编码多肽的多核苷酸包含或由选自以下一组的氨基酸序列组成SEQ ID NO2的2-285，3-285，4-285，5-285，6-285，7-285，8-285，9-285，10-285，11-285，12-285，13-285，14-285，15-285，16-285，17-285，18-285，19-285，20-285，21-285，22-285，23-285，24-285，25-285，26-285，27-285，28-285，29-285，30-285，31-285，32-285，33-285，34-285，35-285，36-285，37-285，38-285，39-285，40-285，41-285，42-285，43-285，44-285，45-285，46-285，47-285，48-285，49-285，50-285，51-285，52-285，53-285，54-285，55-285，56-285，57-285，58-285，59-285，60-285，61-285，62-285，63-285，64-285，65-285，66-285，67-285，68-285，69-285，70-285，71-285，72-285，73-285，74-285，75-285，76-285，77-285，78-285，79-285，80-285，81-285，82-285，83-285，84-285，85-285，86-285，87-285，88-285，89-285，90-285，91-285，92-285，93-285，94-285，95-285，96-285，97-285，98-285，99-285，100-285，101-285，102-285，103-285，104-285，105-285，106-285，107-285，108-285，109-285，110-285，111-285，112-285，113-285，114-285，115-285，116-285，117-285，118-285，119-285，120-285，121-285，122-285，123-285，124-285，125-285，126-285，127-285，128-285，129-285，130-285，131-285，132-285，133-285，134-285，135-285，136-285，137-285，138-285，139-285，140-285，141-285，142-285，143-285，144-285，145-285，146-285，147-285，148-285，149-285，150-285，151-285，152-285，153-285，154-285，155-285，156-285，157-285，158-285，159-285，160-285，161-285，162-285，163-285，164-285，165-285，166-285，167-285，168-285，169-285，170-285，171-285，172-285，173-285，174-285，175-285，176-285，177-285，178-285，179-285，180-285，181-285，182-285，183-285，184-285，185-285，186-285，187-285，188-285，189-285，和190-285。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。本发明还涉及一种核酸分子，该核酸分子包含或由与编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸序列组成。本发明还涵盖了与异源多核苷酸序列融合的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内，这些多肽是包含或由与上述氨基酸序列与至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列组成的多肽，编码这种多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
另外，由于本发明Neutrokine-α多肽的推定的胞外域可自身激发生物活性，该多肽推定的胞外域(跨越SEQ ID NO2的Gln73-Leu285位氨基酸)缺失N末端和C末端氨基酸残基仍可保留一些生物活性，例如配体结合，刺激淋巴细胞增殖，分化和/或活化，及调节细胞复制或调节靶细胞活性。然而，即使Neutrokine-α多肽推定的胞外域N末端缺失一或多个氨基酸导致此多肽的一或多种生物功能丧失，其它功能活性仍可保留。因此，缩短的多肽诱导和/或结合识别完整多肽或其胞外域的抗体的能力，当完整或成熟多肽或其胞外域的少部分残基自N末端除去时，仍可保留。缺失完整多肽N末端残基的特殊多肽是否保留这种免疫活性，可通过本文所述常规方法及本领域已知其它方法确定。
因此，本发明还提供了一种多肽及编码这种多肽的多核苷酸，该多肽具有缺失自SEQ ID NO2所示Neutrokine-α氨基酸序列氨基端直至280位甘氨酸残基的一或多个残基。尤其地，本发明提供的多肽包含或由SEQ ID NO2的n2-285位氨基酸序列组成，其中n2是SEQ ID NO2的73-280位氨基酸位置数中的一整数位，73位是Neutrokine-α多肽(SEQ ID NO2)推定的胞外域N末端的第一个残基位。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。更特别地，在某些实施方案中，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含或由选自以下一组氨基酸序列组成SEQ ID NO2的Q-73至L-285；G-74至L-285；D-75至L-285；L-76至L-285；A-77至L-285；S-78至L-285；L-79至L-285；R-80至L-285；A-81至L-285；E-82至L-285；L-83至L-285；Q-84至L-285；G-85至L-285；H-86至L-283；H-87至L-285；A-88至L-285；E-89至L-285；K-90至L-285；L-91至L-285；P-92至L-285；A93至L-285；G-94至L-285；A-95至L-285；G-96至L-285；A-97至L-285；P-98至L-285；K-99至L-285；A-100至L-285；G-101至L-285；L-102至L-285；E-103至L-235；E-104至L-285；A-105至L-285；P-106至L-285；A-107至L-285；V-108至L-285；T-109至L-285；A-110至L-285；G-111至L-285；L-112至L-285；K-113至L-285；1-114至L-285；F-115至L-285；EI16至L-285；P-117至L-285；P-118至L-285；A-119至L-285；P-120至L-285；G-121至L-235；E-122至L-285；G-123至L-285；N-124至L-285；S-125至L-285；S-126至L-285；Q-127至L-285；N-128至L-285；S-129至L-285；R-130至L-285；N-131至L-285；K-132至L-285；R-133至L-285；A-134至L-285；V-135至L-285；Q-136至L-285；G-137至L-285；P-138至L-285；E-139至L-285；E-140至L-285；T-141至L-285；V-142至L-285；T-143至L-285；Q-144至L-285；D-145至L-285；C-146至L-285；L-147至L-285；Q-148至L-285；L-149至L-285；I-150至L-285；A-151至L-280；D-152至L-285；S-153至L-285；E-154至L-285；T-155至L-285；P-156至L-285；T-157至L-285；1-158至L-285；Q-159至L-285；K-160至L-285；G-161至L-285；S-162至L-285；Y-163至L-285；T-164至L-285；F-165至L-285；V-166至L-285；P-167至L-285；W-168至L-285；L-169至L-285；L-170至L-285；S-171至L-285；F-172至L-285；K-173至L-285；R-174至L-285；G-175至L-285；S-176至L-285；A-177至L-235；L-178至L-285；E-179至L-285；E-180至L-285；K-181至L-285；E-182至L-285；N-183至L-285；K-184至L-285；I-185至L-285；L-186至L-285；V-187至L-285；K-188至L-285；E-189至L-285；T-190至L-285；G-191至L-285；Y-192至L-285；F-193至L-285；F-194至L-280；I-195至L-285；Y-196至L-285；G-197至L-285；Q-198至L-285；V-199至L-285；L-200至L-285；Y-201至L-285；T-202至L-285；D-203至L-285；K-204至L-285；T-205至L-285；Y-206至L-285；A-207至L-285；M-203至L-285；G-209至L-285；H-210至L-285；L-211至L-285；I-212至L-285；Q-213至L-285；R-214至L-285；K-215至L-285；K-216至L-285；V-217至L-285；H-218至L-285；V-219至L-285；F-220至L-285；G-221至L-285；D-222至L-285；E-223至L-285；L-224至L-285；S-225至L-285；L-226至L-285；V-227至L-285；T-228至L-285；L-229至L-285；F-230至L-285；R-231至L-285；C-232至L-285；I-233至L-285；Q-234至L-235；N-235至L-285；M-236至L-285；P-237至L-285；E-238至L-285；T-239至L-285；L-240至L-285；P-241至L-285；N-242至L-285；N-243至L-285；S-244至L-285；C-245至L-285；Y-246至L-285；S-247至L-285；A-248至L-285；G-249至L-285；1-250至L-285；A-251至L-285；K-252至L-285；L-253至L-285；E-254至L-285；E-255至L-285；G-256至L-285；D-257至L-285；E-258至L-285；L-259至L-285；Q-260至L-285；L-261至L-285；A-262至L-285；I-263至L-285；P-264至L-285；R-265至L-285；E-266至L-285；N-267至L-285；A-268至L-285；Q-269至L-285；I-270至L-285；S-271至L-285；L-272至L-285；D-273至L-285；G-274至L-285；D-275至L-285；V-276至L-285；T-277至L-285；F-278至L-285；F-279至L-285；和G-280至L-285。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。本发明还涉及一种核酸分子，该核酸分子包含或由与编码上述Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸序列组成。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列融合的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内，这些多肽是包含或由与以上氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列组成，编码这种多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明尤为优选的实施方案涉及一种核酸分子，该核酸分子包含或由具有一种核苷酸序列的多核苷酸组成，该核苷酸序列与编码具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少95％，96％，97％，98％，99％或100％相同性。本发明优选的实施方案涉及包含或由多核苷酸组成的核酸分子，该多核苷酸具有一种核苷酸序列，该核苷酸序列序列与编码具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少90％相同性。本发明更优选的实施方案涉及包含或由多核苷酸组成的核酸分子，该多核苷酸具有一种核苷酸序列，该序列与编码具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少95％相同性。本发明更优选的实施方案涉及包含或由多核苷酸组成的核酸分子，该多核苷酸具有一种核苷酸序列，该序列与编码具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少96％相同性。
另外，本发明更优选的实施方案涉及包含或由多核苷酸组成的核酸分子，该多核苷酸具有一种核苷酸序列，该序列与编码具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少97％相同性。另外，本发明更优选的实施方案涉及包含或由多核苷酸组成的核酸分子，该多核苷酸具有一种核苷酸序列，该序列与编码具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少98％相同性。另外，本发明更优选的实施方案涉及包含或由多核苷酸组成的核酸分子，该多核苷酸具有一种核苷酸序列，该序列与编码具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示134-285位氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的多核苷酸序列有至少99％相同性。
在特异的实施方案中，由以下Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的N末端缺失多肽片段之一组成的多肽是优选的SEQ IDNO2的Ala71-Leu285位氨基酸残基，Ala81-Leu285位氨基酸残基，Leu112-Leu285位氨基酸残基，Ala134-Leu285位氨基酸残基，Leu147-Leu285位氨基酸残基，和Gly161-Leu285位氨基酸残基，编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
相似地，已知许多生物功能性C末端缺失突变蛋白。例如，γ干扰素通过缺失其蛋白质羧基端的8-10个氨基酸残基而提高10倍活性(Dobeli等，生物技术杂志7199-216(1988)).由于本发明蛋白是TNF多肽家族的一成员，C末端氨基酸直至284位亮氨酸残基的缺失，期望保留大部分生物活性，例如配体结合，刺激淋巴细胞(如B细胞)增殖，分化和/或活化的能力，调节细胞复制的能力。缺失直至大约10个另外C末端或残基(即直至274位甘氨酸残基)的多肽，也可保留一些活性，如受体结合活性，尽管这种多肽丧失一部分延伸至SEQ ID NO2的Leu284的保守的TNF结构域。然而，即使蛋白质C末端缺失一或多个氨基酸导致丧失一或多种蛋白质的生物功能，其它功能仍可保留。因此，当完整或成熟蛋白质的少量残基自C末端除去时，缩短的蛋白质诱导和/或结合识别完整或成熟蛋白的抗体的能力仍保留。缺失完整蛋白C末端残基的特殊多肽是否保留这种免疫活性，可通过本文所述常规方法和本领域已知其它方法确定。
因此，本发明进一步提供了一种多肽和编码这种多肽的多核苷酸，该多肽具有缺失自图1A和1B(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列羧基端直至274位甘氨酸(Gly274)的一或多个残基。特别地，本发明提供了包含或由SEQ ID NO2氨基酸序列的1-m1位残基的氨基酸序列组成的多肽，其中m1是SEQ ID NO2的274-284位氨基酸残基之间的任一整数。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。更特别地，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含或由选自以下一组的氨基酸序列组成SEQ ID NO2的1-274，1-275，1-276，1-277，1-278，1-279，1-280，1-281，1-282，1-283，和1-284位残基组成的氨基酸序列。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。本发明还涉及一种核酸分子，其包含或由与编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸序列组成。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内，这些多肽是包含或由与上述氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列组成，编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明还提供了一种多肽，其包含或由缺失自氨基端和羧基端的一或多个氨基酸组成，可描述为具有SEQ ID NO2的n1-m1残基，其中n1和m1是如前述的整数。本发明还包括编码多肽的核苷酸序列，该多肽包含或由ATCC保藏号97768的保藏的cDNA克隆编码的完整Neutrokine-α氨基酸序列的一部分组成，其中该部分不包括完整氨基酸序列(或这些N-和C-末端缺失体的任意组合)氨基端的1-190位氨基酸，或C末端的1-11位氨基酸。编码所有上述缺失多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
相似地，自Neutrokine-α推定的胞外域的C末端残基直至SEQID NO2的79位亮氨酸残基缺失体可保留一些生物活性，如配体结合，刺激淋巴细胞(如B细胞)增殖，分化和/或活化，及调节细胞复制或调节靶细胞活性。具有进一步C末端缺失包括SEQ ID NO2的Leu79的多肽不期望保留生物活性。
然而，即使多肽C末端缺失一或多个氨基酸导致丧失一或多种多肽生物功能，其它生物活性仍可保留。因此，缩短的多肽诱导和/或结合识别完整，成熟多肽或其胞外域的抗体的能力，当完整，成熟多肽或其胞外域的少量残基自C末端除去时，仍可保留。缺失推定胞外域C末端残基的特殊多肽是否保留这种免疫活性，可通过本文所述常规方法及本领域已知其它方法确定。
因此，本领域还提供了多肽及编码这种多肽的多核苷酸序列，该多肽具有缺失自SEQ ID NO2所示Neutrokine-α多肽推定胞外域的氨基酸序列羧基端直至79位亮氨酸的一或多个残基。尤其地，本发明提供了包含或由SEQ ID NO2所示氨基酸序列的73-m2残基组成的氨基酸序列组成的多肽，其中m2是SEQ ID NO2所示氨基酸序列的79-285氨基酸残基位中的-整数位，78位残基是Neutrokine-α多肽(SEQ ID NO2)推定胞外域C末端的第一个残基。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。更特别地，在某些实施方案中本发明提供了编码包含或由选自以下一组氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸SEQ ID NO2的Q-73至Leu-285；Q-73至L-284；Q-73至K-283；Q-73至L-282；Q-73至A-281；Q-73至G-280；Q-73至F-279；Q-73至F-278；Q-73至T-277；Q-73至V-276；Q-73至D-275；Q-73至G-274；Q-73至D-273；Q-73至L-272；Q-73至S-271；Q-73至I-270；Q-73至Q-269；Q-73至A-268；Q-73至N-267；Q-73至E-266；Q-73至R-265；Q-73至P-264；Q-73至I-263；Q-73至A-262；Q-73至L-261；Q-73至Q-260；Q-73至L-259；Q-73至E-258；Q-73至D-257；Q-73至G-256；Q-73至E-255；Q-73至E-254；Q-73至L-253；Q-73至K-252；Q-73至A-251；Q-73至I-250；Q-73至G-249；Q-73至A-248；Q-73至S-247；Q-73至Y-246；Q-73至C-245；Q-73至S-244；Q-73至N-243；Q-73至N-242；Q-73至P-241；Q-73至L-240；Q-73至T-239；Q-73至E-238；Q-73至P-237；Q-73至M-236；Q-73至N-235；Q-73至Q-234；Q-73至I-233；Q-73至C-232；Q-73至R-231；Q-73至F-230；Q-73至L-229；Q-73至T-228；Q-73至V-227；Q-73至L-226；Q-73至S-225；Q-73至L-224；Q-73至E-223；Q-73至D-222；Q-73至G-221；Q-73至F-220；Q-73至V-219；Q-73至H-218；Q-73至V-217；Q-73至K-216；Q-73至K-215；Q-73至R-214；Q-73至Q-213；Q-73至I-212；Q-73至L-211；Q73至H-210；Q-73至G-209；Q-73至M-208；Q-73至A-207；Q-73至Y-206；Q-73至T-205；Q-73至K-204；Q-73至D-203；Q-73至T-202；Q-73至Y-201；Q-73至L-200；Q-73至V-199；Q-73至Q-198；Q-73至G-197；Q-73至Y-196；Q-73至I-195； Q-73至F-194；Q-73至F-193；Q-73至Y-192；Q-73至G-191；Q-73至T-190；Q-73至E-189；Q-73至K-188；Q-73至V-187；Q-73至L186；Q-73至I-185；Q-73至K-184；Q-73至N-183；Q-73至E-182；Q-73至K-181；Q-73至E-180；Q-73至E-179；Q-73至L-178；Q-73至A-177；Q-73至S-176；Q-73至G-175；Q-73至R-174；Q-73至K-173；Q-73至F-172；Q-73至S-171；Q-73至L-170；Q-73至L-169；Q-73至W-168；Q-73至P-167；Q-73至V-166；Q-73至F-165；Q-73至T-164；Q-73至Y-163；Q-73至S-162；Q-73至G-161；Q-73至K-160；Q-73至Q-159；Q-73至I-158；Q-73至T-157；Q-73至P-156；Q-73至T-155；Q-73至E-154；Q-73至S-153；Q-73至D-152；Q-73至A-151；Q-73至1-150；Q-73至L-149；Q-73至Q-148；Q-73至L-147；Q-73至C-146；Q-73至D-145；Q-73至Q-144；Q-73至T-143；Q-73至V-142；Q-73至T-141；Q-73至E-140；Q-73至E-139；Q-73至P-138；Q-73至G-137；Q-73至Q-136；Q-73至V-135；Q-73至A-134；Q-73至R-133；Q-73至K-132；Q-73至N-131；Q-73至R-130；Q-73至S-129；Q-73至N-128；Q-73至Q-127；Q-73至S-126；Q-73至S-125；Q-73至N-124；Q-73至G-123；Q-73至E-122；Q-73至G-121；Q-73至P-120；Q-73至A-119；Q-73至P-118；Q-73至P-117；Q-73至E-116；Q-73至F-115；Q-73至I-114；Q-73至K-113；Q-73至L-112；Q-73至G-111；Q-73至A-110；Q-73至T-109；Q-73至V-108；Q-73至A-107；Q-73至P-106；Q-73至A-105；Q-73至E-104；Q-73至E-103；Q-73至L-102；Q-73至G-101；Q-73至A-100；Q-73至K-99；Q-73至P-98；Q-73至A-97；Q-73至G-96；Q-73至A-95；Q-73至G-94；Q-73至A-93；Q-73至P-92；Q-73至L-91；Q-73至K-90；Q-73至E-89；Q-73至A-88；Q-73至H-S7；Q73至H-86；Q-73至G-85；Q-73至Q-84；Q-73至L-83；Q-73至E-82；Q-73至A-81；Q-73至R-80；Q-73至L-79。由这些多核苷酸编码的多肽也涵盖在本发明内。本发明还涉及包含或由一种多核苷酸序列组成的核酸分子，该多核苷酸序列与编码上述Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性，本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内，这些多肽是包含或由与上述氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列组成的多肽，编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明还提供了具有缺失自Neutrokine-α推定胞外域氨基端和羧基端的一或多个氨基酸的多肽，其可描述为具有SEQ ID NO2的n2-m2残基，其中n2和m2为如前述的整数。
在另一实施方案中，一核苷酸序列编码由Neutrokine-α氨基酸序列胞外域的一部分组成的多肽，Neutrokine-α氨基酸序列由ATCC中No.97768的cDNA质粒编码，所述胞外域的一部分不包括Neutrokine-α氨基酸序列胞外域氨基端的1-206位氨基酸，或羧基端的1-206位氨基酸，或上述氨基端和羧基端缺失的任意组合。
如上所述，即使多肽N末端缺失一或多个氨基酸导致丧失多肽的一或多种功能活性(即生物活性)，其它功能或生物活性仍可保留。因此，缩短的Neutrokine-α突变蛋白诱导和/或结合识别全长或成熟形式多肽或其胞外域的抗体的能力，当完整或成熟多肽或其胞外域的少量残基自N末端除去时，仍可保留。缺失完整多肽N末端残基的特殊多肽是否保留这种免疫活性，可通过本文所述方法和本领域已知方法确定。缺失大量N末端氨基酸残基的Neutrokine-α突变蛋白仍保留一些功能(如生物或免疫)活性不是不可能的。事实上，由少如6个Neutrokine-α氨基酸残基组成的肽通常也可激发免疫应答。
因此，本发明提供了一种多肽和编码这种多肽的多核苷酸，该多肽具有缺失自SEQ ID NO2所示Neutrokine-α的推定的全长氨基酸序列氨基端直至280位甘氨酸残基的一或多个残基。尤其本发明提供了包含SEQ ID NO2所示序列n3-285残基组成的氨基酸序列的多肽，其中n3是SEQ ID NO2所示氨基酸序列1-280氨基酸残基位中的一整数。
更特别地，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含或由选自以下一组的氨基酸序列组成SEQ ID NO2的D-2至L-285；D-3至L-285；S-4至L-285；T-5至L-285；E-6至L-285；R-7至L-285；E-8至L-285；Q-9至L-285；S-10至L-285；R-11至L-285；L-12至L-285；T-13至L-285；S-14至L-285；C-15至L-285；L-16至L-285；K-17至L-285；K-18至L-285；R-19至L-285；E-20至L-285；E-21至L-285；M-22至L-285；K23至L-285；L-24至L-285；K-25至L-285；E-26至L-285；C-27至L-285；V-28至L-285；S-29至L-285；I-30至L-285；L-31至L-285；P-32至L-285；R-33至L-285；K-34至L-285；E-35至L-285；S-36至L-285；P-37至L-285；S-38至L-285；V-39至L-285；R-40至L-285；S-41至L-285；S-42至L-285；K43至L-285；D-44至L-285；G-45至L-285；K-46至L-285；L-47至L-285；L-48至L-285；A-49至L-285；A-50至L-285；T-51至L-285；L-52至L-285；L-53至L-285；L-54至L-285；A-55至L-285；L-56至L-285；L-57至L-285；S-58至L-285；C-59至L-285；C-60至L-283；L-61至L-285；T-62至L-285；V-63至L-285；V-64至L-285；S-65至L-285；F-66至L-285；Y-67至L-285；Q-68至L-285；V-69至L-285；A-70至L-285；A-71至L-285；L-72至L-285；Q-73至L-285；G-74至L-285；D-75至L-285；L-76至L-285；A-77至L-285；S-78至L-285；L-79至L-285；R-80至L-285；A-81至L-285；E-82至L-285；L-83至L-285；Q-84至L-285；G-85至L-285；H-86至L-285；H-87至L-285；A-88至L-285；E-89至L-285；K-90至L-285；L-91至L-285；P-92至L-285；A-93至L-285；G-94至L-285；A-95至L-285；G-96至L285；A-97至L-285；P-98至L-285；K-99至L-285；A-100至L-285；G-101至L-285；L-102至L-285；E-103至L-285；E-104至L-285；A-105至L-285；P-106至L-285；A-107至L-285；V-108至L-285；T-109至L-285；A-110至L-285；G-111至L-285；L-112至L-285；K-113至L-285；I-114至L-285；F-115至L-285；E-116至L-285；P-117至L-285；P-118至L-285；A-119至L-285；P-120至L-285；G-121至L-285；E-122至L-285；G-123至L-285；N-124至L-285；S-125至L-285；S-126至L-285；Q-127至L-285；N-128至L-285；S-129至L-285；R130至L-285；N-131至L-285；K-132至L-285；R-133至L-285；A-134至L-285；V-135至L-285；Q-136至L-285；G-137至L-285；P-138至L-285；E-139至L-285；E-140至L-285；T-141至L-285；V-142至L-285；T-143至L-285；Q-144至L-285；D-145至L-285；C-146至L-285；L-147至L-285；Q-148至L-285；L-149至L-285；I-150至L-285；A-151至L-285；D-152至L-285；S-153至L-285；E-154至L-285；T-155至L-285；P-156至L-285；T-157至L-283；I-158至L-285；Q-159至L-285；K-160至L-285；G-161至L-285；S-162至L-285；Y-163至L-285；T-164至L-285；F-165至L-285；V-166至L-285；P-167至L-285；W-168至L-285；L-169至L-285；L-170至L-285；S-171至L-285；F-172至L-285；K-173至L-285；R-174至L-285；G-175至L-285；S-176至L-285；A-177至L-285；L-178至L-285；E-179至L-285；E-180至L-285；K-181至L-285；E-182至L-285；N-183至L-285；K-184至L-285；I-185至L-285；L-186至L-285；V-187至L-285；K-188至L-285；E-189至L-285；T-190至L-285；G-191至L-285；Y-192至L-285；F-193至L-285；F-194至L-285；I-195至L-285；Y-196至L-285；G-197至L-285；Q-198至L-285；V-199至L-285；L-200至L-285；Y-201至L-285；T-202至L-285；D-203至L-285；K-204至L-285；T-205至L-285；Y-206至L-285；A-207至L-285；M-208至L-285；G-209至L-285；H-210至L-285；L-211至L-285；I-212至L-285；Q-213至L-285；R-214至L-285；K-215至L-285；K-216至L-285；V-217至L-285；H-218至L-285；V-219至L-285；F-220至L-285；G-221至L-285；D-222至L-285；E-223至L-285；L-224至L-285；S-225至L-285；L-226至L-285；V-227至L-285；T-228至L-285；L-229至L-285；F-230至L-285；R-231至L-285；C-232至L-285；I-233至L-285；Q-234至L-285；N-235至L-285；M-236至L-285；P-237至L-285；E-238至L-285；T-239至L-285；L-240至L-285；P-241至L-285；N-242至L-285；N-243至L-285；S-244至L-285；C-245至L-285；Y-246至L-285；S-247至L-285；A-248至L-285；G-249至L-285；I-250至L-285；A-251至L-285；K-252至L-285；L-253至L-285；E-254至L-285；E-255至L-285；G-256至L-285；D-257至L-285；E-258至L-285；L-259至L-285；Q-260至L-285；L-261至L-285；A-262至L-285；1-263至L-285；P-264至L-285；R-265至L-285；E-266至L-285；N-267至L-285；A-268至L-285；Q-269至L-285；I-270至L-285；S-271至L-285；B-272至L-285；D-273至L-285；G-274至L-285；D-275至L-285；V-276至L-285；T-277至L-285；F-278至L-285；F-279至L-285；以及G-280至L-285。本发明还涉及包含或由一种多核苷酸序列组成的核酸分子，该多核苷酸序列与编码上述Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性，本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内，这些多肽包含与上述氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
如上所述，即使蛋白质C末端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质丧失一或多种功能活性(如生物活性)，其它功能活性仍可保留。因此，当完整或成熟多肽或胞外域的少量残基自C末端除去时，缩短的Neutrokine-α突变蛋白诱导和/或结合识别完整或成熟多肽或胞外域的抗体的能力仍可保留。缺失完整多肽C末端特殊多肽是否保留这种免疫活性，可通过本文所述方法和本领域已知其它方法确定。缺失大量C末端氨基酸残基的Neutrokine-α突变蛋白仍保留一些功能(如生物或免疫)活性不是不可能的。事实上，由少如6个Neutrokine-α氨基酸残基组成的肽通常也可激发免疫应答。
因此，本发明提供了具有缺失自SEQ ID NO2所示Neutrokine-α氨基酸序列羧基端直至在6位的谷氨酸的一或多个残基的多肽，还提供了编码这种多肽的多核苷酸。尤其本发明提供了包含SEQID NO2的1-m3残基组成的氨基酸序列的多肽，其中m3是SEQ IDNO2所示氨基酸序列6-284氨基酸残基位中的一整数位。
更特别地，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含或由选自以下一组氨基酸序列组成SEQ ID NO2的M-1至L-284；M-1至K-283；M-1至L-282；M-1至A-281；M-1至G-280；M-1至F-279；M-1至F-278；M-1至T-277；M-1至V-276；M-1至D-275；M-1至G-274；M-1至D-273；M-1至L-272；M-1至S-271；M-1至I-270；M-1至Q-269；M-1至A-268；M-1至N-267；M-1至E-266；M-1至R-265；M-1至P-264；M-1至I-263；M-1至A-262；M-1至L-261；M-1至Q-260；M-1至L-259；M-1至E-258；M-1至D-257；M-1至G-256；M-1至E-255；M-1至E-254；M-1至L-253；M-1至K-252；M-1至A-251；M-1至I-250；M-1至G-249；M-1至A-248；M-1至S-247；M-1至Y-246；M-1至C-245；M-1至S-244；M-1至N-243；M-1至N-242；M-1至P-241；M-1至L-240；M-1至T-239；M-1至E-238；M-1至P-237；M-1至M-236；M-1至N-235；M-1至Q-234；M-1至I-233；M-1至C-232；M-1至R-231；M-1至F-230；M-1至L-229；M-1至T-228；M-1至V-227；M-1至L-226；M-1至S-225；M-1至L-224；M-1至E-223；M-1至D-222；M-1至G-221；M-1至F-220；M-1至V-219；M-1至H-118；M-1至V-117；M-1至K-216；M-1至K-115；M-1至R-114；M-1至Q-113；M-1至I-112；M-1至L-211；M-1至H-210；M-1至G-209；M-1至M-208；M-1至A-207；M-1至Y-206；M-1至T-205；M-1至K-204；M-1至D-203；M-1至T-202；M-1至Y-201；M-1至L-200；M-1至V-199；M-1至Q-198；M-1至G-197；M-1至Y-196；M-1至1-195；M-1至F-194；M-1至F-193；M-1至Y-192；M-1至G-191；M-1至T-190；M-1至E-189；M-1至K-188；M-1至V-187；M-1至L-186；M-1至I-185；M-1至K-184；M-1至N-183；M-1至E-132；M-1至K-181；M-1至E-180；M-1至E-179；M-1至L-178；M-1至A-177；M-1至S-176；M-1至G-175；M-1至R-174；M-1至K-173；M-1至F-172；M-1至S-171；M-1至L-170；M-1至L-169；M-1至W-168；M-1至P-167；M-1至V-166；M-1至F-165；M-1至T-164；M-1至Y-163；M-1至S-162；M-1至G-161；M-1至K-160；M-1至Q-159；M-1至I-158；M-1至T-157；M-1至P-156；M-1至T-155；M-1至E-154；M-1至S-153；M-1至D-152；M-1至A-151；M-1至I-150；M-1至L-149；M-1至Q-148；M-1至L-147；M-1至C-146；M-1至D-145；M-1至Q-144；M-1至T-143；M-1至V-142；M-1至T-141；M-1至E-140；M-1至E-139；M-1至P-138；M-1至G-137；M-1至Q-136；M-1至V-135；M-1至A-134；M-1至R-133；M-1至K-132；M-1至N-131；M-1至R-130；M-1至S-129；M-1至N-128；M-1至Q-127；M-1至S-126；M-1至S-125；M-1至N-124；M-1至G-123；M-1至E-122；M-1至G-121；M-1至P-120；M-1至A-119；M-1至P118；M-1至P-117；M-1至E-116；M-1至F-115；M-1至I-114；M-1至K-113；M-1至L-112；M-1至G-111；M-1至A-110；M-1至T-109；M-1至V-108；M-1至A-107；M-1至P-106；M-1至A-105；M-1至E-104；M-1至E-103；M-1至L-102；M-1至G-101；M-1至A-100；M-1至K-99；M-1至P-98；M-1至A-97；M-1至G-96；M-1至A-95；M-1至G-94；M-1至A-93；M-1至P-92；M-1至L-91；M-1至K-90；M-1至E-89；M-1至A-88；M-1至H-87；M-1至H-86；M-1至G-35；M-1至Q-84；M-1至L-83；M-1至E-82；M-1至A-81；M-1至R-80；M-1至L-79；M-1至S-78；M-1至A-77；M-1至L-76；M-1至D-75；M-1至G-74；M-1至Q-73；M-1至L-72；M-1至A-71；M-1至A-70；M-1至V-69；M-1至Q-68；M-1至Y-67；M-1至F-66；M-1至S-65；M-1至V-64；M-1至V-63；M-1至T-62；M-1至L-61；M-1至C-60；M-1至C-59；M-1至S-58；M-1至L-57；M-1至L-56；M-1至A-55；M-1至L-54；M-1至L-53；M-1至L-52；M-1至T-5 1；M-1至A-50；M-1至A-49；M-1至L-48；M-1至L-47；M-1至K-46；M-1至G-45；M-1至D-44；M-1至K-43；M-1至S-42；M-1至S-41；M-1至R-40；M-1至V-39；M-1至S-38；M-1至P-37；M-1至S-36；M-1至E-35；M-1至K-34；M-1至R-33；M-1至P-32；M-1至L-31；M-1至1-30；M-1至S-29；M-1至V-28；M-1至C-27；M-1至E-26；M-1至K-25；M-1至L-24；M-1至K-23；M-1至M-22；M-1至E-21；M-1至E-20；M-1至R-19；M-1至K-18；M-1至K-17；M-1至L-16；M-1至C-15；M-1至S-14；M-1至T-13；M-1至L-12；M-1至R-11；M-1至S-10；M-1至Q-9；M-1至E-8；M-1至R-7；和M-1至E-6。本发明还涉及包含或由一种多核苷酸序列组成的核酸分子，该多核苷酸序列与编码上述Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内，该多肽包含与上述氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，编码这种多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明还提供了具有缺失自Neutrokine-α多肽氨基端和羧基端的一或多个氨基酸的多肽，其可描述为具有SEQ ID NO2的n3-m3位残基，其中n3和m3为如前述的整数。
另外，由于本发明Neutrokine-αSV多肽的推定胞外域可自身激发功能活性(如生物活性)，在SEQ ID NO19的Gln73-Leu266位的多肽的推定胞外域N和C末端氨基酸缺失仍可保留一些功能活性，如配体结合，刺激淋巴细胞(如B细胞)增殖，分化和/或活化，调节细胞复制，调节靶细胞活性和/或免疫活性。然而，即使Neutrokine-αSV多肽的推定胞外域的N末端缺失一或多个氨基酸导致丧失一或多种功能活性，其它功能活性仍可保留。因此，缩短的多肽诱导和/或结合识别完整或成熟多肽或其胞外域的抗体的能力，当成熟或完整多肽或胞外域的少量残基自N末端除去时，仍可保留。缺失完整多肽N末端残基的特殊多肽是否保留这种免疫活性，可通过本文所述常规方法和本领域已知其它方法确定。
因此，本发明还提供了一种多肽和编码这种多肽的多核苷酸，该多肽具有缺失自Neutrokine-αSV氨基酸序列氨基端直至261位甘氨酸残基的一或多个残基。尤其本发明提供了包含SEQ ID NO19的n4-266氨基酸序列的多肽，其中n4是SEQ ID NO19氨基酸序列73-261氨基酸残基位中的-整数位，且261位是Neutrokine-αSV(如SEQ ID NO19所示)多肽的推定胞外域N末端的第一个残基位。
更特别地，在某些实施方案中，本发明提供了编码一种多肽的多核苷酸，该多肽包含或由选自以下一组的氨基酸序列组成SEQ IDNO19的Q-73至L-266；G-74至L-266；D-75至L-266；L-76至L-266；A-77至L-266；S-78至L-266；L79至L-266；R-80至L-266；A-81至L-266；E-82至L-266；L-83至L-266；Q-84至L-266，G-85至L-266；H-86至L-266；H-87至L-266；A-88至L-266；E-89至L-266；K-90至L-266；L-91至L-266；P-92至L-266；A-93至L-266；G-94至L-266；A-95至L-266；G-96至L-266；A-97至L-266；P-98至L-266；K-99至L-266；A-100至L-266；G-101至L-266；L-102至L-266；E-103至L-266；E-104至L-266；A-105至L-266；P-106至L-266；A-107至L-266；V-108至L-266；T-109至L-266；A-110至L-266；G-111至L-266；L-112至L-266；K-113至L-266；I-114至L-266；F-115至L-266；E-116至L-266；P-117至L-266；P-118至L-266；A-119至L-266；P-120至L-266；G-121至L-266；E-122至L-266；G-123至L-266；N-124至L-266；S-125至L-266；S-126至L-266；Q-127至L-266；N-128至L-266；S-129至L-266；R-130至L-266；N-131至L-266；K-132至L-266；R-133至L-266；A-134至L-266；V-135至L-266；Q-136至L-266；G-137至L-266；P-138至L-266；E-139至L-266；E-140至L-266；T-141至L-266；G-142至L-266；S-143至L-266；Y-144至L-266；T-145至L-266；F-146至L-266；V-147至L-266；P-148至L-266；W-149至L-266；L-150至L-266；L-151至L-266；S-152至L-266；F-153至L-266；K-154至L-266；R-155至L-266；G-156至L-266；S-157至L-266；A-158至L-266；L-159至L-266；E-160至L-266；E-161至L-266；K-162至L-266；E-163至L-266；N-164至L-266；K-165至L-266；I-166至L-266；L-167至L-266；V-168至L-266；K-169至L-266；E-170至L-266；T-171至L-266；G-172至L-266；Y-173至L-266；F-174至L-266；F-175至L-266；I-176至L-266；Y-177至L-266；G-178至L-266；Q-179至L-266；V-180至L-266；L-181至L-266；Y-182至L-266；T-183至L-266；D-184至L-266；K-185至L-266；T-186至L-266；Y-187至L-266；A-188至L-266；M-189至L-266；G-190至L-266；H-191至L-266；L-192至L-266；I-193至L-266；Q-194至L-266；R-195至L-266；K-196至L-266；K-197至L-266；V-198至L-266；H-199至L-266；V-200至L-266；F-201至L-266；G-202至L-266；D-203至L-266；E-204至L-266；L-205至L-266；S-206至L-266；L-207至L-266；V-203至L-266；T-209至L-266；L-210至L-266；F-211至L-266；R-212至L-266；C-213至L-266；I-214至L-266；Q-215至L-266；N-216至L-266；M-217至L-266；P-218至L-266；E-219至L-266；T-220至L-266；L-221至L-266；P-222至L-266；N-223至L-266；N-224至L-266；S-225至L-266；C-226至L-266；Y-227至L-266；S-228至L-266；A-229至L-266；G-230至L-266；I-231至L-266；A-232至L-266；K-233至L-266；L-234至L-266；E-235至L-266；E-236至L-266；G-237至L-266；D-238至L-266；E-239至L-266；L-240至L-266；Q-241至L-266；L-242至L-266；A-243至L-266；I-244至L-266；P-245至L-266；R-246至L-266；E-247至L-266；N-248至L-266；A-249至L-266；Q-250至L-266；I-251至L-266；S-252至L-266；L-233至L-266；D-254至L-266；G-255至L-266；D-256至L-266；V-257至L-266；T-258至L-266；F-259至L-266；F-260至L-266；和G-261至L-266。本发明还涉及包含或由一种多核苷酸序列组成的核酸分子，该多核苷酸序列与编码上述Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸序列具有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内，该多肽包含与上述氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，编码这种多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
相似地，Neutrokine-αSV的推定胞外域的C末端氨基酸直至SEQ ID NO19第79位亮氨酸的缺失可保留一些功能活性，如配体结合，刺激淋巴细胞(如B细胞)增殖，分化和/或活化，调节细胞复制，调节靶细胞活性和/或免疫原性。具有进一步SEQ ID NO19的C末端缺失包括Leu79缺失的多肽不期望能保留生物活性。
然而，即使多肽C末端缺失一或多个氨基酸导致多肽丧失一或多种功能活性(如生物活性)，其它功能活性仍可保留。因此，缩短的多肽诱导和/或结合识别完整多肽，成熟多肽或其胞外域的抗体的能力，当成熟，完整多肽或胞外域的少量残基自C末端除去时，仍可保留。缺失推定胞外域的C末端残基的特殊多肽是否保留这种免疫活性，可通过本文所述常规方法和本领域已知其它方法确定。
因此，本发明进一步提供了一种多肽和编码这种多肽的多核苷酸，该多肽具有缺失自SEQ ID NO19所示Neutrokine-αSV的推定胞外域的氨基酸序列羧基端直至79位亮氨酸的一或多个残基。尤其本发明提供了具有SEQ ID NO19所示氨基酸序列的73-m4位残基组成的氨基酸序列的多肽，其中m4是SEQ ID NO19所示氨基酸序列的79-266位氨基酸残基位中的一个整数位。
更特别地，在某些实施方案中，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含或由选自以下一组的氨基酸序列组成SEQ IDNO19的Q-73至K-264；Q-73至L-263；Q-73至A-262；Q-73至G-261；Q-73至F-260；Q-73至F-259；Q-73至T-258；Q-73至V-257；Q-73至D-256；Q-73至G-255；Q-73至D-254；Q-73至L-253；Q-73至S-252；Q-73至I-251；Q-73至Q-250；Q-73至A-249；Q-73至N-248；Q-73至E-247；Q-73至R-246；Q-73至P-240；Q-73至I-244；Q-73至A-243；Q-73至L-242；Q-73至Q-241；Q-73至L-240；Q73至E-239；Q-73至D-238；Q-73至G-237；Q-73至E-236；Q-73至E-235；Q-73至L-234；Q-73至K-233；Q-73至A-232；Q-73至I-231；Q-73至G-230；Q-73至A-229；Q-73至S-228；Q-73至Y-227；Q-73至C-226；Q-73至S-225；Q-73至N-224；Q-73至N-223Q-73至P-222；Q-73至L-221；Q-73至T-220；Q-73至E-219；Q-73至P-218；Q-73至M-217；Q-73至N-216；Q-73至Q-215；Q-73至I-214；Q-73至C-213；Q-73至R-212；Q-73至F-211；Q-73至L-210；Q-73至T-209；Q-73至V-208；Q-73至L-207；Q-73至S-206；Q-73至L-205；Q-73至E-204；Q-73至D-203；Q-73至G-202；Q-73至F-201；Q-73至V-200；Q-73至H-199；Q-73至V-198；Q-73至K-197；Q-73至K-196；Q-73至R-195；Q-73至Q-194；Q-73至I-193；Q-73至L-192；Q-73至H-191；Q-73至G-190；Q-73至Q-73；Q-73至A-188；Q-73至Y-187；Q-73至T-186；Q-73至K-185；Q-73至D-184；Q-73至T-183；Q-73至Y-182；Q-73至L-181；Q-73至V-180；Q-73至Q-179；Q-73至G-178；Q-73至Y-177；Q-73至I-176；Q-73至F-175；Q-73至F-174；Q-73至Y-173；Q-73至G-172；Q-73至T-171；Q-73至E-170；Q-73至K-169；Q-73至V-168；Q-73至L-167；Q-73至I-166；Q-73至K-165；Q-73至N-164；Q-73至E-163；Q-73至K-162；Q-73至E-161；Q-73至E-160；Q-73至L-159；Q-73至A-158；Q-73至S-157；Q-73至G-156；Q-73至R-155；Q-73至K-154；Q-73至F-153；Q-73至S-152；Q-73至L-151；Q-73至L-150；Q-73至W-149；Q-73至P-148；Q-73至V-147；Q-73至F-146；Q-73至T-145；Q-73至Y-144；Q-73至S-143；Q-73至G-142；Q-73至T-141；Q-73至E-140；Q-73至E-139；Q-73至P-138；Q-73至G-137；Q-73至Q-136；Q-73至V-135；Q-73至A-134；Q-73至R-133；Q-73至K-132；Q-73至N-131；Q-73至R-130；Q-73至S-129；Q-73至N-128；Q-73至Q-127；Q-73至S-126；Q-73至S-125；Q-73至N-124；Q-73至G-123；Q-73至E-122；Q-73至G-121；Q-73至P-120；Q-73至A-119；Q-73至P-118；Q-73至P-117；Q-73至E-116；Q-73至F-115；Q-73至I-114；Q-73至K-113；Q-73至L-112；Q-73至G-111；Q-73至A-110；Q-73至T-109；Q-73至V-108；Q-73至A-107；Q-73至P-106；Q-73至A-105；Q-73至E-104；Q-73至E-103；Q-73至L-102；Q-73至G-101；Q-73至A-100；Q-73至K-99；Q-73至P-98；Q-73至A-97；Q-73至G-96；Q-73至A-95；Q-73至G-94；Q-73至A-93；Q-73至P-92；Q-73至L-91；Q-73至K-90；Q-73至E-89；Q-73至A-88；Q-73至H-87；Q-73至H-86；Q-73至G-85；Q-73至Q-84；Q-73至L-83；Q-73至E-82；Q-73至A-81；Q-73至R-80；Q-73至L-79；以及Q-73至S-78。本发明还涉及包含或由一种多核苷酸序列组成的核酸分子，该多核苷酸序列与编码上述Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸序列具有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内，这种多肽含有与上述氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，编码这种多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明还提供了具有缺失自Neutrokine-αSV的推定胞外域氨基端和羧基端的一或多个氨基酸的多肽，其可描述为具有SEQ IDNO19的n4-m4位残基，其中n4和m4为如前述的整数。
在另一实施方案这，一核苷酸序列编码一种多肽，该多肽由ATCC保藏号203518的保藏的cDNA克隆编码的Neutrokine-αSV氨基酸序列的胞外域的一部分组成，所述胞外域的一部分不包括胞外域氨基端的1-260位氨基酸，或胞外域羧基端的1-187位氨基酸，或胞外域上述氨基端和氨基端缺失的任意组合。
如上所述，即使多肽N末端缺失一或多个氨基酸导致丧失一或多种多肽功能活性(如生物活性)，其它功能活性仍可保留。因此，当全长或成熟多肽或其胞外域的少量残基自N末端除去时，缩短的Neutrokine-αSV突变蛋白诱导和/或结合识别全长或成熟多肽或其胞外域的抗体的能力仍保留。缺失完整多肽N末端残基的特殊多肽是否保留这种免疫活性，可通过本文所述常规方法和本领域已知其它方法确定。大量缺失N末端氨基酸残基的Neutrokine-αSV突变蛋白仍保留功能(如免疫原性)活性不是不可能的。事实上，由少如6个Neutrokine-αSV氨基酸残基组成的肽也可通常引发免疫应答。
因此，本发明提供了一种多肽和编码这种多肽的多核苷酸，该多肽具有缺失自SEQ ID NO19所示Neutrokine-αSV的推定的全长氨基酸序列氨基端直至261位甘氨酸的一或多个残基。尤其本发明提供了包含SEQ ID NO19所示序列的n5-266位残基组成的氨基酸序列，其中m5是SEQ ID NO19所示氨基酸序列的1-261氨基酸残基位中的一整数位。
更特别地，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽选自以下一组的氨基酸序列SEQ ID NO19的D-2至L-266；D-3至L-266；S-4至L-266；T-5至L-266；E-6至L-266；R-7至L-266；E-8至L-266；Q-9至L-266；S-10至L-266；R-11至L-266；L-12至L-266；T-13至L-266；S-14至L-266；C-15至L-266；L-16至L-266；K-17至L-266；K-18至L-266；R-19至L-266；E-20至L-266；E-21至L-266；M-22至L-266；K-23至L-266；L-24至L-266；K-25至L-266；E-26至L-266，C-27至L-266；V-28至L-266；S-29至L-266；I-30至L-266；L-31至L-266；P-32至L-266；R-33至L-266；K-34至L-266；E-35至L-266；S-36至L-266；P-37至L-266；S-38至L-266；V-39至L-266；R-40至L-266；S-41至L-266；S-42至L-266；K-43至L-266；D-44至L-266；G-45至L-266；K-46至L-266；L-47至L-266；L-48至L-266；A-49至L-266；A-50至L-266；T-51至L-266；L-52至L-266；L-53至L-266；L-54至L-266；A-55至L-266；L-56至L-266；L-57至L-266；S-58至L-266；C-59至L-266；C-60至L-266；L-61至L-266；T-62至L-266；V-63至L-266；V-64至L-266；S-65至L-266；F-66至L-266；Y-67至L-266；Q-68至L-266；V-69至L-266；A-70至L-266；A-71至L-266；L-72至L-266；Q-73至L-266；G-74至L-266；D-75至L-266；L-76至L-266；A-77至L-266；S-78至L-266；L-79至L-266；R-80至L-266；A-81至L-266；E-82至L-266；L-83至L-266；Q-84至L-266；G-85至L-266；H-36至L-266；H-87至L-266；A-88至L-266；E-89至L-266；K-90至L-266；L-91至L-266；P-92至L-266；A-93至L-266；G-94至L-266；A-95至L-266；G-96至L-266；A-97至L-266；P-98至L-266；K-99至L-266；A-100至L-266；G-101至L-266；L-102至L-266；E-103至L-266；E-104至L-266；A-105至L-266；P-106至L-266；A-107至L-266；V-108至L-266；T-109至L-266；A-110至L-266；G-111至L-266；L-112至L-266；K-113至L-266；I-114至L-266；F-115至L-266；E-116至L-266；P-117至L-266；P-118至L-266；A-119至L-266；P-120至L-266；G-121至L-266；E-122至L-266；G-123至L-266；N-124至L-266；S-125至L-266；S-126至L-266；Q-127至L-266；N-128至L-266；S-129至L-266；R-130至L-266；N-131至L-266；K-132至L-266；R-133至L-266；A-134至L-266；V-135至L-266；Q-136至L-266；G-137至L-266；P-138至L-266；E-139至L-266；E-140至L-266；T-141至L-266；G-142至L-266；S-143至L-266；Y-144至L-266；T-145至L-266；F-146至L-266；V-147至L-266；P-148至L-266；W-149至L-266；L-150至L-266；L-151至L-266；S-152至L-266；F-153至L-266；K-154至L-266；R-155至L-266；G-156至L-266；S-157至L-266；A-158至L-266；L-159至L-266；E-160至L-266；E-161至L-266；K-162至L-266；E-163至L-266；N-164至L-266；K-165至L-266；I-166至L-266；L-167至L-266；V-168至L-266；K-169至L-266；E-170至L-266；T-171至L-266；G-172至L-266；Y-173至L-266；F-174至L-266；F-175至L-266；I-176至L-266；Y-177至L-266；G-178至L-266；Q-179至L-266；V-180至L-266；L-181至L-266；Y-182至L-266；T-183至L-266；D-184至L-266；K-185至L-266；T-186至L-266；Y-187至L-266；A-188至L-266；M-189至L-266；G-190至L-266；H-191至L-266；L-192至L-266；I-193至L-266；Q-194至L-266；R-195至L-266；K-196至L-266；K-197至L-266；V-198至L-266；H-199至L-266；V-200至L-266；F-201至L-266；G-202至L-266；D-203至L-266；E-204至L-266；L-205至L-266；S-206至L-266；L-207至L-266；V-208至L-266；T-209至L-266；L-210至L-266；F-211至L-266；R-212至L-266；C-213至L-266；1-214至L-266；Q-215至L-266；N-216至L-266；M-217至L-266；P-218至L-266；E-219至L-266；T-220至L-266；L-221至L-266；P-222至L-266；N-223至L-266；N-224至L-266；S-225至L-266；C-226至L-266；Y-227至L-266；S-223至L-266；A-229至L-266；G-230至L-266；I-231至L-266；A-232至L-266；K-233至L-266；L-234至L-266；E-235至L-266；E-236至L-266；G-237至L-266；D-238至L-266；E-239至L-266；L-240至L-266；Q-241至L-266；L-242至L-266；A-243至L-266；I-244至L-266；P-245至L-266；R-246至L-266；E-247至L-266；N-248至L-266；A-249至L-266；Q-250至L-266；I-251至L-266；S-252至L-266；U-253至L-266；D-254至L-266；G-255至L-266；D-256至L-266；V-257至L-266；T-258至L-266；F-259至L-266；F-260至L-266；以及G-261至L-266。本发明还涉及包含或由多核苷酸序列组成的核酸分子，该多核苷酸序列与编码上述Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸序列具有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内，这些多肽具有与上述氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，编码这些多肽的多核苷酸也在本发明内。
如上所述，即使蛋白质C末端缺失一或多个氨基酸导致丧失一或多种蛋白质功能活性(如生物活性)，其它功能活性仍可保留。因此，缩短的Neutrokine-αSV突变蛋白诱导和/或结合识别完整或成熟多肽或其胞外域的抗体的能力，当完整或成熟多肽或胞外域的少量残基自C末端除去时仍可保留。缺失完整多肽C末端残基的特殊多肽是否保留这种免疫活性，可通过本文所述常规方法和本领域已知其它方法确定。大量缺失C末端氨基酸残基的Neutrokine-αSV突变蛋白仍保留一些功能(如免疫原性)活性不是不可能的。事实上，由少如6个Neutrokine-αSV氨基酸残基组成的肽通常也可激发免疫应答。
因此，本发明提供了一种多肽及编码这种多肽的多核苷酸，该多肽具有缺失自SEQ ID NO19所示Neutrokine-αSV氨基酸序列羧基端直至在第6位的谷氨酸的一或多个残基。尤其本发明提供了包含SEQ ID NO19的1-m5残基氨基酸序列的多肽，其中m5是SEQ IDNO19所示氨基酸序列6-265氨基酸残基位中的一整数位。
更特别地，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含或由选自以下一组氨基酸序列组成SEQ ID NO19的M-1至G-265；M-1至G-264；L-263；M-1至A-262；M-1至G-261；M-1至F-260；M-1至F-259；M-1至T-258；M-1至V-257；M-1至D-256；M-1至G-255；M-1至D-254；M-1至L-253；M-1至S-252；M-1至I-251；M-1至Q-250；M-1至A-249；M-1至N-248；M-1至E-247；M-1至R-246；M-1至R-245；M-1至I-244；M-1至A-243；M-1至L-242；M-1至Q-241；M-1至L-240；M-1至E-239；M-1至D-238；M-1至G-237；M-1至E-236；M-1至E-235，5M-1至L-234；M-1至K-233；M-1至A-232；M-1至I-231；M-1至G-230；M-1至A-229；M-1至S-228；M-1至Y-227；M-1至C-226；M-1至S-225；M-1至N-224；M-1至N-223；M-1至P-222；M-1至L-221；M-1至T-220；M-1至E-219；M-1至P-218；M-1至M-217；M-1至N-216；M-1至Q-115；M-1至I-214；M-1至C-213；M-1至R-112；M-1至F-211；M-1至L-210；M-1至T-209；M-1至V-208；M-1至L-207；M-10至S-206；M-1至L-205；M-1至E-204；M-1至D-203；M-1至G-202；M-1至F-201；M-1至V-200；M-1至H-199；M-1至V-198；M-1至K-197；M-1至K-196；M-1至R-195；M-1至Q-194；M-1至I-193；M-1至L-192；M-1至H-191；M-1至G-190；M-1至M-189；M-1至A-188；M-1至Y-187；M-1至T-186；M-1至K-185；M-1至D-184；M-1至T-183；M-1至Y-182；M-1至L-181；M-1至V-180；M-1至Q-179；M-1至G-178；M-1至Y-177；M-1至I-176；M-1至F-175；M-1至F-174；M-1至Y-173；M-1至G-172；M-1至T-171；M-1至E-170；M-1至K-169；M-1至V-168；M-1至L-167；M-1至1-166；M-1至K-165；M-1至N-164；M-1至E-163；M-1至K-162；M-1至E-161；M-1至E-160；M-1至L-159；M-1至A-158；M-1至S-157；M-1至G-156；M-1至R-155；M-1至K-154；M-1至F-153；M-1至S-152；M-1至L-151；M-1至L-150；M-1至W-149；M-1至P-148；M-1至V-147；M-1至F-146；M-1至T-145；M-1至Y-144；M-1至S-143；M-1至G-142；M-1至T-141；M-1至E-140；M-1至E-139；M-1至P-138；M-1至G-137；M-1至Q-136；M-1至V-135；M-1至A-134；M-1至R-133；M-1至K-132；M-1至N-131；M-1至R-130；M-1至S-129；M-1至N-128；M-1至Q-127；M-1至S-126；M-1至S-125；M-1至N-124；M-1至G-123；M-1至E-122；M-1至G-121；M-11至P-120；M-1至A-119；M-1至P-118；M-1至P-117；M-1至E-116；M-1至F-110；M-1至I-114；M-1至K-113；M-1至L-112；M-1至G-111；M-1至A-110；M-1至T-109；M-1至V-108；M-1至A-107；M-1至P-106；M-1至A-105；M-1至E-104；M-1至E-103；M-1至L-102；M-1至G-101；M-1至A-100；M-1至K-99；M-1至P-98；M-1至A-97；M-1至G-96；M-1至A-95；M-1至G-94；M-1至A-93；M-1至P-92；M-1至L-91；M-1至K-90；M-1至E-89；M-1至A-88；M-1至H-87；M-1至H-86；M-1至G-85；M-1至Q-84；M-1至L-83；M-1至E-82；M-1至A-81；M-1至R-80；M-1至L-79；M-1至S-78；M-1至A-77；M-1至L-76；M-1至D-75；M-1至G-74；M-1至Q-73；M-1至L-72；M-1至A-71；M-1至A-70；M-1至V-69；M-1至Q-68；M-1至Y-67；M-1至F-66；M-1至S-65；M-1至V-64；M-1至V-63；M-1至T-62；M-1至L-61；M-1至C-60；M-1至C-59；M-1至S-58；M-1至L-57；M-1至L-56；M-1至A-55；M-1至L-54；M-1至L-53；M-1至L-52；M-1至T-51；M-1至A-50；M-1至A-49；M-1至L-48；M-1至L-47；M-1至K-46；M-1至G-45；M-1至D-44；M-1至K-43；M-1至S-42；M-1至S-41；M-1至R-40；M-1至V-39；M-1至S-38；M-1至P-37；M-1至S-36；M-1至E-35；M-1至K-34；M-1至R-33；M-1至P-32；M-1至L-31；M-1至I-30；M-1至S-29；M-1至V-28；M-1至C-27；M-1至E-26；M-1至K-25；M-1至L-24；M-1至K-23；M-1至M-22；M-1至E-21；M-1至E-20；M-1至R-19；M-1至K-18；M-1至K-17；M-1至L-16；M-1至C-15；M-1至S-14；M-1至T-13；M-1至L-12；M-1至R-11；M-1至S-10；M-1至Q-9；M-1至E-8；M-1至R-7；和M-1至E-6。本发明还涉及包含或由多核苷酸序列组成的核酸分子，该多核苷酸序列与编码上述Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸序列具有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内，这些多肽包含与上述氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，编码这些多肽的多核苷酸也在本发明内。
本发明还提供了具有缺失自Neutrokine-αSV多肽氨基端和羧基端的一或多个氨基酸的多肽，其可描述为具有SEQ ID NO19的n5-m5残基，其中n5和m5是上述的整数。
在另外的实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO2的134-m6位残基的氨基酸序列的多肽，其中m6是SEQ ID NO2所示序列140-285位氨基酸残基中的一整数。例如本发明提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含或由选自以下一组氨基酸序列组成SEQ ID NO2的A-134至Leu-285；A-134至L-284；A-134至K-283；A-134至L-282；A-134至A-281；A-134至G-280；A-134至F-279；A-134至F-278；A-134至T-277；A-134至V-276；A-134至D-275；A-134至G-274；A-134至D-273；A-134至L-272；A-134至S-271；A-134至I-270；A-134至Q-269；A-134至A-268；A-134至N-267；A-134至E-266；A-134至R-265；A-134至P-264；A-134至I-263；A-134至A-262；A-134至L-261；A-134至Q-260；A-134至L-239；A-134至E-258；A-134至D-257；A-134至G-256；A-134至E-255；A-134至E-254；A-134至L-253；A-134至K-252；A-134至A-251；A-134至I-250；A-134至G-249；A-134至A-248；A-134至S-247；A-134至Y-246；A-134至C-245；A-134至S-244；A-134至N-243；A-134至N-242；A-134至P-241；A-134至L-240；A-134至T-239；A-134至E-238；A-134至P-237；A-134至M-236；A-134至N-235；A-134至Q-234；A-134至I-233；A-134至C-232；A-134至R-231；A-134至F-230；A-134至L-229；A-134至T-228；A-134至V-227；A-134至L-226；A-134至S-225；A-134至L-224；A-134至E-223；A-134至D-222；A-134至G-221；A-134至F-220；A-134至V-219；A-134至H-218；A-134至V-217；A-134至K-216；A-134至K-215；A-134至R-214；A-134至Q-213；A-134至I-212；A-134至L-211；A-134至H-210；A-134至G-209；A-134至M-208；A-134至A-207；A-134至Y-206；A-134至T-205；A-134至K-204；A-134至D-203；A-134至T-202；A-134至Y-201；A-134至L-200；A-134至V-199；A-134至Q-198；A-134至G-197；A-134至Y-196；A-134至I-195；A-134至F-194；A-134至F-193；A-134至Y-192；A-134至G-191；A-134至T-190；A-134至E-189；A-134至K-188；A-134至V-187；A-134至L-186；A-134至I-185；A-134至K-184；A-134至N-183；A-134至E-182；A-134至K-181；A-134至E-180；A-134至E-179；A-134至L-178；A-134至A-177；A-134至S-176；A-134至G-175；A-134至R-174；A-134至K-173；A-134至F-172；A-134至S-171；A-134至L-170；A-134至L-169；A-134至W-168；A-134至P-167；A-134至V-166；A-134至F-165；A-134至T-164；A-134至Y-163；A-134至S-162；A-134至G-161；A-134至K-160；A-134至Q-159；A-134至I-158；A-134至T-157；A-134至P-156；A-134至T-155；A-134至E-154；A-134至S-153；A-134至D-152；A-134至A-151；A-134至I-150；A-134至L-149；A-134至Q-148；A-134至L-147；A-134至C-146；A-134至D-145；A-134至Q-144；A-134至T-143；A-134至V-142；A-134至T-141；以及A-134至E-140。本发明还涉及包含或由一种多核苷酸序列组成的核酸分子，该多核苷酸与编码上述Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的多核苷酸序列具有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性。本发明还涵盖了融合于异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸和/或多核苷酸序列编码的多肽也涵盖在本发明内，这些多肽具有与上述氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，编码这些多肽的多核苷酸也在本发明内容。
本发明其它优选的多肽片段包含或由选自以下一组氨基酸序列组成SEQ ID NO2的M-1至C-15；D-2至L-16；D-3至K-17；S-4至K-18；T-5至R-19；E-6至E-20；R-7至E-21；E-8至M-22；Q-9至K-23；S-10至L-24；R-11至K-25；L-12至E-26；T-13至C-27；S-14至V-28；C-15至S-29；L-16至I-30；K-17至L-31；K-18至P-32；R-19至R-33；E-20至K-34；E-21至E-35；M-22至S-36；K-23至P-37；L-24至S-38；K-25至V-39；E-26至R-40；C-27至S-41；V-28至S-42；S-29至K-43；I-30至D-44；L-31至G-45；P-32至K-46；R-33至L-47；K-34至L-48；E-35至A-49；S-36至A-50；P-37至T-51；S-38至L-52；V-39至L-53；R-40至L-54；S-41至A-55；S-42至L-56；K-43至L-57；D-44至S-58；G-45至C-59；K-46至C-60；L-47至L-61；L-48至T-62；A-49至V-63；A-50至V-64；T-51至S-65；L-52至F-66；L-53至Y-67；L-54至Q-68；A-55至V-69；L-56至A-70；L-57至A-71；S～58至L-72；C-59至Q-73；C-60至G-74；L-61至D-75；T-62至L-76；V-63至A-77；V-64至S-78；S-65至L-79；F-66至R-80；Y-67至A-81；Q-68至E-82；V-69至L-83；A-70至Q-84；A-71至G-85；L-72至H-86；Q-73至H-87；G-74至A-88；D-75至E-89；L-76至K-90；A-77至L-91；S-78至P-92；L-79至A-93；R-80至G-94；A-81至A-95；E-82至G-96；L-83至A-97；Q-84至P-98；G-85至K-99；H-86至A-100；H-87至G-101；A-83至L-102；E-89至E-103；K-90至E-104；L-91至A-105；P-92至P-106；A-93至A-107；G-94至V-108；A-95至T-109；G-96至A-110；A-97至G-111；P-98至L-112；K-99至K-113；A-100至I-114；G-101至F-115；L-102至E-116；E-103至P-I17；E-104至P-118；A-105至A-119；P-106至P-120；A-107至G-121；V-103至E-122；T-109至G-123；A-110至N-124；G-111至S-125；L-112至S-126；K-113至Q-127；I-114至N-128；F-110至S-129；E-116至R-130；P-117至N-131；P-118至K-132；A-119至R-133；P-120至A-134；G-121至V-135；E-122至Q-136；G-123至G-137；N-124至P-138；S-125至E-139；S-126至E-140；Q-127至T-141；N-123至V-142；S-129至T-143；R-130至Q-144；N-131至D-145；K-132至C-146；R-133至L-147；A-134至Q-148；V-135至L-149；Q-136至I-150；G-137至A-151；P-138至D-152；E-139至S-153；E-140至E-154；T-141至T-155；V-142至P-156；T-143至T-157；Q-144至I-158；D-145至Q-159；C-146至K-160；L-147至G-161；Q-148至S-162；L-149至Y-163；I-150至T-164；A-151至F-165；D-152至V-166；S-153至P-167；E-154至W-168；T-155至L-169；P-156至L-170；T-157至S-171；I-158至F-172；Q-159至K-173；K-160至R-174；G-161至G-175；S-162至S-176；Y-163至A-177；T-164至L-178；F-165至E-179；V-166至E-180；P-167至K-181；W-168至E-182；L-169至N-183；L-170至K-184；S-171至iI-185；F-172至L-186；K-173至V-187；R-174至K-188；G-175至E-189；S-176至T-190；A-177至G-191；L-178至Y-192；E-179至F-193；E-180至F-194；K-181至I-195；E-182至Y-196；N-183至G-197；K-184至Q-198；I-185至V-199；L-186至L-200；V-187至Y-201；K-188至T-202；E-189至D-203；T-190至K-204；G-191至T-205；Y-192至Y-206；F-193至A-207；F-194至M-208；I-195至G-209；Y-196至H-210；G-197至L-211；Q-198至I-212；V-199至Q-213；L-200至R-214；Y-201至K-215；T-202至K-216；D-203至V-217；K-204至H-218；T-205至V-219；Y-206至F-220；A-207至G-221；M-208至D-222；G-209至E-223；H-210至L-224；L-211至S-225；I-212至L-226；Q-213至V-227；R-214至T-228；K-215至L-229；K-216至F-230；V-217至R-231；H-218至C-232；V-219至I-233；F-220至Q-234；G-221至N-235；D-222至M-236；E-223至P-237；L-224至E-238；S-225至T-239；L-226至L-240；V-227至P-241；T-228至N-242；L-229至N-243；F-230至S-244；R-231至C-245；C-232至Y-246；I-233至S-247；Q-234至A-248；N-235至G-249；M-236至1-250；P-237至A-251；E-238至K-252；T-239至L-253；L-240至E-254；P-241至E-255；N-242至G-256；N-243至D-257；S-244至E-258；C-245至L-259；Y-246至Q-260；S-247至L-261；A-248至A-262；G-249至I-263；I-250至P-264；A-251至R-265；K-252至E-266；L-253至N-267；E-254至A-268；E-255至Q-269；G-256至I-270；D-257至S-271；E-258至L-272；L-259至D-273；Q-260至G-274；L-261至D-275；A-262至V-276；I-263至T-277；P-264至F-278；R-265至F-279；E-266至G-280；N-267至A-281；A-268至L-282；Q-269至K-283；I-270至L-284；和S-271至L-285。优选地，这些多肽片段具有本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的一或多种功能活性(如生物活性，抗原性和免疫原性)，且可例如用于产生或筛选抗体，如下所述。本发明还涉及包含或由与上述氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列组成。本发明还涵盖了融合于异源氨基酸序列的上述氨基酸序列。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明其它优选的多肽片段包含或由选自以下一组氨基酸序列组成SEQ ID NO19的M-1至C-15；D-2至L-16；D-3至K-17；S-4至K-18；T-5至R-19；E-6至E-20；R-7至E-21；E-8至M-22；Q-9至K-23；S-10至L-24；R-11至K-25；L-12至E-26；T-13至C-27；S-14至V-28；C-15至S-29；L-16至I-30；K-17至L-31；K-18至P-32；R-19至R-33；E-20至K-34；E-21至E-35；M-22至S-36；K-23至P-37；L-24至S-38；K-25至V-39；E-26至R-40；C-27至S-41；V-28至S-42；S-29至K-43；I-30至D-44；L-31至G-45；P-32至K-46；R-33至L-47；K-34至L-48；E-35至A-49；S-36至A-50；P-37至T-51；S-38至L-52；V-39至L-53；R-40至L-54；S-41至A-55；S-42至L-56；K-43至L-57；D-44至S-58；G-43至C-59；K-46至C-60；L-47至L-61；L-48至T-62；A-49至V-63；A-50至V-64；T-51至S-65；L-52至F-66；L-53至Y-67；L-54至Q-68；A-55至V-69；L-56至A-70；L-57至A-71；S-58至L-72；C-59至Q-73；C-60至G-74；L-61至D-73；T-62至L-76；V-63至A-77；V-64至S-78；S-65至L-79；F-66至R-80；Y-67至A-81；Q-68至E-82；V-69至L-83；A-70至Q-84；A-71至G-85；L-72至H-86；Q-73至H-87；G-74至A-88；D-75至E-89；L-76至K-90；A-77至L-91；S-78至P-92；L-79至A～93；R-80至G-94；A-81至A-95；E-82至G-96；L-83至A-97；Q-84至P-98；G-85至K-99；H-86至A-100；H-87至G-101；A-88至L-102；E-89至E-103；K-90至E-104；L-91至A-105；P-92至P-106；A-93至A-107；G-94至V-108；A-95至T-109；G-96至A-110；A-97至G-111；P-98至L-112；K-99至K-113；A-100至I-114；G-101至F-115；L-102至E-116；E-103至P-117；E-104至P-118；A-105至A-119；P-106至P-120；A-107至G-121；V-108至E-122；T-109至G-123；A-110至N-124；G-111至S-125；L-112至S-126；K-113至Q-127；I-114至N-128；F-115至S-129；E-116至R-130；P-I17至N-131；P-118至K-132；A-119至R-133；P-120至A-134；G-121至V-135；E-122至Q-136；G-123至G-137；N-124至P-138；S-125至E-139；S-126至E-140；Q-127至T-141；N-128至G-142；S-129至S-143；R-130至Y-144；N-131至T-145；K-132至F-146；R-133至V-147；A-134至P-148；V-135至W-149；Q-136至L-150；G-137至L-151；P-138至S-152；E-139至F-153；E-140至K-154；T-141至R-155；G-142至G-156；S-143至S-157；Y-144至A-158；T-145至L-159；F-146至E-160；V-147至E-161；P-148至K-162；W-149至E-163；L-150至N-164；L-151至K-165；S-152至I-166；F-153至L-167；K-154至V-168；R-155至K-169；G-156至E-170；S-157至T-171；A-158至G-172；L-159至Y-173；E-160至F-174；E-161至F-175；K-162至I-176；E-163至Y-177；N-164至G-178；K-165至Q-179；I-166至V-180；L-167至L-181；V-168至Y-182；K-169至T-183；E-170至D-184；T-171至K-185；G-172至T-186；Y-173至Y-187；F-174至A-188；F-175至M-189；I-176至G-190；Y-177至H-191；G-178至L-192；Q-179至I-193；V-180至Q-194；L-181至R-195；Y-182至K-196；T-183至K-197；D-184至V-198；K-185至H-199；T-186至V-200；Y-187至F-201；A-188至G-202；M-189至D-203；G-190至E-204；H-191至L-205；L-192至S-206；I-193至L-207；Q-194至V-208；R-195至T-209；K-196至L-210；K-197至F-211；V-198至R-212；H-199至C-213；V-200至I-214；F-201至Q-213；G-202至N-216；D-203至M-217；E-204至P-218；L-205至E-219；S-206至T-220；L-207至L-221；V-208至P-222；T-209至N-223；L-210至N-224；F-211至S-225；R-212至C-226；C-213至Y-227；I-214至S-228；Q-215至A-229；N-216至G-230；M-217至I-231；P-218至A-232；E-219至K-233；T-220至L-234；L-221至E-235；P-222至E-236；N-223至G-237；N-224至D-238；S-225至E-239；C-226至L-240；Y-227至Q-241；S-228至L-242；A-229至A-243；G-230至I-244；I-231至P-245；A-232至R-246；K-233至E-247；L-234至N-24S；E-235至A-249；E-236至Q-250；G-237至I-251；D-238至S-252；E-239至L-253；L-240至D-254；Q-241至G-250；L-242至D-256；A-243至V-257；I-244至T-258；P-245至F-259；R-246至F-260；E-247至G-261；N-248至A-262；A-249至L-263；Q-250至K-264；I-251至L-265；以及S-252至L-266。优选地，这些多肽片段具有本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的一或多种功能活性(如生物活性，抗原性和免疫原性)，且可例如用于产生或筛选抗体，如下所述。本发明还涉及包含或由与上述氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列组成的多肽。本发明还涵盖了融合于异源氨基酸序列的上述氨基酸序列。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明其它优选的多肽片段包含或由选自以下一组氨基酸序列组成SEQ ID NO38的M-1至F-15；D-2至C-16；E-3至S-17；S-4至E-18；A-5至K-19；K-6至G-20；T7至E-21；L-8至D-22；P-9至M-23；P-10至K-24；P-11至V-25；C-12至G-26；L-13至Y-27；C-14至D-28；F-15至P-29；C-16至I-30；S-17至T-31；E-18至P-32；K-19至Q-33；G-20至K-34；E-21至E-35；D-22至E-36；M-23至G-37；K-24至A-38；V-25至W-39；G-26至F-40；Y-27至G-41；D-28至I-42；P-29至C-43；I-30至R-44；T-31至D-45；P-32至G-46；Q-33至R-47；K-34至L-48；E-35至L-49；E-36至A-50；G-37至A-51；A-38至T-52；W-39至L-53；F-40至L-54；G-41至L-55；I-42至A-56；C-43至L-57；R-44至L-58；D-45至S-59；G-46至S-60；R-47至S-61；L-48至F-62；L-49至T-63；A-50至A-64；A-51至M-65；T-52至S-66；L-53至L-67；L-54至Y-68；L-55至Q-69；A-56至L-70；L-57至A-71；L-58至A-72；S-59至L-73；S-60至Q-74；S-61至A-73；F-62至D-76；T-63至L-77；A-64至M-78；M-65至N-79；S-66至L-80；L-67至R-81；Y-68至M-82；Q-69至E-83；L-70至L-84；A-71至Q-85；A-72至S-86；L-73至Y-87；Q-74至R-88；A-75至G-89；D-76至S-90；L-77至A-91；M-78至T-92；N-79至P-93；L-80至A-94；R-81至A-95；M-82至A-96；E-83至G-97；L-84至A-98；Q-85至P-99；S-86至E-100；Y-87至L-101；R-88至T-102；G-89至A-103；S-90至G-104；A-91至V-105；T-92至K-106；P-93至L-107；A-94至L-108；A-93至T-109；A-96至P-110；G-97至A-111；A-98至A-112；P-99至P-113；E-100至R-114；L-101至P-115；T-102至H-116；A-103至N-117；G-104至S-118；V-105至S-119；K-106至R-120；L-107至G-121；L-108至H-122；T-109至R-123；P-110至N-124；A-111至125；A-112至R-126；P-113至A-127；R-114至F-128；P-115至Q-129；H-116至G-130；N-117至P-131；S-118至E-132；S-119至E-133；R-120至T-134；G-121至E-135；H-122至Q-136；R-123至D-137；N-124至V-138；R-125至D-139；R-126至L-140；A-127至S-141；F-128至A-142；Q-129至P-143；G-130至P-144；P-131至A-145；E-132至P-146；E-133至C-147；T-134至L-148；E-135至P-149；Q-136至G-150；D-137至C-151；V-138至R-152；D-139至H-153；L-140至S-154；S-141至Q-105；A-142至H-156；P-143至D-157；P-144至D-158；A-145至N-159；P-146至G-160；C-147至M-161；L-148至N-162；P-149至L-163；G-150至R-164；C-151至I-165；R-152至I-166；H-153至I-167；S-154至Q-168；Q-155至D-169；H-156至C-170；D-157至L-171；D-158至Q-172；N-159至L-173；G-160至I-174；M-161至175；N-162至D-176；L-163至S-177；R-164至D-178；N-165至T-179；I-166至P-180；I-167至A-181；Q-163至L-182；D-169至E-183；C-170至E-184；L-171至K-185；Q-172至E-186；L-173至N-187；I-174至K-188；A-175至I-189；D-176至V-191；S-177至V-191；D-178至R-192；T-179至Q-193；P-180至T-194；A-181至G-195；L-182至Y-196；E-183至F-197；E-184至F-198；K-185至I-199；E-186至Y-200；N-187至S-201；K-188至Q-202；I-189至V-203；V-190至L-204；V-191至Y-205；R-192至T-206；Q-193至D-207；T-194至P-203；G-195至I-209；Y-196至F-210；F-197至A-211；F-198至M-212；I-199至G-213；Y-200至H-214；S-201至V-215；Q-202至I-216；V-203至Q-217；L-204至R-218；Y-205至K-219；T-206至K-220；D-207至V-221；P-208至H-222；I-209至V-223；F-210至F-224；A-211至G-225；M-212至D-226；G-213至E-227；H-214至L-228；V-215至S-229；I-216至L-230；Q-217至V-231；R-218至T-232；K-219至L-233；K-220至F-234；V-221至R-235；H-222至C-236；V-223至1-237；F-224至Q-238；G-225至N-239；D-226至M-240；E-227至P-241；L-228至K-242；S-229至T-243；L-230至L-244；V-231至P-245；T-232至N-246；L-233至N-247；F-234至S-248；R-235至C-249；C-236至Y-250；I-237至S-250；Q-238至A-252；N-239至G-253；M-240至I-254；P-241至A-253；K-242至R-256；T-243至L-257；L-244至E-253；P-245至E-259；N-246至G-260；N-247至D-261；S-248至E-262；C-249至I-263；Y-250至Q-264；S-251至L-265；A-252至A-266；G-253至I-267；I-234至P-268；A-255至R-269；R-256至E-270；L-257至N-271；E-258至A-272；E-259至Q-273；G-260至I-274；D-261至S-275；E-262至R-276；I-263至N-277；Q-264至G-278；L-265至D-279；A-266至D-280；I-267至T-281；P-268至F-282；R-269至F-283；E-270至G-284；N-271至A-285；A-272至L-286；Q-273至K-287；I-274至L-288；以及S-275至L-289。优选地，这些多肽片段具有本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的一或多种活性，且可以例如用于产生或筛选抗体，如下所述。本发明还涉及包含或由与上述氨基酸序列有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列组成的多肽。本发明还涵盖了融合于异源氨基酸序列的上述氨基酸序列。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本领域技术人员意识到一些Neutrokine-α和Neutrokine-αSV多肽的氨基酸序列可以改变而不明显影响多肽的结构或功能。如果这种序列差异是期望的，应记得存在确定多肽活性的关键区域。
因此，本发明还提供了Neutrokine-α多肽的变体，其呈现Neutrokine-α多肽的功能活性(如生物活性)或其包括Neutrokine-α多肽的区域，如本文所述的多肽片段。本发明还包括Neutrokine-αSV多肽的变体，其呈现Neutrokine-αSV多肽的功能活性(如生物活性)，或其包括Neutrokine-αSV多肽的区域，如本文所述的多肽片段。这种突变体包括根据本领域已知一般规则而选择的插入，缺失，转换，重复和模式取代，因此对活性影响较小。例如，关于怎样产生表型沉默氨基酸取代的指导见于Bowie，J.U.等，“耐受氨基酸取代的蛋白质序列中信息释义”，科学2471306-1310(1990).其中作者指出有二种主要方法研究氨基酸序列对变化的耐受性。第一种方法依赖于进化过程，其中突变是通过自然选择而接受或排斥的。第二种方法是用基因工程在克隆的基因的特异位置进行氨基酸变化，并进行选择或筛选以鉴别保持功能性的序列。
如作者所述，这些研究已证实蛋白质令人惊奇地耐受氨基酸取代。作者还指出氨基酸变化在蛋白质的一些位置是允许的。例如，大多数隐蔽氨基酸残基要求非极性侧链，而表面侧链通常是保守的。其它这种表型沉默取代见于Bowie，J.U.等，如前，及本文所示参考文献所述。显而易见的保守取代是脂族氨基酸Ala，Val，Leu和Ile之间的置换；羟基残基Ser和Thr之间的互换，酸性残基Asp和Glu之间的交换，酰胺残基Asn和Gln之间的取代，碱性残基Lys和Arg之间的交换，及芳香族残基Phe，Tyr之间的置换。
因此，图1A和1B(SEQ ID NO2)所示多肽或保藏cDNA质粒编码的多肽的片段，衍生物或类似物可以是如下的一种(i)其中一或多个氨基酸残基用保守的或非保守的氨基酸残基取代(优选保守的氨基酸残基)，且这种取代的氨基酸残基可以或不是由遗传密码编码的；(ii)其中一或多个氨基酸残基包括一取代基；或(iii)其中多肽的胞外域与另一化合物融合，如提高多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)其中其它氨基酸与多肽胞外域融合，如IgG FC融合区肽或前导或分泌序列或用于纯化多肽胞外域的序列或前蛋白序列。这种片段，衍生物和类似物被本领域技术人员根据本文教导认为在本发明范围内。
另外，图5A和5B(SEQ ID NO19)所示的或由保藏cDNA质粒编码的多肽的片段，衍生物或类似物可以是这样的一种(i)其中一或多个氨基酸残基用保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代，且这种取代的氨基酸残基可以或不是由遗传密码编码的，或(ii)其中一或多个氨基酸残基包括一取代基，或(iii)其中多肽的胞外域与另一化合物融合，如提高多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或(iv)其中其它氨基酸与多肽的胞外域融合，如其它TNF配体家族成员(如CD40配体)的可溶生物活性片段，IgGFC融合区肽或前导或分泌序列，或用于纯化多肽胞外域的序列或前蛋白序列。这种片段，衍生物和类似物被本领域技术人员根据本文教导认为在本发明范围内。
因此，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽可包括一或多个氨基酸取代，缺失或添加，其经天然突变或人为操纵。如上所述，变化优选是较小的，如基本不影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸取代(见表2)。
表2保守氨基酶取代
在本发明的一实施方案中，多肽包含或由Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的氨基酸序列组成，该Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的氨基酸序列含有至少1个但不超过50个，优选不超过40个，更优选不超过30个，尤为优选不超过20个保守氨基酸取代。当然最优选的是含有至少1个但不超过10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个保守氨基酸取代。
例如，在Neutrokine-α的氨基酸水平的定点诱变可通过用保守取代基置换特殊的氨基酸而进行。SEQ ID NO2所示Neutrokine-α氨基酸序列中优选的保守取代突变包括用A，G，I，L，S，T或V取代M1；用A，G，I，L，T，或V置换M1；用E置换D2；用E置换D3；用A，G，I，L，T，M或V置换S4；用A，G，I，L，S，M或V置换T5；用D置换E6；用H，或K置换R7；用D置换E8；用N置换Q9；用A，G，I，L，T，或V置换S10；用H，或K置换R11；用A，G，I，S，T，M或V置换L12；用A，G，I，L，S，M或V置换T13；用A，G，I，L，T，M或V置换S14；用A，G，I，S，T，M或V置换L16；用H，或R置换K17；用H，或R置换K18；用H，或K置换R19；用D置换E20；用D置换E21；用A，G，I，L，S，T，置换M22；用H，或R置换K23；用A，G，I，S，T，M或V置换L24；用H，或R置换K25；用D置换E26；用A，G，I，L，S，T或M置换V28；用A，G，I，L，T，M或V置换S29；用A，G，L，S，T，M或V置换I30；用A，G，I，S，T，M或V置换L31；用H，或K置换R33；；用H，或R置换K34；用D置换E35；用A，G，I，L，T，M或V置换S36；用A，G，I，L，T，M或V置换S38；用A，G，I，L，S，T或M置换V39；用H，或K置换R40；用A，G，I，L，T，M或V置换S41；用A，G，I，L，T，M或V置换S42；用H，或R置换K43；用E置换D44；用A，I，L，S，T，M或V置换G45；用H，或R置换K46；用A，G，I，S，T，M或V置换L47；用A，G，I，S，T，M或V置换L48；用G，I，L，S，T，M或V置换A49；用G，I，L，S，T，M或V置换A50；用A，G，I，L，S，M或V置换T5 1；用A，G，I，S，T，M，或V置换L52；用A，G，I，S，T，M或V置换L53；用A，G，I，S，T，M或V置换L54；用G，I，L S，T，M或V置换A55；用A，G，I，S，T，M或V置换L56；用A，G，I，S，T，M或V置换L57；用A，G，I，L，T，或V置换S58；用A，G，I，L，S，T，M或V置换L61；用A，G，I，L，S，M或V置换T62；用A，G，I，L，S，T，或M置换V63；用A，G，I，L，S，T，或M置换V64；用A，G，I，L，T，M，或V置换S65；用W，或Y置换F66；用F，或W置换Y67；用N置换Q68；用A，G，I，L，S，T，或M置换V69；用G，I，L S，T，M或V置换A70；用G，I，L S，T，M或V置换A71；用A，G，I，S，T，M或V置换L72；用N置换Q73；用A，I，L，S，T，M或V置换G74；用E置换D75；用A，G，I，S，T，M或V置换L76；用G，I，L，S，T，M或V置换A77；用A，G，I，L，T，M或V置换S78；用A，G，I，S，T，M或V置换L79；用H，或K置换R80；用G，I，L，S，T，M或V置换A81；用D置换E82；用A，G，I，S，T，M或V置换L83；用N置换Q84；用A，I，L，S，T，M或V置换G85；用K或R置换H86；用K或R置换H87；用G，I，L S，T，M或V置换A88；用D置换E89；用H或R置换K90；用A，G，I，S，T，M或V置换L91；用G，I，LS，T，M或V置换A93；用A，I，L，S，T，M或V置换G94；用G，I，LS，T，M或V置换A95；用A，I，L，S，T，M或V置换G96；用G，I，L S，T，M或V置换A97；用H或R置换K99；用G，I，LS，T，M或V置换A100；用A，I，L，S，T，M或V置换G101；用A，G，I，S，T，M或V置换L102；用D置换E103；用D置换E104；用G，I，LS，T，M或V置换A105；用G，I，LS，T，M或V置换A107；用A，G，I，L，S，T或M置换V108；用A，G，I，L，S，M或V置换T109；用G，I，LS，T，M或V置换A110；用A，I，L，S，T，M或V置换G111；用A，G，I，S，T，M或V置换L112；用H或R置换K113；用A，G，L，S，T，M或V置换I114；用W或Y置换F115；用D置换E116；用G，I，L S，T，M或V置换A119；用A，I，L，S，T，M或V置换G121；用D置换E122；用A，I，L，S，T，M或V置换G123；用Q置换N124；用A，G，I，L，T，M或V置换S125；用A，G，I，L，T，M或V置换S126；用N置换Q127；用Q置换N128用A，G，I，L，T，M或V置换S129；用H，或K置换R130；用Q置换N131；用H或R置换K132；用H，或K置换R133；用G，I，LS，T，M或V置换A134；用A，G，I，L，S，T或M置换V135；用N置换Q136；用A，I，L，S，T，M或V置换G137；用D置换E139；用D置换E140；用A，G，I，L，S，M或V置换T141；用A，G，I，L，S，T或M置换V142；用A，G，I，L，S，M或V置换T143；用N置换Q144；用E置换D145；用A，G，I，S，T，M或V置换L147；用N置换Q148；用A，G，I，S，T，M或V置换L149；用A，G，L，S，T，M或V置换I150；用G，I，LS，T，M或V置换A15 1；用E置换D152；用A，G，I，L，T，M或V置换S153；用D置换E154；用A，G，I，L，S，M或V置换T155；用A，G，I，L，S，M或V置换T157；用A，G，L，S，T，M或V置换I158；用N置换Q159；用H或R置换K160；用A，I，L，S，T，M或V置换G161；用A，G，I，L，T，M或V置换S162；用F或W置换Y163；用A，G，I，L，S，M或V置换T164；用W或Y置换F165；用A，G，I，L，S，T或M置换V166；用F或Y置换W168；用A，G，I，S，T，M或V置换L169；用A，G，I，S，T，M或V置换L170；用A，G，I，L，T，M或V置换S171；用W或Y置换F172；用H或R置换K173；用H或K置换R174；用A，I，L，S，T，M或V置换G175；用A，G，I，L，T，M或V置换S176；用G，I，LS，T，M或V置换A177；用A，G，I，S，T，M或V置换L178；用D置换E179；用D置换E180；用H或R置换K181；用D置换E182；用Q置换N183；用H或R置换K184；用A，G，L，S，T，M或V置换I185；用A，G，I，S，T，M或V置换L186；用A，G，I，L，S，T或M置换V187；用H或R置换K188；用D置换E189；用A，G，I，L，S，M或V置换T190；用A，I，L，S，T，M或V置换G191；用F或W置换Y192；用W或Y置换F193；用W或Y置换F194；用A，G，L，S，T，M或V置换I195；用F或W置换Y196；用A，I，L，S，T，M或V置换G197；用N置换Q198；用A，G，I，L，S，T或M置换V199；用A，G，I，S，T，M或V置换L200；用F或W置换Y201；用A，G，I，L，S，M或V置换T202；用E置换D203；用H或R置换K204；用A，G，I，L，S，M或V置换T205；用F或W置换Y206；用G，I，L S，T，M或V置换A207；用A，G，I，L，S，T或V置换M208；用A，I，L，S，T，M或V置换G209；用K或R置换H210；用A，G，I，S，T，M或V置换L211；用A，G，L，S，T，M或V置换I212；用N置换Q213；用H或K置换R214；用H或R置换K215；用H或R置换K216；用A，G，I，L，S，T或M置换V217；用K或R置换H218；用A，G，I，L，S，T或M置换V219；用W或y置换F220；用A，I，L，S，T，M或V置换G221；用E置换D222；用D置换E223；用A，G，I，S，T，M或V置换L224；用A，G，I，L，T，M或V置换S225；用A，G，I，S，T，M或V置换L226；用A，G，I，L，S，T或M置换V227；用A，G，I，L，S，M或V置换T228；用A，G，I，S，T，M或V置换L229；用W或Y置换F230；用H或K置换R231；用A，G，L，S，T，M或V置换I233；用N置换Q234；用Q置换N235；用A，G，I，L，S，T或V置换M236；用D置换E238；用A，G，I，L，S，M或V置换T239；用A，G，I，S，T，M或V置换L240；用Q置换N242；用Q置换N243；用A，G，I，L，T，M或V置换S244；用F或W置换Y246；用A，G，I，L，T，M或V置换S247；用G，I，LS，T，M或V置换A248；用A，I，L，S，T，M或V置换G249；用A，G，L，S，T，M或V置换I250；用G，I，L S，T，M或V置换A251；用H或R置换K252；；用A，G，I，S，T，M或V置换L253；用D置换E254；用D置换E255；用A，I，L，S，T，M或V置换G256；用E置换D257；用D置换E258；用A，G，I，S，T，M或V置换L259；用N置换Q260；用A，G，I，S，T，M或V置换L261；用G，I，LS，T，M或V置换A262；用A，G，L，S，T，M或V置换I263；用H或K置换R265；用D置换E266；用Q置换N267；用G，I，L，S，T，M或V置换A268；用N置换Q269；用A，G，L，S，T，M或V置换I270；用A，G，I，L，T，M或V置换S271；用A，G，I，S，T，M或V置换L272；用E置换D273；用A，I，L，S，T，M或V置换G274；用E置换D275；用A，G，I，L，S，T或M置换V276；用A，G，I，L，S，M或V置换T277；用W或Y置换F278；用W或Y置换F279；用A，I，L，S，T，M或V置换G280；用G，I，LS，T，M或V置换A281；用A，G，I，S，T，M或V置换L282；用H或R置换K283；用A，G，I，S，T，M或V置换L284；和/或用A，G，I，S，T，M或V置换L285。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。对所得本发明Neutrokine-α蛋白质可进行常规筛选Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质(如增强或降低的稳定性和/或溶解性)。优选地，本发明所得蛋白质具有提高和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性。更优选地，本发明所得Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白具有一种以上提高和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质。
在另一实施方案中，在Neutrokine-αSV氨基酸水平的定点诱变可通过用保守取代基置换特定氨基酸而进行。SEQ ID NO19所示Neutrokine-αSV氨基酸序列的优选保守取代突变包括用A，G，I，L，S，T或V置换M1；用E置换D2；用E置换D3；用A，G，I，L，T，M或V置换S4；用A，G，I，L，S，M或V置换T5；用D置换E6；用H或K置换R7；用D置换E8；用N置换Q9；用A，G，I，L，T，M或V置换S10；用H或K置换R11；用A，G，I，S，T，M或V置换L12；用A，G，I，L，S，M或V置换T13；用A，G，I，L，T，M或V置换S14；用A，G，I，S，T，M或V置换L16；用H或R置换K17；用H或R置换K18；用H或K置换R19；用D置换E20；用D置换E21；用A，G，I，L，S，T或V置换M22；用H或R置换K23；用A，G，I，S，T，M或V置换L24；用H或R置换K25；用D置换E26；用A，G，I，L，S，T或M置换V28；用A，G，I，L，T，M或V置换S29；用A，G，L，S，T，M或V置换I30；用A，G，I，S，T，M或V置换L31；用H或K置换R33；用H或R置换K34；用D置换E35；用A，G，I，L，T，M或V置换S36；用A，G，I，L，T，M或V置换S38；用A，G，I，L，S，T或M置换V39；用H或K置换R40；用A，G，I，L，T，M或V置换S41；用A，G，I，L，T，M或V置换S42；用H或R置换K43；用E置换D44；用A，I，L，S，T，M或V置换G45；用H或R置换K46；用A，G，I，S，T，M或V置换L47；用A，G，I，S，T，M或V置换L48；用G，I，L，S，T，M或V置换A49；用G，I，L，S，T，M或V置换A50；用A，G，I，L，S，M或V置换T51；用A，G，I，S，T，M或V置换L52；用A，G，I，S，T，M或V置换L53；用A，G，I，S，T，M或V置换L54；用G，I，L，S，T，M或V置换A55；用A，G，I，S，T，M或V置换L56；用A，G，I，S，T，M或V置换L57；用A，G，I，L，T，M或V置换S58；用A，G，I，S，T，M或V置换L61；用A，G，I，L，S，M或V置换T62；用A，G，I，L，S，T或M置换V63；用A，G，I，L，S，T或M置换V64；用A，G，I，L，T，M或V置换S65；用W或Y置换F66；用F或W置换Y67；用N置换Q68；用A，G，I，L，S，T或M置换V69；用G，I，L，S，T，M或V置换A70；用G，I，L，S，T，M或V置换A71；用A，G，I，S，T，M或V置换L72；用N置换Q73；用A，I，L，S，T，M或V置换G74；用E置换D75；用A，G，I，S，T，M或V置换L76；用G，I，L，S，T，M或V置换A77；用A，G，I，L，T，M或V置换S78；用A，G，I，S，T，M或V置换L79；用H或K置换R80；用G，I，L，S，T，M或V置换A81；用D置换E82；用A，G，I，S，T，M或V置换L83；用N置换Q84；用A，I，L，S，T，M或V置换G85；用K或R置换H86；用K或R置换H87；用G，I，L，S，T，M或V置换A88；用D置换E89；用H或R置换K90；用A，G，I，S，T，M或V置换L91；用G，I，L，S，T，M或V置换A93；用A，I，L，S，T，M或V置换G94；用G，I，L，S，T，M或V置换A95；用A，I，L，S，T，M或V置换G96；用G，I，L，S，T，M或V置换A97；用H或R置换K99；用G，I，L，S，T，M或V置换A100；用A，I，L，S，T，M或V置换G101；用A，G，I，S，T，M或V置换L102；用D置换E103；用D置换E104；用G，I，L，S，T，M或V置换A105；用G，I，L，S，T，M或V置换A107；用A，G，I，L，S，T或M置换V108；用A，G，I，L，S，M或V置换T109；用G，I，L，S，T，M或V置换A110；用A，I，L，S，T，M或V置换G111；用A，G，I，S，T，M或V置换L112；用H或R置换K113；用A，G，L；S，T，M或V置换I114；用W或Y置换F115；用D置换E116；用G，I，L，S，T，M或V置换A119；用A，I，L，S，T，M或V置换G1 21；用D置换E122；用A，I，L，S，T，M或V置换G123；用Q置换N124；用A，G，I，L，T，M或V置换S125；用A，G，I，L，T，M或V置换S126；用N置换Q127；用Q置换N128；用A，G，I，L，T，M或V置换S129；用H或K置换R130；用Q置换N131；用H或R置换K132；用H或K置换R133；用G，I，L，S，T，M或V置换A134；用A，G，I，L，S，T或M置换V135；用N置换Q136；用A，I，L，S，T，M或V置换G137；用D置换E139；用D置换E140；用A，G，I，L，S，M或V置换T141；用A，I，L，S，T，M或V置换G142；用A，G，I，L，T，M或V置换S143；用F或W置换Y144；用A，G，I，L，S，M或V置换T145；用W或Y置换F146；用A，G，I，L，S，T或M置换V147；用F或Y置换W149；用A，G，I，S，T，M或V置换L150；用A，G，I，S，T，M或V置换L151；用A，G，I，L，T，M或V置换S152；用W或Y置换F153；用H或R置换K154；用H或K置换R155；用A，I，L，S，T，M或V置换G156；用A，G，I，L，T，M或V置换S157；用G，I，L，S，T，M或V置换A158；用A，G，I，S，T，M或V置换L159；用D置换E160；用D置换E161；用H或R置换K162；用D置换E163；用Q置换N164；用H或R置换K165；用A，G，L；S，T，M或V置换I166；用A，G，I，S，T，M或V置换L167；用A，G，I，L，S，T或M置换V168；用H或R置换K169；用D置换E170；用A，G，I，L，S，M或V置换T171；用A，I，L，S，T，M或V置换G172；用F或W置换Y173；用W或Y置换F174；用W或Y置换F175；用A，G，L；S，T，M或V置换I176；用F或W置换Y177；用A，I，L，S，T，M或V置换G178；用N置换Q179；用A，G，I，L，S，T或M置换V1 80；用A，G，I，S，T，M或V置换L181；用F或W置换Y182；用A，G，I，L，S，M或V置换T183；用E置换D184；用H或R置换K185；用A，G，I，L，S，M或V置换T186；用F或W置换Y187；用G，I，L，S，T，M或V置换A188；用A，G，I，L，S，T或V置换M189；用A，I，L，S，T，M或V置换G190；用K或R置换H191；用A，G，I，S，T，M或V置换L192；用A，G，L；S，T，M或V置换I193；用N置换Q194；用H或K置换R195；用H或R置换K196；用H或R置换K197；用A，G，I，L，S，T或M置换V198；用K或R置换H199；用A，G，I，L，S，T或M置换V200；用W或Y置换F201；用A，I，L，S，T，M或V置换G202；用E置换D203；用D置换E204；用A，G，I，S，T，M或V置换L205；；用A，G，I，L，T，M或V置换S206；用A，G，I，S，T，M或V置换L207；用A，G，I，L，S，T或M置换V208；用A，G，I，L，S，M或V置换T209；用A，G，I，S，T，M或V置换L210；用W或Y置换F211；用H或K置换R212；用A，G，L；S，T，M或V置换I214；用N置换Q215；用Q置换N216；用A，G，I，L，S，T或V置换M217；用D置换E219；用A，G，I，L，S，M或V置换T220；用A，G，I，S，T，M或V置换L221；用Q置换N223；用Q置换N224；用A，G，I，L，T，M或V置换S225；用F或W置换Y227；用A，G，I，L，T，M或V置换S228；用G，I，L，S，T，M或V置换A229；用A，I，L，S，T，M或V置换G230；用A，G，L；S，T，M或V置换I231；用G，I，L，S，T，M或V置换A232；用H或R置换K233；用A，G，I，S，T，M或V置换L234；用D置换E235；用D置换E236；用A，I，L，S，T，M或V置换G237；用E置换D238；用D置换E239；用A，G，I，S，T，M或V置换L240；用N置换Q241；用A，G，I，S，T，M或V置换L242；用G，I，L，S，T，M或V置换A243；用A，G，L；S，T，M或V置换I244；用H或K置换R246；用D置换E247；用Q置换N248；用G，I，L，S，T，M或V置换A249；用N置换Q250；用A，G，L；S，T，M或V置换I251；用A，G，I，L，T，M或V置换S252；用A，G，I，S，T，M或V置换L253；用E置换D254；用A，I，L，S，T，M或V置换G255；用E置换D256；用A，G，I，L，S，T或M置换V257；用A，G，I，L，S，M或V置换T258；用W或Y置换F259；用W或Y置换F260；用A，I，L，S，T，M或V置换G261；用G，I，L，S，T，M或V置换A262；用A，G，I，S，T，M或V置换L263；用H或R置换K264；用A，G，I，S，T，M或V置换L265；和/或用A，G，I，S，T，M或V置换L266。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。对所得本发明Neutrokine-α蛋白质可进行常规筛选Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质(如增强或降低的稳定性和/或可溶性)。优选地，所得本发明蛋白质具有提高和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性。更优选地，所得本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白质具有一种以上提高和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质。
在另一实施方案中，在Neutrokine-α氨基酸水平的位点直接诱变可通过用保守取代基置换特殊的氨基酸而进行。SEQ ID NO23所示Neutrokine-α氨基酸序列的优选保守取代突变包括用H或K置换R1；用A，G，I，L，S，T或M置换V2；用A，G，I，L，S，T或M置换V3；用E置换D4；用A，G，I，S，T，M或V置换L5；用A，G，I，L，T，M或V置换S6；用G，I，L，S，T，M或V置换A7；用G，I，L，S，T，M或V置换A10；用A，G，I，S，T，M或V置换L13；用A，I，L，S，T，M或V置换G15；用H或K置换R17；用K或R置换H18；用A，G，I，L，T，M或V置换S19；用N置换Q20；用K或R置换H21；用E置换D22；用E置换D23；用Q置换N24；用A，I，L，S，T，M或V置换G25；用A，G，I，L，S，T或V置换M26；用Q置换N27；用A，G，I，S，T，M或V置换L28；用H或K置换R29用Q置换N30；用H或K置换R31；用A，G，I，L，S，M或V置换T32；用F或W置换Y33；用A，G，I，L，S，M或V置换T34；用W或Y置换F35；用A，G，I，L，S，T或M置换V36；用F或Y置换W38；用A，G，I，S，T，M或V置换L39；用A，G，I，S，T，M或V置换L40；用A，G，I，L，T，M或V置换S41；用W或Y置换F42；用H或R置换K43；用H或K置换R44；用A，I，L，S，T，M或V置换G45；用Q置换N46；用G，I，L，S，T，M或V置换A47；用A，G，I，S，T，M或V置换L48；；用D置换E49；用D置换E50；用H或R置换K51；用D置换E52；用Q置换N53；用H或R置换K54；用A，G，L；S，T，M或V置换I55；用A，G，I，L，S，T或M置换V56；用A，G，I，L，S，T或M置换V57；用H或K置换R58；用N置换Q59；用A，G，I，L，S，M或V置换T60；用A，I，L，S，T，M或V置换G61；用F或W置换Y62；用W或Y置换F63；用W或Y置换F64；用A，G，L；S，T，M或V置换I65；用F或W置换Y66；用A，G，I，L，T，M或V置换S67；用N置换Q68；用A，G，I，L，S，T或M置换V69；用A，G，I，S，T，M或V置换L70；；用F或W置换Y71；用A，G，I，L，S，M或V置换T72；用E置换D73；用A，G，L；S，T，M或V置换I75；用W或Y置换F76；用G，I，L，S，T，M或V置换A77；用A，G，I，L，S，T或V置换M78；用A，I，L，S，T，M或V置换G79；用K或R置换H80；用A，G，I，L，S，T或M置换V81；用A，G，L；S，T，M或V置换I82；用N置换Q83；用H或K置换R84；用H或R置换K85；用H或R置换K86；用A，G，I，L，S，T或M置换V87；用K或R置换H88；用A，G，I，L，S，T或M置换V89；用W或Y置换F90；用A，I，L，S，T，M或V置换G91；用E置换D92；用D置换E93；用A，G，I，S，T，M或V置换L94；用A，G，I，L，T，M或V置换S95；用A，G，I，S，T，M或V置换L96；用A，G，I，L，S，T或M置换V97；用A，G，I，L，S，M或V置换T98；用A，G，I，S，T，M或V置换L99；用W或Y置换F100；用H或K置换R101；用A，G，L；S，T，M或V置换I103；用N置换Q104；用Q置换N105；用A，G，I，L，S，T或V置换M106；用H或R置换K108；用A，G，I，L，S，M或V置换T109；用A，G，I，S，T，M或V置换L110；用Q置换N112；用Q置换N113；用A，G，I，L，T，M或V置换S114；用F或W置换Y116；用A，G，I，L，T，M或V置换S117；用G，I，L，S，T，M或V置换A118；用A，I，L，S，T，M或V置换G119；用A，G，L；S，T，M或V置换I120；用G，I，L，S，T，M或V置换A121；用H或K置换R122；用A，G，I，S，T，M或V置换L123；用D置换E124；用D置换E125；用A，I，L，S，T，M或V置换G126；用E置换D127；用D置换E128；用A，G，L；S，T，M或V置换I129；用N置换Q130；用A，G，I，S，T，M或V置换L131；用G，I，L，S，T，M或V置换A132；用A，G，L；S，T，M或V置换I133；用H或K置换R135；用D置换E136；用Q置换N137；用G，I，L，S，T，M或V置换A138；用N置换Q139；用A，G，L；S，T，M或V置换I140；用A，G，I，L，T，M或V置换S141；用H或K置换R142；用Q置换N143；用A，I，L，S，T，M或V置换G144；用E置换D145；用E置换D146；用A，G，I，L，S，M或V置换T147；用W或Y置换F148；用W或Y置换F149；用A，I，L，S，T，M或V置换G150；用G，I，L，S，T，M或V置换A151；用A，G，I，S，T，M或V置换L152；用H或R置换K153；用A，G，I，S，T，M或V置换L154；和/或用A，G，I，S，T，M或V置换L155。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。对所得本发明Neutrokine-α蛋白可进行常规筛选Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质(如增强或降低的稳定性和/或可溶性)。优选地，所得本发明蛋白质具有提高和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性。更优选地，所得本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白质具有一种以上提高和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质。
在另一实施方案中，在Neutrokine-α氨基酸水平的位点直接诱变可通过用保守取代基置换特殊的氨基酸而进行。SEQ ID NO38所示Neutrokine-α氨基酸序列的优选保守取代突变包括用A，G，I，L，S，T或V置换M1；用E置换D2；用E置换D3；用A，G，I，L，T，M或V置换S4；用G，I，L，S，T，M或V置换A5；用H或R置换K6；用A，G，I，L，S，M或V置换T7；用A，G，I，S，T，M或V置换L8；用A，G，I，S，T，M或V置换L13；用W或Y置换F15；用A，G，I，L，T，M或V置换S17；用D置换E18；用H或R置换K19；用A，I，L，S，T，M或V置换G20；用D置换E21；用E置换D22；用A，G，I，L，S，T或V置换M23；用H或R置换K24；用A，G，I，L，S，T或M置换V25；用A，I，L，S，T，M或V置换G26；用F或W置换Y27；用E置换D28；用A，G，L；S，T，M或V置换I30；用A，G，I，L，S，M或V置换T31；用N置换Q33；用H或R置换K34；用D置换E35；用D置换E36；用A，I，L，S，T，M或V置换G37；用G，I，L，S，T，M或V置换A38；用F或Y置换W39；用W或Y置换F40；用A，I，L，S，T，M或V置换G41；用A，G，L；S，T，M或V置换I42；用H或K置换R44；用E置换D45；用A，I，L，S，T，M或V置换G46；用H或K置换R47；用A，G，I，S，T，M或V置换L48；用A，G，I，S，T，M或V置换L49；用G，I，L，S，T，M或V置换A50；用G，I，L，S，T，M或V置换A51；用A，G，I，L，S，M或V置换T52；用A，G，I，S，T，M或V置换L53；用A，G，I，S，T，M或V置换L54；用A，G，I，S，T，M或V置换L55；用G，I，L，S，T，M或V置换A56；用A，G，I，S，T，M或V置换L57；用A，G，I，S，T，M或V置换L58；用A，G，I，L，T，M或V置换S59；用A，G，I，L，T，M或V置换S60；用A，G，I，L，T，M或V置换S61；用W或Y置换F62；用A，G，I，L，S，M或V置换T63；用G，I，L，S，T，M或V置换A64；用A，G，I，L，S，T或V置换M65；用A，G，I，L，T，M或V置换S66；用A，G，I，S，T，M或V置换L67；用F或W置换Y68；用N置换Q69；用A，G，I，S，T，M或V置换L70；用G，I，L，S，T，M或V置换A71；用G，I，L，S，T，M或V置换A72；用A，G，I，S，T，M或V置换L73；用N置换Q74；用G，I，L，S，T，M或V置换A75；用E置换D76；用A，G，I，S，T，M或V置换L77；用A，G，I，L，S，T或V置换M78；用Q置换N79；用A，G，I，S，T，M或V置换L80；用H或K置换R81；用A，G，I，L，S，T或V置换M82；用D置换E83；用A，G，I，S，T，M或V置换L84；用N置换Q85；用A，G，I，L，T，M或V置换S86；用F或W置换Y87；用H或K置换R88；用A，I，L，S，T，M或V置换G89；用A，G，I，L，T，M或V置换S90；用G，I，L，S，T，M或V置换A91；用A，G，I，L，S，M或V置换T92；用G，I，L，S，T，M或V置换A94；用G，I，L，S，T，M或V置换A95；用G，I，L，S，T，M或V置换A96；用A，I，L，S，T，M或V置换G97；用G，I，L，S，T，M或V置换A98；用D置换E100；用A，G，I，S，T，M或V置换L101；用A，G，I，L，S，M或V置换T102；用G，I，L，S，T，M或V置换A103；用A，I，L，S，T，M或V置换G104；用A，G，I，L，S，T或M置换V105；用H或R置换K106；用A，G，I，S，T，M或V置换L107；用A，G，I，S，T，M或V置换L108；用A，G，I，L，S，M或V置换T109；用G，I，L，S，T，M或V置换A111；用G，I，L，S，T，M或V置换A112；用H或K置换R114；用K或R置换H116；用Q置换N117；用A，G，I，L，T，M或V置换S118；用A，G，I，L，T，M或V置换S119；用H或K置换R120；用A，I，L，S，T，M或V置换G121；用K或R置换H122；用H或K置换R123；用Q置换N124；用H或K置换R125；用H或K置换R126；用G，I，L，S，T，M或V置换A127；用W或Y置换F128；用N置换Q129；用A，I，L，S，T，M或V置换G130；用D置换E132；用D置换E133；用A，G，I，L，S，M或V置换T134；用D置换E135；用N置换Q136；用E置换D137；用A，G，I，L，S，T或M置换V138；用D置换E139；用A，G，I，S，T，M或V置换L140；用A，G，I，L，T，M或V置换S141；用G，I，L，S，T，M或V置换A142；用G，I，L，S，T，M或V置换A145；用A，G，I，S，T，M或V置换L148；用A，I，L，S，T，M或V置换G150；用H或K置换R152；用K或R置换H153；用A，G，I，L，T，M或V置换S154；用N置换Q155；用K或R置换H156；用E置换D157；用E置换D158；用Q置换N159；用A，I，L，S，T，M或V置换G160；用A，G，I，L，S，T或V置换M161；用Q置换N162；用A，G，I，S，T，M或V置换L163；用H或K置换R164；用Q置换N165；用A，G，L；S，T，M或V置换I166；用A，G，L；S，T，M或V置换I167；用N置换Q168；用E置换D169；用A，G，I，S，T，M或V置换L171；用N置换Q172；用A，G，I，S，T，M或V置换L173；用A，G，L；S，T，M或V置换I174；；用G，I，L，S，T，M或V置换A175；用E置换D176；用A，G，I，L，T，M或V置换S177；用E置换D178；用A，G，I，L，S，M或V置换T179；用G，I，L，S，T，M或V置换A181；用A，G，I，S，T，M或V置换L182；用D置换E183；用D置换E184；用H或R置换K185；用D置换E186；用Q置换N187；用H或R置换K188；用A，G，L，S，T，M或V置换I189；用A，G，I，L，S，T或M置换V190；用A，G，I，L，S，T或M置换V191；用H或K置换R192；用N置换Q193；用A，G，I，L，S，M或V置换T194；用A，I，L，S，T，M或V置换G195；用F或W置换Y196；用W或Y置换F197；用W或Y置换F198；用A，G，L；S，T，M或V置换I199；用F或W置换Y200；用A，G，I，L，T，M或V置换S201；用N置换Q202；用A，G，I，L，S，T或M置换V203；用A，G，I，S，T，M或V置换L204；用F或W置换Y205；用A，G，I，L，S，M或V置换T206；用E置换D207；用A，G，L；S，T，M或V置换I209；用W或Y置换F210；用G，I，L，S，T，M或V置换A211；用A，G，I，L，S，T或V置换M212；用A，I，L，S，T，M或V置换G213；用K或R置换H214；用A，G，I，L，S，T或M置换V215；用A，G，L；S，T，M或V置换I216；用N置换Q217；用H或K置换R218；用H或R置换K219；用H或R置换K220；用A，G，I，L，S，T或M置换V221；用K或R置换H222；用A，G，I，L，S，T或M置换V223；用W或Y置换F224；用A，I，L，S，T，M或V置换G225；用E置换D226；用D置换E227；用A，G，I，S，T，M或V置换L228；用A，G，I，L，T，M或V置换S229；用A，G，I，S，T，M或V置换L230；用A，G，I，L，S，T或M置换V231；用A，G，I，L，S，M或V置换T232；用A，G，I，S，T，M或V置换L233；用W或Y置换F234；用H或K置换R235；用A，G，L，S，T，M或V置换I237；用N置换Q238；用Q置换N239；用A，G，I，L，S，T或V置换M240；用H或R置换K242；用A，G，I，L，S，M或V置换T243；用A，G，I，S，T，M或V置换L244；用Q置换N246；用Q置换N247；用A，G，I，L，T，M或V置换S248；用F或W置换Y250；用A，G，I，L，T，M或V置换S251；用G，I，L，S，T，M或V置换A252；用A，I，L，S，T，M或V置换G253；用A，G，L，S，T，M或V置换I254；用G，I，L，S，T，M或V置换A255；用H或K置换R256；用A，G，I，S，T，M或V置换L257；用D置换E258；用D置换E259；用A，I，L，S，T，M或V置换G260；用E置换D261；用D置换E262；用A，G，L，S，T，M或V置换I263；用N置换Q264；用A，G，I，S，T，M或V置换L265；用G，I，L，S，T，M或V置换A266；用A，G，L，S，T，M或V置换I267；用H或K置换R269；用D置换E270；用Q置换N271；用G，I，L，S，T，M或V置换A272；用N置换Q273；用A，G，L，S，T，M或V置换I274；用A，G，I，L，T，M或V置换S275；用H或K置换R276；用Q置换N277；用A，I，L，S，T，M或V置换G278；用E置换D279；用E置换D280；用A，G，I，L，S，M或V置换T281；用W或Y置换F282；用W或Y置换F283；用A，I，L，S，T，M或V置换G284；用G，I，L，S，T，M或V置换A285；用A，G，I，S，T，M或V置换L286；用H或R置换K287；用A，G，I，S，T，M或V置换L288；和/或用A，G，I，S，T，M或V置换L289。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。对所得本发明Neutrokine-α蛋白可进行常规筛选Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质(如增强或降低的稳定性和/或可溶性)。优选地，所得本发明蛋白质具有提高和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性。更优选地，所得本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白质具有一种以上提高和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质。
为功能所必需的本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽中的氨基酸可通过本领域已知方法鉴别，如位点直接诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunnirgham和Wells，科学2441081-1085(1989))。后一方法是在分子中每个残基进行单个丙氨酸突变。然后测试所得突变体的功能活性，如配体结合和刺激淋巴细胞(如B细胞)增殖，分化和/或活化的能力。
特别感兴趣的是用其它荷电或中性氨基酸取代荷电氨基酸，可产生具有所需改良特征如低聚集性的蛋白质。聚集性不仅降低活性，而且也是制备药物配方时的一个问题，因为聚集物可以是免疫原性的(Pinckard等，临床实验免疫学2331-340(1967)；Robbins等，糖尿病36838-845(1987)；C1eland等，Crit.Rev.Therepeutic DrugCarrien Systems10307-377(1993))。
在另一实施方案中，本发明提供了具有含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列非保守取代的氨基酸序列的多肽。例如，SEQ IDNO2所示Neutrokine-α蛋白质序列的非保守取代包括用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M1；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D2；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D3；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S4；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T5；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E6；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R7；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E8；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q9；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S10；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R11；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L12；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T13；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S14；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C15；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L16；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K17；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K18；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R19；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E20；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E21；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换M22；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K23；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L24；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K25；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E26；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C27；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V28；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S29；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I30；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L31；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P32；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R33；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K34；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E35；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S36；用D，E，H，K，R，，A，G，I，L，，ST，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P37；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S38；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V39；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R40；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S41；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S42；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K43；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D44；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G45；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K46；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L47；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L48；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A49；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A50；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T51；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L52；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L53；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L54；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A55；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L56；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L57；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S58；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C59；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C60；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L61；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T62；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V63；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V64；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S65；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F66；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y67；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q68；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V69；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A70；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A71；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L72；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q73；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G74；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D75；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L76；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A77；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S78；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L79；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R80；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A81；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E82；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L83；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q84；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G85；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H86；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H87；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A88；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E89；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K90；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L91；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P92；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A93；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G94；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A95；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G96；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A97；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P98；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K99；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A100；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G101；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L102；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E103；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E104；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A105；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P106；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A107；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V108；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T109；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A110；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G111；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L112；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K113；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I114；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F115；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E116；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P117；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P118；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A119；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P120；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G121；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E122；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G123；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N124；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S125；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S126；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q127；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N128；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S129；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R130；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N131；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K132；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R133；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A134；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V135；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q136；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G137；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P138；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E139；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E140；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T141；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V142；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T143；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q144；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D145；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C146；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L147；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q148；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L149；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I150；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A151；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D152；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S153；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E154；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T155；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P156；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T157；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I158；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q159；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K160；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G161；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S162；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y163；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T164；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F165；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V166；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P167；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W168；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L169；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L170；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S171；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F172；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K173；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R174；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G175；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S176；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A177；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L178；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E179；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E180；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K181；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E182；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N183；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K184；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I185；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L186；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V187；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K188；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E189；；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T190；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G191；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y192；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F193；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F194；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I195；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y196；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G197；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q198；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V199；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L200；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y201；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T202；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D203；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K204；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T205；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y206；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A207；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换M208；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G209；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H210；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L211；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I212；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q213；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R214；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K215；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K216；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V217；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H218；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V219；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F220；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G221；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D222；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E223；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L224；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S225；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L226；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V227；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T228；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L229；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F230；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R23 1；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C232；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I233；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q234；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N235；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换M236；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P237；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E238；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T239；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L240；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P241；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N242；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N243；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S244；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C245；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y246；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S247；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A248；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G249；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I250；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A251；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K252；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L253；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E254；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E255；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G256；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D257；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E258；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L259；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q260；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L261；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A262；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I263；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P264；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R265；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E266；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N267；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A268；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q269；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I270；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S271；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L272；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D273；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G274；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D275；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T276；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T277；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F278；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F279；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G280；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A281；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L282；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K283；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L284；和/或用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L285。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。对所得本发明的Neutrokine-α蛋白可进行常规筛选本文所述及本领域已知的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质(如增强或降低的稳定性和/或可溶性)。优选地，所得本发明的蛋白质具有增强和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性。更优选地，所得本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白质具有一种以上提高和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质。
在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α多肽包含一个以上(如2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，30，和50个)用上述氨基酸置换的氨基酸(保守或非保守性的)。
在本发明另一实施方案中，SEQ ID NO19所示Neutrokine-αSV蛋白质序列中的非保守性取代包括用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换M1；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D2；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D3；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S4；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T5；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E6；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R7；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E8；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，W，Y，P，或C置换Q9；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S10；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R11；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L12；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T13；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S14；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C15；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L16；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K17；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K18；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R19；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E20；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E21；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换M22；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K23；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L24；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K25；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E26；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C27；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V28；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S29；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I30；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L31；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P32；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R33；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K34；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E35；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S36；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P37；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S38；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V39；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R40；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S41；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S42；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K43；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D44；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G45；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K46；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L47；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L48；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A49；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A50；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T51；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L52；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L53；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L54；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A55；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L56；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L57；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S58；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C59；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C60；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L61；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T62；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V63；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V64；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S65；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F66；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换Y67；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q68；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V69；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A70；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A71；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L72；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q73；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G74；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D75；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L76；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A77；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S78；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L79；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R80；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A81；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E82；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L83；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q84；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G85；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H86；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H87；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A88；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E89；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K90；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L91；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P92；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A93；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G94；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A95；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G96；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A97；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P98；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K99；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A100；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G101；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L102；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E103；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E104；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A105；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P106；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A107；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V108；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T109；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A110；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G111；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L112；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K113；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I114；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换F115；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E116；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P117；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P118；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A119；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P120；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G121；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E122；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G123；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N124；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S125；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S126；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q127；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N128；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S129；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R130；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N131；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K132；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R133；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A134；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V135；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，，W，Y，P，或C置换Q136；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G137；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P138；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E139；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E140；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换T141；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G142；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S143；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y144；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T145；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F146；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V147；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P148；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P或C置换W149；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L150；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L151；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S152；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F153；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K154；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R155；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G156；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S157；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A158；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L159；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E160；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E161；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K162；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E163；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N164；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K165；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I166；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L167；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V168；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K169；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E170；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T171；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G172；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y173；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F174；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F175；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I176；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y177；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G178；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，M，V，P，或C置换Q179；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V180；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L181；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y182；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T183；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D184；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K185；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T186；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y187；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A188；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换M189；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G190；用D，E，，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H191；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L192；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I193；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，M，V，P，或C置换Q194；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R195；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K1 96；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K197；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V198；用D，E，，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H199；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V200；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F201；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G202；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D203；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E204；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L205；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S206；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L207；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V208；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T209；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L210；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F211；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R212；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C213；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I214；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，M，V，P，或C置换Q215；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N216；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换M217；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P218；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E219；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T220；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L221；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P222；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N223；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N224；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S225；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C226；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y227；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S228；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A229；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G230；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I231；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A232；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K233；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L234；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E235；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E236；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G237；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D238；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E239；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L240；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，M，V，P，或C置换Q241；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L242；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A243；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I244；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P245；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R246；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E247；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N248；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A249；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，M，V，P，或C置换Q250；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I251；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S252；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L253；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D254；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G255；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D256；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V257；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T258；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F259；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F260；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G261；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A262；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L263；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K264；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L265；和/或用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L266。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。对所得本发明的Neutrokine-α蛋白质可进行常规筛选本文所述及本领域已知的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质(如增强或降低的稳定性和/或可溶性)。优选地，所得本发明的蛋白质具有增强和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性。更优选地，所得本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白质具有一种以上增强和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质。
在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α多肽包含用上述取代氨基酸(保守或非保守的)置换的一个以上(如2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，30，和50个)氨基酸。
例如，SEQ ID NO23所示Neutrokine-α蛋白质序列的优选非保守性取代包括用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R1；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V2；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V3；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D4；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L5；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S6；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A7；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P8；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P9；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A10；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P11；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C12；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L1 3；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P14；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G15；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P置换C16；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V， N，Q，F，W，Y，P，或C置换R17；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H1 8；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S19；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q20；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换H21；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D22；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D23；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N24；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G25；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M26；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N27；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L28；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R29；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N30；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R31；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T32；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y33；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T34；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F35；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V36；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P37；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换W38；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L39；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L40；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S41；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F42；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K43；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R44；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G45；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N46；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A47；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L48；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E49；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E50；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K51；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E52；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N53；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K54；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I55；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V56；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V57；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V， N，Q，F，W，Y，P，或C置换R58；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q59；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T60；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G61；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y62；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F63；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F64；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I65；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y66；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S67；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q68；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V69；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L70；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y71；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T72；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D73；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P74；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I75；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F76；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A77；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M78；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G79；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H80；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V81；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I82；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q83；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R84；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K85；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K86；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V87；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H88；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V89；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F90；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G91；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D92；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E93；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L94；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S95；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L96；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换V97；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T98；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L99；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F100；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V， N，Q，F，W，Y，P，或C置换R101；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C102；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I103；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q104；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N105；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M106；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P107；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K108；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T109；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L110；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P111；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N112；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N113；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S114；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C115；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y116；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S117；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A118；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G119；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I120；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A121；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R122；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L123；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E124；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E125；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G126；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D127；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E128；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I129；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q130；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L131；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A132；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I133；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P134；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R135；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换E136；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N137；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A138；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换Q139；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I140；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S141；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换R142；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换N143；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G144；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D145；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D146；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T147；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F148；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F149；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G150；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A151；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L152；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K153；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L154；和/或用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L155。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。对所得本发明的Neutrokine-α蛋白质可进行常规筛选本文所述及本领域已知的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或可溶性。优选地，所得本发明的蛋白质具有增强或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性。更优选地，所得本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白质具有一种以上增强或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质。
在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α多肽包含用上述取代氨基酸(保守或非保守的)置换的一个以上(如2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，30，和50个)氨基酸。
例如，SEQ ID NQ38所示Neutrokine-α蛋白质序列的优选非保守取代包括用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M1；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D2；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E3；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S4；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A5；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K6；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T7；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L8；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P9；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P10；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P11；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C12；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L13；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C14；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F15；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C16；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S17；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E18；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K19；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G20；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E21；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D22；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M23；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K24；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V25；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G26；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y27；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D28；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P29；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I30；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T31；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P32；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q33；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K34；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E35；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E36；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G37；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A38；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换W39；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F40；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G41；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I42；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C43；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R44；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D45；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G46；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R47；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L48；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L49；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A50；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A51；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T52；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L53；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L54；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L55；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A56；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L57；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L58；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S59；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S60；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S61；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F62；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T63；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A64；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M65；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S66；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L67；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y68；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q69；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L70；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A71；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A72；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L73；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q74；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A75；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D76；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L77；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M78；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N79；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L80；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R81；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M82；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E83；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L84；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q85；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S86；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y87；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R88；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G89；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S90；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A91；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T92；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P93；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A94；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A95；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A96；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G97；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A98；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P99；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E100；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L101；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T102；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A103；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G104；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V105；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K106；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L107；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L108；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T109；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P110；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A111；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A112；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P113；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R114；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P115；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H116；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N117；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S118；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S119；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R120；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G121；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H122；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R123；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N124；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R125；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R126；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A127；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F128；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q129；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G130；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P131；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E132；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E133；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T134；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E135；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q136；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D137；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V138；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D139；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L140；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S141；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A142；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P143；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P144；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A145；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P146；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C147；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L148；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P149；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G150；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C151；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R152；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H153；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S154；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q155；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H156；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D157；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D158；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N159；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G160；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M161；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N162；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L163；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R164；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N165；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I166；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I167；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q168；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D169；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C170；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L171；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q172；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L173；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I174；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A175；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D176；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S177；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D178；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T179；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P180；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A181；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L182；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E183；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E184；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K185；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E186；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N187；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K188；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I189；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V190；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V191；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R192；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q193；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T194；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G195；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y196；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F197；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F198；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I199；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y200；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S201；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q202；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V203；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L204；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y205；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T206；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D207；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P208；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I209；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F210；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A211；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M212；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G213；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H214；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V215；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I216；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q217；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R218；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K219；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K220；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V221；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换H222；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V223；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F224；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G225；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D226；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E227；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L228；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S229；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L230；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换V231；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T232；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L233；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F234；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R235；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C236；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I237；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q238；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N239；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P或C置换M240；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P241；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K242；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T243；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L244；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P245；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N246；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N247；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S248；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或P，置换C249；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换Y250；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S251；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A252；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G253；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I254；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A255；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R256；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L257；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E258；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E259；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G260；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D261；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E262；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I263；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q264；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L265；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A266；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I267；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，或C置换P268；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R269；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换E270；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N271；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A272；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P或C置换Q273；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换I274；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换S275；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换R276；用D，E，H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，F，W，Y，P，或C置换N277；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G278；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D279；用H，K，R，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P或C置换D280；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换T281；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F282；用D，E，H，K，R，N，Q，A，G，I，L，S，T，M，V，P，或C置换F283；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换G284；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换A285；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L286；用D，E，A，G，I，L，S，T，M，V，N，Q，F，W，Y，P，或C置换K287；用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L288；和/或用D，E，H，K，R，N，Q，F，W，Y，P，或C置换L289。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。对所得本发明的Neutrokine-α蛋白质可进行常规筛选本文所述及本领域已知的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质(如增强或降低的稳定性和/或可溶性)。优选地，所得本发明的蛋白质具有增强和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性。更优选地，所得本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白质具有一种以上增强和/或降低的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能活性和/或物理性质。
在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α多肽包含用上述取代氨基酸(保守或非保守的)置换的一个以上(如2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，30，和50个)氨基酸。
氨基酸的置换也可改变配体与细胞表面受体的选择性结合。例如Ostade等，自然361266-268(1993)阐述了一些突变导致TNF-α选择性地只与二种已知TNF受体之一结合。由于Neutrokine-α和Neutrokine-αSV是TNF多肽家族成员，类似于TNF-α中的那些突变在Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV中具有相似作用。
配体-受体结合的关键位点也可通过结构分析确定，如结晶，核磁共振，或放射亲和性标记(Smith等，分子生物学杂志224899-904(1992)和Uos等，科学255306-312(1992))。
由于Neutrokine-α是TNF相关蛋白家族的成员，为调节而不是完全消除Neutrokine-α的功能活性(如生物活性)可对编码TNF保守的结构域中的氨基酸的序列进行突变，所述氨基酸即图1A和1B(SEQ ID NO2)所示Gly191-Leu284位内的氨基酸，优选是此区域内在全部，大多数或一些TNF家族成员(如TNF-α，TNF-β，LT-β，和Fas配体)中是不保守的氨基酸残基(见图2A-B)。通过在这种保守的氨基酸典型地在相关TNFs中发现的位置进行Neutrokine-α中特异突变，Neutrokine-α突变蛋白将作为拮抗剂起作用，因而具有抑制淋巴细胞(如B细胞)增殖，分化和/或活化作用。因此，本发明的多肽包括Neutrokine-α突变体。这种Neutrokine-α突变体包含或由图1A和1B(SEQ ID NO2)所示Neutrokine-α氨基酸序列的全长或优选胞外域的片段，变体或衍生物组成。编码上述Neutrokine-α突变体的多核苷酸也涵盖在本发明内。
由于Neutrokine-αSV是TNF相关蛋白家族的成员，为调节而不是完全消除Neutrokine-αSV的功能活性，可对编码TNF保守结构域中氨基酸的序列进行突变，所述氨基酸即图5A和5B(SEQ IDNO19)中Gly172-Leu265位内的氨基酸，优选是此区域内在全部，大多数或一些TNF家族成员(如TNF-α，TNF-β，LT-β，和Fas配体)中是非保守的氨基酸残基(见图2A-B)。通过在这种氨基酸在相关TNFs中典型发现的位置进行Neutrokine-αSV中特异突变，Neutrokine-αSV突变蛋白将作为拮抗剂起作用，因而具有例如抑制淋巴细胞(如B细胞)增殖，分化和/或活化作用。因此，本发明的多肽包括Neutrokine-αSV突变体。这种Neutrokine-αSV突变体包含或由图5A和5B(SEQ ID NO19)所示Neutrokine-αSV氨基酸序列的全长或优选胞外域的片段，变体或衍生物组成。编码上述Neutrokine-αSV突变体的多核苷酸也涵盖在本发明内。
另外，本领域技术人员意识到定向于本发明Neutrokine-α多肽一些区域的突变可影响Neutrokine-α多肽所观测到的功能活性(如生物活性)，所述区域涵盖在Neutrokine-αSV多肽序列中未发现的19个氨基酸残基插入序列(即图1A和1B及SEQ ID NO2所示序列的Val142-Lys160位氨基酸残基)。更特别地，可定向突变的Neutrokine-α多肽序列的这种残基非限制性地例如包括以下SEQ ID NO2所示Neutrokine-α多肽序列的氨基酸残基V142；T143；Q144；D145；C146；L147；Q148；L149；I150；A151；D152；S153；E154；T155；P156；T157；I158；Q159；和K160。
本领域已知的重组DNA方法(见例如DNA改组，如前述)可用于产生新的突变体蛋白或突变蛋白，包括单个或多个氨基酸取代，缺失，添加或融合蛋白。这种修饰的多肽可呈现例如增强的活性或提高的稳定性。另外，它们至少在一定纯化和储存条件下，与相应的天然多肽相比，可高产量纯化及呈现较好的可溶性。
因此，本发明还涵盖了Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的衍生物和类似物，它们具有一或多个氨基酸残基缺失，添加或取代，以产生更适于在选择的宿主细胞中表达，放大的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽。例如，半胱氨酸残基可缺失或用其它氨基酸残基取代以消除二硫键；N连接的糖基化位点可改变或消除以例如达到同源产物的表达，该同源产物更易于从酵母宿主中回收和纯化，酵母宿主已知具有超糖基化位点。因此，在Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽中一或多个糖基化识别序列的第一个或第三个氨基酸位或这二位上的各种氨基酸取代，和/或在一或多个这种识别序列的第二个氨基酸位上的氨基酸缺失，将阻止Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV在修饰的三肽序列糖基化(参见Miyajimo等，EMBO杂志5(6)1193-1197)。
另外，本发明多肽的一或多个氨基酸残基(如精氨酸和赖氨酸残基)可缺失或用其它残基取代，以通过蛋白酶如弗林蛋白酶或Kexins消除不希望的加工。这种突变的一个可能结果是本发明的Neutrokine-α多肽不被切割并从细胞表面释放。
在一特异的实施方案中，SEQ ID NO2所示Neutrokine-α序列的Lys132和/或Arg133突变为其它氨基酸残基或一起缺失，以阻止或减少可溶形式的Neutrokine-α从表达Neutrokine-α的细胞中释放。在更特异的实施方案中，SEQ ID NO2所示Neutrokine-α序列的Lys132突变为Ala132。在另一实施方案中，SEQ ID NO2所示Neutrokine-α序列的Arg133突变为Ala133。这些突变的蛋白质和/或编码这些蛋白质的多核苷酸具有例如体外治疗或基因治疗的作用，以工程化表达保留在工程化细胞表面的Neutrokine-α多肽的细胞。
在一特异的实施方案中，SEQ ID NO2所示Neutrokine-α序列的Cys146突变为其它氨基酸残基或缺失，以例如有助于阻止或减少当在表达系统中表达时Neutrokine-α多肽突变体的寡聚体化(基本如实施例1所述)。在一特异的实施方案中，Cys146用丝氨酸残基置换。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
在另一特异的实施方案中，SEQ ID NO2所示Neutrokine-α序列的Cys232突变为其它氨基酸残基或缺失，以有助于阻止或减少当在表达系统中表达时Neutrokine-α多肽突变体的寡聚体化(基本如实施例1所述)。在一特异的实施方案中，Cys232用丝氨酸残基置换。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
在另一特异的实施方案中，SEQ ID NO2所示Neutrokine-α序列的Cys245突变为其它氨基酸残基或缺失，以例如有助于阻止或减少当在表达系统中表达时Neutrokine-α多肽突变体的寡聚体化(基本如实施例1所述)。在一特异的实施方案中，Cys245用丝氨酸残基置换。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明的多肽优选是分离形式的，且优选是基本纯化的。重组生产的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽可通过Smith和Johnson在基因6731-40(1988)中所述的一步法而基本纯化。
本发明的多肽包括由保藏的cDNA(ATCC保藏号97768)编码的完整多肽，包括由保藏的cDNA编码的多肽的胞内域，跨膜域和胞外域，由保藏的cDNA编码的成熟可溶的多肽，蛋白质的胞外域减去胞内域和跨膜域，图1A和1B的完整多肽(SEQ ID NO2的1-285位氨基酸残基)，图1A和1B的成熟可溶多肽(SEQ ID NO2的134-285位氨基酸残基)，图1A和1B的胞外域(SEQ ID NO2的73-285位氨基酸残基)减去胞内域和跨膜域，以及与上述多肽有至少80％，85％，90％，优选至少95％，更优选至少96％，97％，98％或99％相似性的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明的多肽包括由保藏的cDNA(ATCC保藏号203518)编码的完整多肽，包括由保藏的cDNA编码的多肽的胞内域，跨膜域和胞外域，由保藏的cDNA编码的成熟可溶的多肽，蛋白质的胞外域减去胞内域和跨膜域，图5A和5B的完整多肽(SEQ ID NO19的1-266位氨基酸残基)，图5A和5B的胞外域(SEQ ID NO2的73-266位氨基酸残基)减去胞内域和跨膜域，以及与上述多肽有至少80％，85％，90％，优选至少95％，更优选至少96％，97％，98％或99％相似性的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明的其它多肽包括与保藏的cDNA(ATCC No.97768)编码的或图1A和1B(SEQ ID NO2)所示多肽有至少80％或85％，优选至少90％或95％，更优选至少96％，97％，98％或99％相同性的多肽，也包括这种多肽的具有至少30个，优选至少50个氨基酸的一部分。编码这种多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明的其它多肽包括与保藏的cDNA(ATCC No.203518)编码的或图5A和5B(SEQ ID NO19)所示多肽有至少80％或85％，优选至少90％或95％，更优选至少96％，97％，98％或99％相同性的多肽，也包括这种多肽的具有至少30个，优选至少50个氨基酸的一部分。编码这种多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
两个多肽之间的“相似性百分率”是指用Bestfit程序(Wisconsin序列分析软件包，用于Unix的8版本遗传学计算机小组，大学研究园，575 Science Drive，Madison，WI53711)及设立默认参数对比两个多肽的氨基酸序列，以确定相似性而产生的相似性范围。Bestit使用Smith和Waterman的局部同源序列对比(Advances in AppliedMathematics 2482-498，1981)，以发现两个序列间最佳相似区段。
具有与参照的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的氨基酸序列有例如至少95％“相同性”的氨基酸序列的多肽，是指此多肽的氨基酸序列与参照序列是相同的，除了此多肽序列可包括参照Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的氨基酸序列的每100个氨基酸有至多5个改变。换而言之，为获得含有与参照氨基酸序列有至少95％相同性的氨基酸序列的多肽，参照序列中5％的氨基酸残基可缺失或用其它氨基酸取代，或占参照序列总氨基酸残基数5％的氨基酸可插入到参照序列中。参照序列的这些变化可发生在参照序列的氨基端或羧基端，或发生在这些末端之间的任何位置，分散在参照序列各个残基之间或在参照序列的一或多个连续组中。
实际上，任何特殊的多肽是否与以下序列有至少80％，85％，90％，95％96％，97％，98％或99％相同性，可用已知计算机程序如Bestfit程序(如前)确定，所述序列是例如图1A和1B(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列，由保藏的cDNA克隆HNEDU15(ATCC NO.97768)编码的氨基酸序列，或它们的片段，或例如是图5A和5B(SEQID NO19)所示氨基酸序列，由保藏的cDNA克隆HDPMC52(ATCCNO.203518)编码的氨基酸序列或它们的片段。当用Bestfit或任何其它序列对比程序以确定一特殊序列是否与本发明的参照序列有例如至少95％相同性时，当然要设立参数，这样在全长参照序列上计算相同性百分率，且允许有占参考序列总氨基酸残基数5％的同源缺口。
在特异的实施方案中，参照(参比)序列(本发明的序列)和目标序列之间的相同性，也称作整体序列对比，是用基于Brutlag等的序列对比的FASTDB计算机程序(Comp.App.Biosei.6237-245(1990)确定的。用于FASTDB氨基酸序列对比的优选参数是Matrix＝PAM 0，K-tuple＝2，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列长度，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或目标序列长度，取更短的。根据此实施方案，如果目标序列由于N或C末端缺失而非因为内在缺失而短于参比序列，对结果要进行人工调整，因为FASTDB程序在计算整体相同性百分比时，未考虑到目标序列N和C末端的截短。就相对于参比序列，目标序列在N和C末端截短而言，相同性百分率通过计算不与相应目标序列匹配的是目标序列N和C末端的参比序列的残基数而调整，作为参比序列总碱基数的百分比。确定一个残基是否匹配是通过FASTDB序列对比结果确定的。然后将此百分率从通过FASTDB程序用特定参数计算出来的相同性百分率中减去，得到最终相同性百分率范围。此最终相同性百分率才可用于本发明。只有目标序列的N和C末端残基不与参比序列匹配，才需要人工调整相同性百分率。即只有参比序列残基位在目标序列的最远N和C末端残基之外。例如，一个90个氨基酸残基的目标序列与100个残基的参比序列对比确定相同性百分率。缺失发生在目标序列的N末端，因而FASTDB对比未显示出在N末端前10个残基的匹配。此10个未成对的残基代表序列的10％(在N和C末端未匹配的残基数/参比序列中总残基数)，因此将此10％从经FASTDB程序计算的相同性百分比中减去。如果剩余的90个残基充分匹配，则最终相同性百分比为90％。在另一实施方案中，一个90个残基的目标序列与100个残基的参比序列对比。这次缺失是内在缺失，因此在目标序列的N和C末端没有未与参比序列匹配的残基。在此情况下，经FASTDB计算的相同性百分率不同人工调整。再者，只有位于目标序列N和C末端外的残基不与参比序列匹配，如FASTDB序列对比所示，此时需要人工调整。本发明不需要进行其它人工调整。
本发明多肽的用途包括但非限于在SDS-PAGE凝胶上或在分子筛凝胶过滤柱上，使用本领域熟知方法作为分子量标记。另外，如以下详述，本发明多肽的用途包括但非限于产生多克隆和单克隆抗体，用于检测Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的表达，或作为能增强或抑制Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV功能的激动剂和拮抗剂。本发明的多肽还具有如下述的治疗作用。另外，这种多肽能用于酵母双杂交系统以“捕捉”也是本发明候选激动剂和拮抗剂的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV结合蛋白。此酵母双杂交系统见于Fields和Song，自然340245-246(1989)所述。转基因与“剔除”本发明多肽也可在转基因动物中表达。任何物种动物包括但非限于大鼠，小鼠，兔，仓鼠，豚鼠，猪，小猪，山羊，绵羊，奶牛和非人灵长目动物如狒狒，猴，和黑猩猩可用于产生转基因动物。在一特异的实施方案中，本文所述方法及本领域已知其它方法用于在人体内表达本发明多肽，作为基因疗法的一部分。
本领域任何已知方法可用于将转基因(即本发明的多核苷酸)导入动物体内，以产生转基因动物的建立者品系。这种方法包括但非限于前核微注射(Paterson等，应用微生物学生物技术40691-698(1994)；Carver等，生物技术(NY)111263-1270(1993)；Wright等，生物技术(NY)9830-834(1991)；和Hoppe等，美国专利No.4873191(1989))；逆转录病毒介导的基因转移至生殖细胞系中(Vander putten等，美国科学院院报826148-6152(1985)，胚泡或胚胎中；胚胎干细胞中基因定向(Thompson等，细胞56313-321(1989))；细胞或胚胎的电穿孔(Lo，1983，分子细胞生物学31803-1814(1983))；用基因枪导入本发明的多核苷酸(见Ulmer等，科学2591745(1993)；将核酸构建体导入胚胎多能性干细胞中并将此干细胞再移回胚泡中；及精子介导的基因转移(Lavitrano等，细胞57717-723(1989)；等。对这些方法的综述见Gordon，“转基因动物”，Int′l Rev Cytol.115171-229(1989)所述，其全文并入参考。也见于美国专利No.5464764(Capecchi等，阳性/阴性选择方法及载体)；美国专利No.5631153(Capecchi等，含有预定的基因组修饰的细胞和非人生物体及生产它们的阳性/阴性选择方法及载体)；美国专利No.4736866(Leder等，转基因非人动物)；和美国专利No.4873191(Wagner等，受精卵的遗传转化)；以上文献均全文并入参考。
本领域已知的任何方法均可用于生产含有本发明多核苷酸的转基因克隆，例如，将细胞核移至诱导为静止状态的培养的胚胎，胎儿或成体细胞的去核卵母细胞中(Campell等，自然38064-66(1996)；Wilmut等，自然385810-813(1997))。
本发明提供了在其所有细胞中均携带转基因的转基因动物，以及在其一些而不是全部细胞中携带转基因的动物，即镶嵌或嵌合动物。此转基因可以作为单一转基因或多个拷贝如多联体例如头头串联或头尾串联形式整合。转基因也可选择性地导入特定细胞类型中并在其中活化，例如通过Lasko等教导(Lasko等，美国科学院院报896232-6236(1992))。为这种细胞类型特异性活化所需的调节序列依赖于相应的特殊细胞类型而定，并为本领域技术人员所显而易见。当需要将多核苷酸转基因整合入内源基因的染色体位置时，优选基因定向。简而言之，当使用这种方法时，设计含有同源于内源基因的一些核苷酸序列的载体，整合入内源基因的核苷酸序列中并破坏其功能，所述载体是通过用染色体序列同源重组的。转基因也可选择性地导入特定细胞类型中，因此灭活只在此细胞类型中的内源基因，例如由Gu等教导(Gu等，科学265103-106(1994))。为这种细胞类型特异性灭活所需的调节序列将依赖于相应的特殊细胞类型而言，并为本领域技术人员所显而易见。除了在转基因动物中以遍在或组织特异性方式表达本发明多肽之外，产生通过各种其它方式调节多肽表达的构建体(例如发育性或化学性调节的表达)，对本领域技术人员而言也是轻而易举的。
一旦已产生转基因动物，可利用标准方法分析重组基因的表达。初始可通过Southern印迹分析或PCR筛选，以分析动物组织查证转基因整合是否已经发生。转基因在转基因动物组织内的mRNA表达水平也可用以下方法确定，所述方法包括但非限于对得自动物的组织样品进行Northern印迹分析，体内杂交分析，逆转录酶-PCR(rt-PCR)；和TagMan PCR。表达转基因的组织样品也可用特异于转基因产物的抗体进行免疫细胞化学性或免疫组织化学性评价。
一旦产生建立者动物，可将它们繁殖，近亲繁殖，远亲繁殖或杂交繁殖以产生特定动物群落。这种繁殖方法例如包括但非限于远亲繁殖具有一个以上整合位点的建立者动物以建立分离的品系；近亲繁殖分离的品系以产生在高水平表达转基因的转基因化合物，高水平表达是因为每个转基因的表达累加的影响所致；交叉繁殖杂合子转基因动物产生给定整合位点的动物纯合子以增大表达及消除通过DNA分析筛选动物之需；交叉繁殖分离的纯合子品系以产生杂合子或纯合子品系化合物；将转基因在适于试验模型的不同背景中繁殖；并将转基因动物繁殖为携带不同转基因或剔除突变的其它动物。
本发明的转基因及“剔除”动物的用途包括但非限于用于在阐述Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽生物功能，研究与异常Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV表达相关的疾病，及筛选改善这种疾病的有效化合物中作为动物模型系统。
在本发明另外的实施方案中，将基因工程化的表达或不表达(如剔除)本发明多肽的细胞在体内施用于患者。这种细胞可得自患者(即动物，包括人)或MHC相容的供体，且可包括但非限于成纤维细胞，骨髓细胞，血细胞(如淋巴细胞)，脂肪细胞，肌细胞，内皮细胞等。细胞是在体外用重组DNA方法基因工程化的，将本发明多肽的编码序列导入细胞，或者破坏本发明多肽的编码序列和/或与之相关的内源性调节序列，如通过转导(用病毒载体，优选将转基因整合入细胞基因组的载体)，或转染法包括但非限于用质粒，粘粒，YACs，裸DNA，电穿孔，脂质体等。本发明多肽的编码序列可置于强组成型或诱导型启动子或启动子/增强子的控制下，以表达优选分泌本发明的多肽。表达且优选分泌本发明多肽的工程化细胞可全身性地导入患者体内，如在循环中或腹膜内导入。
或者，此细胞可掺入基质中并植入体内，如基因工程化的成纤维细胞可作为皮肤移植物的一部分而植入；基因工程化的内皮细胞可作为淋巴管或血管移植物的一部分而植入(见例如Anderson等，美国专利No.5399349；和Mulligan和Wilson，美国专利No.5460959所述，均并入参考)。
当施用的细胞是非自身的或非MHC相容性的细胞时，可将它们通过使用熟知的组织宿主对导入的细胞产生免疫应答的方法施用。例如，细胞可以胶囊形式导入，使组分立即与胞外环境交换，而不使导入的细胞被宿主免疫系统识别。抗体本发明其它的多肽涉及抗体及T细胞抗原受体(TCR)，其免疫特异性地结合本发明的SEQ ID No2和/或SEQ ID No19的多肽，多肽片段或变体，和/或表位(通过本领域熟知的分析特异性抗体-抗原结合的免疫分析确定)。本发明的抗体包括但非限于多克隆抗体，单克隆抗体，多特异性抗体，人抗体，人化抗体或嵌合抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab′)片段，由Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体(包括抗本发明抗体的抗独特型抗体)及以上任何抗体的表位结合片段。术语“抗体”是指免疫球蛋白分子及其免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类别(如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2)或亚类免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可以是重链或轻链的。一批IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY重链可以与K或λ形式的轻链配对。
最优选的抗体是本发明的结合人抗原的抗体片段，包括但非限于Fab，Fab′，和F(ab′)2，Fd，单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连的Fvs(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。结合抗原的抗体片段，包括单链抗体，可只包含可变区或包含与所有或部分以下区域的组合绞链区，CH1，CH2，和CH3结构域。本发明还包括也包含可变区与绞链区，CH1，CH2，和CH3结构域任意组合的结合抗原的片段。本发明的抗体可来自任何动物包括鸟和哺乳动物。优选地，抗体是人，鼠(如大鼠和小鼠)，驴，兔，山羊，豚鼠，骆驼，马或鸡。文中所用“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并包括分离自人免疫球蛋白文库或分离自用一或多种人免疫球蛋白转基因的且不表达内源性免疫球蛋白的动物的抗体，如前所述及Kucherlapati等美国专利No.5939598所述。
本发明的抗体可以是单特异性，双特异性，三重特异性或更多重特异性的。多特异性抗体可以是特异于本发明多肽的不同表位，或可以特异于本发明多肽以及异源表位如异源多肽或固体支持物。例如见于PCT出版物WO93/17715；WO 92/08802；WO91/00360；WO 92/05793；Tutt等，免疫学杂志14760-69(1991)；美国专利No.4474893；4714681；5573920；5601819；Kostelng等，免疫学杂志1481547-1553(1992)。
本发明的抗体可以用它们识别或特异结合的本发明多肽的表位或一部分等术语加以阐述。所述表位或多肽的一部分可以例如通过N末端和C末端位置，连续氨基酸残基的大小，或列于表及图中加以阐述说明。特异结合本发明任何表位或多肽的抗体也可被排除。因此，本发明包括特异结合本发明多肽的抗体，并允许排除相同的抗体。
在特异的实施方案中，本发明的抗体与包含以下氨基酸序列的多肽结合SEQ ID No2的Phe115-Leu147，Ile150-Tyr163，Ser171-Phe194，Glu223-Tyr246，和Ser271-Phe278的氨基酸序列。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体与包含以下氨基酸序列的多肽结合SEQ ID No2的Phe115-Leu147，Ile150-Tyr163，Ser171-Phe194，Glu223-Tyr246，和Ser271-Phe278的氨基酸序列。在一优选的实施方案中，本发明的抗体与包含SEQ ID No2的Glu223-Tyr246的多肽结合。在另一优选的实施方案中，本发明的抗体与由SEQ ID No2的Glu223-Tyr246组成的多肽结合。在一更优选的实施方案中，本发明的抗体与由SEQ ID No2的Phe230-Asn242组成的多肽结合。在另一优选的实施方案中，本发明的抗体通过特异性结合抑制本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的一或多种生物活性。在更优选的实施方案中，本发明的抗体抑制Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的B细胞增殖。
本发明的抗体还可以其交叉反应性加以阐述或说明。本发明包括不结合本发明多肽的任何其它类似物，直向同源物，或同源物的抗体。本发明还包括结合与本发明多肽有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％及50％相同性(用本领域已知方法及本文所述方法计算的)的多肽的抗体。在特异的实施方案中，本发明的抗体与人体蛋白的大鼠，小鼠和/或兔同源物及其相应表位交叉反应。本发明还包括不结合与本发明多肽的相同性少于95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，50％(用本领域已知方法及本文所述方法计算的)的多肽的抗体。在一特异的实施方案中，上述交叉反应性是关于任一特异性抗原性或免疫原性多肽，或2，3，4，5或多个特异抗原性和/或免疫原性多肽的组合的。本发明还包括结合一种多肽的抗体，该多肽由在杂交条件下(如本文所述)与本发明多核苷酸杂交的多核苷酸编码。本发明的抗体还可以其与本发明多肽的结合亲和性加以阐述或说明。优选的结合亲和性包括那些具有解离常数或Kd少于5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10- 13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，或10-15M的抗体。
本发明还提供了竞争性抑制抗体与本发明表位结合的抗体，如通过本领域已知确定竞争性结合的任何方法确定，例如本文所述的免疫分析法。在优选的实施方案中，抗体竞争性抑制与表位的结合有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，60％，或50％。
本发明的抗体可作为本发明多肽的激动剂或拮抗剂。例如，本发明包括部分或全部破坏受体/配体与本发明多肽相互作用的抗体。优选地，本发明的抗体结合本文所述的抗原性表位或其一部分。本发明包括受体特异性抗体和配体特异性抗体。本发明还包括不阻止配体结合但阻止受体活化的受体特异性抗体。受体活化(即信号)可通过本文所述或本领域已知其它方法确定。例如，受体活化可通过检测受体或其底物的磷酸化(如酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸)加以确定，检测是通过免疫沉淀随后进行Western印迹分析(如前述)进行的。在特异的实施方案中，提供了抑制配体活性或受体活性的抗体，所抑制的活性比无抗体存在情况下至少抑制95％，90％，85％，80％，75％，70％，60％，或50％。
本发明还包括阻止配体结合和受体活化的受体特异性抗体，以及识别受体-配体复合物，优选不特异识别未结合的受体或未结合的配体的抗体。本发明还包括结合配体并阻止配体与受体结合的中性化抗体，以及结合配体，从而阻止受体活化但不阻止配体与受体结合的抗体。本发明另外包括激活受体的抗体。这些抗体可作为受体激动剂，即增强或激活全部或部分配体介导的受体活化的生物活性，例如通过诱导受体二聚体化而进行。抗体可作为激动剂，拮抗剂或反向激动剂加以说明其生物活性，包括本发明肽的特异生物活性。上述抗体激动剂可用本领域已知方法生产。见例如PCT公布WO92/40281；美国专利No.581109；Deng等，血液92(6)1981-1988(1998)；Cher等，癌症研究58(16)3668-3678(1998)；Harrop等，免疫学杂志161(4)1786-1794(1998)；Zhu等，癌症研究58(15)3209-3214(1998)；Yoon等，免疫学杂志160(7)3170-3179(1998)；Prat等，细胞科学杂志111(Pt2)237-247(1998)；Pitard等，免疫学方法杂志205(2)177-190(1997)；Liautard等，细胞因子9(4)233-241(1997)；Carlson等，生物化学杂志272(17)11295-11301(1997)；Taryman等，神经元14(4)755-762(1995)；Muller等，结构6(9)1153-1167(1998)；，Bartunek等，细胞因子8(1)14-20(1996)(所有文献均全文并入参考)。
本发明的抗体可例如用于但非限于纯化，检测及定向本发明的多肽，包括用于体外和体内诊断及治疗方法。例如，抗体可用于免疫分析中以定量及定性测定生物样品中本发明多肽的水平。见例如Harlow等，抗体实验手册(冷泉港实验室出版，第二卷，1988)(全文并入参考)。
如下更详尽的阐述，本发明的抗体可单独或与其它组合物组合使用。抗体可在N或C末端融合于异源多肽，或化学缀合于(包括共价和非共价缀合)多肽或其它组合物。例如，本发明的抗体可重组融合或缀于用作检测分析中标记的分子及效应器分子如异源多肽，药物，放射性核素或毒素。见例如PCT公布WO 92/08495；WO91/14438；WO 89/12624；美国专利No.5314995；和EP 396387。
本发明的抗体包括修饰的衍生物，即通过任何类型分子共价附着于抗体，这样共价附着不阻止抗体产生抗独特型应答。抗体衍生物例如但非限于包括通过以下方式修饰的抗体例如通过糖基化，乙酰化，PEG化，磷酸化，酰胺化，通过已知保护/阻断基团的衍生化，蛋白酶切，与细胞配体或其它蛋白质连接等。可通过已知方法进行任何化学修饰，包括但非限于特殊化学裂解，乙酰化，甲酰化，衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可含有一或多个非经典的氨基酸。
本发明的抗体可通过任何本领域已知方法产生。相应抗原的多克隆抗体可通过本领域熟知的各种方法产生。例如，可将本发明的独特施用于各种宿主动物包括但非限于兔，大鼠，小鼠等，以诱导含有特异于抗原的多克隆抗体的血清产生。根据宿主物种可使用各种佐剂以提高兔免疫应答，佐剂包括但非限于Freund′s(完全或不完全)佐剂，无机物凝胶如氧化铝，表面活性剂如溶血卵磷脂，多醇，聚阴离子，肽，油乳胶，匙孔嘁血蓝蛋白，二硝基苯酚，和潜在有效的人佐剂如BCG(卡介苗)，和短小棒杆菌。这些佐剂已为本领域所熟知。
单克隆抗体可用各种本领域已知方法制备，包括使用杂交瘤，重组，和噬菌体展示法，或将它们组合使用。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法产生，该方法包括本领域已知的那些方法并如Harlow等，抗体实验手册(冷泉港实验室出版，第二卷，1988)；Hammerling等，单克隆抗体和T细胞杂交瘤563-681(Elsevier，N.Y.1981)所教导(所述文献全文并入参考)。术语“单克隆抗体”非限于通过杂交瘤方法产生的抗体。术语“单克隆抗体”指衍生自单一克隆包括任何真核，原核或噬菌体克隆的抗体，而不是指生产其的方法。
“单克隆抗体”可包含或由两种蛋白质组成，即重链和轻链。
用杂交瘤方法生产及筛选特异抗体的方法为本领域所熟知，并详见于实施例中所述(如实施例9)。在一非限制性的实施例中，可用本发明的独特或表达这种独特的细胞接种。一旦检测到免疫应答，如在鼠血清中检测到特异于抗原的抗体，将鼠的脾摘下并分离脾细胞。然后将脾细胞通过熟知方法融合于任何适当的骨髓瘤细胞，例如得自ATCC的SP20细胞系的细胞。选择杂交瘤并通过限制性稀释克隆。然后通过本领域已知方法分析杂交瘤克隆的分泌能结合本发明独特的抗体的细胞。通常含有高水平抗体的腹水可通过用阳性杂交瘤克隆接种鼠而产生。
因此，本发明提供了产生单克隆抗体的方法以及通过此方法产生的抗体，该方法包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中优选地此杂交瘤是通过融合脾细胞与骨髓瘤细胞而产生的，脾细胞分离自用本发明的抗原免疫接种的鼠，然后筛选得自融合体的杂交瘤，选择分泌能结合本发明独特的抗体的杂交瘤克隆。
识别特异性表位的抗体片段可通过已知方法产生。例如，本发明的Fab和F(ab′)2片段可通过蛋白酶解免疫球蛋白分子而产生，使用的酶如是木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)，或胰蛋白酶(产生F(ab′)2片段)。F(ab′)2片段含有可变区，轻链恒定区和重链的CH1结构域。
例如，本发明的抗体也可用本领域已知的各种噬菌体展示法产生。在噬菌体展示法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面。在特异的实施方案中，这种噬菌体可用于展示表达自所有组成成分或组合抗体文库的抗原结合结构域。表达结合相应抗原的抗原结合结构域的噬菌体可用抗原选择或鉴别，如用标记的抗原或结合或捕捉于固体表面或珠的抗原。这些方法中使用的噬菌体是典型的丝状噬菌体，包括表达自噬菌体的fd和M13结合结构域，该噬菌体具有重组融合于噬菌体基因III或基因VIII蛋白质的Fab，Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域。可用于生产本发明抗体的噬菌体展示法例如包括以下参考文献所述的那些方法如Brinkman等，免疫方法杂志18241-50(1995)；Ames等，免疫方法杂志184177-186(1995)；Kettleborough等，欧洲免疫学杂志24952-958(1994)；Persic等，基因1879-18(1997)；Burton等，免疫学进展57191-280(1994)；PCT申请No.PCT/GB91/01134；PCT公布WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/20401；和美国专利No.5698426，5223409，5403484，5580717，5427908，5750753，5821047，5571698，5427908，5516637，5780225，5658727，5733743，和5969108所述，以上文献均全文并入参考。
如以上参考文献所述，在噬菌体选择之后，噬菌体中的抗体编码区可分离并用于产生整个抗体，包括人抗体，或任何其它所需的抗原结合片段，并可在任何所需宿主包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母和细菌中表达，如以下详述。例如，重组产生Fab，Fab′和F(ab′)2片段的方法也可通过本领域已知方法应用，如PCT公布WO 92/22324；Mullinax等，生物技术12(6)864-869(1992)；和Sawai等，AJRI 3426-34(1995)；和Better等，科学2401041-1043(1988)所述，所述文献均全文并入参考。
可用于产生单链Fvs及抗体的方法例如包括美国专利4946778和5258498；Huston等，酶学方法20346-88(1991)；Shu等，PNAS907995-7999(1993)；和SKerra等，科学2401038-1040(1988)所述的那些方法。对于一些应用，包括在人体内使用抗体及体外检测分析而言，优选使用嵌合，人化或人抗体。嵌合抗体是一种分子，其中抗体的不同部分衍生自不同物种的动物，如抗体具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区及人免疫球蛋白恒定区。产生嵌合抗体的方法本领域已知。见例如Morrison，科学2291202(1985)；Oi等，生物技术4214(1986)；Gillies等(1989)，免疫方法杂志125191-202；美国专利No.5807715，4816567和4816397所述。人化抗体是来自非人物种抗体的抗体分子，其结合具有非人物种的一或多个互补决定区(CDR)和人免疫球蛋白分子的框架区的所需抗原。通常，人框架区域内的框架残基将用CDR供体抗体的相应残基取代，以改变优选改良抗原结合。这些框架取代是通过本领域熟知方法鉴别的，如通过建立CDR与框架残基的相互作用模型，以鉴别对抗原结合重要的框架残基，并进行序列对比以鉴别在特殊位置的独特的框架残基(见例如Queen等，美国专利No.5585089；Riechmann等，自然332323(1988)，全文并入参考)。抗体可用本领域已知多种方法人源化，例如包括CDR移位(EP239400；PCT出版物；/09967美国专利No.5225539，5530101，和5585089)，Veneering或重新表面化(EP592106；EP 519596；Padlan，分子免疫学28(4/5)489-498(1991)；Studnicka等，蛋白质工程7(6)805-814(1994)；Roguska等，PNAS 91969-973(1994))，和链改组(美国专利No.5565332)。
完全人抗体是治疗病人所特需的。人抗体可通过本领域已知各种方法生产，包括上述使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示法。见于美国专利No.4444887，和4716111；及PCT出版物WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO96/34096，WO 96/33735和WO 91/10741所述，每个文献均以全文并入参考。
人抗体也可用转基因鼠产生，该转基因鼠不能表达功能内源性免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可随机导入或同源重组入鼠胚胎干细胞中。或者，除了人重链和轻链基因之外，人可变区，恒定区和多变区可导入鼠胚胎干细胞中。鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以非功能性分离或通过同源重组同时导入人免疫球蛋白基因座。尤其地，JH区的纯合缺失阻止内源抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩展并微注射到胚泡中以产生嵌合鼠。然后繁殖嵌合鼠产生表达人抗体的纯合子代。将转基因鼠以正常方式用选择的抗原如本发明多肽的全部或一部分免疫接种。直接抗抗原的单克隆抗体可得自用常规杂交瘤方法免疫接种的转基因鼠。人免疫球蛋白转基因通过转基因鼠在B细胞分化期间重排，随后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用这种方法可能产生有治疗用途的IgG，IgA，IgM和IgE抗体。关于这种产生人抗体的方法的一般研究见Lonberg和Huszar，免疫学研究Int.1365-93(1995)所述。产生人抗体和人单克隆抗体的方法及产生这种抗体的方案详见例如PCT出版物WO 98/24893，WO 92/01047，WO96/34096，WO 96/33735；欧洲专利No.0598877；美国专利No.5413923，5625126，5633425，5569825，5661016，5545806，5814318，5885793，5916771和5939598所述，以上文献均全文并入参考。另外，Abgenix公司(Freemont，CA)和Genpharm公司(San Jose，CA)可提供直接抗选择的抗原的人抗体，使用类似于上述那些方法生产。
识别选择的表位的完全人抗体可用称作“指导选择”的方法产生。在此方法中，选择的非人单克隆抗体如鼠抗体，用于指导选择识别相同表位的完全人抗体(Jespers等，生物技术12899-903(1988))。
另外，本发明多肽的抗体可用于产生“模拟”本发明多肽的抗独特型抗体，使用本领域熟知的方法(见例如Greenspan和Bona，FASEB杂志7(5)437-444，(1989)和Nissinoff，免疫学杂志147(8)2429-2438(1991))。例如，结合并竞争性抑制多肽多聚体化和/或本发明多肽与配体结合的抗体，可用于产生“模拟”多肽多聚体化和/或结合结构域，并因此结合并中和化多肽和/或其配体的抗独特型。这种中和抗独特型抗体或这种抗独特型抗体的Fab片段可用于治疗方案中以中和多肽配体。例如，这种抗独特型抗体可用于结合本发明的多肽和/或结合其配体/受体，从而阻断其生物活性。编码抗体的多核苷酸本发明还提供了包含编码本发明抗体的核苷酸序列及其片段的多核苷酸。本发明还涵盖了在严格或低严格杂交条件下(如前所述)，与编码抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸，所述抗体优选特异地结合本发明的多肽，更优选地结合具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。在另一优选的实施方案中，抗体特异地结合具有SEQ ID NO19氨基酸序列的多肽。在另一优选的实施方案中，抗体特异地结合具有SEQ ID NO23氨基酸序列的多肽。在另一优选的实施方案中，抗体特异地结合具有SEQ ID NO28氨基酸序列的多肽。在另一优选的实施方案中，抗体特异地结合具有SEQ ID NO30氨基酸序列的多肽。
多核苷酸可通过本领域已知任何方法获得，且多核苷酸的核苷酸序列可通过本领域已知任何方法确定。例如，如果已知抗体的核苷酸序列，编码抗体的多核苷酸可装配自化学合成的寡核苷酸(如Kutmeier等，生物技术17242(1994)所述)，简而言之，包括合成含有编码抗体的序列一部分的重叠寡核苷酸，退火并连接这些寡核苷酸，然后经PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，编码抗体的多核苷酸可产生自适当来源的核酸。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不能获得，但已知抗体分子的序列，则编码免疫球蛋白的核酸可化学合成，或使用可与待鉴别的特定基因序列，例如来自编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆的3′和5′末端杂交的合成引物经PCR扩增得自适当来源或用特异于该序列的寡核苷酸探针经克隆得自适当来源(例如抗体cDNA文库，或产生自表达抗体的任何组织或细胞如选择用于表达本发明的抗体的杂交瘤细胞的cDNA文库，或分离自表达抗体的任何组织或细胞的核酸、优选聚A+RNA)。通过PCR产生的扩增的核酸然后可用本领域任何熟知方法克隆入可复制的克隆载体中。
一旦确定抗体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，可用本领域熟知方法操纵抗体的核苷酸序列，如重组DNA方法，定点诱变，PCR等(见例如Sambrook等，1990，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，NY和Ausubel等编辑，1998，分子生物学通用方法，John Wiley和Sons，NY所述所述文献全文并入参考)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代，缺失和/或插入。
在一特异的实施方案中，对重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列进行检查，以鉴别互补决定区(CDR)的序列，通过本领域熟知方法检查，如对比其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列，以确定序列高度可变性的区域。使用常规重组DNA方法，可将一或多个CDR插入框架区中，如插入人框架区中以人源化非人抗体，如前所述。框架区可以是天然发生的或是共有框架区，且优选是人框架区(见例如Chothia等，分子生物学杂志278457-479(1998)所列的人框架区)。优选地，通过组合框架区和CDR产生的多核苷酸编码特异结合本发明多肽的抗体。优选地，如前所述，在框架区内可进行一或多个氨基酸取代，且优选地，此氨基酸取代改良抗体与其抗原的结合。另外，这种方法可用于产生参与链内二硫键的一或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，以产生缺失一或多个链内二硫键的抗体分子。多核苷酸的其它变化也涵盖在本发明内。
另外，可以使用生产“嵌合抗体”的方法(Morrison等，美国科学院院报81851855(1984)；Neuberger等，自然312604-608(1984)；Takeda等，自然314452-454(1985))，通过剪接来自适当抗原特异性的鼠抗体分子的基因，与来自适当生物活性的人抗体分子的基因而进行。如前所述，嵌合抗体是一种分子，其中不同部分衍生自不同物种动物，如那些具有衍生自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的嵌合抗体，例如人化抗体。
或者，可使用产生单链抗体的方法(美国专利No.4946778；Bird，科学242423-42(1988)；Huston等，美国科学院院报855879-5883(1988)；和Ward等，自然334544-54(1989)，产生单链抗体。单链抗体是通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段，产生单链抗体。也可使用在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的方法(Skerra等，科学2421038-1041(1988))。生产抗体的方法本发明的抗体可通过本领域已知的任何合成抗体，尤其通过化学合成或优选通过重组表达方法而生产。本发明的抗体或其片段，衍生物或类似物(如本发明抗体的重链或轻链，或本发明的单链抗体)的重组表达，要求构建一个含有编码抗体的多核苷酸的表达载体。一旦已经获得编码本发明抗体分子或其重链或轻链或其一部分(优选含有重链或轻链可变结构域的部分)的多核苷酸，生产抗体分子的载体可用本领域熟知的方法通过重组DNA方法产生。因此，本文阐述了通过表达含有抗体编码序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。可用本领域熟知的方法构建含有抗体编码序列和适当转录及翻译控制信号的表达载体。这些方法例如包括体外重组DNA方法，合成法，及体内遗传重组。因此本发明提供了一种可复制载体，其包含可操纵地连于启动子，编码本发明抗体分子或其重链或轻链，或重链或轻链可变区的核苷酸序列。这种载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(见例如PCT出版物WO86/05807；PCT出版物WO89/01036；和美国专利No.5 122464)，且抗体的可变结构域可克隆入这种载体中以表达全部重链或轻链。
将表达载体通过常规方法移至宿主细胞中，然后将转染的细胞通过常规方法培养以产生本发明的抗体。因此，本发明包括含有可操纵地连于异源启动子，编码本发明抗体，其重链或轻链，或本发明单链抗体的多核苷酸的宿主细胞。在表达双链抗体的优选的实施方案中，编码重链和轻链的载体可在宿主细胞中共同表达，以表达全部免疫球蛋白分子，如下所述。
可用各种宿主表达载体系统表达本发明的抗体分子。这种宿主表达系统代表一种载体，通过它可产生相应的编码序列并随后纯化，但也代表一种细胞，当用适当核苷酸编码序列转化或转染时，该细胞可原位表达本发明的抗体分子。这些宿主表达系统包括但非限于微生物，如用含有抗体编码序列的重组细菌噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌，枯草杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如糖酵母，毕赤氏酵母)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的，或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有含有衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5k启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(如COS，CHO，BHK，293，3T3细胞)。优选地，细菌细胞如大肠杆菌，更优选地，尤其表达整个重组抗体分子的真核细胞用于表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，与载体联合是抗体的有效表达系统，该载体如是人巨细胞病毒的主要中早期基因启动子因子(Foecking等，基因45101(1986)；Cockett等生物/技术82(1990)。
在细菌系统中，根据被表达的抗体分子所用，可选择许多有利的表达载体。例如，当生产出大量这种蛋白质时，为产生抗体分子的药物组合物，需要直接高水平表达易于纯化的融合蛋白产物的载体。这种载体包括但非限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO杂志21791(1983))，其中抗体编码序列单独连接具有LacZ编码区的框架中的载体中，产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和InouYe，核酸研究133101-3109(1985)；Van Heeke和Schuster，生物化学杂志245503-5509(1989))等。pGEX载体也可用于表达作为与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。通常地，这种蛋白是可溶的，且易于从裂解的细胞中纯化，通过吸附并结合于基质谷胱甘肽-琼脂糖珠，随后在存在游离谷胱甘肽的情况下洗脱而纯化。pGEX载体包括凝血酶或因子Xo蛋白酶解位点，以便克隆的靶基因产物可从GST组分中释出。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。该病毒在草地夜蛾细胞中生长。抗体编码序列可单独克隆入病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可使用许多基于病毒的表达系统。当腺病毒用作表达载体的情况下，相应的抗体编码曲线可连于腺病毒转录/翻译控制复合物，如晚期启动子和三联前导序列。然后此嵌合基因可通过体外或体内重组插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区(如E1区或E3区)的插入产生重组病毒，其是存活的，且能在感染的宿主中表达抗体分子(例如见Logan和Shenk，美国科学院院报81355-359(1984))。也可需要特异的起始信号以有效地翻译抗体编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。另外，起始密码子必须具有所需编码序列的读框，以保证全部插入体均翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是各种起源的，如天然和合成的。表达效力可通过包含适当的转录增强子因子，转录终止子等得以加强(见Bitther等，酶学方法15351-544(1987))。
另外，可选择调节插入序列的表达或以特异所需方式修饰及加工基因产物的宿主细胞菌株。蛋白质产物的这种修饰(如糖基化)和加工(如切割)，对蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞具有特殊的及特异的翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以保证正确修饰和加工要表达的外源蛋白。为此，可使用具有正确加工初级转录物，使基因产物糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但非限于CHO，VERY，BHK，Hela，COS，MDCK，293，3T3，WI38，尤其乳腺癌细胞系和BT 483，Hs 578T，HTB2，HT20，和T47D，及正常乳腺细胞系如CRL 7030和Hs 578Bst。
就长期高产量生产重组蛋白质而言，优选稳定表达。例如，稳定表达抗体分子的细胞系可以基因工程化。除非使用含有病毒复制起源的表达载体，宿主细胞可用由适当的表达控制因子(如启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)和可选择的标记控制的DNA转化。在导入外源DNA之后，工程化的细胞在滋养培养基中生长1-2天，然后转换为选择性培养基。重组质粒中的可选择标记赋予选择抗性，并使细胞稳定地将质粒整合至其染色质中，并生长形成集落，随之可被克隆并扩展至细胞系。此方法可用于基因工程化表达抗体分子的细胞系。这种工程化的细胞系可特别地用于筛选和评价直接或间接与抗体分子相互作用的化合物。
许多选择系统可以使用，包括但非限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，细胞11223(1977))，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，美国科学院院报48202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，细胞22817(1980)基因分别可用于tk-，hgprt-或aprt-细胞。同样，抗代谢物抗性可用作选择以下基因的基础dhfr，其授与氨甲喋呤抗性(Wigler等，美国科学院院报77357(1980)；O′Hare等，美国科学院院报781527(1981))；gpt，其授与霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，美国科学院院报782072(1981))；neo，其授与氨基糖苷类G418抗性(临床药理学12488-505；Wu和Wu，生物治疗387-95(1991)；Tolstoshev，药物毒性分析研究32573-596(1993)；Mulligan，科学260926-932(1993)；及Morgan和Anderson，生物化学分析研究62191-217(1993)；May，1993，TIB，TECH 11(5)155-215)；和hygro，其授与潮霉素抗性(Santerre等，基因30147(1984)。本发明已知的重组DNA方法可常规用于选择所需的重组克隆，这种方法例如由Ausubel等，(编辑)，分子生物学通用方法，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，基因转移和表达实验手册，Stockton出版社，NY(1990)；及Dracopoli等(编辑)，人类基因学常用方法，第12和13章，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colbene-Garapin等，分子生物学杂志1501(1981)所述，在此均全文并入参考。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增而提高(参见Bebbington，和Hentschel，使用基于基因扩增的载体在哺乳动物细胞中表达克隆的基因，DNA克隆，第三卷(科学出版社，纽约，1987))。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时，宿主细胞培养物中的抑制剂水平提高将增加标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体基因相关，因此抗体产量也增加(Crouse等，分子细胞生物学3257(1983)).
宿主细胞可用本发明的两种表达载体共同转染，第一种载体编码重链衍生的多肽，第二种载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可含有相同的选择的标记，这种标记能相同表达重链和轻链多肽。或者可使用一个他，该载体编码且能表达重链及轻链多肽。在这种情况下，轻链应置于重链之前，以避免毒性游离重链过多(Proudfoot，自然32252(1986)；Kohler，美国科学院院报772197(1980)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
一旦本发明的抗体分子已通过动物，化学合成，或重组表达而产生，其可通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的任何方法而纯化，例如，通过层析(例如离子交换层析，亲和层析，尤其通过在蛋白A之后的特异抗原亲和层析，及大小柱层析)，离心，不同的溶解性，或通过任何其它纯化蛋白质的标准方法。另外，本发明的抗体或其片段可融合于本文所述或本领域已知其它异源序列，以促进纯化。
本发明涵盖了重组融合或化学缀合于(包括共价和非共价转化)本发明多肽(或其一部分，优选至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或100个氨基酸的多肽)的抗体，以产生融合蛋白。融合不必是直接的，也可通过接头序列发生。抗体可特异于不同于本发明多肽(或其一部分，优选至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或100个氨基酸的多肽)的抗原。例如，抗体可用于在体外或体内将本发明的多肽定向于特殊类型细胞，通过将本发明多肽融合或缀合于特异于特殊细胞表面受体的抗体而进行。融合或缀合于本发明多肽的抗体也可用于体外免疫分析和纯化方法。见例如Harbor等，如前，和PCT出版物WO93/21232；EP 439095；Naramura等，免疫学通信，3991-99(1994)；美国专利5474981；Gillies等，PNAS891428-1432(1992)；Fecl等，免疫学杂志1462446-2452(1991)；在此均全文并入参考。
本发明还包括一种组合物，该组合物包含融合或缀合于除可变区外其它抗体结构域的本发明的多肽。例如，本发明的多肽可融合于或缀合于抗体的Fc区域，或其一部分。融合于本发明的多肽的抗体部分可包括恒定区，绞链区，CH1结构域，CH2结构域，和CH3结构域，或所有结构域的任意组合或其一部分。多肽也可融合或缀合于上述抗体一部分以形成多聚体。例如，融合于本发明多肽的Fc部分可通过Fc部分之间的二硫键形成二聚体。较高的多聚体形式可通过多肽与IgA和IgM的一部分融合而产生。本领域已知将本发明多肽融合或缀合于抗体的方法。见例如美国专利No.5336603；5622929；5359046；5349053；5447851；5112946；EP 307434EP367166；PCT出版物WO 96/04388；WO 91/06570；Ashkenazi等，美国科学院院报8810535-10539(1991)；Zheng等，免疫学杂志1545590-5600(1995)；和Vil等，美国科学院院报8911337-11341(1992)所述，在此均全文并入参考。
如前所述，相应于SEQ ID NO2多肽，多肽片段或其变体的多肽可融合或缀合于上述抗体部分，以提高多肽的体内半衰期，或用于免疫分析中。另外，相当于SEQ ID NO19的多肽，可融合或缀合于上述抗体部分以促进纯化。例如一篇报道阐述了由人CD4-多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的轻链或重链的恒定区的各种结构域组成的嵌合蛋白。(EP 394827；Traunecker等，自然33184-86(1988))。融合或缀合于具有二硫键连的二聚体结构(由于IgG所致)的抗体的本发明多肽，也可比单体的分泌蛋白或其片段更有效地结合及中和其它分子(Fountoulakis等，生物化学杂志2703958-3964(1995)。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分对治疗和诊断是有利的，因此可例如改进药物动力学性质(EP A232262)。或者，可在融合蛋白已表达，检测和纯化后缺失Fc部分。例如，如果融合蛋白用作免疫接种的抗原，Fc部分可阻碍治疗和诊断。在药物开发中，例如人体蛋白如hIL-5以与Fc部分融合以进行高产量筛选分析而鉴别hIL-5的拮抗剂。(见Bennett等，分子识别杂志852-58(1995)；Johanson等，生物化学杂志2709459-9471(1995)。
另外，本发明的抗体或其片段可融合于标记序列，如与肽融合以促进纯化。在优选的上述方案中，标记氨基酸序列是6组氨酸肽，如pQE载体中提供的标记(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)，其中许多可以商购。如Gentz等，美国科学院院报86821-824(1989)，所述，6组氨酸可以常规纯化融合蛋白。用于纯化的其它肽标记包括但非限于“HA″标记，其相当于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，细胞37767(1984))，和“flag”标记。
本发明还涵盖了缀合于诊断或治疗剂的抗体或其片段。此抗体例如可诊断性地用于监测肿瘤的发育或进展，作为临床测试的一部分，以例如确定治疗方案的效果。将抗体偶联于可检测的物质可便于检测。可检测的物质例如包括各种酶，辅基，荧光物，发光物，生物发光物，放射性物质，使用各种正电子发射计算机化断层显象的正电子发射金属，和非放射性顺磁金属离子。可检测的物质可使用本领域已知方法直接偶联或缀合于抗体(或其片段)，或间接地通过中间体(如本领域已知的接头)偶联或缀合于抗体(或其片段)。见例如美国专利No.4741900阐述了可缀合于抗体的金属离子，其根据本发明可用作诊断剂。适当的酶例如包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基复合物例如包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适当的荧光物包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪胺，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物例如包括鲁米诺；生物发光物例如包括荧光素酶，荧光素和水母蛋白；适当的放射性物质包括125I，131I，111In，或99Tc。
另外，抗体或其片段可缀合于治疗性组分如细胞毒素例如细胞抑制剂或杀细胞剂，治疗剂或放射性金属离子例如α-发射体例如213Bi。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何制剂。例如包括paclitaxol，细胞松驰素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，吐根碱，丝裂霉素，表鬼臼毒，表鬼臼毒噻吩糖苷，长春新碱，长春花碱，秋水仙素，阿霉素，道诺红菌素，二羟炭疽菌素，mitoxantrone，光神霉素，放线菌素D，1-脱氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，心得安，和嘌呤霉素及它们的类似物或同系物。治疗剂包括但非限于抗代谢物(例如氨甲喋呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化剂(例如二氯甲基二乙胺，thioepa苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，卡氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)，cyclothosphamide，白消安，二溴甘露糖醇，链脲菌素，丝裂霉素C，和二氯二胺顺铂(II)(DDP)，蒽环类抗生素(例如道诺红菌素，(从前的道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(如道诺霉素(从前的放线菌素)，博来霉素，光神霉素，氨苜霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(如长春新碱和长春花碱)。
本发明的缀合物可用于修饰给定的生物应答，治疗剂或药物组分不必限于传统的化疗剂。例如，药物组分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可例如包括毒素如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白，假单胞杆菌外毒素，或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经生长因子，血小板衍生的生长因子，组织纤溶酶原激活物，细胞程序死亡剂如α-TNF，β-TNF，AIMI(见国际出版物No.WO 97/33899)，AIMII(见国际出版物No.WO 97/34911)，Fas配体(Takahashi等，免疫学研究61567-1574(1994))，VEGI(见国际出版物No.WO 99/23105)，CD 40配体，血栓形成(thrombotic)剂或抗血管生成剂例如制管张素或endostatin；或生物应答修饰剂如淋巴因子，白细胞介素-1(“IL-1″)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-6(IL-6)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，或其它生长因子。
抗体也可附着于固体支持物，其特别用于靶抗原的免疫分析或纯化。这种固体支持物包括但非限于玻璃，纤维素，聚丙烯酰胺，尼龙，聚苯乙烯，聚氯乙烯，或聚丙烯。
将这种治疗组分与抗体缀合的方法是熟知的，见例如Arnon等，“癌症治疗中药物免疫定向的单克隆抗体”，单克隆抗体与癌症治疗，Reisfeld等(编辑)。P243-56(Alan R.Liss，Inc。1985)；Hellstrom等，“药物输送的抗体”，控制的药物输送(第二版)，Robinson等(编辑)，623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“癌症治疗中胞毒剂的抗体载体”，单克隆抗体84生物与临床应用，Pinchera等(编辑)，P475-506(1985)；“癌症治疗中治疗性使用放射标记的抗体的分析，结果及预期结果”，癌症检测与治疗中的单克隆抗体，Balolwin等，P303-16(科学出版社1985)，和Thorpe等，“抗体-毒素缀合物的制备与胞毒性”，免疫学研究62119-58(1982)。
或者，抗体可与另一种抗体缀合形成抗体异源缀合物，如Segal在美国专利No.4676980中所述，在此全文并入参考。
有或无治疗性组分缀合于其的抗体，单独或与胞毒因子和/或细胞因子组合施用可用于治疗。免疫分型本发明的抗体可用于细胞系和生物样品的免疫分型。本发明基因的翻译产物可用作细胞特异性标记，或更特别地用作在特殊类型细胞的各个分化和/或成熟阶段不同表达的细胞标记。直接抗特异的表位或表位组合的单克隆抗体，可以筛选表达标记的细胞群。可利用各种用单克隆抗体筛选表达标记的细胞群的方法，包括用抗体包被的磁珠进行磁性分离，用附着于固体基质(即平板)的抗体淘选，及流式细胞计量术(见例如美国专利5985660；和Morrison等，细胞96737-49(1999))。
这些方法用于筛选细胞的特殊群落，如可以发现血癌(即急性白血病人中的MRD)和移植的“非自身”细胞，以预防移植物/宿主疾病(GVHD)。或者，这些方法可用于筛选能增殖和/或分化的造血干细胞和祖细胞，这些细胞可见于人脐带血中。抗体结合分析本发明的抗体可通过本领域已知任何方法进行免疫特异性结合分析。可使用的免疫分析包括但非限于竞争性或非竞争性分析系统，如用Western印迹分析，放射性免疫分析，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫分析，免疫沉淀分析，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀素反应，免疫扩散分析，凝集分析，补体结合分析，免疫放射分析，荧光免疫分析，蛋白A免疫分析，等等。这种分析对本领域而言是常用的且熟知的(见例如Ausubel等编辑，1994，分子生物学通用方法，第一卷，John Wiley&Sons，Inc.，纽约；在此全文并入参考)。以下简要地举例阐述了一些免疫分析(但无限制之意)。
免疫沉淀方法一般包括在补加蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(如EDTA，PMSF，抑蛋白酶肽，钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.01％SDS，0.15M Nacl，0.01M磷酸钠，pH7.2，1％Trasylol)中裂解细胞群，将相应的抗体加入细胞裂解物中，在4℃保温一段时间(如1-4小时)，将蛋白A和/或蛋白G琼脂糖凝胶珠加入细胞裂解物中，在4℃保温大约1小时或更长时间，在裂解液中冲洗此珠，并将其再悬浮于SDS/样品缓冲液中。相应抗体免疫沉淀特殊抗原的能力可通过例如Western印迹分析确定。本领域技术人员知道可修改参数以提高抗体与抗原的结合及降低背景(如用琼脂糖凝胶珠预先清理细胞裂解物)。关于免疫沉淀方法的进一步阐述见例如Ausubel等编辑，1994，分子生物学通用方法，第一卷，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，在10.16.1阐述。
Westeyn印迹分析一般包括制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶中电泳蛋白质样品(如根据抗原的分子量选用8％-20％SDS-PAGE)，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶中移至膜上，如硝基纤维素，PVDF或尼龙膜上，在封闭液(如具有3％BSA的PBS或脱脂乳)中封闭此膜，在冲洗缓冲液中冲洗此膜(如在PBS-Tween 20中)，用在封闭液中稀释的一抗(相应抗体)封闭此膜，在冲洗缓冲液中冲洗此膜，用二抗(其识别一抗，如抗人抗体)封闭此膜，该二抗在封闭液中稀释，缀合于酶促底物(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(如32P或125I)，在冲洗液中冲洗此膜，并检测抗原的存在情况。本领域技术人员知道可修改参数以提高检测的信号及降低背景干扰。关于Western印迹方法的进一步阐述见例如Ausubel等编辑，1994，分子生物学通用方法，第一卷，John Wiley&Sons，Inc.，纽约，在10.8.1阐述。
ELISAs包括制备抗原，用抗原包被96孔微滴定平板，向孔中加入与可检测化合物如酶底物(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)缀合的相应抗体，保温一段时间，检测抗原的存在情况。在ELISAs中，相应抗体不必一定连接于可检测化合物；相反，缀合于可检测化合物的二抗(其识别一抗)可加入孔中。另外，可不用抗原包被孔而代之以用抗体包被孔。在这种情况下，缀合于可检测化合物的二抗可在向包被的孔中加入相应的抗原之后加入。本领域技术人员知道可对参数进行修改以提高检测信号，也知本领域已知的ELISAs的其它变化。关于ELISA的进一步阐述见例如Ausubel等编辑，1994，分子生物学通用方法，第一卷，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，在11.2.1中阐述。
抗体与抗原的结合亲和性和抗体-抗原相互作用的脱离率可通过竞争性结合分析确定。竞争性结合分析例如是放射性免疫分析，包括用相应的抗体在存在增加量的未标记抗原的情况下，温育标记的抗原(例如3H或125I)，并检测与标记的抗原结合的抗体。相应抗体与特殊抗原的亲和性和结合脱离率，可从Scatchard印迹分析所得数据中确定。与第二种抗体的竞争也可用放射免疫分析确定。在这种情况下，抗原用缀合于标记的化合物(如3H或125I)的相应抗体，在存在增加量的未标记的另一种抗体的情况下温育。治疗用途本发明还涉及一种基于抗体的治疗方法，包括将本发明的抗体施用于动物，优选哺乳动物，更优选人，病人，以治疗一或多种所述疾病，功能失调或病理状况。本发明的治疗化合物包括但非限于本发明的抗体(包括其片段，类似物和衍生物)，和编码本发明抗体(包括其片段，类似物和衍生物及所述抗独特型抗体)。本发明的抗体可用于治疗，抑制或预防与本发明多肽异常表达和/或活性相关的疾病。功能失调或病理状况，包括但非限于本文所述的任一或多种疾病，功能失调或病理状况(例如自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性新生儿血小板减少，自发的血小板减少性紫癜，自身免疫性细胞减少症；溶血性贫血，抗磷脂综合征，皮炎，过敏性脑脊髓炎，心肌炎，复发性多发性软骨炎，风湿性心脏病，肾小球肾炎(如IgA肾病)，多发性硬化，神经炎，眼色素层炎，多发性内分泌疾病，紫癜(如Henloch-Scoenlein紫癜)，Reiter′s病，Stiff-Man综合征，自身免疫性肺炎，Guillain-Pane综合征，胰导素依赖型糖尿病，和自身免疫性眼炎，自身免疫性甲状腺炎，甲状腺功能低下(即Hashimoto′s甲状腺炎)，系统性红斑狼疮，Goodpasture′s综合征，天疱疮，受体自身免疫性例如(a)Graves病，(b)Myasthenia Gravis，和(c)胰导素抗性，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性血小板减少性紫癜，风湿性关节炎，具有抗胶原抗体的schleroderma，混合的结缔组织病，多发性肌炎/皮肤肌炎，恶性贫血，自发性Addison′s病，不孕症，肾小球肾炎如原发性肾小球肾炎和IgA肾病，大疱性天疱疮，SJogren′s综合征，糖尿病，和肾上腺素类药物抗性(包括治疗哮喘或膀胱纤维化的肾上腺素类药物抗性)，慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，其它内分泌腺病变，白癜风，血管炎，后MI，心肌综合征，荨麻疹，遗传性过敏性皮炎，哮喘，炎症性肌病，和其它炎症，granulamatous，退化，及萎缩性功能失调)。
在一特异的实施方案中，本发明的抗体用于治疗，抑制，预后，诊断或预防风湿性关节炎。
在另一特异的实施方案中，本发明的抗体用于治疗，抑制，预后，诊断或预防系统性红斑狼疮。
与本发明多肽异常表达和/或活性相关的疾病，失调或病理状况的治疗和/或预防，包括但非限于减轻与这些疾病，失调或病理状况相关的症状。本发明的抗体也可用于定向和杀死在其表面表达Neutrokine-α的细胞，或在其表面有Neutrokine-α结合的细胞。本发明的抗体可以本领域已知的或本文所述的药物适当组合物形式提供。
本发明抗体可治疗性使用的方法包括局部或系统地在体内结合本发明的多核苷酸或多肽，或通过抗体的直接胞毒性，如由补体(CDC)或效应器细胞(ADCC)介导。以下更详细地阐述了一些这样的方法。通过本文教导，本领域技术人员知道怎样使用本发明的抗体，以进行诊断，监测或治疗而不用过多的试验。
本发明的抗体与其它单克隆或嵌合抗体，或与淋巴因子或造血生长因子(如IL-2，IL-3和IL-7)组合使用是有利的，例如提高与抗体相互作用的效应器细胞的数目或活性。
本发明的抗体可单独或与其它类型治疗方案组合施用(如放疗，化疗，激素疗法，免疫治疗，抗肿瘤剂，抗生素，和免疫球蛋白)。通常地，优选施用与患者相同物种的物种来源或物种反应性(在抗体的情况下)产物。因此，在一优选的实施方案中，人抗体，片段衍生物，类似物或核酸施用于人类患者以进行治疗或预防。
优选使用高亲和性和/或强有力在体内抑制和/或中和抗本发明多肽或多核苷酸的抗体，以对与本发明的多核苷酸或多肽包括其片段相关的疾病进行免疫分析和治疗。这种抗体，片段或区域优选与本发明的多核苷酸或多肽包括其片段有亲和性。优选的结合亲和性包括解离常数或Kd小于5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，和10-15M。基因治疗在一特异的实施方案中，施用包含编码抗体或其功能衍生物的序列的核酸，以通过基因疗法治疗，抑制或预防与本发明多肽异常表达和/或活性相关的疾病或功能失调。基因疗法指通过为治疗对象施用表达的或可表达的核酸进行的治疗。在本发明的此实施方案中，核酸产生介导治疗效应的其编码的蛋白质。
本领域中任何适当的基因治疗的方法根据本发明可以使用。例如以下所述的方法。
关于基因治疗的一般研究见Goldspiel等，临床药学12488-505(1993)；Wu和Wu，生物治疗387-95(1991)；Tolstoshev，药物毒性学分析研究32573-596(1993)；Mulligan，科学260926-932(1993)；和Morgan和Anderson，生物化学分析研究62191-217(1993)；May，TIB TECH 11(5)155-215(1993)所述。可使用的本领域熟知的重组DNA技术见Ausubel等(编辑)，分子生物学通用方法，John Wiley & Sons，NY(1993)；和Kriegler，基因转移和表达实验手册，Stockton出版社，NY(1990)所述。
在一优选的实施方案中，化合物包含编码抗体的核酸序列，所述核酸序列是在适当宿主中表达抗体或其片段或嵌合蛋白或重或轻链的表达载体的一部分。尤其地，这种核酸序列有可操纵地连于抗体编码区的启动子，所述启动子是可诱导的或组成型的，及任选地是组织特异性的。在另一特殊的实施方案中，使用的核酸分子其中抗体编码序列和任何其它所需序列是位于在基因组所需位点中启动同源重组的区域两侧，因此提供抗体编码核酸在染色体内表达(Koller和Smithies，美国科学院院报868932-8935(1989)；Zijlstra等，自然342435-438(1989)。在特异的实施方案中，表达的抗体分子是单链抗体；或者，核酸序列包括编码抗体重链和轻链或其片段的序列。
核酸输送至患者可以是直接或间接的，直接方式是患者直接暴露于核酸或携带核酸的载体，间接方式是首先用核酸在体外转化细胞，然后移植入患者体内。这两种方法分别已知为体内或源于体内的基因治疗。
在一特异的实施方案中，核酸序列是直接在体内施用的，其在体内表达产生编码的产物。这可通过本领域已知的各种方法进行，例如，将它们构建为适当的核酸表达载体的一部分，并施用以使它们成为细胞内物质，例如通过用缺陷的或弱化的逆转录病毒或其它病毒载体感染(见美国专利No.4980286)，或通过直接注射裸露的DNA，或使用微粒子轰击(如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，用脂质体，微粒或微囊胶囊化，或通过与已知进入核的肽连接施用，通过与配体连接施用进行受体介导的胞吞(见例如Wu和Wu，生物化学杂志2624429-4432(1987)所述)(其可用于定向特异表达受体的细胞类型)。在另一实施方案中，可形成核酸一配体复合物，其中配体包含融合病毒肽以破坏核内体，使核酸免于被溶酶体降解。在另一实施方案中，核酸可通过定向-特异受体而在体内定向于特异吸收和表达的细胞(见例如PCT出版物WO92/06180；WO92/22635；WO92/20316；WO93/14188；WO923/20221)。或者，核酸可通过同源重组导入细胞内及掺入宿主细胞DNA中以表达(Koller和Smithies，美国科学院院报868932-8935(1989)；Zijlstra等，自然342435-438(1989))。
在一特异的实施方案中，使用含有编码本发明抗体的核酸序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(见Miller等，酶学方法217581-599(1993)。这些逆转录载体含有正确包装病毒基因组和整合λ宿主细胞DNA所必需的组分。将编码基因治疗中使用的抗体的核酸序列克隆λ一或多个载体中，所述载体促进基因输送至患者体内。关于逆转录病毒的更详细阐述见于Boesen等，生物治疗6291-302(1994)，其阐述了使用逆转录载体将mdr1基因输送至造血干细胞，以产生对化疗更有抗性的干细胞。基因治疗中使用逆转录病毒载体的其它例证见于Clowes等，临床研究杂志93644-651(1994)；Kiem等，血液831467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，人体基因治疗4129-141(1993)；及Grossman和Wilson，遗传和发育中的通用观点3110-114(1993)。
腺病毒是可用于基因治疗的其它病毒载体。腺病毒是将基因输送至呼吸道上皮的特别适用的运载工具。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，导致轻微疾病。基于腺病毒的输送系统的其它目标是肝，中枢神经系统，内皮细胞和肌。腺病毒具有能感染未分化的细胞的优势。Kozansky和Wilson，遗传和发育通用观点3499-503(1993)提出了一种基于腺病毒的基因治疗方法。Bout等，人体基因治疗53-10(1994)阐述了使用腺病毒载体将基因移至哮喘猴呼吸道上皮的腺病毒载体。基因治疗中腺病毒使用的其它参考见于Rosenfeld等，科学252431-434(1991)；Rosenfeld等，细胞68143-155(1992)；Mastrangeli等，临床研究杂志91225-234(1993)；PCT出版物WO 94/12649；和Wang等，基因治疗2775-783(1995)。在一优选的实施方案中，使用腺病毒载体。
腺伴随病毒(AAV)为此已用于基因治疗中(Walsh等，美国科学院院报204289-300(1993)；美国专利No.5436146)。
另一种基因治疗方法包括通过如电穿孔，脂转染，磷酸钙介导的转染，或病毒感染等方法，将基因移至组织培养物中的细胞中。通常地，转移方法包括将一可检测的标记移至细胞。然后分离已处理的并表达转移基因的细胞。接着将这些细胞施用于病人。
在此实施方案中，在体内施用所得重组细胞之前，将核酸导入细胞中。这种导入可通过本领域已知的任何方法进行，包括但非限于转染，电穿孔，微注射，用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染，细胞融合，染色体介导的基因转移，微细胞介导的基因转移，原生质球融合等。本领域已知许多将外源基因导入细胞的方法(见例如Loeffler和Beht，酶学方法217599-618(1993)；Cohen等，酶学方法217618-644(1993)；临床药物治疗2969-92m(1985)，根据本发明可以使用这些方法，且不破坏受体细胞的基本发育和生理功能。所用方法应稳定地将核酸移至细胞，以便核酸可由细胞表达且优选可由其细胞子代遗传和表达。
所得重组细胞可通过本领域已知的各种方法施用于患者。重组血细胞(如造血干细胞或祖细胞)优选静脉内施用。所用细胞数量根据所需效应，患者状态等而定，且可由本领域技术人员确定。
为进行基因治疗而将核酸导入其中的细胞涵盖了任何所需的适当的细胞类型，包括但非限于上皮细胞，内皮细胞，角质形成细胞，成纤维细胞，肌细胞，肝细胞，血细胞如T淋巴细胞，B淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，嗜伊红性粒细胞，巨核细胞，粒细胞；各种干或祖细胞，尤其造血干细胞或祖细胞，如得自骨髓。脐带血，外周血，胎儿肝脏等的细胞。
在优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自身的。
在重组细胞用于基因治疗的实施方案中，将编码抗体的核酸序列导入细胞，由此它们可由细胞或细胞子代表达，接着将重组细胞在体内施用进行治疗。在一特异的实施方案中，使用干或祖细胞。任何可分离并在体外维持的干和/或祖细胞，根据本发明的此实施方案均可使用(见例如PCT出版物WO 94/08598；Stemple和Anderson，细胞71973-985(1992)；Rheinwald，细胞生物学方法21A229(1980)；和Pittelkow和Scott，Mayo Clinic Proc。61771(1986)。
在特异的实施方案中，为进行基因治疗所导入的核酸包含可操纵地连于编码区的可诱导的启动子，由此核酸的表达可通过控制有或无适当的转录诱导子存在而控制。治疗或预防活性的证明本发明的化合物或药物组合物优选先在体外测试，然后在体内测试所需治疗或预防活性，之后再用于人体。例如，体外分析证实化合物或药物组合物的治疗或预防活性包括化合物对细胞系或病人组织样品的效应。化合物或组合物对细胞系或病人组织样品的作用可利用本领域已知的方法确定，包括但非限于花结形成分析和细胞裂解分析。根据本发明，可用于确定施用的特异的化合物是否是指明的体外分析，包括体外细胞培养分析，其中将病人组织样品在培养基中生长，暴露于或施用化合物，并观测这种化合物对组织样品的作用。治疗和/或预防性施用方法及组合物本发明提供了通过为治疗对象施用有效量的本发明的化合物或药物组合物，优选本发明抗体，而达到治疗，抑制和预防目的的方法。在一优选的实施方案中，化合物是基本纯化的(如基本没有限制其作用或产生非所需副作用的物质)。治疗对象优选是动物，包括但非限于是奶牛，猪，马，鸡，猫，狗等，优选是哺乳动物，且最优选是人。
当化合物包含核酸或免疫球蛋白时，可使用的施用配方和方法如上所述；另外的适当配方和施用途径可选自以下所述内容。
已知各种输送系统并可用于施用本发明的化合物，例如在脂质体中胶囊化，微粒，微囊，能表达化合物的重组细胞，受体介导的胞吞(见例如Wu和Wu，生物化学杂志2624429-4432(1987))，将核酸构建为逆转录病毒或其它载体的一部分等。导入方法包括但非限于皮内，肌肉，腹膜内，静脉内，舌下，鼻内，表皮或口服。化合物或组合物可通过常规途径施用，例如通过融合或大丸药注射，通过上皮或粘膜与皮肤分界线处吸收(如口腔粘膜，直肠和小肠粘膜等)，且可与其它生物活性剂一起施用。可全身或局部施用。另外，可通过任何适当途径将本发明的药物化合物或组合物导入中枢神经系统，包括静脉内和动脉内注射；静脉内注射通过静脉内导管而简化，例如吸附于液槽如Ommaya液槽。也可经肺施用，如使用吸入器或喷雾器，及具有烟雾剂的配方。
在一特异的实施方案中，需要在需要治疗的部位局部施用本发明的药物化合物或组合物；这可通过例如在手术期间局部灌注，局部应用，如在手术后与伤口敷料一起应用，通过注射，通过导管，通过栓剂，或通过植入而应用，所述植入体是有孔，无孔，或胶状物，包括膜，如sialastic膜，或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质包括抗体时，必须注意要使用蛋白质不吸收的物质。
在另一实施方案中，化合物或组合物可在小泡尤其脂质体中输送(见Langer，科学2491527-1533(1990)；Treat等，感染性疾病和癌症治疗中的脂质体，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss，纽约，p353-365(1989)；Lopez-Berestein，如上，p317-327)。
在另一实施方案中，化合物或组合物可在受控释放系统中输送。在一实施方案中，可使用泵(见Langer，如前；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等，外科学88507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一实施方案中，可使用聚合物(见控制释放的医学应用，Langer和Wise(编辑)，CRC出版社，Boca Raton，Florida(1974)；控制的药物生物利用度，药品设计与生产，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas，J.，Macromol，Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；也见于Levy等，科学228190(1985)；During等，神经学研究25351(1989)；Howanol等，Neurosurg杂志71105(1989))。在另一实施方案中，控制释放系统可置于治疗目标即脑的附近，这样只需要全身剂量的一部分(见例如，Goodson，控制释放的医学应用，如前，第二卷，p115-138(1984)。
其它控制释放系统见Langer所述(科学2491527-1533(1990))。
在其中本发明的化合物是编码蛋白质的核酸的一特异的实施方案中，核酸可在体内施用以启动其编码的蛋白质的表达，通过将其构建为适当的核酸表达载体的一部分并施用，使其成为细胞内的一部分，例如通过使用逆转录病毒载体(见美国专利No.4980286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过与已知能进入核内的类同源框肽连接施用(见例如Joliot等，美国科学院院报881864-1868(1991))等。或者，核酸可通过同源重组导入细胞内及掺入宿主细胞DNA中进行表达。
本发明还提供了药物组合物。这种组合物包含治疗有效量的化合物，和药物合适的载体。在一特异的实施方案中，术语“药物合适的”指经联邦或政府结构允许的或美国药品管理结构所列的，或其它一般认为可用于动物尤其是人的物品。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂，佐剂，赋形剂或运载体。这种药物载体可以是无菌液如水和油，包括石油，动物油，植物油或合成油，如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等。当药物组合物是经静脉内施用时，水是优选的载体。盐水和葡萄糖液和甘油液也可用作液体载体。适当的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，水稻，面粉，石灰，二氧化硅凝胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油，talc，氯化钠，脱脂乳，甘油，丙烯，二醇，水，乙醇等。如果需要，组合物也可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以是溶液，悬浮液，乳状液，片剂，丸剂，胶囊，粉末，持续释放的配方等。组合物可用传统的结合剂和载体如甘油三酯配制为栓剂。口服配方可包括标准载体如药物级别的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。适当的药物载体例如由E.W.Martin在“Remington′s药物科学”中所述。这种组合物含有治疗有效量的化合物，优选纯化形式的化合物，和适量的载体，以提供正确施用予患者的剂型。
在一优选的实施方案中，组合物是根据常规制备适于静脉内施用于人体的药物方法配制的。典型地，静脉内施用的组合物是无菌等渗溶液。如果需要，组合物还可包括稳定剂和局麻剂如利诺卡因，以减轻注射部位的痛感。通常地，配料可单独或以单位剂量混合提供，例如在密封的容器中以无水的冻干粉末或无水浓缩物存在，所述容器如安瓿或表明活性剂数量的袋。当组合物通过灌注施用时，其可用含有无菌药物级别的水或盐水的灌注瓶分液。当组合物通过注射施用时，可用无菌注射用水或盐水的安瓿，以在施用之前混合配料。
本发明的化合物可配制为中性的或盐形式。药物合适的盐包括与阳离子如产自盐酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的阳离子，或与阴离子如产自氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙，氢氧化铁，异丙基胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组胺，普鲁卡因等的阴离子形成的盐。
有效地治疗，抑制和预防与本发明多肽的异常表达和/或活性相关的疾病或功能失调的本发明化合物的数量，可通过标准临床技术确定。另外，可任选地应用体外分析以助于鉴别最佳剂量范围。配方中应用的实际剂量也依赖于施用途径，疾病的严重程度而定，并应根据医生的诊断和病人的情况而定。有效剂量可通过从体外或动物模型试验系统中产生的剂量应答曲线中确定。
就抗体而言，施用于病人的剂量为0.1-100mg/kg体重之间，更优选地，在1-10mg/kg体重之间。通常地，人抗体比其它物种的抗体在人体内的半衰期长，这是由于对外源多肽的免疫应答所致。因此，可以施用较少剂量的人抗体，且施用频率也可较长。另外，本发明抗体的施用剂量和频率，通过对抗体加以修饰如脂化从而增强抗体的吸收和组织通透性(如入脑)而减少。
本发明还提供了包含一或多个装有本发明药物组合物的一或多种配料的容器的药物包装或试剂盒。任选地与这种容器相关的是政府机构调节生产，使用或销售药物或生物制品所做的告示，该告示反映了许可的生产，使用或销售施用于人的生物制品或药物。诊断与成象与相应的肽特异结合的标记的抗体，及其衍生物和类似物，可用于诊断性地检测，诊断或监测量与本发明多肽异常表达和/或活性相关的疾病和/或功能失调。本发明提供了检测相应多肽异常表达的方法，包括(a)用特异于相应多肽的一或多种抗体，在个体的细胞或体液中分析相应多肽的表达，和(b)将此基因表达水平与标准基因表达水平相对比，从而与标准基因表达水平相对比，分析的多肽基因表达水平提高或降低表明异常表达。
本发明提供了诊断功能失调的诊断分析，包括(a)用特异于相应多肽的一或多种抗体，在个体的细胞或体液中，分析相应多肽的表达，和(b)将此基因表达水平与标准基因表达水平相对比，从而与标准表达水平相比，分析的多肽基因表达水平的提高或降低表明特定的功能失调，就癌症而言，个体活检组织中存在相对高量的转录物可表示疾病发生的易患性，或可在真实临床症状出现之前提供检测疾病的方法，一更确定的诊断可使健康从业者较早地应用预防措施或大胆治疗，从而防止癌症的发生或进一步发展。
本发明的抗体可用本领域技术人员已知的传统免疫组织学方法，用于在生物样品中分析蛋白质水平(见例如Jalkanen等，细胞生物学杂志101976-985(1985)；Jalkanen等，细胞生物学杂志1053087-3096(1987))。用于检测蛋白质基因表达的其它基于抗体的方法包括免疫分析，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫分析(RIA)。本领域已知适当的抗体分析标记，包括酶标记如葡糖氧化酶；放射性同位素如碘(131I，125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)氚(3H)，铟(115mIn，113mIn，112In，111In)，和锝(99Tc，99mTc)，铊(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)，氙(138Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh，97Ru；发光标记如Luminol；和荧光标记如荧光素，和罗丹明，和生物素。
可用本领域已知的方法标记本发明的抗体。这种方法包括但非限于使用双功能缀合剂(见例如美国专利No.5756065；5714631；5996239；5652361；5505931；5489425；5435990；5428139；5342604；5274119；4994560；和5808003所述，以上文献均全文并入参考)。
本发明的一实施方案是在动物优选哺乳动物更优选在人体内，检测和诊断与相应多肽异常表达相关的疾病或功能失调。在一实施方案中，诊断方法包括(a)为诊断对象施用特异结合相应多肽的有效量的标记的分子，如通过非肠道，皮下或腹膜内施用；(b)在施用之后等待一段时间，使标记的分子在多肽表达的部位优先浓缩(并清除未标记的分子)；(c)确定背景水平；和(d)检测诊断对象中标记的分子，这样检测的标记分子高于背景水平表明诊断对象有与相应多肽异常表达相关的特殊疾病或功能失调。背景水平可通过各种方法确定，包括将检测的标记分子数量与预先在特定系统中确定的标准值相对比。如本文所述，本发明特异的实施方案是使用本发明的抗体定量或定性浓缩B细胞系的细胞或单核细胞系的细胞。
也如本文所述，本发明的抗体可用于治疗，诊断或预防具有免疫缺陷的个体，在一特异的实施方案中，本发明的抗体用于治疗，诊断和/或预防具有CVID或其亚型的个体。在另一实施方案中，本发明的抗体用于诊断，预防，治疗特征在于血清免疫球蛋白产生缺陷，复发性感染，和/或免疫系统功能失调的疾病。
同样如本文所述，本发明的抗体可用于治疗，诊断或预测具有自身免疫疾病或功能失调的个体。在一特异的实施方案中，本发明的抗体用于治疗，诊断和/或预测具有系统性红斑狼疮或此疾病亚型的个体。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体用于治疗，诊断和/或预测具有风湿性关节炎或其亚型的个体。
本领域应知治疗对象的大小和所用的显象系统将确定需要产生诊断图象的显象组分的数量。在放射性同位素组分的情况下，就人而言，注射的放射性数量正常在大约5-20毫居里99mTc之间。标记的抗体或抗体片段然后在含有特异蛋白质的细胞中优先积累。体内肿瘤显象见于S.W.Burchiel等，“放射标记的抗体及其片段的免疫药动学”(肿瘤显象中第13章癌症的放射化学检测，S.W.Burchiel和B.A.Rhocles编辑，Masson Publishing Inc.(1982))所述。
根据一些变量，包括所用标记类型和施用模式，施用后间隔的时间是6-48小时，或6-24小时或6-12小时，间隔一定时间是使标记的分子优先在目标位浓缩，及将未结合的标记分子清除于背景水平。在另一实施方案中，施用后的时间间隔为5-20天或5-10天。
在一实施方案中，通过重复诊断疾病的方法对疾病或功能失调加以监测，例如在初始诊断一个月之后，6个月之后，一年之后等。
在病人体内标记分子的存在与否可用本领域已知的体内扫描方法检测。这些方法依赖于所用标记的类型。熟练技术人员能确定检测特殊标记的适当方法。可用于本发明诊断方法中的方法和仪器包括但非限于计算机化断层显象(CT)，全身扫描如正电子发射断层扫描(PET)，核磁共振(MRI)和超声。
在一特异的实施方案中，分子用放射性同位素标记并在病人体内用辐射应答性外科仪器检测(Thurston等，美国专利No.5441050)。在另一实施方案中，分子用荧光化合物标记，并在病人体内用荧光应答扫描仪检测，在另一实施方案中，分子用发射正电子的金属标记，并在病人体内用正电子发射断层扫描检测。在另一实施方案中，分子用顺磁性标记物标记，并在病人体内用核磁共振(MRI)检测。试剂盒本发明提供了能用于上述方法中的试剂盒。在一实施方案中，试剂盒包括一或多个容器，其中含有本发明的抗体，优选纯化的抗体，在一特异的实施方案中，本发明的试剂盒含有基本分离的多肽，该多肽包含与试剂盒中的抗体特异性免疫反应的表位。优选地，本发明的试剂盒还包含不与相应的多肽反应的对照抗体。在另一特异的实施方案中，本发明的试剂盒包含识别本发明多肽的相同和/或不同序列或区域的两或多种抗体(单克隆和/或多克隆)。在另一特异的实施方案中，本发明的试剂盒包含检测抗体与相应多肽结合的设施(例如抗体可与可检测的底物缀合，如荧光化合物，酶促底物，放射性化合物，或发光化合物，或者识别第一种抗体的第二种抗体可与可检测底物缀合)。
在本发明的另一特异实施方案中，试剂盒是用于筛选含有特异抗增殖性和/或癌症多核苷酸和多肽的抗体的血清的诊断性试剂盒。这种试剂盒可包括不与相应多肽反应的对照抗体。这种试剂盒可包括基本分离的多肽抗原，该抗原包含与至少一种抗多肽抗原的抗体特异性免疫反应的表位。另外，这种试剂盒包括检测所述抗体与抗原结合的手段(例如抗体可缀合于荧光化合物如可通过流式细胞术检测的荧光素或罗丹明)。在特异的实施方案中，试剂盒可包括重组产生的或化学合成的多肽抗原。试剂盒的多肽抗原也可附着于固体支持物。
在一更特异的实施方案中，上述试剂盒的检测手段包括所述多肽抗原附着的固体支持物，这种试剂盒也可包括未附着的受体标记的抗人抗体。在此实施方案中，抗体与多肽抗原的结合可通过所述受体标记的抗体的结合而检测。
在另一实施方案中，本发明包括用于筛选含有本发明多肽抗原的血清的诊断试剂盒。此诊断试剂盒包括与多核苷酸或多肽抗原特异性免疫反应的基本分离的抗体，及检测多核苷酸或多肽抗原与抗体结合的手段。在一实施方案中，抗体附着固体支持物，在一特异的实施方案中，抗体可以是单克隆抗体。试剂盒中的检测手段可包括第二种标记的单克隆抗体。或者，检测是可包括标记的竞争抗原。
在一诊断构型中，测试血清与固相试剂反应，此固相试剂具有通过本发明的方法获得的表面结合抗原。在特异抗原的抗体与试剂结合及通过冲洗除去结合的血清组分之后，试剂与受体标记的抗人抗体反应，受体与试剂结合比例是固体支持物上抗抗原的抗体数量。再一次冲洗试剂除去未结合的标记的抗体，并确定与试剂相关的受体的数量。特别地，受体是一种酶，其通过在存在适当的荧光，发光或比色底物的情况下温育固相而检测(Sigma，St.Louis，Mo)。
上述分析中的固体表面试剂是通过本领域已知的将蛋白质附着于固体支持物的方法制备的，如聚合物珠，浸渍条，96孔平板或滤膜。这些附着方法一般包括蛋白质非特异性吸附支持物，或蛋白质通过游离氨基共价附着于固体支持物上的化学反应基因，如活性的羧基，羟基或醛基。或者，链霉亲和素包被的平板可用于与生物素酰化的抗原的缀合中。
因此，本发明提供了进行这种诊断方法的分析系统或试剂盒。此试剂盒一般包括具有表面结合重组抗原的支持物，和受体标记的抗人抗体，以检测表面结合的抗抗原的抗体。
本发明还涉及作为本发明多肽的激动剂或拮抗剂的抗体。例如，本发明包括部分或全部破坏受体/配体与本发明多肽相互作用的抗体，这包括受体特异性抗体和配体特异性抗体两种。其中受体特异性抗体不阻止配体结合但阻止受体活化。受体活化(即信号化)可通过本文所述的或本领域已知的方法确定。即阻止配体结合又阻止受体活化的受体特异性抗体也包括在内。另外，还包括结合配体及阻止配体与受体结合的中性抗体，以及结合配体从而阻止受体活化，但不阻止配体与受体结合的抗体，另外包括活化受体的抗体。这些抗体可作为激动剂，通过配体介导的受体活化影响全部或部分生物活性。抗体可特异地作为包含本文所述特异活性的生物活性的激动剂或拮抗剂。另外包括的是无论Neutrokine-α或Neutrokine-αSV是否与Neutrokine-α受体结合，而结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的抗体。这些抗体作为Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV激动剂，在存在这些抗体的情况下，提高对Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV与Neutrokine-α受体结合应答的细胞增殖。上述抗体激动剂可用本领域已知方法产生。见例如WO96/40281；美国专利5811097；Deng，B.等血液92(6)1981-1988(1998)；Chen，Z.等，癌症研究58(16)3668-3678(1998)；Harrop，J.A.等，免疫学杂志161(4)1786-1794(1998)；Zhu，Z.等，癌症研究58(15)3209-3214(1998)；Yoon，D.Y.等，免疫学杂志160(7)3170-3179(1998)；Prat，M.等，细胞科学杂志111(Pt2)237-247(1998)；Ptard，V.等，免疫学方法杂志205(2)177-190(1997)；Lautard，J.等，细胞因子9(4)233-241(1997)；Carlson，N.G.等，生物化学杂志272(17)11295-11301(1997)；Taryman，R.E.等，神经元14(4)755-762(1995)；Muller，Y.A.等，结构6(9)1153-1167(1998)；Bartunek，P.等，细胞因子8(1)14-20(1996)所述(所述文献的全文并入参考)。
现已产生抗Neutrokine-α的至少14个单克隆抗体，这些单克隆抗体称为12D6，2E5，9B6，1B8，5F4，9A5，10G12，11G12，16B4，3D4，16C9，13D5，15C10，和12C5。对这些抗体的初步分析表明在Western印迹分析中及当Neutrokine-α蛋白质与ELISA平板结合时，均与Neutrokine-α结合。然而对12D6，2E5，9B6，1B8，5F4，9A5，10G12，11G12和16B4抗体的进一步分析表明，只有12D6，9B6，2E5，10G12，9A5和11G12抗体与膜结合形式的Neutrokine-α结合。因此，已确定产生的抗Neutrokine-α的单克隆抗体的亚型，只与膜结合形式的Neutrokine-α结合(即此亚型不与相当于SEQ ID NO2的134-285位氨基酸的可溶形式的Neutrokine-α结合)，如本文所述，其限于在单核细胞和树状细胞上表达。
现已发现9B6抗体特异地结合膜结合形式的Neutrokine-α，但不与可溶形式的Neutrokine-α结合。
抗体9B6的表位图表明此抗体特异地结合包含于SEQ ID NO2的Ser171-Phe194氨基酸残基中的氨基酸序列。更特别地，表位图表明抗体9B6特异地结合包含SEQ ID NO2的Lys173-Lys188氨基酸残基的肽。
相反，已发现抗体16C9和15C10结合可溶形式的Neutrokine-α(即SEQ ID NO2的134-285位氨基酸)，并抑制Neutrokine-α介导的B细胞增殖。见例如实施例10，已发现15C10抗体抑制Neutrokine-α与其受体的结合。抗体15C10的表位图已表明此抗体特异地结合包含于SEQ ID NO2的Glu223-Tyr246位氨基酸残基中的氨基酸序列。更特别地，表位图表明抗体15C10特异地结合包含SEQ ID NO2的Val227-Asn242位氨基酸残基的肽。抗体15C10也特异地结合包含SEQ ID NO2的Phe230-Cys245位氨基酸残基的肽。
如上所述，现已制备抗Neutrokine-α的单克隆抗体。产生9B6和15C10抗体的杂交瘤保藏在ATCC中，保藏号分别为PTA-1158和PTA-1159。在一实施方案中，本发明的抗体具有一或多种与由保藏号PTA-1158或PTA-1159的杂交瘤细胞系分泌的抗体相同的生物特性。“生物特性”是指抗体的体外或体内活性或性质，例如结合Neutrokine-α的能力(如SEQ ID NO2的多肽，成熟形式的Neutrokine-α，膜结合形式的Neutrokine-α，可溶形式的Neutrokine-α(SEQ ID NO2的134-285位氨基酸)，和Neutrokine-α的抗原区和/或表位区)，基本阻断Neutrokine-α与其受体结合的能力，或阻断Neutrokine-α介导的生物活性的能力(如刺激B细胞增殖和免疫蛋白产生)。任选地，本发明的抗体结合与所特指的至少一种抗体相同的表位。这种表位结合可用本领域已知方法常规确定。
因此，在一实施方案中，本发明提供了特异结合膜结合形式而不结合可溶形式Neutrokine-α的抗体。这些抗体的用途包括但非限于作为诊断探针，鉴别和/或分离表达膜结合形式Neutrokine-α的单核细胞系。例如，在活化的单核细胞上，膜结合形式的Neutrokine-α表达提高，因此，本发明涵盖的抗体可用于检测和/或确定活化的单核细胞的水平。另外，只结合膜结合形式Neutrokine-α的抗体可用于将毒素定向于致瘤性的，预致瘤性的，和/或表达膜结合形式Neutrokine-α的其它细胞(如单核细胞和树状细胞)。
在另一实施方案中，本发明的抗体只特异结合可溶形式的Neutrokine-α(SEQ ID NO2的134-285位氨基酸)。这些抗体的用途包括但非限于用作诊断探针以分析生物样品中可溶形式的Neutrokine-α，及用作治疗剂，将毒素导向表达Neutrokine-α受体的细胞(如B细胞)，和/或降低或阻断体外或体内Neutrokine-α介导的生物活性(如刺激B细胞增殖和/或免疫球蛋白产生)。
本发明还提供了特异地结合膜结合及可溶形式Neutrokine-α的抗体。
如上所述，本发明涵盖了抑制或降低Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV在体内和/或体外结合其受体的能力的抗体，在一特异的实施方案中，本发明的抗体抑制或降低Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV在体外结合其受体的能力的抗体，在另一特异的实施方案中，本发明的抗体抑制或降低Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV在体内结合其受体的能力的抗体。这种抑制可用本文所述的或本领域已知的方法分析。
本发明还涵盖了特异结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV，但不抑制Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV在体外和/或体内结合其受体能力的抗体。在一特异的实施方案中，本发明的抗体不抑制或降低Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV在体外结合其受体的能力。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体不抑制或降低Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV在体内结合其受体的能力。
如上所述，本发明涵盖了抑制或降低在体外和/或体内Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的生物活性的抗体。在一特异的实施方案中，本发明的抗体抑制或降低在体外Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的B细胞增殖。这种抑制可通过本文所述或本领域已知的常规修饰B细胞增殖的方法加以分析。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体抑制或降低Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV在体内介导的B细胞增殖。在一特异的实施方案中，本发明的抗体是15C10，或其人化形式。在另一优选的特异实施方案中，抗体是16C9，或其人化形式。因此，在本发明特异的实施方案中，16C9和/或15C10抗体或其人化形式，用于结合可溶形式的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV，和/或其激动剂和/或拮抗剂，从而抑制(部分或完全地)B细胞增殖。
或者，本发明还涵盖了特异结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV，但不抑制或降低Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的体外和/或体内生物活性(如刺激B细胞增殖)的抗体。在一特异的实施方案中，本发明的抗体不抑制或降低Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的体外生物活性。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体不抑制或降低Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的体内生物活性。在一特异的实施方案中，本发明的抗体是9B6，或其人化形式。
如上所述，本发明涵盖了在体外的和/或体内特异结合与所特指的至少一种抗体相同的表位的抗体。
在一特异的实施方案中，本发明的抗体在体外特异结合包含于SEQ ID NO2的Ser171-Phe194位氨基酸残基中的氨基酸序列。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体在体内特异结合包含于SEQID NO2的Ser171-Phe194位氨基酸残基中的氨基酸序列。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体在体外特异结合包含于SEQ IDNO2的Lys173-Lys188位氨基酸残基中的氨基酸序列。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体在体内特异结合包含于SEQ IDNO2的Lys173-Lys188位氨基酸残基中的氨基酸序列。
在另一特异的实施方案中，本发明的抗体在体外特异结合包含于SEQ ID NO2的Glu223-Tyr246位氨基酸残基中的氨基酸序列。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体在体内特异结合包含于SEQID NO2的Glu223-Tyr246位氨基酸残基中氨基酸序列。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体在体外特异结合包含于SEQ IDNO2的Val227-Asn242位氨基酸残基中氨基酸序列。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体在体内特异结合包含于SEQ ID NO2的Val227-Asn242位氨基酸残基中的氨基酸序列。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体在体外特异结合包含于SEQ ID NO2的Phe230-Cys245位氨基酸基中的氨基酸序列。在另一特异的实施方案中，本发明的抗体在体内特异结合包含于SEQ ID NO2的Phe230-Cys245位氨基酸残基中的氨基酸序列。
本发明还提供了竞争性抑制由保藏的PTA-1159产生的9B6单克隆抗体与本发明多肽，优选SEQ ID NO2多肽，更优选具有SEQID NO2的Ser171-Phe194位残基的氨基酸序列的多肽结合的抗体。竞争性抑制可通过本领域已知任何方法确定，例如用本文所述的竞争性结合分析法。在优选的实施方案中，此抗体竞争性抑制9B6单克隆抗体与SEQ ID NO2多肽、优选具有SEQ ID NO2的Ser171-Phe194位氨基酸序列的多肽结合的至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，60％，50％。
本发明还提供了竞争性抑制由保藏的PTA-1158杂交瘤产生的15C10单克隆抗体，与本发明的多肽，优选SEQ ID NO2多肽，更优选具有SEQ ID NO2的Glu223-Try246位氨基酸序列的多肽的结合的抗体。在优选的实施方案中，此抗体竞争性抑性15C10单克隆抗体与SEQ ID NO2多肽，优选具有SEQ ID NO2的Glu223-Tyr246位氨基酸序列的多肽结合的至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，60％，50％。
本发明另外的实施方案涉及9B6抗体及表达此抗体的杂交瘤细胞系。表达9B6抗体的杂交瘤细胞系于2000年1月7日保藏在ATCC中，保藏号为PTA-1159。在一优选的实施方案中，抗体9B6是人化的。
本发明另外的实施方案涉及15C10抗体及表达此抗体的杂交瘤细胞系。表达抗体15C10的杂交瘤细胞系于2000年1月7日保藏在ATCC中，保藏号为PTA-1158。在一优选的实施方案中，抗体15C10是人化的。
在一特异的实施方案中，上述特异的抗体是用本文所述的或本领域已知的方法人化的，然后用作治疗剂。
在另一特异的实施方案中，上述任一抗体是以可溶形式使用的。
在另一特异的实施方案中，上述任一抗体是与毒素或标记(如前述)缀合的。这种缀合的抗体用于杀死特殊的细胞群，或定量特殊的细胞群。在一优选的实施方案中，这种缀合的抗体用于杀死在其表面表达Neutrokine-α受体的B细胞。在另一优选的实施方案中，这种缀合的抗体用于定量在其表面表达Neutrokine-α受体的B细胞。
在另一特异的实施方案中，上述任一抗体是与毒素或标记(如前述)缀合的。这种缀合的抗体用于杀死特殊的细胞群或定量特殊的细胞群。在一优选的实施方案中，这种缀和的抗体用于杀死表达膜结合形式的Neutrokine-α的单核细胞。在另一优选的实施方案中，这种缀合的抗体用于定量表达膜结合形式的Neutrokine-α的单核细胞。
本发明的抗体还具有治疗和/或预防用途，包括但非限于活化单核细胞或阻断单核细胞活化和/或杀死单核细胞系，此单核细胞在其表面表达膜结合形式的Neutrokine-α(例如治疗，预防和/或诊断骨髓白血病，单核细胞基础上的白血病和淋巴瘤，单核细胞增多症，单核细胞减少症，风湿性关节炎，和其他与活化的单核细胞相关的病症或病理状态)。在一特异的实施方案中，本发明的抗体固定补体。在其它特异的实施方案中，本发明的抗体(或其片段)与异源多肽或核酸结合(例如毒素，如结合并活化内源胞毒性效应器系统的化合物，和放射性同位素；及胞毒性药物)。
在另一实施方案中，产生了一或多种单克隆抗体，它们识别或结合Neutrokine-α和/或其突变蛋白，但不识别或结合Neutrokine-αSV和/或其突变蛋白。在一相关的实施方案中，产生了一或多种单克隆抗体，其中它们识别或结合Neutrokine-α和/或其突变蛋白，但不识别或结合Neutrokine-α和/或其突变蛋白。
如上所述，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的抗体，可用于产生“模拟”Neutrokine-α的抗独特型抗体，使用的是本领域技术人员熟知的方法(见例如Greenspan&Bona，FASEB杂志7(5)437-444(1989)，和Nissionff，免疫学杂志147(8)2429-2438(1991)。例如，结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV及竞争性抑制Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多聚体和/或与配体结合的抗体，可用于产生“模拟”Neutrokine-αTNF多聚体化和/或结合结构的抗独特型抗体，从而结合并中和Neutrokine-α或Neutrokine-αSV和/或其配体。这种中和抗独特型抗体或其Fab片段，可用于治疗方案中以中和Neutrokine-α配体。例如，这种抗独特型抗体可用于结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV，或结合在B细胞表面的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体，从而阻断Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的B细胞活化，增殖和/或分化。
免疫系统相关疾病的诊断Neutrokine-α在肾、肺、外周血白细胞，骨髓，T细胞淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，活化的T细胞，胃癌，平滑肌，巨噬细胞，和脐血组织及单核细胞系的特殊细胞中表达。另外，Neutrokine-αSV在初始树状细胞中表达。另外，Neutrokine-α在以下的非造血性肿瘤细胞系的细胞表面表达结肠癌HCT 116(ATCC保藏号NO.CCL-247)和HT-29(ATCC保藏号NO.HTB-38)；结肠腺癌Caco-2(ATCC保藏号NO.HTB-37)，COLO 201(ATCC保藏号NO.CCL-224)和WiDr(ATCC保藏号NO.CCL-218)；乳腺癌MDA-MB-231(ATCC保藏号NO.HTB-26)；膀胱鳞癌SCaBER(ATCC保藏号NO.HTB-3)；膀胱癌HT-1197(ATCC保藏号NO.CRL-1473)；肾癌A-498(ATCC保藏号NO.HTB-44)；Caki-1(ATCC保藏号NO.HTB-46)，和Caki-2(ATCC保藏号NO.HTG-47)；肾Wilms肿瘤SK-NEP-1(ATCC保藏号NO.HTB-48)；和胰腺癌Hs766T(ATCC保藏号NO.HTB-134)；MIA PaCa-2(ATCC保藏号NO.CRL-1420)和SU.86.86(ATCC保藏号NO.CRL-1837)。就许多免疫系统相关的疾病而言，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因表达水平与标准水平相比的变化(提高或降低)，可在取自具有这种疾病的个体的免疫系统组织或其它细胞或体液(如血清，血浆，尿液，滑液或脑脊液)中检测，“标准”Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因表达水平，是在取自无免疫系统疾病的个体的免疫系统组织或体液中的表达水平。因此，本发明提供了在诊断免疫系统疾病期间使用的一种诊断方法，包括在取自个体的免疫系统组织或其它细胞或体液中，测定编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的基因的表达水平，并与标准Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因表达水平相对比，此基因表达水平提高或降低表明有免疫系统疾病或正常活化，增殖，分化和/或死亡。
特别地，据信在某些患有癌症的哺乳动物的组织中，与“标准”水平相比，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽及编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV和mRNA的表达水平明显提高或降低。另外，据信在这种患有癌症的哺乳动物的一些体液(如血清，血浆、尿液，和脑脊液)或细胞或组织中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的表达水平与无癌症的相同物种的血清相对比所表现的提高或降低，可以检测。
例如，如本文所述，Neutrokine-α在单核细胞系的细胞中高度表达。因此，本发明的多核苷酸(如互补于全部或部分Neutrokine-αmRNA和/或Neutrokine-αSV mRNA的多核苷酸序列)和抗本发明多肽的抗体(及抗体片段)，可用于定量或定性在其表面表达Neutrokine-α的单核细胞系的细胞(如单核细胞性白血病细胞)的浓度。这些抗体另外在检测Neutrokine-α基因表达水平异常，或Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的结构和/或时序，组织，细胞或亚细胞定位中的异常中有诊断用途。这些诊断分析可在体内或体外进行，例如在血液样品，活检组织或尸检组织中进行。
另外，如本文所述，Neutrokine-α受体初始在B细胞系的细胞上表达。因此，本发明的Neutrokine-α多肽(包括标记的Neutrokine-α多肽和Neutrokine-α融合蛋白)，和抗本发明多肽的抗Neutrokine-α抗体(包括抗Neutrokine-α抗体的片段)，可用于定量或定性在其表面表达Neutrokine-α受体的B细胞系细胞(如B细胞相关的白血病或淋巴瘤细胞)的浓度。这些Neutrokine-α多肽和抗体另外在检测Neutrokine-α受体基因表达水平异常，或Neutrokine-α受体的结构和/或时序，组织，细胞或亚细胞定位中的异常，和/或诊断与Neutrokine-α相关的信号途径中的活性/缺陷中，有诊断用途。这些诊断分析可在体内或体外进行，例如在血液样品或活检组织用本文所述的或本领域已知的方法进行。
在一实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或抗Neutrokine-αSV的抗体)，用于治疗，预防，诊断或预测患有免疫缺陷的个体。
可以用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-α多核苷酸或多肽，或Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的抗体)治疗，预防，诊断和/或预测的免疫缺陷包括但非限于一或多种选自以下的免疫缺陷X连锁的重度联合免疫缺损(SCID)，常染色体SCID；腺苷脱氨酶缺陷(ADA缺陷)，X连锁的丙种球蛋白缺乏症，(XLA)，Bruton’s病，先天性丙种球蛋白缺乏症，X连锁的婴儿丙种蛋白缺乏症，获得性丙种球蛋白缺乏症，成人发作的丙种球蛋白缺乏症，晚期发作的丙种球蛋白缺乏症，异常γ球蛋白血症，低γ球蛋白血症，丙种球蛋白缺乏症，普通可变性免疫缺陷(CVID)(获得性)，Wiskott-Aldrich综合征(WAS)，X连锁的高IgM免疫缺陷，非X连锁的高IgM免疫缺陷，选择性IgA缺陷，IgG亚类缺陷(有或无IgA缺陷)，正常或提高的IgS的抗体缺陷，胸腺瘤免疫缺陷，Ig重链缺失，k链缺损，B细胞淋巴增殖性疾病(BLPD)，选择性IgM免疫缺陷，隐性丙种球蛋白缺乏症(Swiss型)，网状细胞发育不全，新生儿嗜中性白细胞减少症，重度同类白细胞减少，免疫缺陷性胸腺淋巴组织发育不全-发育不全或发育异常，共济失调-毛细管扩张，短肢侏儒症，X连锁的淋巴增殖综合征(XLP)，联合IgS免疫缺陷的Nezelof综合征，嘌呤核苷酸磷酸酶缺陷(PNP)，MHC II类缺陷(Bare淋巴细胞综合征)，和重度联合免疫缺陷。
根据此实施方案，患有免疫缺陷的个体与无免疫缺陷的个体相比，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的水平异常地低。本文所述的或本领域已知的任何方法均可以用于检测本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽(如FACS分析或ELISA检测及杂交或PCR检测)，及用于确定本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽在生物样品中的表达模式。
患有免疫缺陷的人的生物样品特征是与无免疫缺陷个体中观察到的结果相对比，其Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的表达水平低。因此，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂，可根据本发明的方法用于诊断和/或预测免疫缺陷。例如，可分析得自怀疑患有免疫缺陷的人的生物样品(“目标”)的本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽的相关表达水平。然后将本发明的一或多个这些分子的表达水平与相同分子在已知无免疫缺陷的人体内的表达水平相对比。在得自目标和对照样品之间，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂和/或拮抗剂的表达水平明显不同，提示目标患有免疫缺陷。
在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的抗体)，用于治疗，诊断和/或预测患有普通可变性免疫缺陷疾病，(CVID，也称作获得性丙种球蛋白缺乏症，和获得性低丙种球蛋白血症)或其亚类疾病的个体。根据此实施方案，患者CVID或其亚类的个体表现为当与无CVID的个体相对比时，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体在其B细胞和/或单核细胞上的表达水平异常。本文所述的及本领域已知的任何方法可用于检测本发明的Neutrokine-α多核苷酸或多肽和/或其受体多肽(例如检测多肽的FACS分析或ELISA，及检测多核苷酸的杂交或PCR方法)，并用于确定本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽及其受体多肽，在含有至少单核细胞或其一些组分(如RNA)的样品中，与在含有至少B细胞或其组分(如RNA)的样品中，不同的表达模式。在确定在至少含有单核细胞或其一些组分(如RNA)的样品中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽表达增强，及确定在至少含有B细胞或其一些组分(如RNA)的样品中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽表达水平低于正常的情况下，此样品可提示患有CVID(即获得性丙种球蛋白缺乏症，或获得性低丙种球蛋白血症)。
患有CVID的人特征是当与在无CVID的人体中观测的结果相对比时，Neutrokine-α及其受体(NAR)在外周血或循环血B细胞中表达水平均高。相反，未患CVID的人的特征是在外周或循环血B细胞中Neutrokine-α表达水平低，而NAR表达水平高。因此，本发明的Neutrokine-α，Neutrokine-αSV多肽和/或NAR多肽，多核苷酸，和/或其激动剂或拮抗剂，可根据本发明的方法用于此CVID亚型的不同诊断当中，例如，对得自疑患有CVID的人(目标)的外周血B细胞样品进行分析本发明Neutrokine-α，Neutrokine-αSV和/或NAR多核苷酸和/或多肽的相关表达水平。将本发明的一个或多个这些分子的表达水平与相同分子在已知无CVID的人体(对照)中的表达水平相对比。在目标和对照样品之间，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，和/或NAR多肽表达水平的明显不同，提示目标患有CVID亚型疾病。
在一特异的实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽，或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或抗Neutrokine-αSV的抗体)，用于诊断，预测，治疗或预防特征在于血清免疫球蛋白产生缺陷，反复发生的感染和/或免疫系统功能失调的疾病。另外，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的抗体)，可用于诊断，预测，治疗或预防关节，骨，皮肤和/或腮腺的感染，血液感染(如败血症，脑膜炎，败血症性关节炎，和/或骨髓炎)，自身免疫系统疾病(如本文所述的)，炎症，及恶性肿瘤和/或与这些疾病，感染，功能失调和/或恶性肿瘤相关的任何疾病或功能失调或病理状态，包括但非限CVID，其它原发的免疫缺陷，HIV疾病，CLL，反复发生的支气管炎，瘘管，中耳炎，结缔组织炎，肺炎，肝炎，脑膜炎，带状疱疹(如重度带状疱疹)和/或pneumocystiscapnii。
在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的抗体)，用于治疗，诊断或预测患有自身免疫系统疾病的个体。
可用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的抗体)治疗，诊断或预测的自身免疫疾病包括但非限于一或多种以下疾病自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性新生儿血小板减少症，自发性血小板减少性紫癜，自身免疫性血细胞减少症，溶血性贫血，抗磷脂综合征，皮炎，过敏性脑脊髓炎，心肌炎，复发性多发性软骨炎，风湿性心脏病，肾小球肾炎(如IgA肾病)，多发性硬化，神经炎，眼色素层炎，多发性内分泌疾病，紫癜(如Henloch-Scoenlein紫癜)，Reiter′s病，Stiff-Man综合征，自身免疫性肺炎，Guillain-Pane综合征，胰导素依赖型糖尿病，和自身免疫性眼炎，自身免疫性甲状腺炎，甲状腺功能低下(即Hashimoto′s甲状腺炎)，系统性红斑狼疮，Goodpasture′s综合征，天疱疮，受体自身免疫性例如(a)Graves病，(b)Myasthenia Gravis，和(c)胰导素抗性，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性血小板减少性紫癜，风湿性关节炎，具有抗胶原抗体的schleroderma，混合的结缔组织病，多发性肌炎/皮肤肌炎，恶性贫血，自发性Addison′s病，不孕症，肾小球肾炎如原发性肾小球肾炎和IgA肾病，大疱性天疱疮，Sjogren′s综合征，糖尿病，和肾上腺素类药物抗性(包括治疗哮喘或膀胱纤维化的肾上腺素类药物抗性)，慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，其它内分泌腺病变，白癜风，血管炎，后MI，心肌综合征，荨麻疹，遗传性过敏性皮炎，哮喘，炎症性肌病，和其它炎症，granulamatous，退化，及萎缩性功能失调)。
根据此实施方案，患有自身免疫疾病或功能失调的个体表现为与无自身免疫疾病或功能失调的个体相对比，其Neutrokine-α，Neutrokine-αSV和/或NAR的表达水平异常高，本文所述的及本领域已知的任何方法均可用于检测本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，和/或NAR多肽(例如检测多肽的FACS分析或ELISA，及检测多核苷酸的杂交或PCR)，并可用于确定本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/多肽，和/或NAR多肽在生物样品中的表达模式。
患有自身免疫疾病的人体生物样品的特征是当与无自身免疫疾病或功能失调的个体中观测的结果相比时，Neutrokine-α，Neutrokine-αSV和/或NAR的表达水平高。因此，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂，可根据本发明的方法用于诊断和/或预测自身免疫疾病或功能失调。例如，可分析得自疑有自身免疫疾病或功能失调的人(目标)生物样品中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽和/或NAR多肽的相关表达水平。然后将本发明的一或多个这些分子的表达水平与相同分子在已知无自身系统疾病的人体中的表达水平相对比。在得自目标和对照体的样品之间，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂和/或拮抗剂，和/或NAR多肽表达水平的明显不同，提示目标体患有自身免疫疾病或功能失调。
在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或抗NEUTROKINE-ASV的抗体)，用于治疗，诊断或预测患有系统性红斑狼疮或其亚型疾病的个体。根据此实施方案，患有系统性红斑狼疮或其亚型的个体，当与无系统性红斑狼疮的个体相比时，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的表达水平异常高。本文所述的及本领域已知的任何方法均可用于检测本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽(例如检测多肽的FACS分析或ELISA，及检测多核苷酸的杂交或PCR方法)，并用于确定本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽在生物样品中的表达模式。
患有系统性红斑狼疮的人生物样品特征是当与无系统性红斑狼疮的个体中观测的结果相比时，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的表达水平高。因此，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或抗剂，根据本发明的复发可用于诊断和/或预测系统性红斑狼疮或其亚型。例如，对得自疑患有系统性红斑狼疮的病人(目标)的生物样品进行分析本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽的相关表达水平。然后将一或多个本发明的这些分子的表达水平与相同分子在已知无系统性红斑狼疮的人体中的表达水平相对比。在得自目标与对照体的样品之间，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂和/或拮抗剂中表达水平的明显不同，提示目标体患有系统性红斑狼疮或其亚型。
另外，系统性红斑狼疮或其亚型的病情程度与本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸(RNA)和/或多肽之间有直接关系。因此，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸(RNA)，多肽和/或激动剂或拮抗剂，根据本发明的方法可用于预测系统性红斑狼疮或其亚型疾病程度。例如，分析得自疑患有系统性红斑狼疮病人(目标)的生物样品中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽的相对表达水平。然后将一或多个本发明这些分子的表达水平与相同分子在已知代表这种疾病不同程度的一组病中的表达水平相对比。根据这种方法，表达水平符合这一组病人中的哪一个成员，则表明具有这个成员的程度。
在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的抗体)，用于治疗，诊断或预测患有风湿性关节炎或其亚型的个体。根据此实施方案，患有风湿性关节炎或其亚型的个体与无风湿性关节炎或其亚型的个体相对比，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的表达水平异常高。本文所述的和本领域已知的任何方法均可用于检测本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽(例如检测多肽的FACS分析或ELISA，及检测多核苷酸的杂交或PCR方法)，并可用于确定本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽在生物样品中的表达模式。
患有风湿性关节炎的病人的生物样品特征是当与在无风湿性关节炎的个体中观测的结果相对比时，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的表达水平提高。因此，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂，可根据本发明的方法用于诊断和/或预测风湿性关节炎或其亚型。例如，分析得自疑患有风湿性关节炎的病人(目标)的生物样品中，本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽的相对表达水平。然后将一或多个本发明这些分子的表达水平与相同分子在已知无风湿性关节炎的人体中的表达水平相对比。在得自目标和对照体的样品之间，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸和/或多肽，和/或其激动剂和/或拮抗剂的表达水平明显不同，提示目标体患有风湿性关节炎或其亚型。
因此，本发明提供了一种在诊断免疫系统功能失调包括此系统癌症，及免疫缺陷和/或自身免疫疾病中的有效诊断方法，包括测定编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的基因，在个体的免疫系统组织或其它细胞或体液中的表达水平，并将此表达水平与标准Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因表达水平相对比，从而与标准水平相比提高或降低则表明患有免疫系统疾病。
诊断免疫系统疾病包括但非限于诊断肿瘤，免疫缺陷，和/或自身免疫疾病，已根据常规方法进行，本发明用作预测指示剂，从而病人呈现Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因表达水平增强或降低，相对于基因表达水平接近标准水平的病人，所表现的临床结果更加严重。
分析或确定编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的基因的表达水平，是指直接或间接地定量或定性测定或估计Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的mRNA在第一个生物样品的表达水平，直接测定是确定或估计绝对蛋白质水平或mRNA水平，间接测定是与在第二个生物样品中的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽水平或mRNA水平比较。优选地，测定或估计第一个生物样品中Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽水平或mRNA水平，并与标准Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽水平或mRNA水平相对比，标准水平得自正常人体的第二个生物样品，或通过确定正常人体的平均水平而得。本领域技术人员知道，一旦已知标准Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽水平或mRNA水平，其可重复用作对照标准。
“生物样品”是指得自含有Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或mRNA的个体，体液，细胞系，组织培养物或其它来源的任何生物样品。如上所述，生物样品包括体液(如血清，血浆，尿液，滑液和脑脊液)，其含有Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的游离胞外结构域，免疫系统组织，和其它发现表达完整或游离Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV或其受体的胞外结构域的组织。本领域熟知从哺乳动物获得活检组织和体液的方法。当生物样品包括mRNA时，活检组织是优选的来源。
本发明的化合物用于诊断，预测或治疗哺乳动物优选人体内的各种免疫系统相关的疾病。这种疾病包括但非限于肿瘤(如B细胞和单核细胞性白血病和淋巴瘤)及肿瘤转移，细菌，病毒及其它寄生虫感染，免疫缺陷，炎症，淋巴腺病，自身免疫疾病(如风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，Sjogren综合征，混合的结缔组织疾病，及炎症性肌病)，及移植物/宿主疾病。
用任何适当的方法可从生物样品中分离出总细胞RNA，如Chomczynski和Sacchi在生物化学分析162156-159(1987))中所述的一步硫氰酸胍-苯酚-氯仿法。然后用任何适当的方法分析编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的mRNA水平。这些方法包括Northern印迹分析，S1核酸酶作图，聚合酶链反应(PCR)，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，和逆转录-连接酶链反应(RT-LCR)。
可用基于抗体的方法分析生物样品中Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽水平。例如，组织中Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的表达可用传统的免疫组织学方法研究(Jalkanen，M.，等，细胞生物学杂志101976-985(1985)；Jalkanen，M.等，细胞生物学杂志1053087-3096(1987))。基于抗体的其它检测Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽基因表达的方法包括免疫分析，如酶联免疫吸附测定(ELISA)放射免疫分析(RIA)。本领域已知适当的抗体分析标记，包括酶标记如葡糖氧化酶，和放射性同位素如碘(131I，125I，123I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(115mIn，113mIn，112mIn，111mIn，)，和锝(99Tc，99mTc)，钛(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，188Re，142Pr，105Rh，97Ru；发光标记如鲁米诺，和荧光标记如荧光素和罗丹明，及生物素。
本领域已知的方法可用于标记本发明的抗体。这种方法包括但非限于使用双功能缀合剂(见例如美国专利No.5756065；5714631；5696239；5652361；55055931；5489425；5435990；5428139；5342604；5274119；4994560；和5808003；以上文献全文并入参考)。
所分析的组织或细胞类型一般包括已知或怀疑表达Neutrokine-α基因的细胞或组织(如单核细胞系细胞)，或已知或怀疑表达Neutrokine-α受体基因的细胞或组织(如B细胞系和脾细胞)。本发明所用的蛋白质分离方法例如由Harlow和Lane所述的方法(Harlow，E和Lane，D。，1988，“抗体实验手册”，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)，以其全文并入参考。分离的细胞可衍生自细胞培养物或病人。分析取自培养物的细胞是确定此细胞能用作基于细胞的基因治疗方法的一部分，或测试化合物Neutrokine-α基因或Neutrokine-α受体基因表达的作用所必需的一个步骤。
例如，本文所述的抗体或其片段可用于定量或定性检测Neutrokine-α基因产物或其保守的变体或肽片段的存在情况。这可例如通过免疫荧光方法进行，用光学显微镜，流式细胞计量术或荧光测定法检测荧光标记的抗体。
本发明的抗体(或其片段)或Neutrokine-α多肽可另外用于组织学分析如免疫荧光分析，免疫电子显微镜或非免疫学分析中，以原位检测Neutrokine-α基因产物或其保守的变体或肽片段，或结合Neutrokine-α受体的Neutrokine-α。原位检测可通过从病人体内取组织学样品，或对其施用本发明标记的抗体或Neutrokine-α多肽。抗体(或片段)或Neutrokine-α多肽优选通过将标记的抗体(或片段)覆盖在生物样品上而施用。通过使用这种方法，不仅可确定Neutrokine-α基因产物，或保守的变体或肽片段，或Neutrokine-α多肽结合，还可确定其在测试组织中的分布。使用本发明，本领域技术人员将易于理解可对许多组织学方法(如染色方法)加以修改，以进行原位检测。
对Neutrokine-α基因产物或其保守的变体或肽片段进行的免疫和非免疫分析，包括在存在能鉴别Neutrokine-α基因产物或其保守的变体或肽片段的可检测标记的抗体的情况下，温育样品如生物液，组织提取物，新收集的细胞，或在细胞培养物中温育的细胞裂解物，并通过本领域熟知的许多方法检测结合的抗体。
对Neutrokine-α受体基因产物或其保守的变体或肽片段进行的免疫和非免疫分析，包括在存在能鉴别Neutrokine-α受体基因产物或其保守的变体或肽片段的可检测或标记的Neutrokine-α多肽存在的情况下，温育样品如生物液，组织提取物，新收集的细胞或在细胞培养物中温育的细胞裂解物，并通过本领域熟知的许多方法检测结合的Neutrokine-α多肽。
生物样品可与固相支持物或载体接触并固定于其上，如固定于硝基纤维素或能固定细胞，细胞颗粒或可溶蛋白的其它固体支持物。然后将此支持物用适当的缓冲剂冲洗，随后用可检测标记的抗Neutrokine-α抗体或可检测的Neutrokine-α多肽处理。然后将此固相支持物用缓冲液再冲洗一次，以除去未结合的抗体或多肽。任选地此抗体是随后标记的。固体支持物上结合的标记数量然后可通过常规方法检测。
“固相支持物或载体”是指能结合抗原或抗体的任何支持物。熟知的支持物或载体，包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龙，淀粉酶，天然和修饰的纤维素，聚丙烯酰胺，辉卡岩，和磁铁矿。载体的性质可以是在一些情况下可溶的，或为本发明目的而不溶的。固体支持物实际上可有任何可能的构型，只要偶联的分子能结合抗原或抗体。因此，支持物构型可以是球形的如珠，或圆柱体如在试管的内表面，或棒的外表面。或者，此表面可以是平坦的如薄片，试纸等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员已知许多结合抗体或抗原的其它适当载体，或能使用常规试验确定。
除了在得自个体的生物样品中分析Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽水平或多核苷酸水平，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸也可在体内通过显象而检测。例如，在本发明的一个实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽和/或抗Neutrokine-α抗体用于显象B细胞淋巴瘤。在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽和/或抗Neutrokine-α的抗体和/或Neutrokine-α多核苷酸(如互补于全部或部分Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV mRNA的多核苷酸)，用于显象淋巴瘤(如单核细胞和B细胞淋巴瘤)。
用于体内显象Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的抗体标记或标志物包括可通过X线，NMR，MRI，CAT扫描，或ESR检测的标记。就X线而言，适当的标记包括放射性同位素如钡或铯，其发射可检测的射线，但对测试对象无明显伤害。进行NMR和ESR的适当标记包括具有可检测特征性自旋的标记如氚，其可通过标记相关杂交瘤的营养素而掺入抗体中。在体内显象用于检测Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽水平增强时以对人体进行诊断时，优选使用人抗体或“人化的”嵌合单克隆抗体。这种抗体可用于本文所述的或本领域已知方法产生。例如，本领域已知产生嵌合抗体的方法。见例如，Morrison，科学2291202(1985)；Oi等，生物技术4214(1986)；Cabilly等，美国专利4816567；Taniguchi等，EP171496；Morrison等，EP173494；Neuberger等，WO8601533；Robinson等，WO8702671；Boulianne等，自然312643(1984)；Neuberger等，自然314268(1985)。
或者，可施用其存在可被检测的任何Neutrokine-α多肽。例如，可施用经不透射线的或其它适当化合物标记的Neutrokine-α多肽，并如上所述在体内评价标记的抗体。另外这种Neutrokine-α多肽可用于体外诊断方法。
将已用适当的可检测显象组分标记的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽特异性抗体或抗体片段，导入哺乳动物中(如经非肠道，皮下或腹膜内施用)以检测免疫系统疾病，所述可检测的显象组分例如是放射性同位素(例如131I，112In，99mTc，(131I，125I，123I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(115mIn，113mIn，112In，111In，)，和锝(99Tc，99mTc)，钛(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh，97Ru)，不透射线的物质，或通过核磁共振可检测的物质。本领域技术人员应知测试对象的大小及所用的显象系统将确定产生诊断影像所的显象组分。在使用放射性同位素的情况下，就人而言，注射的放射活性数量一般为大约5-20毫居里的99mTc。然后标记的抗体和抗体片段优先在含有Neutrokine-α蛋白的细胞处累积。体内肿瘤成象见于S.W.Burchiel等，“放射标记的抗体及其片段的免疫药动学”(第13章，肿瘤成象癌症的放射化学检测，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编辑，Masson Publishing Inc.(1982))。
就抗体而言，其中抗Neutrokine-α的抗体可检测地标记的方式之一是将其与酶连接，并在酶免疫分析中(EIA)使用连接的产物(Voller，A.“酶联免疫吸附测定(ELISA)”，1978，诊断水平21-7，微生物学相关四分出版物，Walkersville，MD)；Voller等，临床病理学杂志31507-520(1978)；Bulter，J.E.酶学方法73482-523(1981)；Maggio，E.等(编辑)1980，酶免疫分析，CRC出版社，Boca Raton，FL；Ishikawa，E.等(编辑)，1981，酶免疫分析，Kgaku Shoin，Tokyo)。与抗体结构的酶将与适当底物反应，优选与显色底物反应，以此方式产生可通过例如分光光度法，荧光测定法或目测法检测的化学组分。可用于可检测地标记抗体的酶包括但非限于苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，δ-5-类固醇异构酶，酵母乙醇脱氢酶，α-甘油磷酸酯，脱氢酶，丙糖磷酸异构酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，过氧化氢酶，葡糖-6-磷酸脱氢酶，葡糖淀粉酶，和乙酰胆碱酯酶。另外，可通过使用与酶反应的显色底物的比色法进行检测。也可通过目测将底物与酶的反应情况与相似制备的标准相对比进行检测。
也可用任何其它免疫分析进行检测。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，可经放射免疫分析(RIA)检测Neutrokine-α(见例如Weintraub，B.，放射免疫分析原理，对放射配体分析方法的第7次training Course，The Endocrine Society，March，1986，以其全文并入参考)。放射性同位素可通过包括但非限于γ计数仪，闪烁计数仪或放射自显影等方法检测。
也可用荧光化合物标记抗体。当荧光标记的抗体暴露于适当波长的光线之下时，由于荧光素而可检测其存在情况。常用的荧光标记化合物是异硫氰酸荧光素，罗丹明，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，ophthaldehyde和荧光胺。
抗体也可用发射荧光的金属如152Eu，或其它镧系金属可检测地标记。这些金属可用这种金属的螯合基团如二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)而附着于抗体。
抗体也可通过将其与化学发光化合物偶联而可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光现象，而确定化学发光物标记的抗体。尤为有效的化学发光标记化合物例如是鲁米诺，异鲁米诺，theromatic acridinum ester，咪唑，acridmium盐和草酸盐。
另外，生物发光化合物可用于标记本发明的抗体。生物发光物是一种在生物系统中发现的化学发光物，其中催化蛋白提高化学发光物反应的效力。生物发光蛋白的存在情况可通过检测发光物的存在情况而检测。进行标记的重要生物发光化合物包括但非限于荧光素，荧光素酶，和水母蛋白。
免疫系统相关疾病的治疗如上所述，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽和多核苷酸及抗Neutrokine-α的抗体，用于诊断Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性的异常高或低表达的疾病。提供其中Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV被表达的以及其活性由Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV调节的细胞和组织，与标准或“正常”水平相比个体中Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的表达水平发生变化(提高或降低)，产生与其中Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV是表达的和/或活性的机体系统相关的病理改变。
本领域技术人员还知道，由于本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽是TNF家族的成员，代表性蛋白质的胞外结构域可以可溶形式从表达Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的细胞中，通过蛋白酶解而释放，且因此当Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽〔尤其可溶形式的代表性胞外结构域〕从外源加入个体的组织，细胞或机体时，此多肽呈现对个体的任何其靶细胞经调节的活性。同样，表达此II型跨膜蛋白的细胞可加入个体的细胞，组织或机体中，从而加入的细胞与表达Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体的细胞结合，由此，表达Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的细胞可对携带受体的靶细胞产生作用(如增殖或胞毒性)。
在一实施方案中，本发明提供了为定向的细胞输送含有本发明多肽的组合物(如含有与异源多肽，异源核酸，毒素或前体药物相关的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或抗Neutrokine-α和/或抗Neutrokine-αSV抗体的组合物)的方法，所述定向的细胞如是表达Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体的B细胞，或表达细胞表面结合形式的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的单核细胞。本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV抗体，通过亲水性，疏水性，离子和/或共价相互作用而与异源多肽，异源核酸，毒素或前体药物相结合。
在一实施方案中，本发明提供了一种将本发明的组合物特异地输送至细胞的方法，通过施用与异源多肽或核酸相关的本发明的多肽(如Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或抗Neutrokine-α和/或抗Neutrokine-α的抗体)进行。在一实施例中，本发明提供了一种将治疗性蛋白质输送至定向的细胞的方法。在另一实施例中，本发明提供了一种将单链的核酸(如反义或核酶分子)，或双链的核酸(如能整合入细胞的基因组或附加复制及能转录的DNA)。
在另一实施方案中，本发明提供了一种特异破坏细胞(如破坏肿瘤细胞)的方法，通过施用与与毒素或胞毒性前体药物相结合的本发明多肽(如Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或抗Neutrokine-α和/或抗Neutrokine-αSV抗体)而进行。
在一特异的实施方案中，本发明提供了一种特异破坏B细胞系细胞(如B细胞相关的白血病或淋巴瘤)的方法，通过施用与毒素或胞毒性前体药物相结合的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽而进行。
在另一特异的实施方案中，本发明提供了一种特异破坏单核细胞系细胞(如单核细胞性白血病或淋巴瘤)的方法，通过施用与毒素或胞毒性前体药物相关的抗Neutrokine-α和/或抗Neutrokine-αSV抗体而进行。
“毒素”是指结合并激活内源性胞毒性效应器系统的化合物，放射性同位素，全毒素，修饰的毒素，毒素的催化亚基，胞毒素(胞毒剂)，或在限定的导致细胞死亡的条件下非正常地存在于或在细胞表面的任何分子或酶。根据本发明的方法可使用的毒素包括但非限于本领域已知的放射性同位素，化合物如结合固有的或诱导的内源性胞毒性效应器系统的抗体(或含有其一部分的补体固定区)，胸苷激酶，内切核酸酶，RNase，α-毒素，蓖麻毒蛋白，红豆毒素，假单胞杆菌属外毒素A，白喉毒素，皂草素，苦瓜定，gelonin，商陆抗病毒蛋白，α-sarcin和霍乱毒素。“毒素”还包括细胞抑制剂或杀细胞剂，治疗剂或放射性金属离子，如α-发射体例如213Bi，或其它放射性同位素例如133Xe，131I，68Ge，57Co，65Zn，85Sr，32P，35S，90Y，153Sm，153Gd，169Yb，51Cr，54Mn，75Se，113Sn，90钇，117锡，186铼，166钬和188铼，发光标记如鲁米诺；和荧光标记如荧光素和罗丹明，和生物素。
本领域已知的方法可用于标记本发明的抗体。这种方法包括但非限于使用双功能缀合剂(见例如美国专利5756065；5714631；5696239；5652361；5505931；5489425；5435990；5428139；5342604；5274119；4994560；和5808003；所述文献均全文并入参考)。胞毒素或胞毒剂包括对细胞不利的任何制剂。例如包括paclitaxol，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，吐根碱，丝裂霉素，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，表鬼臼毒噻吩糖苷，长春新碱，长春花碱，秋水仙碱，阿霉素，道诺红菌素，二羟炭疽菌素dione mitoxantrone，光神霉素，放线菌素D，1-脱氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，心得安，和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂包括但非限于抗代谢物(如氨甲喋呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化剂(例如二氯甲基二乙胺，thioepa苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，卡氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)，cyclothosphamide，白消安，二溴甘露糖醇，链脲菌素，丝裂霉素C，和二氯二胺顺铂(II)(DDP)，蒽环类抗生素(例如道诺红菌素，(从前的道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(如道诺霉素(从前的放线菌素)，博来霉素，光神霉素，氨茴霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(如长春新碱和长春花碱)。
“胞毒性前体药物”是指通过细胞内正常存在的酶转换为胞毒性化合物的非毒性化合物。根据本发明的方法可使用的胞毒性前体药物包括但非限于安息香酸芥子烷化剂的谷氨酰衍生物，表鬼臼毒吡喃葡糖苷或丝裂霉素C的磷酸盐衍生物，阿糖胞苷，道诺红菌素和阿霉素的苯氧基乙酰胺衍生物。
应知由个体中Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性水平低于标准或正常水平所致的疾病，尤其免疫系统疾病，可通过施用Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽(以可溶的胞外结构域或表达完整蛋白的细胞形式)或激动剂而处理。因此，本发明还提供了一种治疗需要提高Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性水平的个体的方法，包括给这种体施用一种药物组合物，该组合物包含一定数量的分离的本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或其激动剂，有效地提高这种个体中Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性水平。
还应知道由个体Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性水平高于标准或正常水平所致的疾病，尤其免疫系统疾病，可通过施用Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽(可溶的胞外结构域或表达完整蛋白的细胞形式)或其拮抗剂(如抗Neutrokine-α的抗体)而进行治疗。因此本发明还提供了一种治疗需要降低Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性的个体的方法，包括为这种个体施用一种药物组合物，该组合物包含一定量的本发明分离的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽，或其拮抗剂，以有效地降低这种个体中的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性水平。
本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽或其拮抗剂，可用于治疗感染性疾患。例如，通过提高免疫应答尤其提高B细胞增殖和分化，可治疗感染性疾患。免疫应答可通过增强现存的免疫应答，或通过启动新的免疫应答而得以提高。或者，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽或其拮抗剂，也可直接抑制感染性因素，而不需激发免疫应答。
病毒例如是一种能产生疾病或临床症状的感染因子，这种疾病或临床症状可通过Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽或其激动剂而加以治疗。病毒例如包括但非限于以下DNA和RNA病毒及病毒科虫媒病毒，腺病毒，沙粒病毒，动脉炎病毒，双RNA病毒，布尼亚病毒，杯状病毒，Circoviridae，冠状病毒，登革病毒，EBV，HIV，黄病毒，嗜肝DNA病毒(肝炎病毒)，疱疹病毒(如巨细胞病毒，单纯疱疹病毒，带状疱疹病毒)，Mononegavirus(如副粘病毒，麻疹病毒，弹状病毒)，正粘病毒(如甲型流感病毒，乙型流感病毒和副流感病毒)，乳头瘤病毒，乳多空病毒，细小病毒，小RNA病毒，痘病毒(如天花或痘苗病毒)，呼肠病毒(如轮状病毒)，逆转录病毒(HTLV-I，HTLV-II，慢病毒属)，和披膜病毒(如风疹病毒)。这些家族中的病毒可导致各种疾病或临床症状，包括但非限于关节炎，支气管炎，呼吸道合胞病毒，脑炎，眼部感染(如结膜炎，角膜炎)，慢性疲劳综合征，肝炎(甲，乙，丙，戊型，慢性活动型，δ型)，日本B型脑炎，Junin，Chikungunya，Rift Valley热，黄热病，脑膜炎，机会感染(如AIDS)，肺炎，Burkitt’s淋巴瘤，水痘，出血热，麻疹，流行性腮腺炎，副流感，狂犬病，普通感冒脊髓灰质炎，白血病，风疹，性病，皮肤病(如Kaposi’疣)和病毒血症。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗，预防，诊断和/或检测任一种这些症状或疾病。在特异的实施方案中，Neutrokine-α-多核苷酸，多肽或激动剂用于治疗，预防和/或诊断脑膜炎，登革热，EBV，和/或肝炎(如乙型)。在另一特异的实施方案中，Neutrokine-α-多核苷酸，多肽或激动剂用于治疗对一或多种其它商购肝炎疫苗无应答的病人。在另一特异的实施方案中，Neutrokine-α多核苷酸，多肽或激动剂用于治疗，预防和/或诊断AIDS。在另一特异的实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV和/或其受体多核苷酸，多肽，激动剂和/或拮抗剂用于治疗，预防和/或诊断隐孢子虫病。
相似地，可引起疾病或临床症状并可用Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂治疗的细菌或真菌病因包括但非限于以下革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌和细菌科及真菌放线目(如棒杆菌，分枝杆菌，诺卡氏菌)，新型隐球酵母，曲霉，芽孢杆菌科(如炭疽菌，梭状芽孢杆菌属)，类菌科，芽生菌，包特菌属，疏螺旋体(如Borrelia Burgdorferi)，布鲁氏杆菌，念珠菌属，弯曲菌属，球孢子菌，隐球菌，Dermatocycoses，大肠杆菌(如肠产毒性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌)，肠杆菌属(克雷伯杆菌属，沙门氏菌属(如伤寒杆菌，副伤寒杆菌)，Serratiia，耶尔森菌属)，丹毒丝菌，卷旋杆菌，军团菌属，钩端螺旋体属，李斯特菌属(如Listeria monocytogenes)，支原体，麻风杆菌，霍乱弧菌，奈瑟菌属(如放线杆菌，Gornorrhea，脑膜炎球菌)，Meisseriameningitidis，巴氏菌属感染(如放线芽孢杆菌，嗜血杆菌(如B型流感嗜血杆菌)，巴氏菌属)，假单胞菌属，立克次氏体，衣原体，梅毒，志贺菌属，葡萄球菌属，脑膜炎球菌，肺炎球菌，和链球菌(如肺炎链球菌和B组链球菌)。这些细菌或真菌科可产生以下疾病或症状，包括但非限于细菌血症，心内膜炎，眼部感染(结膜炎，结核，眼色素层炎)，牙龈炎，机会感染(如AIDS相关的感染)，甲沟炎，假体相关的感染，Reiter’s病，呼吸道感染，如百日咳或积脓，败血症，Lyme病，Cat-Seratch病，痢疾，副伤寒，食物中毒，伤寒，肺炎，淋病，脑膜炎(如甲型，乙型脑膜炎)，衣原体病，梅毒，白喉，麻风，副结核，结核，狼疮，肉毒中毒，坏疽，破伤风，脓疱病，风湿热，猩红热，性病，皮肤病(如蜂窝组织炎，dermatocycoses)，毒血症，尿路感染，伤口感染。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于处理，预防，诊断和/或检测任一种这些病疾或症状。在特异的实施方案中，Neutrokine-α多核苷酸，多肽或其激动剂用于治疗，预防和/或诊断破伤风，Diptheria，肉毒中毒和/或乙型脑膜炎。
另外，导致疾病或症状且能用Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂治疗的寄生虫病因，包括但非限于以下家族或类型阿米巴病，巴贝西虫病，球孢子，隐孢子虫病，Dientamoebiasis，媾疫，Ectoparasitic，贾第鞭毛虫病，蠕虫病，利什曼病，泰勒尔梨浆虫病，弓形体病，锥虫病，和毛滴属及孢子虫(如Plasmodium virax，恶性疟原虫，疟疾疟原虫和Plasmodium ovale)。这些寄生虫可导致各种疾病或症状，包括但非限于疥疮，秋恙虫病，眼部感染，肠道疾病(如痢疾，贾第鞭毛虫病)，肝脏疾病，肺部疾病，机会感染(如AIDS相关的感染)，疟疾，孕期并发症，和弓形体病。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于治疗，预防，诊断和/或检测任何这些症状或疾病。在特异的实施方案中，Neutrokine-α-多核苷酸，多肽或其激动剂用于治疗，预防和/或诊断疟疾。
在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂，用于治疗，预防和/或诊断内耳感染(如中耳炎)，以及其它特征在于肺炎链球菌及其它病原微生物所致感染。
在一特异的实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的抗体)，用于治疗或预防特征在于血清免疫球蛋白产生缺陷，复发感染和/或免疫系统功能失调的疾病。另外Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的抗体)，可用于治疗或预防关节，骨，皮肤和/或腮腺感染，血液所致感染(如败血症，脑膜炎，败血症性关节炎，和/或骨髓炎)，自身免疫系统疾病(如本文所述的)，炎症，和恶性肿瘤，和/或与这些感染，疾病，功能关调或恶性肿瘤相关的任何疾病或功能失调或病理改变，包括但非限于CVID，其它原发免疫缺陷，HIV，CLL，复发性支气管炎，窦炎，中耳炎，结膜炎，肺炎，肝炎，脑膜炎，带状疱疹(如重度带状疱疹)，和/或卡氏肺囊虫。
Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于诊断，预测，治疗或预防一或多种以下疾病或功能失调，或病理状态原发免疫缺陷，免疫介导的血小板性贫血，Kawasaki综合征，骨髓移植(如成人或儿童的骨髓移植)，慢性B细胞淋巴性白血病，HIV感染(如成人或儿童HIV感染)，慢性炎症性脱髓鞘多神经病，和输血后紫癜。
另外，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂或拮抗剂，可用于诊断，预测，治疗或预防一或多种以下疾病，功能失调或病理状态Guillian-Barre综合征，贫血(如与细小病毒B19相关的贫血，具有稳定的多个骨髓瘤的病人，其感染的危险性很高(如复发感染)，自身免疫性溶血性贫血(如发热型自身免疫性溶血性贫血)，血小板性贫血(如新生儿血小板性贫血)，和免疫介导的神经性贫血)，移植(如CMV阳性器官的CMV阴性受体)，低丙种球蛋白血症(如具有感染或发病危险因素的新生儿低丙种球蛋白血症)，癫痫(如难治的癫痫)，全身性血管综合征，肌无力(如肌无力中的心脏代偿失调)，皮肌炎，和多发性肌炎。
本发明另外的优选实施方案包括但非限于将Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽，多核苷酸及其功能激动剂，用于以下应用中施用于动物(如小鼠，大鼠，免，仓鼠，豚鼠，猪，小猪，鸡，骆驼，山羊，马，牛，羊，狗，猫，非人灵长目，和人，优选人)，以辅助免疫系统产生增加量的一或多种抗体(如IgG，IgA，IgM和IgE)，诱导较高亲和性抗体产生(如IgG，IgA，IgM和IgE)，和/或提高免疫应答。在一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α多肽和/或其激动剂，以辅助免疫系统产生增加量的IgG。在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α多肽和/或其激动剂，以辅助免疫系统产生增加量的IgA。在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α多肽和/或其激动剂，以辅助免疫系统产生增加量的IgM。
施用于动物(包括但非限于以上所列的并还包括转基因动物)，所述动物不能产生功能性内源抗体分子，或具有另外组成的内源免疫系统，但不能通过从另外动物中重建或部分重建免疫系统而产生人免疫球蛋白分子(见例如PCT出版物No.WO98/24893，WO96/34096，WO96/33735和WO91/10741所述)。
一种疫苗佐剂增强对特异抗原的免疫应答。在一特异的实施方案中，疫苗佐剂是本文所述的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽。在另一特异的实施方案中，疫苗佐剂是在此所述的Neutrokine-α和/或αSV多核苷酸(即Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸是一种遗传的疫苗佐剂)。如本文所述，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸可使用本领域已知的方法施用，包括但非限于脂质体输送，重组载体输送，注射裸DNA，及基因枪输送。
一种佐剂增强肿瘤特异性免疫应答。
一种佐剂增强抗病毒免疫应答。抗病毒免疫应答可用本发明的组合物作佐剂而增强，抗病毒免疫应答包括但非限于本发明所述的或本领域已知的病毒与病毒相关的疾病或症状。在特异的实施方案中，本发明的组合物用作佐剂，以增强对选自以下的病毒疾病或症状的免疫应答AIDS，脑膜炎，登革热，EBV，和肝炎(如乙肝)。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物用作佐剂，以增强对选自以下的病毒，疾病或症状的免疫应答HIV/AIDS，呼吸道合胞病毒，登革热，轮状病毒，日本B型脑炎，甲型和乙型流感，副流感，麻疹，巨细胞病毒，狂犬病，Junin，Chikungunya，Rift Valley热，单纯疱疹，和黄热病。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物用作佐剂增强对HIV gp120抗原的免疫应答。
一种佐剂增强抗菌或抗真菌免疫应答。可用本发明的组合物作佐剂增强的抗菌或抗真菌免疫应答，包括本文所述及本领域已知的细菌或真菌及与细菌或真菌相关的疾病或症状。在特异的实施方案中，本发明的组合物用作佐剂以增强对选自以下细菌或真菌，疾病或症状的免疫应答破伤风，白喉，肉毒中毒，和乙型脑膜炎。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物用作佐剂，以增强对选自以下的细菌或真菌，疾病或症状的免疫应答霍乱弧菌，麻风杆菌，伤寒杆菌，副伤寒杆菌，Meisseria meningitidis，肺炎链球菌，B组链球菌，志贺菌，肠产毒性大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌，Borreliaburgdorferi，疟原虫属(疟疾)。
一种佐剂增强抗寄生虫免疫应答。可用本发明的组合物作佐剂增强的抗寄生虫免疫应答，包括本文所述或本领域已知的寄生虫及与寄生虫相关的疾病或症状。在特异的实施方案中，本发明的组合物用作佐剂增强对寄生虫的免疫应答。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物用作佐剂以增强对疟原虫属(疟疾)的免疫应答。
作为B细胞对病原体应答的刺激剂。
作为在接受免疫抑制治疗之前，评价个体免疫状态的因子。
作为诱导高亲和性抗体的因子。
作为提高血清免疫球蛋白浓度的因子。
作为加速免疫包含个体回收的因子。
作为辅助老年人免疫应答的因子。
作为在骨髓移植和/或其它移植(如同种或异种器官移植)之前，期间或之后，免疫系统的增强子。考虑到移植，本发明的组合物可在移植之前，同时，和/或之后施用。在一特异的实施方案中，本发明的组合物在移植之后，开始回收T细胞之前施用。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物首先在移植后开始恢复T细胞群之后，但在完全恢复B细胞之前施用。
作为辅助B细胞免疫缺陷个体的免疫应答的因子，例如部分或完全脾切除术后患者。可通过施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂而得以改善或治疗的B细胞免疫缺陷症包括但非限于X连锁的重度联合免疫缺损(SCID)，常染色体SCID，腺苷脱氨酶缺损(ADA缺损)，X连锁的丙种球蛋白缺乏症(XLA)，Bruton’s病，先天性丙种球蛋白缺乏症，X连锁的婴儿丙种球蛋白缺乏症，获得性丙种球蛋白缺乏症，成人发作性丙种球蛋白缺乏症，晚期发作性丙种球蛋白缺乏症，丙种球蛋白异常血症，低丙种球蛋白血症，婴儿短暂性低丙种球蛋白血症，非特异性低丙种球蛋白血症，丙种球蛋白缺乏症，普通变异的免疫缺陷(CVID)(获得性)，Wiskott-Aldrich综合征(WAS)，X-连锁的高IgM免疫缺陷，非X连锁的高IgM免疫缺陷，选择性IgA缺陷，IgG亚类缺陷(有或无IgA缺陷)，正常或高IgS抗体缺陷，胸腺瘤免疫缺陷，Ig重链缺失，k链缺损，B细胞淋巴增殖性疾病(BLPD)，选择性IgM免疫缺损，隐性丙种球蛋白缺乏症(Swiss型)，网状组织发育不全，新生儿嗜中性白细胞减少症，重度先天性白血病，免疫缺陷性胸腺淋巴组织发育不全，运动失调性毛细血管扩张症，短肢侏儒，X连锁的淋巴增殖性综合征(XLP)，联合Igs免疫缺损的Nozelof综合征，嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺陷，MHCII类缺陷(Bare淋巴细胞综合征)，和重度联合免疫缺损。
作为具有B细胞功能获得性丧失个体的加强免疫应答制剂，可通过施用本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂而得以改善或治疗的导致获得性B细胞功能丧失的疾病包括但非限于HIV感染，AIDS，骨髓移植，和B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
作为辅助暂时性免疫缺损个体免疫应答的因子。可通过施用本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂而得以改善或治疗的导致暂时免疫缺损的疾病包括但非限于病毒感染(如流感)，与营养不良相关的疾病，单核细胞增多症感染，或与应激相关的疾病，麻疹，输血，外科手术。
作为通过单核细胞，树状细胞和/或B细胞进行抗原呈递的调节剂。在一实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽(可溶，膜结合或跨膜形式)或多核苷酸，在体外或体内增强抗原呈递或拮抗抗原呈递。另外，在相关的实施方案中，抗原呈递的这种增强或拮抗作用可用于抗肿瘤治疗或调节免疫系统。
作为粘膜免疫应答的介导剂。单核细胞表达Neutrokine-α及B细胞对其它应答提示，其可包含于B细胞和单核细胞之间或它们分化的子代之间信号交换中。此活性在许多方面与B细胞和T细胞之间CD40-CD154信号相同。因此，Neutrokine-α可以是对环境病原的T细胞非依赖性免疫应答的重要调节剂。尤其与粘膜处相关的及可对人体内许多天然免疫应答的非常规B细胞群(CD5+)，可对Neutrokine-α应答，因此增强个体的防护性免疫状况。
作为指导个体免疫系统发生与TH1细胞应答相反的体液应答(即TH2)的因子。
作为诱导肿瘤增殖的因子，且因此使其更适于抗肿瘤剂。例如，多发性骨髓瘤是一种缓慢分化的疾病，且因此实际上对所有抗肿瘤方法都不起作用。如果使这些细胞更快增殖，其对抗肿瘤方法的接受能力将得以改善。
作为B细胞特异性结合蛋白，细胞生长的特异性激活剂或抑制剂可附着于其。结果是将这种激活剂或抑制剂的活性集中于正常的，疾病态的或肿瘤性B细胞群。
作为通过其特异性而检测B细胞系细胞的因子。此应用可要求用生物素或其它制剂(如本文所述的)标记蛋白质，以进行检测。
作为在一些疾病中B细胞产生的刺激剂，如AIDS，慢性淋巴细胞功能失调和/或普通可变性免疫缺损。
作为选择B细胞的方法的一部分，其功能是从各类细胞的异源混合物中分离B细胞。Neutrokine-α可与固体支持物偶联，然后B细胞与其特异结合。冲洗掉未结合的细胞，随后洗脱结合的细胞。这种选择的一种非限制性应用是使在移植前，将肿瘤细胞从例如骨髓或周围血中清除。
用作在手术，外伤或遗传缺损之后生成和/或再生淋巴组织的疗法。
用作如在SCID病人中观测到的导致无免疫能力的遗传疾病的基因疗法。
作为生成抑制或增强Neutrokine-α介质的应答的抗原。
作为激活单核细胞/巨噬细胞的物质以抵御作用于单核细胞的寄生虫疾病，如利什曼病。
在移植之前作为骨髓样品的预处理剂。这种处理提高B细胞再呈递，并因此加速回收。
作为调节分泌的细胞因子的物质，该细胞因子的分泌由Neutrokine-α激发。
本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂可用于在体外或体内调节IgE浓度。
另外，本发明的Neutrokine-α或Neutrokine-αSV多肽或核苷酸，或其激动剂可用于治疗，预防和/或诊断IgE介导的变态反应。这种变态反应包括但非限于哮喘，鼻炎和湿疹。
在一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂，以治疗，预防，诊断和/或改善选择性IgA缺陷。
在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂，以治疗，预防，诊断和/或改善运动失调性毛细血管扩张症。
在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂，以治疗，预防，诊断和/或改善普通变异的免疫缺损。
在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂，以治疗，预防，诊断和/或改善X连锁的丙种球蛋白缺乏症。
在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂，以治疗，预防，诊断和/或改善重度联合免疫缺损(SCID)。
在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂，以治疗，预防，诊断和/或改善Wiskott-Aldrich综合征。
在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂，以治疗，预防，诊断和/或改善X连锁的高IgM的Ig缺损。
在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α抗体)，以治疗，预防，诊断和/或诊断慢性骨髓性白血病，急性骨髓性白血病，白血病，hystiocytic白血病，单核细胞性白血病(如急性单核细胞性白血病)，网状细胞增多性白血病，Shilling型单核细胞性白血病，和/或衍生自单核细胞和/或单核的细胞和/或组织的其它白血病。
在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂，以治疗，预防，诊断和/或改善单核细胞性白血病性反应，例如见于结核。
在另一特异的实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其激动剂，以治疗，预防，诊断和/或改善，单核细胞性白细胞增多症，单核细胞性白细胞减少症，单核细胞性贫血和/或单核细胞增多症。
在一特异的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，和/或抗Neutrokine-α的抗体和/或其激动剂或拮抗剂，用于治疗，预防，检测和/或诊断原发B淋巴细胞功能失调和/或与之相关的疾病和/或病理状态。在一实施方案中，这种原发性B淋巴细胞功能失调，疾病和/或病理状态，特征是完全或部分丧失体液免疫。特征在于完全或部分丧失体液免疫，且可用本发明的组合物预防，治疗，检测和、或诊断的原发性B淋巴细胞功能失调，疾病和/或病理状态，包括但非限于X连锁的血中丙球蛋白贫乏(XLA)，重度联合免疫缺损(SCID)，和选择性IgA缺损。
在一优选的实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸，多肽和/或其激动剂或拮抗剂，用于治疗，预防和/或诊断与机体的一或多种各种粘膜相关的疾病。这种疾病包括但非限于粘膜炎，粘膜毁除术，粘液性结肠炎，粘膜与皮肤利什曼病(例如美州利什曼病，鼻咽利什曼病，和新世界利什曼病)，粘膜与皮肤淋巴法综合征(例如Kawasaki病)，粘液性肠炎，粘液性表皮样癌，粘液性表皮样肿瘤，粘膜上皮发育不良，粘液性腺癌，粘液性变性，粘液样变性；粘液瘤变性；多发性粘液瘤，粘液样中层高性〔如囊中层坏死〕，粘脂病(包括I型粘脂病，II型粘脂病，III型粘脂病，和IV型粘脂病)，粘液性肠炎，粘多糖病(如I型粘多糖尿(即Hurler’s综合征)，IS型粘多糖病(即Scheie’s综合征或V型粘多糖病)，II型粘多糖病(即Hunter’s综合征)，III型粘多糖病(即Sanfilippo’s综合征)，IV型粘多糖病(即Morquio’s综合征)，VI型粘多糖病(即Naroteaux-Lamy综合征)，VII型粘多糖病(即由于β-葡糖醛酸酶缺陷所致粘多糖病)，和(粘液硫酸盐症)粘多糖尿，粘液脓性结膜炎，粘液性脓，毛霉菌病，粘膜病(即牛病毒腹泻)，粘液性结肠炎(如粘液性和粘液膜性结肠炎)，和胰纤维性囊肿病(如胰囊性纤维化，Carke-Hadfield综合征，胰纤维囊性病变，胰纤维性囊肿病)。在一特别优选的实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸，多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂，用于治疗，预防和/或诊断粘膜炎，尤其与化疗相关的粘膜炎。
在一优选的实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸，多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂，用于治疗，预防和/或诊断与窦炎相关的疾病。
Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂可以治疗，预防和/或诊断的另一种疾病或症状是骨髓炎。
Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其激动剂可以治疗，预防和/或诊断的另一种疾病或症状是心内膜炎。
所有上述应用均可用于兽医制药。
Neutrokine-α的拮抗剂包括结合和/或抑制性抗体，反义核酸，核酶，和本发明的Neutrokine-α多肽。这些可期望逆转上述配体的一些活性，以及发现一些临床或实际应用，如用于阻断对外源或自身物质的各方面免疫应答。例如包括自身免疫疾病如狼疮，和关节炎，以及对皮肤过敏，炎症，肠道疾病，损伤和病原体的免疫应答。尽管现有数据直接说明了Neutrokine-α在B细胞和单核细胞相关的病理学中的潜在作用，其它类型细胞也可能表达或应答Neutrokine-α。因此，Neutrokine-α如同CD40及其配体一样，可由免疫系统的状况及细胞所处的微环境而调节。
用于防止与自身免疫疾病相关的B细胞增殖和Ig分泌的治疗中，如自发性血小板减少性紫癜，系统性红班狼疮和MS。
作为移植物与宿主相对抗的疾病或移植排斥的抑制剂。
治疗B细胞恶性肿瘤如ALL，Hodgkins病，非Hodgkins淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病，浆细胞瘤，多发性骨髓瘤，Burkitt’s淋巴瘤，和EBV-转化的疾病。
治疗慢性高丙种球蛋白血症，如在未确定重要性的单细胞的丙种球蛋白病(MGUS)，Waldenstrom’s病，相对自发性单细胞丙种球蛋白病，和浆细胞瘤中。
治疗大B细胞淋巴瘤的细胞增殖降低。
降低与慢性骨髓性白血病相关的B细胞和Ig关连物。
作为免疫抑制剂。
本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其拮抗剂可用于在体外或体内调节IgE浓度。
在另一实施方案中，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸，或其拮抗剂，可用于治疗，预防和/或诊断IgE介导的变态反应，包括但非限于哮喘，鼻炎和湿疹。
作为包含ERK1，COX2和Cyclin D2的信号途径的抑制剂，该途径与Neutrokine-α诱导的B细胞活化相关。
上述应用在众多宿主中均可使用。这种宿主包括但非限于人，鼠，兔，山羊，豚鼠，骆驼，马，小鼠，大鼠，仓鼠，猪，小猪，鸡，牛，绵羊，狗，猫，非人灵长目动物，和人。在特异的实施方案中，宿主是小鼠，兔，山羊，豚鼠，鸡，大鼠，仓鼠，猪，羊，狗或猫。在优选的实施方案中，宿主是哺乳动物。在更优选的实施方案中，宿主是人。
激动剂和拮抗剂可与药物合适的载体组合应用。
拮抗剂例如可用于抑制Neutrokine-α介导的和/或Neutrokine-αSV介导的趋化和活化巨噬细胞及其前体，和嗜中性白细胞，嗜碱性粒细胞，B淋巴细胞，和一些T细胞子集如活化的和CD8胞毒性T细胞，及天然杀伤细胞，在一些自身免疫疾病和慢性炎症及感染性疾病中。自身免疫疾病例如包括多发性硬化，和胰岛素依赖型糖尿病、拮抗剂也可用于治疗，预防和/或诊断感染性疾病，包括矽肺，肉状瘤病，原发性肺纤维化，可通过阻止单核吞噬细胞征集和活化而进行。它们也可用于治疗，预防和/或诊断原发性嗜伊红性粒细胞综合征，通过阻止嗜伊红性粒细胞产生和迁移而进行。内毒性休克也可由此拮抗剂治疗，通过阻止巨噬细胞迁移和其产生本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽而进行。此拮抗剂还可用于治疗动脉硬化，通过阻止单核细胞浸润动脉壁而进行。此拮抗剂还可用于治疗，预防和/或诊断组胺介导的变态反应和免疫功能失调，包括晚期变态反应，慢性荨麻疹，和特应性皮炎，通过抑制趋化因子诱导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱粒和组胺释放而进行。也可治疗IgE介导的变态反应如过敏性哮喘，鼻炎和湿疹。拮抗剂也可用于治疗，预防和/或诊断慢性和急性炎症，通过阻止单核细胞侵入损伤区域而进行。它们也可用于调节正常肺部巨噬细胞群，因为慢性和急性肺部炎症与肺内单核巨噬细胞的汇集有关。拮抗剂还可用于治疗，预防和/或诊断风湿性关节炎，通过阻止单核细胞侵入病人关节内的滑液而进行。单核细胞流入量和活化在退化性和炎症性关节病变中起重要作用。拮抗剂可用于干扰由IL-1和TNF所致的对身体有害的纫联反应，通过阻止其它炎症性细胞因子的生物合成而进行。在此方式中，拮抗剂可用于预防炎症。拮抗剂还用于抑制由Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV诱导的前列腺素非依赖性发热。拮抗剂还可用于治疗，预防和/或诊断骨髓病变，例如再生障碍性贫血和myelodysplastic综合征。拮抗剂还可用于治疗，预防和/或诊断哮喘和变态反应，通过阻止肺内嗜伊红性粒细胞累积而进行。拮抗剂还可用于治疗，预防和/或诊断亚上皮基底膜纤维化，这是哮喘肺的一个明显特征。拮抗剂还可用于治疗，预防和/或诊断淋巴瘤(如一或多种本文所列举的淋巴瘤，但非限于此)。
所有上述应用均可用于兽医制药。
本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂，可用于治疗，预防，和/或诊断哺乳动物优选人体的各种免疫系统相关疾病。许多自身免疫疾病是由免疫细胞对自身物作为外源物的非适当识别所致。这种非适当识别导致破坏宿主组织的免疫应答。因此，施用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂，可抑制免疫应答，尤其B细胞的增殖和/或免疫球蛋白的产生，可有效地治疗和/或预防自身免疫疾病。因此，在优选的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV拮抗剂(如Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的多肽片段和抗Neutrokine-α抗体)，用于治疗，预防和/或诊断自身免疫疾病。
可用本发明Neutrokine-α多核苷酸，多肽和/或拮抗剂(如抗Neutrokine-α抗体)治疗，预防和/或诊断的自身免疫疾病，包括但非限于自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性新生儿血小板减少，原发性血小板减少性紫癜，自身免疫细胞减少，溶血性贫血，抗磷脂综合征，皮炎，过敏性脑脊髓炎，心肌炎，复发性多发软骨炎，风湿性心脏病，肾小球肾炎(即IgA肾病)，多发性硬化，神经炎，眼色素层炎，多发内分泌病，紫癜(如Henloch-Scoenlein紫癜)，Reiter’s病，Stiff-Man综合征，自身免疫性肺炎，Guillain-Barre综合征，胰岛素依赖型糖尿病和自身免疫性眼部炎症。
可用本发明的组合物治疗，预防和/或诊断的另外的自身免疫性疾病，包括但非限于自身免疫性甲状腺炎，亚甲状腺炎(即Hashimoto’s甲状腺炎)，(通常特征是由细胞介导的和体液甲状腺胞毒性)，系统性红班狼疮(通常特征是血液循环和局部产生免疫复合物)，Goodpasture’s综合征(通常特征是抗基底膜抗体)，受体自身免疫性如(a)Grave’s病(通常特征是TSH受体抗体)，(b)Myasthenia Gravis(通常特征为乙酰胆碱受体抗体)和(c)胰岛素抗性(通常特征为胰岛素受体抗体)，自身免疫性溶血性贫血(通常特征为抗体敏化的RBCs的吞噬作用)，自身免疫性血小板减少性紫癜(通常特征为抗体敏化的血小板的吞噬作用)。
可用本发明的组合物治疗，预防和/或诊断的另外的自身免疫疾病，包括但非限于风湿性关节炎(通常特征为关节中的免疫复合物定性)，具有抗胶原抗体的schleroderma(通常特征在于核仁抗体及其它核抗体)，混合的结缔组织疾病(通常特征在于可提取核抗原的抗体(如核糖核蛋白))，多发性肌炎/表皮肌炎(通常特征在于非组ANA)，恶性贫血(通常特征为抗胃壁细胞，微粒体，和内因子抗体)原发性Addison’s病(通常特征为体液和细胞介导的肾上腺毒性)，不育症(通常特征为抗精子抗体)，肾小球肾炎(通常特征为肾小球基膜抗体或免疫复合物)如原发性肾小球肾炎和IgA肾病，大疱性天疱疮(通常特征为基膜中的IgG和补偿)，Sjogren’s综合征(通常特征为多组织抗体和/或非组ANA(SS-B))，糖尿病(通常特征为细胞介导的和体液胰岛细胞抗体)，和肾上腺素药物抗性(包括哮喘或囊性纤维化肾上腺素药物抗性)(通常特征为β肾上腺素能受体抗体)。
可用本发明的组合物治疗，预防和/或诊断的另外的自身免疫疾病，包括但非限于慢性活动性肝炎(通常特征为平滑肌抗体)，原发性胆汁性肝硬化(通常特征为线粒体抗体)，其它内分泌腺病变(通常特征为一些情况中的特异组织抗体)，白癜风(通常特征为黑色素细胞抗体)，血管病变(通常特征为血管壁内的Ig和补体和/或低血清补体)，MI后遗症(特征在于心肌抗体)，心脏术后综合征(通常特征为心肌抗体)，荨麻疹(通常特征为IgE的IgG和IgM抗体)，特应性皮炎(通常特征为IgE的IgG和IgM抗体)，哮喘(通常特征为IgE的IgG和IgM抗体)，炎症性肌病和许多其它炎症，granulamatous，退化性和其它萎缩性疾病。
在一优选的实施方案中，上述自身免疫性疾病和功能失调和/或病理状态，用抗Neutrokine-α抗体和/或抗Neutrokine-αSV抗体治疗，预防和/或诊断。
在一特异的优选实施方案中，风湿性关节炎用本发明的抗Neutrokine-α抗体和/或抗Neutrokine-αSV抗体和/或其它拮抗剂治疗，预防和/或诊断。
在一特异的优选实施方案中，狼疮用本发明的抗Neutrokine-α抗体和/或Neutrokine-αSV抗体和/或其它拮抗剂治疗，预防和/或诊断。
在一特异的优选实施例中，与狼疮相关的肾炎用本发明的抗Neutrokine-α抗体和/或Neutrokine-αSV抗体和/或其它拮抗剂治疗，预防和/或诊断。
在一特异的实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其拮抗剂(如抗Neutrokine-α抗体和/或Neutrokine-αSV抗体)，用于治疗或预防系统性红斑狼疮和/或与之相关的疾病。可用本发明的Neutrokine-α抗体和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其拮抗剂治疗的与狼疮相关的疾病，包括但非限于血液疾病(如溶血性贫血，白血病，淋巴细胞性贫血，和血小板性贫血)，免疫性疾病(如抗DNA抗体，和抗Sm抗体)，皮疹，光敏性，口腔溃疡，关节炎，发热，疲劳，体重降低，浆液性疾病(如胸膜炎)，肾脏疾病(如肾炎)，神经病变(如发作性周围神经病变，CNS相关的疾病)，胃肠道疾病，Raynaud现象，如心包炎。在一优选的实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV抗体)，用于治疗或预防与系统性红斑狼疮相关的肾脏疾病。在一更优选的实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，或其拮抗剂(如抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV抗体)，用于治疗或预防与系统性红斑狼疮相关的肾炎。
相似地，变态反应疾病如哮喘(尤其过敏性哮喘)或其它呼吸道疾病，也可用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂治疗。另外，这些分子可用于治疗，预防和/或诊断对抗原分子的过敏性，超敏性，或血液基团的不相容性。
本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，和/或其激动剂和/或拮抗剂，也可用于治疗，预防和/或诊断器官排斥或移植宿主排斥疾病(GVHD)和/或与之相关的疾病。移植的组织通过免疫应答破坏宿主免疫细胞而发生器官排斥。相似地，在GVHD中也包含免疫应答，但在这种情况中，外源移植的免疫细胞破坏宿主组织。施用抑制免疫应答，尤其抑制T细胞增殖，分化或趋化性的本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽和/或其激动/或拮抗剂，可有效地防止器官排斥或GVHD。
相似地，本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂，也可用于调节炎症。例如，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂，可抑制炎症应答中细胞的增殖和分化。这些分子可用于治疗，预防和/或诊断急性和慢性炎症，包括慢性前列腺炎，肉芽肿前列腺炎，和软化斑，与感染相关的炎症(如败血症休克，或全身性炎症反应综合症(SIRS))，局部缺血再灌注损伤，内毒素致死性疾病，关节炎，补体介导的过急性排斥，肾炎，细胞因子或趋化因子诱导的肺部损伤，炎症性肠道疾病，Crohn’s病，或由于细胞因子(如TNF或IL-1)过量产生所致疾病。
在一特异的实施方案中，本发明的抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV抗体用于治疗，预防，调节，检测和/或诊断炎症。
在一特异的实施方案中，本发明的抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV抗体用于治疗，预防，调节，检测和/或诊断炎症性疾病。
在另一特异的实施方案中，本发明的抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV抗体用于治疗，预防，调节，检测和/或诊断变态反应和/或高敏感性疾病。
抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV抗体可用于结合和抑制Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV活性，以通过在损伤后阻止中性粒细胞浸润肺部而治疗，预防和/或诊断ARDS。本发明的激动剂和拮抗剂可与药物合适的载体组合应用，如后文所述。
本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV和/或Neutrokine-α受体多核苷酸或多肽，和/或其激动剂和/或拮抗剂，用于治疗，预防和/或诊断肺系疾病(如支气管疾病，例如sinopulmonary和支气管感染，及与之相关的疾病及其它呼吸道疾病)。在特异的实施方案中，这种疾病包括但非限于支气管腺瘤，支气管哮喘，肺炎(如支气管肺炎，和结核性支气管肺炎)，慢性阻塞性肺部疾病(COPD)，支气管息肉，支气管扩张(如干性支气管扩张，桶状支气管扩张，和囊状支气管扩张)，支气管腺癌，支气管癌，细支气管炎(如渗出性细支气管炎，纤维瘤闭塞性细支气管炎和增殖性支气管炎)，支气管-肺泡癌，支气管哮喘，支气管炎(如哮喘性支气管炎，Castellani’s支气管炎，慢性支气管炎，哮吼性支气管炎，纤维蛋白性支气管炎，出血性支气管炎，感染性禽支气管炎，闭塞性支气管炎，可塑性支气管炎，假膜性支气管炎，腐败性支气管炎，和蠕虫性支气管炎)，支气管中心性肉芽肿病，支气管性水肿，支气管食管病，支气管原性癌，支气管原性囊肿，支气管结石病，支气管软化，支气管真菌病(如支气管肺曲霉病)，支气管肺螺旋体病，出血性支气管炎，支气管粘液溢，支气管痉挛，支气管出血，支气管狭窄，Biot’s呼吸音，支气管呼吸音，Kussmaul呼吸音，Kussmaul-kien呼吸音，呼吸性酸中毒，呼吸性碱中毒，新生儿呼吸窘迫综合征，呼吸功能不全，呼吸道硬结病，呼吸道合胞病毒，等。
在一特异的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，和/或其激动剂和/或拮抗剂，用于治疗，预防，和/或诊断慢性阻塞性肺部疾病(COPD)。
在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂，用于治疗，预防和/或诊断与纤维化相关的病变，例如但非限于囊性纤维化(包括胰腺囊性纤维化，Clarke-Hadfield综合证，胰纤维性囊肿，和粘液性病变)，心肌纤维化，原发性腹膜后纤维化，柔脑脊膜纤维化，纵隔纤维化，表皮下小结纤维化，中枢周围纤维化，肌周纤维化，声带纤维化，外膜下纤维化和Symmer’s粘土纤维化。
已知TNF家族配体是最多效的细胞因子，诱导大量细胞应答，包括胞毒性，抗病毒活性，免疫调节活性，和一些基因的转录调节(D.V Goeddet等，“肿瘤坏死因子基因结构与生物活性”，Symp.Quant.Biol.51597-609(1986)，冷泉港；B.Beutler和A.Cerami，生物化学分析研究57505-5181(1988)；L.J.Old.Sci.Am.25859-75(1988)；W.Fiers，FEBs通信284199-224(1991))。TNF家族配体，包括本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV，通过与TNF家族受体结合而诱导这样的各种细胞应答。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽确信激发有效的细胞应答，包括细胞，细胞系，组织。组织培养物或病人的基因型，表型和/或形态改变。如上所述，这种细胞应答不仅包括正常的对TNF家族配体的生理应答，还包括与细胞程序死亡增加或抑制相关的疾病。细胞程序死亡是一种生理机制，包含于免疫系统外周B和/或T淋巴细胞的缺失中，且其功能失调可导致许多不同的病理变化(J.C.Ameisen，AIDS81197-1213，(1994)；P.H.Krammer等，免疫学通用观点6279-289(1994))。
可用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，及其激动剂和拮抗剂诊断，治疗或预防的与细胞存活性提高或细胞程序死亡抑制相关的疾病，包括癌(如囊性淋巴瘤，p53突变所致的癌，和激素依赖性肿瘤，包括但非限于结肠癌，心肌肿瘤，胰管癌，黑素瘤，视网膜神经胶质瘤，恶性胶质瘤，肺癌，肠癌，睾丸癌，骨癌，成神经细胞瘤，粘液瘤，肌瘤，淋巴瘤，内皮瘤，成骨C瘤，破骨细胞瘤，骨肉瘤，软骨肉瘤，腺瘤，乳腺癌，前列腺癌，Kaposi’s肉瘤和卵巢癌)；自身免疫系统疾病(如系统性红斑狼疮，和免疫相关的肾小球肾炎，风湿性关节炎)；病毒感染(如疱疹病毒，痘病毒，和腺病毒)；炎症；移植物抗宿主；急性移植排斥和慢性移植排斥。因此，在优选的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽和/或其激动剂或拮抗剂，用于治疗，预防和/或诊断自身免疫系统疾病和/或抑制，癌症的生长，进展和/或转移，包括但非限于本文所述的那些癌症，例如淋巴细胞性白血病(包括例如MLL，和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和淋巴滤泡瘤。在另一实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽用于激活癌细胞或组织(如B细胞系相关的癌症(如CLL和MLL)，淋巴细胞性白血病，或淋巴瘤)的分化或增殖，从而使细胞更易接受癌症治疗(如化疗或放疗)。
另外，在其它实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽或其激动剂或拮抗剂，用于抑制恶性肿瘤及相关疾病的生长，进展和/或转移，这些疾病如白血病(包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病，急性骨髓细胞性白血病(包括原粒C性白血病，早幼粒细胞性白血病，髓单核细胞性白血病，单核细胞性白血病，和红白血病))和慢性白血病(如慢性髓细胞性(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))，真性红细胞增多，淋巴瘤(Hodgkin’s病和非Hdgkin’s病)，多发性髓瘤，Waldenstrom’s巨球蛋白血症，重链病，和固态肿瘤包括但非限于肉瘤和癌如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，脊髓瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴血管肉瘤，淋巴血管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，Ewing’s瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓癌，支气管原癌，肾细胞癌，肝细胞瘤，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，Wilm’s瘤，宫颈癌，睾丸癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞癌，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，黑色素瘤，成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
可用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽及其激动剂和拮抗剂诊断，治疗或预防的与细胞程序死亡增加的疾病，包括AIDS；神经变性疾病(如Alzheimer’s病，Parkinson’s病，肌萎缩性脊髓侧索硬化，视网膜炎，小脑变性)；骨髓发育不良综合征(如再生障碍性贫血)，局部缺血损伤(如心梗，中风和再灌注损伤)，毒素引起的肝脏疾病(如由乙醇所致)，败血症休克，恶病质，和厌食。因此，在优选的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽和/或其激动剂或拮抗剂，用于治疗，预防和/或诊断上述疾病。
在优选的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽和/或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α抗体)，以剂量依赖性方式抑制人组织细胞淋巴瘤U-937细胞的生长。在另一优选的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽和/或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α抗体)，抑制PC-3细胞，HT-29细胞，Hela细胞，MCF-7细胞和A293细胞的生长。在另一更优选的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽和/或其激动剂(如抗Neutrokine-α抗体)，用于抑制前列腺癌，结肠癌，宫颈癌和乳腺癌的生长，进展和/或转移。
因此，在另一优选的实施方案中，本发明涉及增加通过TNF家族配体诱导的细胞程序死亡的方法，包括为表达Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体的细胞施用有效量的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV，或其激动剂或拮抗剂，能提高或降低Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的信号。优选地，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的信号化提高或降低可治疗，预防和/或诊断其中细胞程序死亡降低或细胞因子和吸附分子表达降低的疾病。激动剂或拮抗剂可包括可溶形式的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV及直接抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的单克隆抗体。
另一方面，本发明涉及一种抑制由TNF家族配体诱导的细胞程序死亡的方法，其包括为表达Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体的细胞施用有效量的能提高或降低Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的信号化的激动剂或拮抗剂。优选地，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的信号化提高或降低可治疗，预防和/或诊断其中细胞程序死亡或NF-KB表达提高的疾病。激动剂或拮抗剂可包括可溶形式的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV及直接抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的单克隆抗体。
由于Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV属于TNF超家族，此多肽也应调节血管生成。另外，由于Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV抑制免疫细胞功能，此多肽具有广泛的抗炎活性。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV可用作抗新血管生成剂，以治疗，预防和/或诊断固态肿瘤，通过刺激宿主防御细胞如胞毒性T细胞和巨噬细胞侵染和活化，及通过抑制肿瘤的血管生成而进行。本领域技术人员可识别其中血管增殖是非所需的其它非癌指征。它们也可用于增强宿主抗慢性和急性感染的抗性，例如通过引诱和活化杀微生物的白细胞而抗肌细菌性感染。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV也可通过抑制IL-2生物合成而抑制T细胞增殖，以治疗T细胞介导的自身免疫疾病和淋巴细胞性白血病(包括例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL))。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV也可用于刺激伤口愈合，通过募集碎片清除和启动炎症细胞的结缔组织而进行。以相同的方式，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV也可用于治疗，预防和/或诊断其它纤维化疾病，包括肝硬化，骨关节炎和肺纤维化。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV还增加嗜伊红性粒细胞的含量，该细胞具有杀伤侵染组织的大量寄生虫的独特功能，如血吸虫、毛线虫和蛔虫。其也可用于调节血细胞生成，通过调节各种造血细胞祖细胞的激活和分化而进行，例如从化疗后的骨髓中释放成熟白细胞，即在干细胞转移中。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV还可用于治疗，预防和/或诊断脓毒症。
本发明的多核苷酸或/或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂可用于诊断和治疗或预防许多疾病和/或病理变化。这种疾病和病理变化包括但非限于癌症(如免疫细胞相关的癌症，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，淋巴滤泡瘤，与p53突变或改变相关的癌症，脑瘤，膀胱癌，宫颈癌，结肠癌，结肠直肠癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，胃癌等)，淋巴增殖性疾病(如淋巴腺病变)，微生物(如病毒，细菌等)感染，(如HIV-1感染，HIV-2感染，疱疹病毒感染(包括但非限于HSV-1，HSV-2，CMV，VZV，HHV-6，HHV-7，EBV)，腺病毒感染，痘病毒感染，人乳头瘤病毒感染，肝炎病毒感染(如HAV，HBV，HCV等)，幽门螺旋菌感染，葡萄球菌等)，寄生虫感染，肾炎，骨病(如骨质疏松症)，动脉粥样硬化，疼痛，心血管疾病(如新血管生成，血管生成减少，或循环血量减少(如缺血性疾病)如心肌梗塞，中风等))，AIDS，变态反应，炎症，神经变性疾病(如Alzheimer’s病，Parkinson’s病，肌萎缩性侧索硬化，色素沉着性视网膜炎，小脑变性等)，移植排斥(急性和慢性)，移植物抗宿主病，骨髓发育不良所致疾病(如再生障碍性贫血等)，风湿病中关节组织破坏，肝脏疾病(如急性和慢性肝炎，肝损伤和肝硬化)，自身免疫性疾病(如多发性硬化，风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，免疫复合物肾小球肾炎，自身免疫性糖尿病，自身免疫性血小板减少性紫癜，Grave’s病，Hashimoto’s甲状腺炎等)，心肌病(如扩张性心肌病)，糖尿病，糖尿病并发症(如糖尿病性肾病，糖尿病性神经病变，糖尿病性视网膜病变)，流感，哮喘，牛皮癣，肾小球肾炎，败血症休克和溃疡性结肠炎。
本发明的多核苷酸和/或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂用于促进血管生成，伤口愈合(如创伤，烧伤和骨折)。本发明的多核苷酸和/或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂，还用作佐剂以增强对特异抗原的免疫应答，抗病毒免疫应答。
通常地，本发明的多核苷酸和/或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂，用于调节(即激发或降低)免疫应答。例如，本发明的多核苷酸和/或多肽可用于准备或自外科手术，外伤，放疗，化疗和移植中恢复，或可用于在年老者和免疫损害者中辅助免疫应答和/或恢复。或者，本发明的多核苷酸和/或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂，用作免疫抑制剂，例如在治疗或预防自身免疫疾病中。在特异的实施方案中，本发明的多核苷酸和/或多肽用于治疗或预防慢性炎症，变态反应或自身免疫疾病，如本文所述的及本领域已知的其它疾病。
优选地，用Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸或多肽，和/或其激动剂或拮抗剂(如抗Neutrokine-α抗体)，可通过将有效量的本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽，或其激动剂或拮抗剂，施用于病人；或自病人移出细胞，用Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多核苷酸供养此细胞，然后将此工程化的细胞再施用于病人〔来自体内治疗〕。另外，如本文进一步所述Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽或多核苷酸可用作疫苗中的佐剂，以产生抗感染性疾病的免疫应答。配方和施用方法考虑各个病人的临床条件(尤其只用Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的副作用)，Neutrokine-α和/或多肽组合物的输送位置，施用方法，施用程序，及其它已知因素，为取得良好医疗应用，配制Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽组合物(优选含有是可溶形式Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV胞外域的多肽)，和确定剂量。“有效量”的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽因此通过这种条件而确定。
一般情况下，非肠道施用的每剂Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的总药物有效量范围在大约1μg/kg天至10mg/kg体重/天，尽管如上所述将进行治疗性决定。优选地此剂量为至少0.01mg/kg体重/天，更优选在0.01-1mg/kg体重/天。
在另一实施方案中，施用于人的本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的剂量在0.0001～0.045mg/kg体重/天之间，优选在0.0045～0.045mg/kg体重/天之间，更优选为45μg/kg体重/天；施用于小鼠的剂量为大约3mg/kg体重/天。
如果连续应用，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽施用剂量为大约1μg/kg体重/小时～50μg/kg体重/小时，每天注射1-4次或连续皮下灌注，例如用微泵。也可使用静脉内输液。
治疗时间根据根据效应而加以确定。
在一特异的实施方案中，非肠道施用每剂Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的总药物有效量范围为大约0.1μg/kg体重/天～45μg/kg体重/天，尽管如上所述要进行治疗性决定。优选地，此剂量至少为0.1μg/kg体重/天，更优选施用于人的剂量在0.01～50μg/kg体重/天之间。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV可连续灌注，每天多次注射(如每天三次或更多次，或每天两次，每天注射一次，或间歇注射(如每日二次，每日一次，隔日一次，每周二次，一周一次，二周一次，一月一次，二月一次，三月一次)。如果连续应用，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽施用剂量为大约0.001～10μg/kg体重/小时～大约50μg/kg体重/小时，每天注射1-4次或连续皮下灌注，例如使用微泵。
施用的本发明组合物的有效剂量可通过本领域已知方法确定，注明参数如生物半衰期，生物效力，和毒性。这种测定已为本领域技术人员所熟知。
在治疗期间机体对Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的生物暴露在确定性和/或药物有效量中也起重要作用。剂量的变化如重复施用相对低剂量的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽相对长的一段时间，与重复施用相对高剂量的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽相对短的一段时间，具有不同的治疗和/或药物学效应。见例如实施例6所示的血清免疫球蛋白水平试验。
使用Freireich，E.J.等(癌症化疗报道50(4)219-44(1966))提供的等价表面积剂量转变因子，本领域技术人员能常规将得自使用Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV在给定试验中的数据，转换为在另一试验系中每剂施用的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的药物有效量的准确估定值。通过在小鼠中施用Neutrokine-α所得的试验数据(见例如实施例6)，可通过Freireich等提供的转换因子，准确地估定Neutrokine-α在大鼠，猴，狗和人中的药物有效量。以下转换表(表3)概述了Freireich等提供的数据。表3提供了将在一个物种中以mg/kg体重表示的剂量转换为在另一特种中以mg/kg体重表示的等价表面积剂量的近似因子。
表3等价表面积剂量转换因子
因此，例如使用表3中所提供的转换因子，在小鼠中50mg/kg的剂量转换为在猴中为12.5mg/kg的适当剂量，因为(50mg/kg)×1/4＝12.5mg/kg。另外，在小鼠中使用0.02，0.08，0.8，2和8mg/kg的剂量等于在人中使用1.667μg/kg，6.67μg/kg，66.7μg/kg，166.7μg/kg和0.667mg/kg的剂量所起的作用。
含有本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的药物组合物可通过口服，直肠，非肠道，皮下，intracistemally，阴道内，腹膜内，局部(通过粉末，软膏，滴剂或贴膏形式)，颊部，或经口腔或鼻腔喷雾(如蒸气或粉末吸入)等施用。在一实施方案中，“药物合适的载体”是指无毒的固体，半固体或液体充填剂，稀释剂，胶囊化物或任何类型的配方辅助剂。在一特异的实施方案中，“药物合适的”是指政府管理机构美国药管部门许可用于动物尤其人的物品。根据此实施方案适当的药物载体非限制性地例如由E.W.Martin在“Remington’s药物科学”中所提供的，并包括无菌液体，如水和油，包括源自石油，动物，植物或合成的，如花生油，豆油，矿物质油，芝麻油等。当药物组合物是静脉内注射时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖溶液及甘油溶液可用作液体载体，尤其用作可注射的溶液，如果需要，此组合物也可含有微量的润湿剂或乳化剂，或PH缓冲剂。这些组合物可以是溶液，悬浮液，乳状液，片剂，丸剂，胶囊，粉末，缓释配方等形式。
术语“非肠道”是指包括静脉内，腹膜内，皮下和动脉内及臀肌注射和灌注的施用模式。
在一优选的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV组合物(包括多肽，多核苷酸及其抗体，激动剂和/或拮抗剂)是经皮下施用的。
在另一优选的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV组合物(包括多肽，多核苷酸及其抗体，激动剂和/或拮抗剂)是经静脉内施用的。
本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV组合物也可通过缓释系统而适当施用。缓释组合物例如包括适当的聚合物(如半透性聚合基质，如薄膜或微囊)，适当的疏水物(如适当油乳液)，或离子交换树脂，和少量可溶衍生物(如少量可溶盐)。
缓释基质包括聚乳酸(美国专利No.3773919，EP58481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman，V.等，生物聚合物22547-556(1983))，聚(乙-羟乙基甲基丙烯酸酯)(R.Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15167-277(1981))，和R.Langer.化学技术1298-105(1982)，乙基乙烯乙酸酯(R.Langer等，Id.)或聚-D-3-羟丁酸(EP133988)。
缓释组合物还包括脂质体载留的本发明组合物(见Langer，科学2491527-1533(1990))；Treat等，感染性疾病和癌症治疗中的脂质体，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss，纽约，p317-327和353-365(1989)。含有Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的脂质体可通过已知方法制备，见DE 3218121；Epstein等，美国科学院院报823688-3692(1985)；Hwang等，美国科学院院报774030-4034(1980)；EP52322；EP36676；EP88046；EP143949；EP142641；日本专利申请83-118008；美国专利No.4485045和4544545；及EP102324。通常地，脂质体是小单片状的(大约200-800Angstroms)，其中脂质含量大于30mol胆固醇，调节选择比例以最佳进行Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽治疗。
在另一实施方案中，本发明的缓释组合物包括本领域已知的晶体配方。
在另一实施方案中，本发明的组合物通过泵输送(见Langer，如前；Sefton，CRC Crit Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等，外科学88507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med 321574(1989))。
其它控制释放系统见于Langer所述(科学2491527-1533(1990))。
就非肠道施用而言，在一实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽一般以所需纯度，以单位剂量可注射形式(溶液，悬浮液或乳状液)，与药物合适载体，即在应用剂量和浓度对受体无毒性并与配方中其它配料可相容的载体。例如，配方优选不包括氧化剂和已知对多肽不利的其它化合物。
一般地，通过将Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽与液体载体或充分分开的固体载体或二者均匀和密切接触而配制配方。然后，如果需要，将产物制成所需形状。优选地，此载体是非肠道载体，更优选是与受体血液等渗的溶液。这种载体例如包括水，盐水，林格氏液，和葡萄糖溶液。非水相载体如固定脂和乙基油酸以及脂质体在此也可使用。
载体适当地含有少量添加剂如增强等渗性和化学稳定性。这种物质在应用剂量和浓度对受体是无毒的，包括缓冲剂如磷酸，柠檬酸，琥珀酸，乙酸及其它有机酸或其盐；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量(小于10个残基)多肽如聚精氨酸或三肽；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或精氨酸；单糖，二糖或其它碳水化合物包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖，蔗糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；反荷离子如钠离子；防腐剂如甲酚、苯酚、氯丁醇，苄乙醇，和对羟基苯甲酸酯类和/或非离子性表面活性剂如聚山梨醇酯，poloxamers或PEG。
在这种载体中配制的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的浓度为大约0.001mg/ml～100mg/ml，或0.1mg/ml～100mg/ml，优选1-10mg/ml，或1-10mg/ml，PH为大约3-10，或2-8，优选5-8，更优选6-7。应知使用一些前述受体，载体或稳定剂将导致Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV形成盐。
用于治疗性施用的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽必须是无菌的。可通过无菌滤膜(如0.2micron的膜)过滤而达到无菌。治疗性Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽多肽组合物一般置于具有无菌通道的容器内，例如静脉内注射溶液包或具有可由皮下注射针头穿入的瓶塞的小瓶内。
Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽通常在单位剂量或多剂量容器内贮存，例如密封安瓿或小瓶，以水溶液形式或可重建的冻干形式。冻干配方例如是10ml小瓶内装有5ml无菌过滤的1％(w/v)Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽水溶液，将所得混合物冻干。灌注液通过用无菌注射用水重建冻干的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽而制备。
或者，将Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽以冻干形式贮存在单剂量容器内。此灌注液用无菌注射载体重配。
本发明还提供了药物包装或试剂盒。包含一或多个充填一或多种本发明药物组合物配料的容器。这种容器还附有由负责生产，使用或销售药物或生物制品审批的政府机构出具的许可用于人体的通知。另外，本发明的多肽可与其它治疗性化合物联合应用。
本发明的组合物可单独或与其它佐剂组合施用。可与本发明的组合物组合使用的佐剂，包括但非限明矾，明矾加上脱氧胆酸盐(Immuno Ag)，MTP-PE(Biocine Corp.)QS21(Genentech，Inc.)，BCG和MPI。在一特异的实施方案中，本发明的组合物与QS-21组合施用。可与本发明组合物组合使用的其它佐剂包括但非限单磷酸脂质免疫调节剂，AdjuVax 100a，QS-21，QS-18，CRL1005，铝盐，MF-59和病毒佐剂。可与本发明组合物使用的疫苗包括但非限于MMR(麻疹，流行性腮腺炎，风疹)疫苗，脊髓灰质炎疫苗，水痘疫苗，破伤风疫苗，白喉疫苗，甲肝疫苗，乙肝疫苗，嗜血杆菌乙型流感疫苗，百日咳疫苗，肺炎疫苗，流感疫苗，Lyme’s病疫苗，霍乱疫苗，黄热病疫苗，流脑疫苗，狂犬病疫苗，伤塞热疫苗，百日咳疫苗和/或PNEUMOVAX-23TM。可伴随性组合施用，如作为混合物，分离地但同时施用；或可相继组合施用，此包括呈递，其中组合剂作为治疗混合物一起施用，还包括组合剂分别地但同时地如经过分别的静脉通道注入同一个体内。“组合”施用还包括分别先施用一种化合物，然后再施用另一种。
在另一特异的实施方案中，本发明的组合物与PNEVMOVAX-23TM组合使用，治疗，预防和/或诊断感染性疾病和/或与之相关的任何疾病。在一实施方案中，本发明的组合物与PNEVMOVAX-23TM组合施用，治疗，预防和/或诊断任何革兰氏阳性菌感染和/或与之相关的任何疾病。在另一实施方案中，本发明的组合物与PNEVMOVAX-23TM组合施用，治疗预防和/诊断与肠杆菌属和/或链霉菌属一多个成员相关的感染。在另一实施方案中，本发明的组合物与PNEOMOVAX-23TM组合使用，治疗，预防和/或诊断与一或多个乙型链球菌属成员相关的疾病。在另一实施方案中，本发明的组合物与PNEOMOVAX-23TM组合使用，治疗，预防和/或诊断与肺炎链球菌相关的疾病。
本发明的组合物可单独施用，或与其它治疗剂组合施用，包括但非限于化疗剂，抗生素，抗病毒剂，类固醇和非类固醇抗炎症剂，常规免疫治疗剂和细胞因子。组合施用可伴随施用如作为混合物，分别地但同时施用；或相继施用。包括组合剂作为治疗性混合物一起施用，也包括组合剂分别地但同时施用，如通过分别的静脉通道同时注入相同个体中，“组合”施用还包括分别先施用一种化合物，然后再施用另一种。
在一实施方案中，本发明的组合物与TNF家族的其它成员组合施用。可与本发明组合物组合施用的TNF，TNF相关的或类TNF分子包括但非限于可溶形式的TNF-α和/或α-淋巴毒素(α-LT，也称为TNF-β)，LT-β(在异源三聚体LT-α2-β复合物中发现的)，OPGL，FasL，CD27L，CD30L，CD40L，40-1BBL，DcR3，OX40L，γ-TNF(国际公开WO96/14328)，AIM-I(国际公开WO97/33899)，AIM-II(国际公开WO97/34911)，APRIL(J.Exp.Med.188(6)1185-1190)，α-内因子(国际公开WO98/07880)，TR6(国际公开WO98/30694)，OPG和Neutrokine-α(国际公开WO98/18921)，OX40和神经生长因子(NGF)和可溶形式的Fas，CD30，CD27，CD40和4-IBB，TR2(国际公开WO98/34095)，DR3(国际公开WO97/33904)，DR4(国际公开WO98/32856)，TR5(国际公开WO98/30693)，TR6(国际公开WO98/30694)TR7(国际公开WO98/41629)，TRANK，TR9(国际公开WO98/56892)，TR10(国际公开WO98/54202)，312C2(国际公开WO98/06842)和TR12。
在一优选的实施方案中，本发明的组合物与CD40配体(CD40L)，可溶形式的CD40L(如AVRENDTM)，CD40L的生物活性片段，变体或衍生物，抗CD40L抗体(如激动性或拮抗性抗体)，和/或抗CD40抗体(如激动性或拮抗性抗体)。
在一些实施方案中，本发明的组合物与抗逆转录病毒制剂，核苷逆转录酶抑制剂，非核苷逆转录酶抑制剂，和/或蛋白酶抑制剂组合施用。可与本发明组合物组合施用的核苷逆转录酶包括但非限于RETROVIRTM(zidovudine/AZT)，VIDEXTM(didanosine/ddI)，HIVIDTM(zalcitabine/ddC)，ZERITTM(stavudine/d4T)，EPIVIRTM(lamivudine/3TC)，和COMBIVIRTM(zidovudine/lamivudine)。可与本发明组合物组合施用的非核苷逆转录酶包括但非限于VIRAMUNETM(nevirapine)，RESCRIPTORTM(delavirdine)，和SUSTIVATM(efavirenz)。可与本发明组合物组合施用的蛋白酶抑制剂包括但非限于CRIXIVANTM(indinavir)，NORVIRTM(ritonavir)，INVIRASETM(saquinavir)，和VIRACEPTTM(nelfinavir)。在一特异的实施方案中，抗病毒剂，核苷逆转录酶抑制剂，非核苷逆转录酶抑制剂，和/或蛋白酶抑制剂可与本发明组合物任意组合，治疗，预防和/或诊断AIDS和/或治疗，预防和/或诊断HIV感染。
在其它实施方案中，本发明的组合物可与抗机会感染剂组合使用。可与本发明组合物组合施用的抗机会感染剂包括但非限于TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM，DAPSONETM，PENTAMIDINETM，ATOVAQUONETM，ISONIAZIDTM，RIFAMPINTM，PYRAZINAMIDETM，ETHAMBUTOLTM，RIFABUTINTM，CLARITHROMYCINTM，AZITHROMYCINTM，GANCICLOVIRTM，FOSCARNETTM，CIDOFOVIRTM，FLUCONAZOLETM，ITRACONAZOLETM，KETOCONAZOLETM，ACYCLOVIRTM，FAMCICOLVIRTM，PYRIMETHAMINETM，LEUCOVORINTM，NEVPOGENTM(filgrastim/G-CSF)，和LEUKINETM(sargramostim/GM-CSF)。在一特异的实施方案中，本发明的组合物可与TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM，DAPSONETM，PENTAMIDINETM和/或ATOVAQUONETM任意组合，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性Pneumocystis carinii感染。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物与ISONIAZIDTM，RIFAMPINTM，PYRAZINAMIDETM和/或ETHAMBUTOLTM任意组合，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性Mycobacterium avium复合物感染。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物与RIFABUTINTM，CLARITHROMYCINTM和AZITHROMYCINTM任意组合，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性结核杆菌感染。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物与GANCICLOVIRTM，FOSCARNETTM和/或CIDOFOVIRTM任意组合，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性巨细胞病毒感染。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物与FLUCONAZOLETM，ITRACONAZOLETM，和/或KETOCONAZOLETM任意组合，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性真菌感染。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物与ACYCOLOVIRTM和/或FAMCICOLVIRTM任意组合，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性I型或II型单纯疱疹病毒感染。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物与PYRIMETHAMINETM和/或LEUCOVORINTM任意组合，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性Toxoplasma gondii感染。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物与LEUCOVORINTM和/或NEUPOGENTM任意组合，以预防性治疗，预防和/或诊断机会性细菌感染。
在另一实施方案中，本发明的组合物与抗病毒剂组合施用。可与本发明组合物组合施用的抗病毒剂包括但非限于无环鸟苷，病毒唑，金刚胺和remantidine。
在另一实施方案中，本发明的组合物与抗生素组合施用。可与本发明组合物组合施用的抗生素包括但非限于阿莫西林，氨基糖苷类抗生素，β-内酰胺(糖肽)，β-内酰胺酶，氯洁霉素，氯霉素，头孢菌素，卷须霉素，红霉素，荧光醌霉素，大环内酯，2-甲基-5-硝基-1-咪唑基乙醇，青霉素，醌霉素，利福平，链霉素，氨磺酰，四环素，三甲氧苄二氨嘧啶，三甲氧苄二氨嘧啶-硫胺咪唑，和万古霉素。
可与本发明组合物组合施用的常规非特异性免疫抑制剂，包括但非限于类固醇，环孢菌素，环孢菌素类似物环磷酰胺，环磷酰胺IV，甲基强的松龙，强的松龙，硫唑嘌呤，FK-506，15-脱氧spergualin和其它抑制应答T细胞功能的免疫抑制剂。
在特异的实施方案中，本发明的组合物与免疫抑制剂组合施用。可与本发明组合物组合施用的免疫抑制剂制备物包括但非限于ORTHOCLONETM(OKT3)，SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(环孢菌素)，PROGRAFTM(tacrolimus)，CELLCEPTTM(霉酚酸盐)，硫唑嘌呤，glucorticosteroids，和RAPAMUNETM(sirolimus)。在一特异的实施方案中，免疫抑制剂可用于预防器官或骨髓移植的排斥反应。
在一优选的实施方案中，本发明的组合物与类固醇治疗组合施用。可与本发明组合使用的类固醇包括但非限于口服肾上腺皮质素，强的松，和甲基强的松(如IV甲基强的松)。在一特异的实施方案中，本发明的组合物与强的松组合施用。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物与强的松和免疫抑制剂组合施用。可与本发明组合物及强的松组合施用的免疫抑制剂如本文所述的那些，包括但非限于硫唑嘌呤，环磷酰胺和环磷酰胺IV。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物与甲基强的松组合施用。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物与甲基强的松和免疫抑制剂组合使用。可与本发明组合物和甲基强的松组合施用的免疫抑制剂如本文所述的那些，包括但非限于硫唑嘌呤，环磷酰胺和环磷酰胺IV。
在一优选的实施方案中，本发明的组合物与抗疟疾剂组合施用。可与本发明组合物组合施用的抗疟疾剂包括但非限于羟基氯喹，氯喹，和/或喹吖因。
在一优选的实施方案中，本发明的组合物与NSAID组合施用。
在一实施方案中，本发明的组合物与一，二，三，四，五，十或多种以下药物组合施用NRD-101(Hoechst Marion Roussel)，环氟拉嗪(Dimethaid)，恶丙嗪钾(Monsanto)，mecasermin(Chiron)，T-614(Toyama)，pemetrexed disodium(Eli Lilly)，atreleuton(Abbott)，valdecoxib(Monsanto)，eltenac(Byk Gulden)，campath，AGM-1470(Takeda)，CDP-571(Celltech Chiroscience)，CM101(CarboMed)，ML-3000(Merckle)，CB-2431(KS Biomedix)，CBF-BS2(KS Biomedix)，IL-1Ra基因治疗(Valentis)，JTE-522(JapanTobacco)，paclitaxel(Angiotech)，DW-166HC(Dong Wha)，darbufelonemesylate(Warner-Lambert)，可溶的TNF受体1(Synergen；Amgen)，IPR-6001(Institute for Pharmaceutical Research)，trocade(Hoffman-La Roche)，EF-5(Scotia Pharmaceuticals)，BIIL-284(BoehringerIngelheim)，BIIF-1149(Boehringer Ingelheim)，Leuko Vax(Inflammatics)，MK-663(Merch)，ST-1482(Sigma-Tau)，和butixocort propionate(Warner Lam bent)。
在一优选的实施方案中，本发明的组合物与以下一，二，三，四，五或多种药物组合施用氨甲喋呤，水杨酸偶氮磺胺吡啶，金硫苹果酸钠，醋硫葡金，环孢霉素，青霉胺，咪唑硫嘌呤，抗疟疾药(如本文所述)，环磷酰胺，瘤可宁，金，ENBRELTM(Etanercept)，抗TNF抗体，和强的松龙。
在一更优选的实施方案中，本发明的组合物与抗疟疾药，氨甲喋呤，抗TNF抗体，ENBRELTM和/或水杨酸偶氮磺胺吡啶组合施用。在一实施方案中，本发明的组合物与氨甲喋呤组合施用。在另一实施方案中，本发明的组合物与抗TNF抗体组合施用。在另一实施方案中，本发明的组合物与氨甲喋呤和抗TNF抗体组合施用。在另一实施方案中，本发明的组合物与水杨酸偶氮磺胺吡啶组合施用。在另一特异的实施方案中，本发明的组合物与ENBRELTM组合施用。在另一实施方案中，本发明的组合物与ENBRELTM，氨甲喋呤，和水杨酸偶氮磺胺吡啶组合施用。在其它实施方案中，一或多种抗疟疾药与上述组合之一组合施用。在一特异的实施方案中，本发明的组合物与抗疟疾药(如羟基氯喹)，水杨酸偶氮磺胺吡啶，抗TNF抗体，和氨甲喋呤组合施用。
在另一实施方案中，本发明的组合物单独施用或与一或多种静脉内注射的免疫球蛋白组合施用。可与本发明组合物组合施用的静脉内免疫球蛋白包括但非限于GAMMARTM，IVEEGAMTM，SANDOGLOBULINTM，GAMMAGARD S/DTM，和GAMIMUNETM。在一特异的实施方案中，本发明的组合物与静脉内免疫球蛋白组合施用于移植疗法中(如骨髓移植)。
CD40配体(CD40L)，一种可溶形式的CD40L(如AURENDTM)，CD40L的生物活性片段，变体或衍生物，抗CD40L抗体(如激动性或拮抗性抗体)，和/或抗CD40抗体(如激动性或拮抗性抗体)。
在另一实施方案中，本发明的组合物单独施用或与抗炎剂组合施用。可与本发明组合物组合施用的抗炎剂包括但非限于糖皮质激素和非激素类抗炎剂，氨芳基羧酸衍生物，芳基乙酸衍生物，芳基丁酸衍生物，芳基丁酸衍生物，芳基羧酸衍生物，芳基丙酸衍生物，吡唑，吡唑啉，水杨酸衍生物，氨甲酰噻嗪，e-乙酰氨基已酸，S-腺苷甲硫氨酸，3-氨基-4-羟丁酸，amixetrine，苯吲酸，6-苄基腺嘌呤，布可龙，双苯哌醋胺，双苯唑醇，emorfazone，愈创奥，萘丁美酮，尼美舒利，orgotein，oxaceprol，paranyline，perisoxal，pifoxine，proquazone，proxazole，和替尼达帕。
在另一实施方案中，本发明的化合物与化疗剂组合施用。可与本发明的组合物组合施用的化疗剂包括但非限于抗生素衍生物(如阿霉素，博来霉素，道诺红菌素和道诺霉素)；抗雌激素(如三苯氧胺)；抗代谢物(如氟尿嘧啶，5-FU，氨甲喋呤，5-氟尿嘧啶脱氧核苷，α-干扰素2b，谷氨酸，光神霉素，巯基嘌呤，和b-硫代鸟嘌呤)；胞毒剂(如卡氮芥，BCNU，1环己亚硝脲，CCNU，阿糖胞苷，环磷酰胺，磷雌氮芥，羟脲，甲基苄肼，丝裂霉素，白消安，顺铂，和长春新碱硫酸盐)；激素(如甲孕酮，雌氮芥磷酸钠，乙烯雌醇，雌二醇，乙酸孕甾酮，甲基睾甾酮，己烯雌酚二磷酸酯，三对甲氧苯氯乙烯，和睾丸内酯)；氮芥衍生物(如mephalen，chorambucil，mechlorethamine(氮芥)和三胺硫磷)；类固醇及组合物(如bethamethasone磷酸钠)；及其它物质(如dicarbazine，天冬酰胺酶，米托坦，硫酸长春新碱，硫酸长春花碱和表鬼臼毒吡喃葡糖苷)。
在一特异的实施方案中，本发明的组合物与CHOP(环磷酰胺，阿霉素，长春新碱和强的松)或与CHOP组分的任意组合物组合施用。在另一实施方案中，本发明的组合物与Rituximab组合施用。在另一实施方案中，本发明的组合物与Rituximab和CHOP，或Rituxamab与CHOP组分的任意组合物组合施用。
在另一实施方案中，本发明的组合物与细胞因子组合施用。可与本发明组合物组合施用的细胞因子包括但非限于GM-CSF，G-CSF，IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL10，IL12，IL13，IL15，抗CD40，CD40L，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，TNF-α，TNF-β。在另一实施方案中，本发明的组合物可与任何白细胞介素组合施用，包括但非限于IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20，IL-21和11-22。在优选的实施方案中，本发明的组合物与IL4和IL10组合施用。本发明人观测到IL4和IL10均增强Neutrokine-α介导的B细胞增殖。
在另一实施方案中，本发明的组合物与趋化因子组合施用。在另一实施方案中，本发明的组合物与趋化因子β-8，趋化因子β-1，和/或巨噬细胞炎症蛋白4组合施用。在一优选的实施方案中，本发明的组合物与趋化因子β-8组合施用。
在另一实施方案中，本发明的组合物与IL-4拮抗剂组合施用。可与本发明组合物组合施用的IL-4拮抗剂包括但非限于可溶的IL-4受体多肽，多聚合形式的可溶IL-4受体多肽；结合IL-4受体但不转导由IL-4激发的生物信号的抗IL-4受体抗体；阻断IL-4与一或多个IL4受体结合的抗IL-4抗体，和结合IL4受体但不转导由IL4激发的生物信号的IL4突变蛋白。优选地，根据此方法使用的抗体是单克隆抗体(包括抗体片段，如本文所述)。
在另一实施方案中，本发明的组合物与造血生长因子组合施用。可与本发明组合物组合施用的造血生长因子包括但非限于LEUKTNETM(SARGRAMOSTIMTM)和NEUPOGENTM(FILGRASTIMTM)。
在另一实施方案中，本发明的组合物与成纤维细胞生长因子组合施用。可与本发明组合物组合施用的成纤维细胞生长因子包括但非限于FGF-1，FGF-2，FGF-3，FGF-4，FGF-5，FGF-6，FGF-7，FGF-8，FGF-9，FGF-10，FGF-11，FGF-12，FGF-13，FGF-14，和FGF-15。
另外，本发明的组合物可单独施用或与其它治疗方法组合施用，包括但非限于放疗。这种组合疗法可相继和/或伴随施用。激动剂和拮抗剂-分析及分子本发明还提供了一种筛选化合物的方法，以鉴别增强或阻断Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽对细胞的作用，如其与Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV结合分子如受体分子相互作用的化合物。激动剂是一种增强Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV天然生物功能，或与Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV相似方式的功能的化合物，而拮抗剂是降低或消除这种功能的化合物。
在另一实施方案中，本发明提供了一种特异结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的受体蛋白或其它配体结合蛋白的方法。例如，细胞区室如细胞膜或其制备物，可制备自表达结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的分子的细胞。将此制备物用标记的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV温育，分离结合受体的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV或其它结合蛋白的复合物，并根据本领域已知常规方法定性。或者，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV可与固体支持物结合，以便自细胞溶解的结合分子与层析柱结合，然后根据常规方法洗脱及定性。
在本发明的激动剂或拮抗剂分析中，细胞区室如细胞膜或其制备物，可制备自表达结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的分子的细胞，该分子如是通过Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV调制的信号或调节途径分子。此制备物用标记的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV在有或无候选分子的情况下温育，该候选分子可以是Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV激动剂或拮抗剂。候选分子与结合分子的结合的能力反映于标记的配体结合降低中。单方面结合的分子即不诱导Neutrokine-α对Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV结合分子结合的作用的分子，是良好的拮抗剂。良好结合并激发相似或密切相关于Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的作用的分子是激动剂。
潜在的激动剂和拮抗剂的类Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV作用，可例如通过确定候选分子与细胞或适当的细胞制备物相互作用之后，第二信使系统的活性，并与Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV或激发与Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV相同作用的分子的作用相对比，而加以确定。可用于此的第二信使系统包括但非限于AMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸水解第二信使系统。
Neutrokine-α和/或αSV拮抗剂的另一种分析例如是竞争分析，其是在适当的条件下组合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV和潜在的拮抗剂，与膜结合的受体分子或重组Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体分子，进行竞争性抑制分析。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV可例如通过放射性标记，这样结合受体分子的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV分子的数目可准确测定，以证实潜在拮抗剂的效力。
潜在的拮抗剂包括结合本发明多肽的小有机分子，肽，多肽(如IL-13)和抗体，从而抑制或灭绝其活性。潜在的拮抗还可以是结合在结合分子如受体分子上相同位点的小有机分子，肽，多肽如密切相关的蛋白质或抗体，而不诱导Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV诱导的活性，从而通过排阻Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV结合而阻止Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的作用。
其它潜在拮抗剂包括反义分子。反义方法可用于通过反义DNA或RNA或通过三螺旋形成而控制基因表达。反义方法例如由Okara，神经化学杂志56560(1991)；“作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸”，CRC出版社，Boca Raton，F1(1988)所述。三螺旋形成例如由Lee等，核酸研究63073(1979)；Cooney等，科学241456(1988)；和Dervan等，科学2511360(1991)。此方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。例如，编码本发明多肽胞外域的多核苷酸的5’编码部分，可用于设计长度大约为10-40碱基对的反义RNA寡核苷酸。设计一个互补于转录中包含的基因的区域的DNA寡核苷酸，从而防止Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的转录和产生。此反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，并阻断mRNA翻译为Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽。上述寡核苷酸也可输送至细胞，这样反义RNA或DNA可在体内表达，以抑制Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的产生。
在一实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV反义核酸是在细胞内通过从外源序列中转录而产生的。例如，转录产生本发明反义核酸(RNA)的一载体或其一部分。这种载体含有编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV反义核酸的序列。这种载体可保持附加型或成为染色体整合的载体，直至其可被转录产生所需的反义DNA。这种载体可通过本领域标准的重组DNA方法构建。载体可以是质粒，病毒，或本领域已知其它物质，用于在脊椎动物细胞中复制和表达。编码Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV，或其片段的序列，可通过本领域已知的任何启动子在脊椎动物尤其人体细胞中表达。这种启动子可以是可诱导的或组成型的。这种启动子包括但非限于SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，自然29304-310(1981)，包含于Rous肉瘤病毒的3′长末端重复中的启动子(Yamamoto等，细胞22787-797(1980))，疱疹胸苷启动子(Wagner等，美国科学院院报781441-1445(1981)，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，自然29639-42(1982))，等。
本发明的反义核酸包含互补于Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因的RNA转录物至少一部分的序列。然而，绝对互补性尽管是优选的，但不是所需的。“互补于RNA至少一部分”的序列是指具有良好的互补性，能与RNA杂交形成稳定的双链体的序列；在双链Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV反义核酸的情况中，可测试单链的双螺旋DNA，或分析三螺旋形成、杂交能力依赖于反义核酸的互补程度和反义核酸的长度。通常地，较大的杂交核酸，与Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV RNA的碱基错配越多，其可含有并仍可形成稳定的双螺旋(或三螺旋)。本领域技术人员使用标准方法可查明错配的允许程度，以确定杂交复合物的熔点。
互补于信使5’末端如接近并包括AUG起始密码子的5’未翻译序列的寡核苷酸，应更有效地抑制翻译。然而，互补于mRNA的3’未翻译序列的序列已示出有效地抑制mRNA的翻译。见Wagner，R.1994，自然372333-335所述。因此，图1A-B和5A-B所示的分别互补于Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的5’或3’未翻译的非编码区的寡核苷酸，可用于反义方法中以抑制内源Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV mRNA的翻译。互补于mRNA的5’未翻译区的寡核苷酸应包括AUG起始密码子的互补序列。互补于mRNA编码区的反义寡核苷酸是微效翻译抑制剂，但根据本发明可以使用。不论是否与Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSVmRNA的5’，3’或编码区杂交，反义核酸长度应为6个核苷酸，优选长度为6～50个核苷酸。特别地，此寡核苷酸长度为至少10，17，25或至少50个核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生合或修饰的形式，可以是单链或双链的。可在碱基组分，糖组分或磷酸盐骨架对寡核苷酸进行修饰，例如以改良分子的稳定性，杂交作用等。此寡核苷酸可包括其它所附基团如肽(如在体内定向宿主细胞受体)，或促进跨膜转运的制剂(见例如Letsinger等，1989，美国科学院院报866553-6556；Lemaitre等，美国科学院院报84648-652(1987)；PCT出版物No.WO88/09810，1988年12月15日出版)或穿过血脑屏障的制剂(见例如PCT公开WO89/10134，1988年4月25日公开)，杂交引发的裂解剂(见例如Krol等，生物技术6958-976(1988))或嵌入剂(见例如Zon，药物研究5539-549(1988))。因此，寡核苷酸可与另一分子缀合，如肽，杂交引发的交联剂，转运剂，杂交引发的裂解剂等。
反义寡核苷酸可包含一种修饰的碱基组分，选自包括但非限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-羧羟甲基尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘌呤，5-羧甲氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖queosine，肌苷，N6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-mannosylqueosine，5-甲氧羧甲基尿嘧啶，5-甲氧尿嘧啶，2-甲硫-N6-异戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，Wybutoxiosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨-3-N-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，和2，6-二氨嘌呤。
反义寡核苷酸还可包含至少一个修饰的糖组分，选自包括但非限于阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖和己糖。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的磷酸盐骨架，选自包括但非限于二硫代磷酸酯，硫代磷酸酯，硫代膦酰酯，亚磷酰胺，亚磷二酰胺，甲基磷酸酯，烷基磷酸三酯，formacetal或其类似物。
在另一实施方案中，反义寡核苷酸是α-端基异构寡核苷酸。α端基寡核苷酸与互补RNA形成特异的双链杂交体，其中与一般的β单位相反，链彼此相互平行(Gautier等，核酸研究156625-6641(1987))。寡核苷酸是2-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，核酸研究156131-6148(1987))，或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，FEBS通信215327-330(1997))。
本发明的多核苷酸可通过本领域已知标准方法合成，例如使用自动DNA合成仪)如可购自Biosearch，Applied Biosysterms等)。例如，硫代磷酸酯可通过Stein等的方法合成(核酸研究163209(1988))，甲基磷酸酯寡核苷酸可通过控制孔玻璃聚合物支持体制备(Sarin等，美国科学院院报857448-7451(1988))等。
可使用互补于Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV编码区序列的反义核苷酸，优选互补于转录的未翻译区的反义核苷酸。
本发明潜在的拮抗剂还包括催化性RNA或核酶(见例如PCT国际公开WO90/11364，1990年10月4日公开；Sarver等，科学2471222-1225(1990)。可以使用在位点特异性识别序列裂解mRNA的核酶，以破坏Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV mRNA，优选使用锤头状核酶。锤头状核酶裂解位于与靶mRNA形成互补碱基对的区域两侧的mRNAS。唯一的需求是靶mRNA具有5’-UG-3’序列。本领域熟知锤头状核酶的构建和产生，并详见于Haseloff和Gerlach，自然334585-591(1988)所述。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的核苷酸序列内有许多潜在的锤头状核酶切割位点(分别见于图1A-B和5A-B)。优选地，对此核酶进行工程化，以使切割识别位点位于Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSVmRNA的5’末端附近，即提高效力及使非功能性mRNA转录物的胞内积累最小化。
在反义方法中，本发明的核酶可由修饰的寡核苷酸组成(如改良稳定性，定向等)，并应输送于在体内表达Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的细胞。编码核酶的DNA构建体可如上述相同方式导入细胞中，以导入反义编码DNA。优选的输送方法包括使用在强组成型启动子如polIII，或polII启动子的控制下，“编码”核酶的DNA构建体，这样转染的细胞将产生足量的核酶，以破坏内源性Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV信使，并抑制翻译。由于核酶不像反义分子是催化性的，需要较低的胞内浓度以增加效力。
内源性基因表达也可通过用定向同源重组，灭活或“剔除”Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因和/或其启动子而降低(如Smithies等，自然317230-24(1985)；Thomas和Capeahi，细胞51503-512(1987)；Thompson等，细胞5313321(1989)；以上文献均全文并入参考)。例如，可使用在同源于内源性多核苷酸序列的DNA(基因的编码区或调节区)两侧的本发明突变的非功能性多核苷酸(或互补的不相关的DNA序列)，其有或无可选择的标记和/或阴性可选择的标记，以转染在体内表达本发明多肽的细胞。在另一实施方案中，使用本领域已知方法在细胞中产生剔除，该细胞含有但不表达相应基因。通过定向的同源重组插入DNA构建体，导致定向的基因灭活。这种方法尤其适于研究和农业领域，其中对胚胎干细胞的修饰可用于产生具有灭活的定向基因的动物子代(如表Thomas和Capechi1987和Thompson1989如前)。然而，此方法可常规适用于人体，提供的重组DNA构建体使用适当的病毒载体，直接施用于或定向于体内所需位点，这对本领域技术人员是显而易见的。所引用的文献均全文并入参考。
在其它的实施方案中，本发明的拮抗剂包括可溶形式的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV(如图1A-B所示的Neutrokine-α的片段，包括配体结合结构域，TNF保守的结构域，和/或Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的胞外结构域，及图5A-B所示Neutrokine-αSV的片段，包括配体结合结构域，TNF保守的结构域，和/或Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的胞外结构域)。这种可溶形式的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV，其可以是天然发生的或合成的，通过与天然Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV竞争结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体(如DR5(见国际公开WO98/41629)，TR10(见国际公开WO98/54202)，312C2(见国际公开WO98/06842)和TR11，TR11SV1和TR11SV2(见美国专利No.09/176200))，或通过形成可结合或不结合受体，但不能诱导信号转导的多聚体，而拮抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的信号。优选地，这些拮抗剂抑制Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的刺激淋巴细胞(如B细胞)增殖，分化和/或激活。本发明的拮抗剂还包括特异于TNF家族配体(如CD30)以及Neutrokine-α-Fc和/或Neutrokine-αSV-Fc融合蛋白的抗体。
“TNF家族配体”是指天然发生的，重组的和合成的配体，其能结合TNF受体家族成员，并诱导和/或阻断配体/受体信号途径。TNF配体家族成员包括但非限于TNF-α，淋巴毒素-α(LT-α，也称为TNF-β)，LT-β(在异源三聚体LT-α-2-β复合物中发现的)，FasL，CD40L，(TNF-γ(国际公开WO96/14328)，ATIM-I(国际公开WO97/33899)，AIM-II(国际公开WO97/34911)，APRIL(J.Exp.Med.188(6)1185-1190)，α-内因子(国际公开WO98/07880)，α-神经因子(国际公开WO97/18921)，CD27L，CD30L，4-1BBL，OX40L，CD27，CD30，4-1BB，OX40和神经生长因子(NGF)。在优选的实施方案中，本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV TNF家族配体是DD5(见国际公开WO98/41629)，TR10(见国际公开WO98/54202)，312C2(见国际公开WO98/06842)和TR11，TR11SV1和TR11SV2(见美国专利申请No.09/176200)。
本发明的拮抗剂还包括特异于TNF家族受体或本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的抗体。本发明的抗体可用本发明的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV免疫原通过各种标准方法制备。这种Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV免疫原包括分别由图1A-B(SEQ ID NO2)和图5A-B(SEQ ID NO19)所示完整的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽(可包括或不包括前导序列)，和Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽片段，包含例如配体结合结构域，TNF保守的结构域，胞外结构域，跨膜域，和/或胞内结构域，或它们的任意组合。
本发明的多克隆和单克隆抗体激动剂或拮抗剂，可根据Tartaglia和Goeddel，生物化学杂志267(7)4304-4307(1992)；Tartaglia等，细胞73213-216(1993)和PCT申请WO94/09137所示的方法产生，且优选是特异于(即只结合)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的本发明多肽。术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(mAb)是指包括能结合抗原的完整分子以及其片段)如Fb和F(ab’)片段)。Fab，Fab’和F(ab’)片段缺失Fc片段完整抗体，更迅速地从循环中清除，且可具有较小的完整抗体的非特异性组织结合(Wahl等，核酸方法杂志24316-325(1983))。
在一优选的方法中，本发明的抗体是mAbs。这种mAbs可用杂交瘤方法制备(Kohler和Millstein，自然256495-497(1975)和美国专利No.4376110；Harlow等，抗体实验手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，1988；单克隆抗体与杂交瘤生物学分析中的新进展，Plenum出版社，纽约，NY，1980；Campbell，“单克隆抗体技术”，生物化学和分子生物学中的实验方法，第13卷(Burdor等编辑)，Elsevier，Amsterdam(1984))。
结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV结构域的蛋白质及其它化合物也是本发明的候选激动剂和拮抗剂。这种结合化合物可用酵母双杂交系统“捕捉”(Fields和Song，自然340245-246(1989))。Roger Brent及其同事对酵母双杂交系统已做了修饰(Gyuris，细胞75791-803(1993)；Zervos等，细胞72223-232(1993))。优选地，根据本发明使用酵母双杂交系统，捕捉结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的配体结合结构域，胞外结构域，胞内结构域，跨膜域，和死亡域的化合物。这种化合物是本发明良好的候选激动剂和拮抗剂。
例如，使用上述双杂交分析，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体的胞外域胞内结构域，或其一部分，可用于鉴别与Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体在体内相互作用的细胞蛋白。这种分析也可用于鉴别具有Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体在体内相互作用的细胞蛋白。这种分析也可用于鉴别具有Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体功能的潜在激动或拮抗活性的配体。此筛选分析先前用于鉴别与小鼠TNF-RII的胞质区相互作用的蛋白质，并鉴别两种受体相关的蛋白。Rothe等，细胞78681(1994)。结合Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV受体的胞质区的这种蛋白质和氨基酸序列是本发明的良好候选激动剂和拮抗剂。
其它筛选方法包括使用表达本发明多肽的细胞(如转染的CHO细胞)测定由受体活化导致的胞外pH改变，如科学246181-296(1989)所述。在另一实施例中，潜在的激动剂或拮抗剂可与表达本发明多肽的细胞相接触，并可测定第二信使应答如信号转导，以确定潜在的拮抗剂或激动剂是否有效。
本发明的激动剂包括天然发生的和合成的化合物，如TNF家族配体肽片段，转化生长因子，神经递质(如谷氨酸，多巴胺，N-甲基-D-天冬氨酸)，肿瘤抑制因子(p53)，溶细胞性T细胞和抗代谢物。优选的激动剂包括化疗药物和顺铂，阿霉素，博来霉素，阿糖胞苷，氮芥，氨甲喋呤和长春新碱。其它激动剂包括乙醇和淀粉肽(科学2671457-1458(1995))。
优选的激动剂是刺激淋巴细胞(如B细胞)增殖，分化和/或活化的本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV片段。进一步优选的激动剂包括抗本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽，或其片段产生的多克隆和单克隆抗体。这种抗TNF家族受体产生的激动剂抗体见于Tartaglia等，美国科学院院报889292-9296(1991)；和Tartaglia等，生物化学杂志2674304-4307(1992)所示。也见于PCT申请WO94/09137所述。
在另一实施方案中，免疫调节分子如IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL10，IL12，IL13，IL15，抗CD40，CD40L，IFN-γ和TNF-α，可用作本发明Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的激动剂，其刺激淋巴细胞(如B细胞)增殖，分化和/或活化。在一特异的实施方案中，IL4和/或IL10用于增殖Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV介导的B细胞增殖。
在本发明另一实施方案中，将工程化的以表达本发明多肽的细胞，或工程化的不表达本发明多肽的细胞(如剔除)在体内施用于病人。这种细胞可得自患者(即动物，包括人)，或MHC相容供体，并可包括但非限于成纤维细胞，骨髓细胞，血细胞(如淋巴细胞)，脂肪细胞，肌细胞，内皮细胞等。细胞在体外用重组DNA方法遗传工程化，以将本发明多肽的编码序列导入细胞中，或者破坏与本发明多肽相关的编码序列和/或内源性调节序列，如通过转导(用病毒载体，及优选将转基因整合入细胞基因组的载体)，或转染方法，包括但非限于用质粒，粘粒，YACs，裸DNA，电穿孔，脂质体等进行。本发明多肽的编码序列可置于强组成型启动子或可诱导的启动子或启动子/增殖子的控制下，以表达优选分泌本发明的多肽。表达及优选分泌本发明多肽的遗传工程化细胞可全身性地如通过循环或腹膜内注射而导入患者体内。
或者，细胞可掺入基质中并植入机体内，如遗传工程化的成纤维细胞可作为皮肤移植物的一部分植入；遗传工程化的内皮细胞可作为淋巴管或血管移植物的一部分植入(见例如Anderson等，美国专利No.5399349；和Mulligan和Wilson，美国专利No.5460959，均全文并入参考)。
当施用的细胞是非自身的或非MHC相容的细胞时，可将它们用熟知的防止宿主对导入的细胞产生免疫应答的方法施用。例如细胞可以胶囊形式导入，使组分立即交换至胞外环境中，但不使导入的细胞被宿主免疫系统识别。
在本发明另一实施方案中，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的活性可由“显性失活”而降低。为此，编码缺陷的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽如缺失全部或部分TNF保守结构域的突变体的构建体，可用于基因疗法中，以削弱Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV对适当靶细胞的活性。例如，指导宿主细胞表达Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽的核苷酸序列可导入单核细胞或其它细胞或组织中(通过在体内或源自体内的基因疗法或本领域已知其它方法)，所述核苷酸序列中全部或部分TNF保守的结构域已改变或缺失。或者，可利用定向同源重组，以将这种缺失体或突变体导入受试个体单核细胞中的内源性Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因中。工程化的细胞将表达无功能的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽(即配体(如多聚体)，其能结合但不能诱导信号转导)。染色体分析本发明的核酸分子还可用于染色体鉴别。此序列特异地定向并能杂交个体人染色体的特殊位置。另外，常需要鉴别染色体上的特殊位点。基于真实序列数据(重复多态性)的少数染色体标记试剂适于标记染色体位置。本发明染色体的DNA作图是确定这些序列与疾病相关基因相关的重要第一步。
在一些优选的实施方案中，本文所示的cDNA和/或多核苷酸用于克隆Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV基因的基因组DNA。这可用各种熟知的方法和可商购的文库进行。此基因组DNA然后用于用熟知的方法进行原位染色体作图。
另外，在一些情况中，可通过从cDNA中制备PCR引物(优选15-25bp)将序列在染色体上定位。对基因的3’未翻译区进行的计算机分析，用于迅速选择在基因组内跨越不超过一个外显子，否则使扩增变得复杂的引物。这些引物然后用于PCR筛选含有个体人染色体的体细胞杂交体。cDNA克隆对中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可用于在一个步骤中提供精确的染色体定位。此方法可使用取自cDNA的短如50或60bp的探针。关于此方法的阐述见Verma等，人体染色体基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
一旦序列精确定位在染色体上，染色体上序列的物理位置可与遗传学图数据相关。这种数据见例如V.McKusick，MendelianInheritance In Man，在线购自Johns Hopkins大学，Welch医学图书馆。已定位于相同染色体区的基因与疾病间的关系然后通过谱系分析鉴别(自然在比邻基因的联合遗传特征)。
接下来需要确定患病的和未患病的个体之间cDNA或基因组序列的不同。如果在一些或全部患病个体中观测到突变而在正常个体中无突变，则此突变即是疾病的产生原因。
通过物理学图和遗传学图方法的分辨，cDNA在染色体上的精确定位与50～500种潜在致病基因所致疾病相关。(假定1兆碱基图分辨力，和每20kb一个基因)。利用上述方法，对Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的染色体位置，组合使用体细胞杂种和辐射杂种，可非常有把握地确定在染色体13g34上。实施例本发明参考以下实施例将便于理解，实施例只是举例说明而非限制本发明。以下实施例中许多是特别阐述本发明的Neutrokine-α多核苷酸和多肽的。每个实施例实际上也适用于产生和/或检测本发明的Neutrokine-αSV多核苷酸和多肽。本领域技术人员能易于通过以下实施例而进行关于Neutrokine-αSV的实施例。实施例1a在大肠杆菌中表达和纯化“His标记的”Neutrokine-α在此实施例中用细菌表达载体pQE9(pD10)进行细菌表达。(QIAGEN公司，如前)。pQE9编码氨苄青霉素抗性(“Ampr”)，并含有一个细菌复制起源(“ori”)，一个IPTG可诱导的启动子，一个核糖体结合位点(“RBS”)，编码组氨酸残基的6个密码子，和适当的单一限制酶切割位点，所述组氨酸残基可用QIAGEN公司所售的镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)亲和树脂进行亲和纯化。排列这些因子，这样编码多肽的插入的DNA片段编码具有6个组氨酸残基(即6X His标记)的多肽，这6个组氨酸残基共价地连于该多肽的氨基端。
编码包含胞外域序列的Neutrokine-α蛋白所需部分的DNA序列，是用PCR寡核苷酸引物扩增自保藏的cDNA克隆，PCR寡核苷酸引物分别退火至蛋白质所需部分的氨基端序列，和保藏构建体序列中cDNA编码序列的3’。将含有pQE9载体中促进克隆的限制位点的额外核苷酸分别加入5’和3’引物序列中。
为克隆蛋白质的胞外域，5’引物的序列为5’-GTGGGA TCCAGC CTC CGG GCA GAG CTG-3’(SEQ ID NO10)，其含有下划线的Bam HI限制位点，后接图1A和1B所示序列的胞外域的氨基端编码序列的18个核苷酸。当然，本领域技术人员知道蛋白质编码序列中5’引物起始的位置可以变化，以扩增编码完整Neutrokine-α蛋白的任何所需部分的DNA区段，此完整Neutrokine-α蛋白比胞外域长或短。3’引物的序列为5’-GTGAAG CTTTTA TTACAG CAG TTT CAA TGC ACC-3’(SEQ ID NO11)，其含有下划线的Hind III限制位点，后接2个终止密码子，和互补于图1A和1B所示DNA序列的3’端编码序列的18个核苷酸。
扩增的DNA片段和载体pQE9用Bam HI和Hind III消化，然后将消化的DNAs连接在一起。插入在限制的pQE9载体中的DNA将蛋白质编码区置于IPTG可诱导启动子的下游并与起始AUG和6个组氨酸密码子同框。
用标准方法将连接混合物转化至合适的大肠杆菌细胞中，所用方法如Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989)所述。含有多个拷贝的质粒pREP4的大肠杆菌菌株M15/rep4用于进行本文举例说明的实施例，所述质粒pREP4表达lac阻抑物并赋予卡那霉素抗性(Kanr)。此菌株仅是适于表达蛋白质的许多菌株中的一种，其可购自QIAGEN公司。转化体通过其在存在氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上的生长能力而加以鉴别。从抗性克隆中分离质粒DNA并通过限制性分析，PCR和DNA测序确定克隆的DNA。含有所需构建体的克隆，在补加氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的液态LB培养基中生长过夜(O/N)。用此O/N培养物接种大培养物，稀释度大约为1∶25至1∶250。细胞生长至在600nm的光密度(OD600)在0.4-0.6之间。
然后加入IPTG至终浓度为1mM，以通过灭活lac阻抑物，从lac阻抑物敏感启动子诱导转录。接着将细胞再温育3-4小时。然后通过离心收集细胞。
接着将细胞在4℃在6M盐酸胍，pH8中搅动3-4小时。经离心除去细胞碎片，将上清加样于镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)亲和树脂层析柱(购自QIAGEN公司)中。具有6×His标记的蛋白质与Ni-NTA树脂高亲和性结合，并可用简便的一步方法纯化(详见QIAexpressionist，1995，QIAGEN公司)。简而言之，将上清加样于6M盐酸胍，pH8中的层析柱中，该柱首先用10体积的6M盐酸胍，pH6冲洗，并最后用6M盐酸胍，pH5洗脱Neutokine-α和Neutokine-αSV多肽。
纯化的蛋白质然后通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或50mM乙酸钠，pH6缓冲液加上200mM NaCl透析而复性。或者，蛋白质可成功的再折叠同时固定于Ni-NTA层析柱上。适用的条件如下在含有蛋白酶抑制剂的500mM NaCl，20％甘油，20mMTris/HCl pH7.4中，以线性6M-1M尿素梯度复性。复性应进行1.5小时或更长时间。在复性之后，蛋白质可通过加入250mM咪唑而洗脱。通过用PBS或50mM乙酸钠pH6缓冲液加上200mM NaCl最后透析除去咪唑。将纯化的蛋白质贮存在4℃或冷冻在-80℃。实施例1b在大肠杆菌中表达和纯化Neutokine-αSV在此实施例中用细菌表达载体pQE60进行细菌表达。(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE60编码氨苄青霉素抗性(“Ampr”)，并含有一个细菌复制起源(“ori”)，一个IPTG可诱导的启动子，一个核糖体结合位点(“RBS”)，编码组氨酸残基的6个密码子，和适当的单一限制酶切割位点，所述组氨酸残基可用QIAGEN公司所售的镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)亲和树脂进行亲和纯化。这些元件的排列是使得编码多肽的DNA片段插入后编码具有6个组氨酸残基(即6×His标记)的多肽，这6个组氨酸残基共价地连于该多肽的氨基端。然而，在此实施例中，插入多肽编码序列，由此防止6个组氨酸密码子翻译，且因而产生无6个组氨酸标记的多肽。
编码包含胞外域序列的蛋白质所需部分的DNA序列，是用PCR寡核苷酸引物扩增自保藏的cDNA克隆，PCR寡核苷酸引物分别退火至蛋白质所需部分的氨基端序列，和保藏构建体的序列中的cDNA编码序列的3’。将含有pQE9载体中促进克隆的限制位点的额外核苷酸分别加入5’和3’引物序列中。
为克隆蛋白质的胞外域，5’引物的序列为5’-GTGTCA TGAGCC TCC GGG CAG AGC TG-3’(SEQ ID NO12)，其含有下划线的Bsp HI限制位点，后接图1A和1B所示序列的胞外域的氨基端编码序列的17个核苷酸。当然，本领域技术人员知道蛋白质编码序列中5’引物起始的位置可以变化’以扩增编码完整蛋白质的任何所需部分，此完整蛋白质比胞外域长或短。3’引物的序列为5’-GTGAAG CTTTTA TTA CAG CAG TTT CAA TGC ACC-3’(SEQ ID NO13)，其含有下划线的Hind III限制位点，后接2个终止密码子，和互补于图1A和1B所示DNA序列的3’端编码序列的18个核苷酸。
扩增的DNA片段和载体pQE60用Bsp HI和Hind III消化，然后将消化的DNAs连接在一起。插入在限制的pQE60载体中的DNA将蛋白质编码区置于IPTG可诱导启动子的下游并与起始AUG和6个组氨酸密码子同框。相关的终止密码子防止在插入点下游的6个组氨酸密码子翻译。
用标准方法将连接混合物转化至合适的大肠杆菌细胞中，所用方法如Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989)所述。含有质粒pREP4的多个拷贝的大肠杆菌菌株M15/rep4用于进行本文举例说明的实施例，该质粒pREP4表达lac阻抑物并赋予卡那霉素抗性(Kanr)。此菌株是适于表达蛋白质的许多菌株中的一种，其可购自QIAGEN公司。转化体通过其在存在氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上的生长能力而加以鉴别。从抗性克隆中分离质粒DNA并通过限制性分析，PCR和DNA测序确定克隆的DNA。
本领域技术人员意识到许多细菌表达载体的任一种均可用于代替此实施例中表达方法所用的pQE9和pQE60。例如，新的pHE4细菌表达载体系列，尤其pHE4-5载体可用于此实施例中的细菌表达(ATCC No.209311；及其变体)。ATCC保藏号209311的称为pHE4-5/MPIFD23的质粒DNA，是含有编码另一种ORF的插入体的载体质粒DNA。此构建体于1997年9月30日保藏在美国典型培养物保藏中心，该中心位于弗吉尼亚州马纳萨斯市大学道20110-2209，邮编10801。使用在不相关的MPIF ORF插入体两侧的Nde I和Asp 718限制位点，本领域技术人员易于使用当前的分子生物学方法，用本发明的Neutrokine-αORF置换pHE4-5载体中不相关的ORF。
pHE4-5细菌表达载体包括进行选择的新霉素磷酸转移酶基因，一个大肠杆菌复制起点，一个T5噬菌体启动子序列，两个lac操纵子序列，一个Shine-Delgarno序列，和乳糖操纵子阻抑物基因(lacIq)。这些元件的排列是使得编码多肽的DNA片段插入后表达具有6个组氨酸残基(即6×His标记)的多肽，此6个组氨酸残基共价连于此多肽氨基端。pHE4-5载体的启动子和操纵子序列是合成产生的。本领域熟知核酸序列的合成产生方法(CLONETECH 95/96 Catalog，p215-216，CLONETECH，1020 East Meadow Circle，Palo Alto，CA94303)。
含有所需Neutokine-αSV构建体的克隆，在补加氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的液态LB培养基中生长过夜(O/N)。用此O/N培养物接种大培养物，稀释度大约为1∶25至1∶250。细胞生长至在600nm的光密度(OD600)在0.4-0.6之间。然后加入IPTG至终浓度为1mM，以通过灭活lac阻抑物，从lac阻抑物敏感启动子诱导转录。接着将细胞再温育3-4小时。然后通过离心收集细胞。
接着将细胞在4℃在6M盐酸胍，pH8中搅动3-4小时。经离心除去细胞碎片，将含有Neutrokine-α的上清用补加200mM NaCl的50mM乙酸钠pH6缓冲液透析。或者，蛋白质可用含有蛋白酶抑制剂的500mM NaCl，20％甘油，25mM Tris/HCl pH7.4透析，而成功地再折叠。在复性之后，蛋白质可通过离子交换，疏水性相互作用及大小排阻层析而纯化。或者，亲和层析如抗体层析柱可用于获得纯化的蛋白质。将纯化的蛋白质贮存在4℃或冷冻在-80℃。
在一些实施方案中，优选产生如本实施例所述的表达构建体，以突变Neutrokine-α多肽序列中3个半胱氨酸残基的一或多个。Neutrokine-α多肽序列中的半胱氨酸残基位于SEQ ID NO2所示的147，232，和245位，及位于SEQ ID NO19所示的213和226位(Neutrokine-αSV多肽序列没有相当于Neutrokine-α多肽序列中Cys-147的半胱氨酸，因为Neutrokine-αSV多肽序列中不存在Neutrokine-α多肽序列的143-160位氨基酸残基)。实施例2在杆状病毒表达系统中克隆，表达，和纯化Neutrokine-α蛋白在此实施例中，质粒穿梭载体pA2GP用于将编码蛋白质胞外域，缺失其天然相关的胞内和跨膜序列的克隆的DNA，插入杆状病毒中，以表达Neutrokine-α蛋白的胞外域，使用杆状病毒前导序列和如Summers等，杆状病毒和昆虫细胞培养方法手册，TexasAgricultural Experimental Station Bulletin No.1555(1987)所述的方法。此表达载体含有AcMNPV的强多角体蛋白启动子，后接杆状病毒gp67蛋白的分泌信号肽(前导序列)，和常规的限制位点如BamHI，Xba I和Asp 718限制位点。猴病毒40(SV40)的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为易于选择重组病毒，质粒含有同向的在弱果蝇启动子控制下的来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因，后接多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。插入的基因位于病毒序列的两侧，以用野生型病毒DNA进行细胞介导的同源重组，产生表达克隆的多核苷酸的活病毒。
许多其它杆状病毒载体可用于代替上述载体，如pAc373，pVL941，和pAcIM1，只要本领域技术人员意识到此构建体提供了适当位置的转录，翻译，分泌等信号，包括所需的信号肽和框内AUG。这种载体例如Luckow等，病毒学17031-39(1989)所述。
保藏克隆中编码N末端缺失形式的Neutrokine-α蛋白胞外域的，缺失AUG起始密码子，天然相关的胞内和跨膜结构域序列，和图1A和1B(SEQ ID NO2)所示Gln-73至Leu-79位氨基酸的cDNA序列，是用相当于基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增的。5’引物序列为5’-GTGGGA TCCCCG GGC AGA GCTGCA GGG C-3’(SEQ ID NO14)，其含有下划线的Bam HI限制酶位点，后接图1A和1B所示Neutrokine-α蛋白胞外域序列的18个核苷酸，起于所示的蛋白质胞外域的N末端。3’引物序列为5’-GTGGGA TCCTTA TTA CAG CAG TTT CAA TGC ACC-3’(SEQ ID NO15)，其含有下划线的Bam HI限制酶位点，后接两个终止密码子，和互补于图1A和1B所示3’编码序列的18个核苷酸。
在一些其它的实施方案中，优选表达Neutrokine-α全部推定的胞外域(即Gln-73至Leu-285位氨基酸残基)的构建体。本领域技术人员能使用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别提供的多核苷酸和多肽序列，设计多核苷酸引物，以产生这种克隆。
在一优选的实施方案中，pA2GP表达构建体编码SEQ ID NO2所示Neutrokine-α多肽序列的Leu-112至Leu-285位氨基酸残基。
在另一优选的实施方案中，pA2GP表达构建体编码SEQ ID NO2所示Neutrokine-α多肽序列的Ser-78至Leu-285位氨基酸残基。
扩增的片段用商购的试剂盒(Geneclean，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)，分离自1％琼脂糖凝胶。然后用BamHI消化此片段，并再在1％琼脂糖凝胶中纯化。此片段在此称为F1。
质粒用限制酶BamHI消化，并任选地用本领域已知的常规方法用小牛小肠磷酸酶去磷酸化。然后将DNA用商购的试剂盒(Geneclean，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)，从1％琼脂糖凝胶中分离。此载体DNA在此称为V1。
将片段F1和去磷酸化的质粒V1用T4 DNA连接酶连接。用此连接混合物转化大肠杆菌HB101或其它适当的大肠杆菌宿主如XL-1 Blue细胞(Statagene Cloning Systems，La Jolla，Ca.)，并涂布于培养平板上。通过用BamHI消化各个菌落的DNA，及接着通过凝胶电泳分析消化产物，鉴别含有具有人体基因的质粒的细菌。通过DNA测序确定克隆片段的序列。此质粒在此称为pA2GP-Neutrokine-α。
将5μg的质粒pA2GP-Neutrokine-α与1.0μg商购的线性杆状病毒DNA(BaculoGoldTM杆状病毒DNA，Pharmingen，San Diego，CA)共转染，使用如Felgner等，美国科学院院报847413-7417(1987)所述的脂染法。将1.0μg的BaculoGoldTM病毒DNA与5μg的质粒pA2GP-Neutrokine-α，在含有50μl的无血清Grace’s培养基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴定平板的无菌孔中混合。之后，加入10μl Lipofectin和90μl Grace’s培养基，混合并在室温温育15分钟。然后将转染混合物滴加至Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)中，Sf9昆虫细胞种植在含有1ml无血清Grace’s培养基的35mm组织培养平板中。接着将此平板在27℃温育5小时。然后从平板中除去转染液，并加入补加10％小牛血清的1ml Grace’s昆虫培养基。然后在27℃持续培养4天。
4天后，收集上清并进行噬斑分析，如Summers和Smith所述。使用具有“Blue Gal”(Life Technologies公司，Rockville，Maryland)的琼脂糖凝胶，便于鉴别和分离产生蓝染的噬斑的gal表达克隆。(关于此型噬斑分析的详细阐述，也可见于Life Technologies公司，Rockville，Maryland的昆虫细胞培养和杆状病毒分布使用指导，p9-10所述)。在适当温育后，用微量移液管(如Eppendorf)的尖端挑取蓝染的噬斑。然后将含有重组病毒的琼脂再悬浮于含有200μlGrace’s培养基的微离心管中，并将含有重组杆状病毒的悬浮液用于感染种植于35mm平皿的Sf9细胞中。4天后，收集这些培养平皿中的上清，然后在4℃贮存。此重组病毒称为V-Neutrokine-α。
为检验Neutrokine-α基因的表达，将Sf9细胞在补加10％热灭活的FBS的Grace’s培养基中生长。将此细胞用重组杆状病毒V-Neutrokine-α，在感染复数(MOI)大约为2的情况下感染。如果需要放射标记的蛋白质，6小时后除去此培养基，而用减去甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900 II培养基(购自Life Technologies公司，Rockville，Maryland)代替。42小时之后，加入5微居里的35S-甲硫氨酸和5微居里的35S-半胱氨酸(购自Amersham)。将细胞温育16小时之后，通过离心收集。上清中的蛋白质以及胞内蛋白质，通过SDS-PAGE接着通过放射自显影(如果是放射标记的)加以分析。
可使用对纯化蛋白质氨基端的氨基酸序列进行微测序，以确定蛋白质胞外域的氨基端序列，且因此确定切割位点和分泌信号肽的长度。
在一特异的实施例中，重组Neutrokine-α纯化自杆状病毒感染的Sf9细胞上清，如下所述。将昆虫细胞生长于具有1％(v/v)小牛血清的EXCEL401培养基(JRH Scientific)中。在感染92小时后，将收集的上清通过在18000×g离心，接着通过在0.45m深度过滤而澄清。也可使用脱脂过滤步骤，以除去脂质污染物，并随之改善Neutrokine-α蛋白的初始捕捉。
将上清随机加样于一系列Poros HS-50/H-50中。或者，可使用Toyopearl QAE，Toyopearl Super Q(Tosohass)，Q-Sepharose(Pharmacia)及等价树脂。此步骤用作阴性纯化步骤以除去强阴离子结合污染物。将流经原料的HS/HQ用1M Tris-HCl pH8调节为pH7.5，用等体积的50mM的Tris-HCl pH8稀释，并加样于多孔PI-20或PI-50层析柱中。将PI层析柱首先用4体积的50mM Tris-HCl pH7.5中75mM NaCl冲洗，然后用3-5柱体积的50mM Tris-HCl pH7.5中300mM，750mM，1500mM NaCl洗脱。Neutrokine-α蛋白在简化的SDS-PAGE上呈现一条17KD条带，并存在于0.75M-1.5M NaCl部分中。
将该PI部分经过Sephacryl S100 HR(Pharmacia)大小排阻层析柱进一步纯化，该层析柱用0.15M NaCl，50mM乙酸钠，pH6平衡。将S200部分用NaCl混合为终浓度为3M，并加样于ToyopearlHexyl 650C(Tosohass)层析柱中。Hexyl层析柱用5-10体积的，在50mM乙酸钠pH6中的3M-0.05M线性梯度的NaCl洗脱。Hexyl层析中此NaCl梯度也可用50mM乙酸钠pH6中的1M-0M梯度的硫酸胺代替。组合含有经过SDS-PAGE分析纯化的Neutrokine-α的部分，并用含有150mM NaCl，50mM乙酸钠，pH6透析。
在本文所述的杆状病毒系统表达的最终纯化的Neutrokine-α蛋白，具有起自SEQ ID NO2的Ala-134氨基酸残基的N末端序列。RP-HPLC分析示出高于95％纯度的单一峰值。内毒素水平在LAL分析的检测限值以下。
在另一实施例中，重组Neutrokine-α纯化自含有0.25％牛血清的杆状病毒感染的Sf9细胞，如下所述。
Sf9上清通过在18000×g离心收集。然后将上清用10mMCaCl2，在弱碱条件下处理10-15分钟，接着进行离心和0.22μm深度过滤。然后将所得Sf9细胞上清稀释2倍，并加样于Poros PI-50层析柱(购自PE生物系统)中。该层析柱用50mM Tris(pH＝7.4)平衡。将PI-50层析柱用1CV的50mM Tris(pH＝7.4)冲洗，然后用3CV以上的50mM NaOAc(pH＝6)中的1.5M NaCl洗脱。将PI部分加样于用50mM NaOAc(pH＝6)，125mM NaCl平衡的SephacrylS200层析柱上。将S200部分与盐混合至终浓度为0.7M硫酸铵和0.6MNaCl，并加样于Toyopearl Hexyl 650C层析柱(购自Toso Haas)中，该层析柱已用含有50mM NaOAc(pH＝6)中0.6M NaCl，0.7M硫酸铵的缓冲液平衡。然后将此层析柱用2CV的相同缓冲液冲洗。重组Neutrokine-α然后用3CV的50mM NaOAc(pH＝6)洗脱，接着用2CV的20％的乙醇冲洗。然后重组Neutrokine-α蛋白在硫酸铵梯度(0.3-0M)末端洗脱。集合适当的部分，并用含有50mM NaOAc(pH＝6)的缓冲液透析，然后经过多孔的50HQ层析柱。将HQ流通物稀释4倍，并加样于Toyopearl DEAD 650M层析柱中，然后用25mM柠檬酸钠，125M NaCl洗脱。
在另一实施例中，重组Neutrokine-α是用Sf+昆虫细胞中的杆状病毒载体系统表达和纯化的。
首先，将编码图1A和1B所示Neutrokine-α多肽序列的Ser-78至Leu-285氨基酸残基(等于SEQ ID NO2所示Neutrokine-α多肽序列的Ser-78至Leu-285氨基酸残基)的多核苷酸，亚克隆入杆状病毒转移构建体PSC中，以产生杆状病毒表达质粒。衍生自pVL941的pA2GP转移载体，含有gp67信号肽，修饰的多克隆位点，和克隆在Drosophila热休克启动子下游的lac基因，以选择蓝染噬斑。使用Neutrokine-α(SEQ ID NO2)序列，和pA2GP载体序列，设计一种克隆方法，将PSC信号肽编码序列紧密融合在Neutrokine-α编码序列(SEQ ID NO2和图1A和1B)的Ala-134上，并将其插入PSC杆状病毒转移质粒中。此方法包含使用两次聚合酶链反应(PCR)。首先，设计扩增Neutrokine-α序列的引物。5’引物由编码Ala-134和以下残基(5’-GGT CGC CGT TTC TAA CGC GGCCGT TCA GGG TCC AGA AG-3’；SEQ ID NO31)的序列组成，位于编码PSC信号肽C末端的序列之前。3’引物(5’-CTG GTTCGG CCC AAG GTA CCA AGC TTG TAC CTT AGA TCT TTT CTAGAT C-3’)，由位于Neutrokine-α编码序列紧邻下游的pA2GP载体序列的反向互补序列组成，位于Kpn I限制性内切酶位点和间隔序列(以提高Kpn I切割效力)之前。用含有Neutrokine-α质粒模板的pA2GP和引物O-1887和O-1888进行PCR，所得PCR产物用标准方法纯化。
用PSC杆状病毒转移质粒pMGS12作模板进行另一个PCR反应。此pMGS12质粒由插入pUC8的AcNPV EcoRI“I”片段组成，在ATG起始密码子之后的多角体蛋白编码序列用PSC信号肽和一多接头位点置换。PCR反应用pMGS12作模板，5’引物(5’-CTGGTA GTT CTT CGG AGT GTG-3’；SEQ ID NO33)在唯一的NgoMIV和EcoRV位点上游的AcNPV ORF603中退火，3’引物(5’-CGCGTT AGA AAC GGC GAC C-3’；SEQ ID NO34)退火至编码PSC信号肽的序列的3’末端。
为产生其中PSC信号肽紧密融合于Neutrokine-α编码序列Ala-134的PCR产物，将此PCR产物与PSC信号肽-多角体蛋白上游区PCR产物组合，并进行再一次PCR循环。由于PSC信号肽PCR产物(pMGS12/O-959/O-1044)的3’末端与用引物O-1887/O-1888制备的Neutrokine-α PCR产物的5’末端重叠，组合这两个PCR产物并用引物O-959和O-1888通过PCR重叠延伸。
将含有融合于Neutrokine-α序列的PSC信号肽的所得重叠延伸的PCR产物，插入杆状病毒转移质粒pMGS12中。此PCR产物用NgoM IV和Kpn I消化，纯化片段并连接于NgoM IV-Kpn I切割的pMGS12中。在用此连接混合物转化感受态大肠杆菌DH5α细胞之后，挑取菌落并微量制备质粒DNA。每个连接反应的一些阳性克隆通过质粒DNA的限制性消化分析鉴别，并选择3个克隆(pAcC9669，pAcC9671，pAcC9672)进行大规模质粒纯化。对所得质粒DNA进行DNA序列分析以确定并测序Neutrokine-α插入体。
以下步骤阐述了从Sf+昆虫细胞中回收和纯化重组Neutrokine-α的方法。除非特别指明，该方法在2-8℃进行。
回收第一步CaCl2处理通过在8000×g离心收集Sf+细胞上清。将回收缓冲液-1(1MCaCl2)加入上清中，由此CaCl2的终浓度为10mM。(在一优选的实施方案中，用1M ZnCl2代替1M CaCl2)。此溶液的pH用回收缓冲液-2(1M Tris pH8(±0.2))调节为7.7±。将此溶液温育15分钟，然后在8000×g离心。
纯化第一步在多孔PI-50层析柱上层析将Sf+细胞上清加样于多孔PI-50层析柱(PE Biosystem)上，该层析柱用PI-1缓冲液(50mM Tris，50mM NaCl，pH7.4(±0.2))平衡。将PI-50层析柱用1-2CV的PI-1缓冲液冲洗，然后用PI-2缓冲液(50mM柠檬酸钠，pH6(±0.2))经3CV线性梯度洗脱。监测洗脱液在280nm的紫外线(UV)吸光度。收集越过洗脱峰值的组分并通过SDS-PAGE分析。集合适当的组分。
第二步在Toyopearl Hexyl 650C层析柱上层析将集合的PI与盐混合至(NH4)2SO4的终浓度为0.7M，并加样于Toyopearl Hexyl 650C层析柱上，该层析柱用HIC-1缓冲液(50mMNaOAc，0.6M NaCl，0.7M(NH4)2SO4pH6(±0.2))平衡。然后将此层析柱用2CV的HIC-1缓冲液冲洗。接着，重组Neutrokine-α用3-5CV HIC-2缓冲液(50mM NaOAc pH6(±0.2))洗脱，然后用2CV的20％乙醇冲洗。监测洗脱液在280nm的紫外线(UV)吸光度和传导性。收集洗脱峰值的组分并通过SDS-PAGE分析。集合适当的组分。
第三步在SP琼脂糖凝胶FF上层析透析Hexyl组分并用SP-1缓冲液(50mM乙酸钠，pH4.5(±0.2))将pH调节为4.5，稀释4倍，并加样于SP琼脂糖凝胶(阳离子交换剂，Pharmacia)层析柱，该层析柱用SP-1缓冲液(50mM乙酸钠，pH4.5(±0.2))平衡。然后用SP-2缓冲液(50mM乙酸钠，pH5.5(±0.2))在pH5.5从SP层析柱洗脱重组Neutrokine-α蛋白。然后监测洗脱液在280nm的紫外线(UV)吸光度。收集越过洗脱峰值的组分并通过SDS-PAGE分析。集合适当的组分。
第四步透析重组Neutrokine-α将SP组分置于6-8kd截断膜装置中，然后在透析缓冲液(10mM柠檬酸钠，140mM NaCl，pH6(±0.2))中透析或渗滤过夜。
第五步过滤和填充第六步的重组Neutrokine-α溶液的蛋白质浓度通过双辛可宁酸(BCA)蛋白质分析确定。用适当的缓冲液将重组Neutrokine-α调节为终蛋白质浓度，并在控制的条件下过滤。将过滤物贮存在-20℃以下的适当无菌容器中。
在一特异的实施方案中，将如前所述产生的本发明的Neutrokine-α蛋白调节为终蛋白质浓度为1-5mg/ml，并用10mM柠檬酸钠，140mM NaCl，pH＝6.0(±0.4)缓冲，并贮存在-20℃以下的1型玻璃瓶中。
在层析期间，监测在280nm的紫外线(UV)吸光度。当适用时，测试层析中间物电导率，pH并通过SDS和/或RP-HPLC监测。
清洁层析柱和纯化设备，并用0.2或0.5M NaOH和去离子水清洗，然后用0.1或0.5M乙酸清洗。将层析柱和纯化设备用去离子水冲洗，如果需要，贮存在适当的贮存液中。在使用之前，将此设备用适当缓冲液(如本文所述或本领域熟知的缓冲液)平衡。
在一优选的实施方案中，在上述回收的第一步中，用1M ZnCl2代替1M CaCl2。同样，在此实施方案中，可使用组合的ZnCl2和CaCl2。0.1M ZnCl2和0.9M CaCl2的一些组合可用于重组Neutrokine-α蛋白的回收方法中，例如但非限于0.1M ZnCl2和0.9M CaCl2，0.2M ZnCl2和0.8M CaCl2，0.3M ZnCl2和0.7M CaCl2，0.4M ZnCl2和0.6M CaCl2，0.5M ZnCl2和0.5M CaCl2，0.6M ZnCl2和0.4M CaCl2，0.7M ZnCl2和0.3M CaCl2，0.8M ZnCl2和0.2M CaCl2，0.9M ZnCl2和0.1M CaCl2等。然而，EDTA的存在将抑制回收过程。另外，回收缓冲液1中存在ZnCl2和/或CaCl2将引导大量高分子量Neutrokine-α多聚体形成。实施例3在哺乳动物细胞中克隆和表达Neutrokine-α典型的哺乳动物表达载体含有介导mRNA转录起始的启动子因子，蛋白质编码序列，和为转录终止和转录物聚腺苷酸化所需的信号。其它元件包括增强子，Kozak序列和两侧为RNA剪接供体和受体位点的间插序列。用SV40的早期和晚期启动子，逆转录病毒的长末端重复(LTRs)如RSV，HTLVI，HIVI和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子，可达到高效转录。然而，也可使用细胞因子(如人肌动蛋白启动子)。用于本发明的适当表达载体例如包括pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，pRSVcat(ATCC 37152)，pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)。可使用的哺乳动物宿主细胞包括人HeLa，293，H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos 1，Cos 7和CV1，令人恐惧的QC1-3细胞，小鼠L细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，和HEK 293细胞。
或者，基因可在适当的细胞系中表达，该细胞系含有整合入染色体的基因。与可选择的标记如dhfr，gpt，新霉素，潮霉素共转染可鉴别和分离转染的细胞。
转染的基因也可扩增以表达大量的编码的蛋白质。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记用于显示携带几百个甚至几千个相应基因的拷贝的细胞系。另一种有效的选择标记是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，生物化学杂志227277-279(1991)；Bebbington等，生物/技术10169-175(1992))。使用这些标记，细胞在选择的培养基中生长，并选择最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合入染色体的扩增的基因。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和NSO细胞通常用于产生蛋白质。
表达载体pC1和pC4含有Rous肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等，分子和细胞生物学，438-447(1985年3月))加上CMV-增强子的片段(Boshart等，细胞41521-530(1985))。多克隆位点如具有限制酶切割位点BamHI，XbaI和Asp718，促进相应基因的克隆。载体另外含有鼠前胰岛素原基因的3’内含子，聚腺苷酸化和终止信号。实施例3(a)在COS细胞中克隆和表达表达质粒pNeutrokine-α-HA是通过将编码蛋白质的胞外域的保藏的cDNA的一部分，克隆入表达载体pcDNAI/Amp或pcDNAIII(其可得自Invitrogen公司)中而产生。为产生可溶的分泌形式的多肽，将胞外域融合于人IL-6基因的分泌前导序列。
表达载体pcDNAI/Amp含有(1)在大肠杆菌和其它原核细胞中有效增殖的大肠杆菌复制起点；(2)选择含有质粒的原核细胞的氨苄青霉素抗性基因；(3)在真核细胞中增殖的SV40复制起点；(4)CMV启动子，多接头，SV40内含子；(5)编码血凝素片段(即促进纯化的HA标记)的一些密码子，后接终止密码子和聚腺苷酸化信号，由此cDNA可方便地置于CMV启动子的表达控制下，并通过多接头内的限制位点可操纵地连于SV40内含子和聚腺苷酸化信号。此HA标记相当于衍生自流感血凝素蛋白的表位，如Wilson等，细胞37767(1984)所述。HA标记与靶蛋白的融合使易于检测和回收具有识别HA表位的抗体的重组蛋白质。另外，pcDNAIII含有可选择的新霉素标记。
将编码Neutrokine-α多肽的胞外域的DNA片段克隆入载体的多接头区域，以便重组蛋白质由CMV启动子指导表达。质粒构建策略如下。将保藏克隆的Neutrokine-αcDNA，用含有常规限制位点的引物扩增，多数如以上在大肠杆菌中构建表达Neutrokine-α的载体的方法所述。适当的引物包括以下用于此实施例中的的引物。含有下划线的BamHI位点，Kozak序列，AUG起始密码子，编码人IL-6基因的分泌前导肽的序列，和Neutrokine-α蛋白胞外域的5’编码序列的18个核苷酸的5’引物，具有以下序列5’-GCGGGA TCCGCC ACC ATG AAC TCC TTC TCC ACA AGC GCC TTCGGT CCA GTT GCC TTC TCC CTG GGG CTG CTC CTG GTG TTGCCT GCT GCC TTC CCT GCC CCA GTT GTG AGA CAA GGG GACCTG GCC AGC-3’(SEQ ID NO16)。含有下划线的BamHI限制位点，和互补于在终止密码子之前的3’编码序列的18个核苷酸的3’引物，具有以下序列5’-GTGGGA TCCTTA CAG CAG TTTCAA TGC ACC-3’(SEQ ID NO17)。
将PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp，用BamHI消化然后连接。将此连接混合物转化入大肠杆菌菌株SURE(购自Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037)，并将此转化培养物铺板于氨苄青霉素培养基上，然后温育此平板使氨苄青霉素抗性菌落生长。从抗性菌落中分离质粒DNA，并通过限制分析或其它方法检测编码Neutrokine-α胞外域的片段存在情况。
为表达重组Neutrokine-α，将COS细胞用如上述的表达载体，使用DEAE-DEXTRAN进行转染，例如Sambrook等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)所述。将细胞在通过载体表达Neutrokine-α的条件下温育。
Neutrokine-α-HA融合蛋白的表达通过放射标记和免疫沉淀进行检测，使用如Harlow等，抗体实验手册，第二版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1988)所述方法。在转染两天后，将细胞通过在含有35S-半胱氨酸的培养基中温育8小时而标记。收集细胞和培养基，用含有去污剂的RIPA缓冲液冲洗并裂解细胞150mMNaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM TRIS，pH7.5，如上述Wilson等所述。从细胞裂解物和培养基中用HA特异性单克隆抗体沉淀蛋白质。然后将沉淀的蛋白质通过SDS-PAGE和放射自显影分析。期望大小的表达产物见于细胞裂解物中，在阴性对照中未见到。实施例3(b)在CHO细胞中克隆和表达载体pC4用于表达Neutrokine-α蛋白。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr(ATCC保藏号No37146)的衍生物。为产生可溶的分泌形式的多肽，将胞外域融合于人IL-6基因的分泌前导序列。载体质粒含有在SV40早期启动子控制下的鼠DHFR基因。用这些质粒转染的缺失二氢叶酸活性的中国仓鼠卵巢或其它细胞，可通过将细胞在补加化疗剂氨甲蝶呤的选择性培养基(α减去MEM，LifeTechnologies)中生长而加以选择。DHFR基因在对氨甲蝶呤(MTX)有抗性的细胞中的扩增已充分证实(见例如Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.，和Schimke，R.T.，1978，生物化学杂志2531357-1370，Hamlin，J.L.和Ma，C.1990，生物化学及生物生理学学报1097107-143，Page，M.J.和Sydenham，M.A.1991，生物技术964-68)。生长在浓度增加的MTX中的细胞，通过过量产生定向的酶DHFR，结果DHFR基因扩增而对药物产生抗性。如果另一种基因连于DHFR基因，其通常被共扩增和过表达。本领域已知此方法可用于产生携带扩增的基因的1000个以上拷贝的细胞系。接着，当氨甲蝶呤除去后，获得含有整合入宿主细胞一或多个染色体中的扩增的基因的细胞系。
质粒pC4含有表达相应基因的Rouse肉瘤病毒的长末端重复(LTR)的强启动子(Cullen等，分子和细胞生物学，1985年3月438-447)，加上分离自人巨细胞病毒(CMV)的立即早期基因的增强子的片段(Boshart等，细胞41521-530(1985))。启动子的下游是以下允许基因整合的一个限制酶切割位点BamHI，XbaI，和Asp718。在这些克隆位点之后，质粒含有鼠前胰岛素原基因的3’内含子和聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也可用于表达，例如人β-肌动蛋白启动子，SV40早期或晚期启动子，或其它逆转录病毒如HIV和HTLVI的长末端重复。Clontech’s Tet-Off和Tet-On基因表达系统及相似的系统可用于在哺乳动物细胞中以调节的方式表达Neutrokine-α(Gossen，M.，&Bujard，H.1992，美国科学院院报895547-5551)。为聚腺苷酸化mRNA其它信号，例如可使用人生长激素或球蛋白基因。携带整合入染色体的相应基因的稳定细胞系，也可在用可选择的标记如gpt，G418或潮霉素共转染的基础上选择。在开始时使用一种以上的标记如G418加上氨甲喋呤是有利的。
将质粒pC4用限制酶BamHI消化，然后用牛小肠磷酸酶通过本领域已知方法去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶中分离载体。
编码Neutrokine-α蛋白胞外域的DNA序列，是用相当于基因的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增的。含有下划线的BamHI位点，Kozak序列，AUG起始密码子，编码人IL-6基因的分泌前导肽的序列，和Neutrokine-α蛋白胞外域的5’编码序列的18个核苷酸的5’引物，具有以下序列5’-GCGGGA TCCGCC ACC ATGAAC TCC TTC TCC ACA AGC GCC TTC GGT CCA GTT GCC TTCTCC CTG GGG CTG CTC CTG GTG TTG CCT GCT GCC TTC CCTGCC CCA GTT GTG AGA CAA GGG GAC CTG GCC AGC-3’(SEQID NO16)。含有下划线的BamHI限制位点，和互补于在终止密码子之前的3’编码序列的18个核苷酸的3’引物，具有以下序列5’-GTGGGA TCCTTA CAG CAG TTT CAA TGC ACC-3’SEQ IDNO17)。
扩增的片段用内切核酸酶BamHI消化，然后在1％琼脂糖凝胶上再纯化。此分离的片段和去磷酸化的载体然后用T4 DNA连接酶连接。然后转化大肠杆菌HB101或XL-1 Blue细胞，并鉴别含有插入质粒pC4的片段的细菌，例如用限制酶分析法鉴别。
缺失活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。将5μg的表达质粒pC4与0.5μg的质粒pSVneo用脂染法共转染(Felgner等，如前)。质粒pSV2-neo含有一显性选择标记，编码赋予抗生素抗性的酶包括G418的Tn5的neo基因。将细胞种植于补加1mg/ml G418的α减MEM培养基中。2天后，将细胞用胰蛋白酶消化，种植于补加10，25，或50ng/ml氨甲喋呤和1mg/ml G418的α减MEM培养基中的杂交瘤克隆平板(Greiner，德国)中。大约10-14天后，用胰蛋白酶消化各个克隆，并用不同浓度的氨甲喋呤(50，100，200，400，800Nm)种植于6孔培养皿或10ml培养瓶中。然后将在最高浓度氨甲喋呤中生长的克隆移至新的含有更高浓度氨甲喋呤(1，2，5，10，20μM)的6孔平板中。重复相同的步骤直至获得在100-200μM浓度生长的克隆。通过例如SDS-PAGE和Western印迹或通过反向HPLC分析所需基因产物的表达。
本发明人已产生了至少6个Neutrokine-α表达构建体，以促进不同规格的及在一些系统中产生Neutrokine-c和/或Neutrokine-αSV多肽。这种表达构建体如下(1)pNa.A71-L285(表达Ala71-Leu285位氨基酸残基)，(2)pNa.A81-L285(表达Ala81-Leu285位氨基酸残基)，(3)pNa.L112-L285(表达Leu112-Leu285位氨基酸残基)，(4)pNa.A134-L285(表达Ala134-Leu285位氨基酸残基)，(5)pNa.L147-L285(表达Leu147-Leu285位氨基酸残基)，(6)pNa.G161-L285(表达Gly161-Leu285位氨基酸残基)。
在优选的实施方案中，表达构建体用于表达细菌，杆状病毒和哺乳动物系统的各种Neutrokine-α的突变蛋白。
在另一些优选的实施方案中，此构建体表达在N或C末端融合于异源多肽的Neutrokine-α多肽片段，异源多肽例如是人IL-6的信号肽，CK-β8的信号肽(PCT出版物PCT/US95/09058所揭示的CK-β8序列的-21至-1位氨基酸)，或人IgG Fc区。本领域技术人员已知其它可以使用的序列。实施例4Neutrokine-αmRNA表达的组织分布进行Northern印迹分析以检测在人体组织中Neutrokine-α基因的表达，使用如Sambrook等所述方法。含有Neutrokine-α蛋白(SEQID NO1)全部核苷酸序列的cDNA探针，使用rediprimeTMDNA标记系统(Amersham Life Science)，根据生产者的指导用32P标记。在标记之后，将探针用CHROMA SPIN-100TM层析柱(ClontechLaboratories公司)，根据生产者的方案号PT1200-1而纯化。然后将纯化的标记的探针用于检测各种人体组织的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV mRNA。
含有各种人体组织(H)或人免疫系统组织(IM)的多组织Northern(MTN)印迹，得自Clontech，使用ExpressHybTM杂交液(Clontech)，根据生产者的方案号PT1190-1用标记的探针检测。在杂交和冲洗之后，将印迹在-70℃过夜曝光于胶片上，胶片根据标准方法显色。
为确定Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的表达模式，对一组多组织Northern印迹进行探查。表明一个2.6kb mRNA在周围血白细胞，脾，淋巴结和骨髓中明显表达，在胎盘，心脏，肺，胎儿肝脏，胸腺和胰腺中可检测到表达。对一组细胞系进行分析表明，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV在HL60细胞中高度表达，在K562中可检测到表达，但在Raji，HeLa，或MOLT-4细胞中不表达。所有分析均显示Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV mRNA表达在免疫系统中富集。实施例5用内源性Neutrokine-α基因进行基因治疗根据本发明的另一种基因疗法，包括通过同源重组将内源性Neutrokine-α序列与启动子可操纵地联合，如1997年6月24日授权的美国专利No5641670；国际公开WO96/29411，1996年9月26日出版；国际公开WO94/12650，1994年8月4日出版；Koller等，美国科学院院报868932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然342435-438(1989)所述。此方法包括激活存在于靶细胞中，但在细胞中不表达或低水平表达的基因。产生含有启动子和定向序列的多核苷酸构建体，其同源于启动子两侧的内源性Neutrokine-α的5’非编码序列。定向序列在Neutrokine-α的5’末端附近，由此启动子通过同源重组与内源性序列可操纵地连接。启动子和定向序列可用PCR扩增。优选地，扩增的启动子在5’和3’末端含有独特的限制酶位点。优选地，第一个定向序列的3’末端含有与扩增的启动子的5’末端相同的限制酶位点，第二个定向序列的5’末端含有与扩增的启动子的3’末端相同的限制酶位点。
扩增的启动子和扩增的定向序列用适当的限制酶消化，然后用牛小肠磷酸酶处理。在存在T4 DNA连接酶的情况下，将消化的启动子和消化的定向序列一起加入。将所得混合物保持在适于这两个片段连接的条件下。将构建体在琼脂糖凝胶上按大小进行分级分离，然后通过苯酚提取和乙醇沉淀而纯化。
在此实施例中，多核苷酸构建体作为裸多核苷酸通过电穿孔而施用。然而，多核苷酸构建体也可与转染促进剂一起施用，如脂质体，病毒序列，病毒颗粒，沉淀剂等。本领域已知这种输送。
一旦细胞被转染，进行同源重组，使启动子可操纵地连于内源性Neutrokine-α序列。这使Neutrokine-α在细胞中表达。表达可通过免疫染色或本领域已知的任何其它方法检测。
成纤维细胞得自对象的皮肤活检组织。将所得组织置于DMEM+10％胎牛血清中。将按指数生长的或早期稳定期成纤维细胞用胰蛋白酶消化，并用营养培养基将其从塑胶表面冲洗下。移出一部分细胞悬浮液进行计数，剩余细胞进行离心。吸出上清，将粒状沉淀重悬浮于5ml电穿孔缓冲液(20mM HEPES pH7.3，137mM NaCl，5mM KCl，0.7mM Na2HPO4，6mM葡萄糖)中。将细胞再离心，吸出上清，将细胞重悬浮于含有1mg/ml乙酰化的牛血清白蛋白的电穿孔液中。终细胞悬浮液含有大约3×106个细胞/ml。电穿孔应在重悬浮之后马上进行。
根据标准方法制备质粒DNA。例如，为构建定向于Neutrokine-α基因座的质粒，将质粒pUC18(MBI Fermentans，Amherst，NY)用HindIII消化。将CMV启动子通过PCR扩增使之在5’末端含XbaI位点和在3’末端含BamHI位点。通过PCR扩增两个Neutrokine-α非编码序列一个Neutrokine-α非编码序列(Neutrokine-α片段1)扩增后在5’末端含HindIII位点和在3’末端含XbaI位点；另一个Neutrokine-α非编码序列(Neutrokine-α片段2)扩增后在5’末端含BamHI位点和在3’末端含HindIII位点。CMV启动子和Neutrokine-α片段用适当的酶消化(CMV启动子用XbaI和BamHI；Neutrokine-α片段1用XbaI；Neutrokine-α片段2用BamHI消化)，并连接在一起。将所得连接产物用HindIII消化，并用HindIII消化的pUC18质粒连接。
将质粒DNA加入具有0.4cm电极间隙的无菌试管(Bio-Rad)中。终DNA浓度为至少120μg/ml。然后将0.5ml的细胞悬浮液(含有大约1.5×106个细胞)加入试管中，并将细胞悬浮液和DNA溶液轻微混合。用Gene-Pulser仪(Bio-Rad)进行电穿孔。电容和电压分别设为960μF和250-300V。随着电压提高，细胞存活降低，但稳定地将导入的DNA掺入其基因组的存活细胞的百分率明显提高。给定这些参数，应观测到大约14-20毫秒的脉冲时间。
将电穿孔的细胞在室温保持大约5分钟，然后将试管的内容物用无菌移液管轻轻移出。将细胞直接加入10cm平皿中的10ml预温的营养培养基(具有15％小牛血清的DMEM)中，并在37℃温育。第二天，吸出培养基并用10ml新鲜培养基置换，再温育16-24小时。
然后将基因工程成纤维细胞注射入宿主体内，单独或在生长至铺满cytodex 3微载体珠之后注射。现在成纤维细胞产生蛋白质产物。然后可将此成纤维细胞导入病人体内，如上所述。实施例6Neutrokine-α，一种作为B淋巴细胞刺激物的肿瘤坏死因子配体家族的新成员在人嗜中性粒细胞/单核细胞衍生的cDNA文库中，鉴别出一种285个氨基酸的蛋白质，在其推定的胞外受体—配体结合结构域中，与APRIL(28.7％)(Hahne，M.等，实验方法杂志188，1185-90(1998))，TNF-α(16.2％)(Pennica，D.等，自然312，724-729(1984))和LT-α(14.1％)(Gray，自然312，721-724(1984))呈现明显同源(图7A)。我们将此细胞因子称为Neutrokine-α(基于其生物活性，也称其为B淋巴细胞刺激物(BlyS))。Neutrokine-α蛋白序列的疏水性分析表明，在47-73位氨基酸残基之间的一个潜在的跨膜结构域位于非疏水性氨基酸之前，提示与其它TNF配体家族一样，Neutrokine-α是一种II型膜结合蛋白(Cosman，D.，干细胞12440-55(1994))。此cDNA在哺乳动物细胞(HEK293和中国仓鼠卵巢细胞)和Sf9昆虫细胞中的表达，鉴别一个具有起自第134位丙氨酸的N末端序列的152个氨基酸的可溶形式(图7A)。对质量和电荷比率的重新构建，确定Neutrokine-α的分子量为17038 Daltons，这个数值与推定的具有一个二硫键的此152个氨基酸的蛋白质的分子量(17037.5 Daltons)一致。
使用人/仓鼠体细胞杂种和辐射杂种作图，发现编码Neutrokine-α的基因与标记SHGC-36171连锁，其定位于人染色体13q34，一个与基因的TNF超家族的任何其它成员不相关的区域(Cosman，D.干细胞12440-55(1994))。
Neutrokine-α的表达模式通过Northern印迹(图7B)和流式细胞计量分析(表5和图8)确定。Neutrokine-α由一个2.6kb的mRNA编码，发现其在周围血白细胞，脾，淋巴结和骨髓中高水平表达。在胎盘，心脏，肺，胎儿肝脏，胸腺和胰腺中检测到低水平表达。在这一组细胞系中，在HL-60和K562中检测到Neutrokine-αmRNA，但在Raji，HeLa，或MOLT-4细胞中未检测到。这些结果使用Neutrokine-α特异性mAb 2E5通过流式细胞计量分析可证实。如图5所示，Neutrokine-α表达在T或B细胞系上未检测到，而是限于骨髓起源的细胞。对正常血细胞的近一步分析表明，在静止的单核细胞上明显表达，在将细胞暴露于IFN-γ(100U/ml)下3天后，正调节大约4倍(图8A)。还检测到Neutrokine-α特异性mRNA的伴随增加(图8B)。相反，Neutrokine-α在新分离的周围血粒细胞，T细胞，B细胞或NK细胞中不表达。
确定纯化的重组Neutrokine-α(rNeutrokine-α)在各种基于细胞的分析中，诱导细胞活化，增殖，分化或死亡的能力，所述细胞包括B细胞，T细胞，单核细胞，NK细胞，造血祖细胞，和各种内皮和上皮源的细胞。在这些分析中，特别发现Neutrokine-α在标准联合刺激分析中提高B细胞增殖，其中纯化的扁桃体B细胞，在存在福尔马林固定的金黄色葡萄球菌Cowan I(SAC)或固定的抗人IgM作为引发剂的情况下培养(Sieckmann，D.G.，等，实验方法杂志147814-29(1978)；Ringden，o.等，Scand.J.Immunol.61159-69(1977))。如图9A所示，重组Neutrokine-α诱导扁桃体B细胞剂量依赖性增殖。此应答类似于rIL2在0.1-10000ng/ml剂量范围的应答。当用固定的抗IgM抗体共同刺激细胞培养时，Neutrokine-α还诱导B细胞增殖(图9B)。在存在固定浓度的IL2或rNeutrokine-α的情况下，随着交联剂数量增加而易于观测到剂量依赖形式的应答。
在将对B细胞的特异生物活性与受体表达联系起来的尝试中，纯化的Neutrokine-α是生物素酰化的。在标准B细胞增殖分析中，所得生物素酰化的Neutrokine-α保留生物功能。人体周围全血细胞的谱系特异性分析表明，生物素酰化的Neutrokine-α的结合在T细胞，单核细胞，NK细胞和粒细胞上未检测到，这分别通过CD3，CD14，CD56和CD66b确定(图10A)。相反，生物素酰化的Neutrokine-α结合周围血CD20+B细胞。在B细胞肿瘤系REH，ARH-77，Raji，Namalwa，RPMI8226和IM-9中还检测到受体表达，但在任何测试的骨髓衍生的细胞系包括THP-1，HL-60，K-562和U-937中未检测到。骨髓瘤细胞系IM-9和组织细胞系U-937的代表性流式细胞计量模式示于图10B。用生物活性的FLAG标记的Neutrokine-α蛋白代替化学修饰的生物素酰化的Neutrokine-α可获得相似结果。这些结果证实Neutrokine-α在其受体分布和生物活性中均显示明显的B细胞向性。这些结果还示出细胞活化是否可诱导Neutrokine-α受体在周围血细胞，其它正常细胞或建立的细胞系中表达。
为测试Neutrokine-α的物种特异性，将小鼠脾B细胞在存在人Neutrokine-α和SAC的条件下培养。结果表明rNeutrokine-α诱导鼠脾B细胞在体外增殖，并结合在这些细胞上细胞表面受体。令人感兴趣的是，分离自小鼠骨髓的不成熟的表面Ig阴性B细胞前体，既不应答Neutrokine-α而增殖，也不结合配体。
为确定rNeutrokine-α的体内活性，将BALB/c小鼠(3个/组)每天注射(i.p.)两次缓冲液，或0.08mg/kg，0.8mg/kg，2mg/kg或8mg/kg的rNeutrokine-α。将小鼠连续4天进行这种处理，之后处死，收集各种组织和血清进行分析。在另一实施方案中，将BALB/c小鼠每天注射(i.p.)两次在0.01-10mg/kg范围内任何剂量的rNeutrokine-α。在一优选的实施方案中，将BALB/c小鼠每天注射(i.p.)两次在0.01-3mg/kg范围内任何剂量的rNeutrokine-α(在此实施方案中特别优选的剂量包括但非限于0.01mg/kg，0.02mg/kg，0.03mg/kg，0.04mg/kg，0.05mg/kg，0.06mg/kg，0.07mg/kg，0.08mg/kg，0.09mg/kg，0.1mg/kg，0.2mg/kg，0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg，0.6mg/kg，0.7mg/kg，0.8mg/kg，0.9mg/kg，1.0mg/kg，1.1mg/kg，1.2mg/kg，1.3mg/kg，1.4mg/kg，1.5mg/kg，1.6mg/kg，1.7mg/kg，1.8mg/kg，1.9mg/kg，2.0mg/kg，2.1mg/kg，2.2mg/kg，2.3mg/kg，2.4mg/kg，2.5mg/kg，2.6mg/kg，2.7mg/kg，2.8mg/kg，2.9mg/kg，和3.0mg/kg)。在另一优选的实施方案中，将BALB/c小鼠每天注射(i.p.)两次在0.02-2mg/kg范围内任何剂量的rNeutrokine-α(在此实施方案中特别优选的剂量包括但非限于0.02mg/kg，0.03mg/kg，0.04mg/kg，0.05mg/kg，0.06mg/kg，0.07mg/kg，0.08mg/kg，0.09mg/kg，0.1mg/kg，0.2mg/kg，0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg，0.6mg/kg，0.7mg/kg，0.8mg/kg，0.9mg/kg，1.0mg/kg，1.1mg/kg，1.2mg/kg，1.3mg/kg，1.4mg/kg，1.5mg/kg，1.6mg/kg，1.7mg/kg，1.8mg/kg，1.9mg/kg，2.0mg/kg)。
施用Neutrokine-α的作用，在显微镜下用HE染色的和用特异于CD45R(B220)的mAb免疫组织化学染色的脾组织切片中非常明显(图11A)。正常脾结构发生改变，白质边缘区明显延伸，红髓的细胞结构明显增加(图11A)。边缘区延伸是由于表达B细胞标记CD45R(B220)的淋巴细胞数量增加所致。另外，T细胞密集的动脉周围淋巴鞘(PALS)区域也被适量的CD45R(B220)阳性细胞侵润。这提示白质变化是由于B细胞数量增加所致。通常充填于红髓的的密集填充细胞群不被CD45R(B220)染色。需要进行另外的试验以对所包含的所有类型细胞加以定性，及进一步确定0.08mg/kg，0.8mg/kg，2mg/kg改变脾结构的机制。
对取自用2mg/kg Neutrokine-α处理的小鼠脾组织进行的流式细胞计量分析表明，与对照鼠相比，Neutrokine-α提高成熟(CD45R(B220)dull，ThBbright)B细胞比例近10倍(图11B)。另外进行的其中小鼠是用缓冲液，0.08mg/kg，0.8mg/kg，2mg/kg，或8mg/kg的Neutrokine-α处理的分析表明，与对照鼠相比，0.08mg/kg，0.8mg/kg，2mg/kg的Neutrokine-α均提高成熟(CD45R(B220)dull，ThBbright)B细胞比例近10倍，而缓冲液和8mg/kg的Neutrokine-α产生大约相同比例的成熟B细胞。见表4。
表4小鼠脾B细胞群的FACS分析Neutrokine-α(mg/kg)成熟B细胞百分率(R2)CD45R阳性百分率(R1)对照(缓冲顺) 1.26 52.170.08mg/kg 16.1556.530.8mg/kg 18.5457.562mg/kg16.5457.558mg/kg1.24 61.42体内成熟B细胞表现度增加的潜在结果是血清Ig滴定相对增加。因此，对比缓冲液和Neutrokine-α处理的小鼠之间血清IgA，IgG和IgM水平(图11C)。施用Neutrokine-α使血清中IgA和IgM水平分别增加2和5倍。另人注目的是IgG的循环水平不增加。
另外，在用各种数量的Neutrokine-α处理4天的小鼠的血清IgA滴定中，观测到剂量依赖性应答，而施用相同量的Neutrokine-α处理2天未观测到明显剂量依赖性。在施用4天的情况下，施用8，2，0.8，0.08和0mg/kg的Neutrokine-α所致血清IgA滴定大约为800μg/ml，700μg/ml，400μg/ml，200μg/ml，和200μg/ml。即施用8，2，0.8，和0.08mg/kg的Neutrokine-α4天后，与只施用缓冲液观测到的背景或基本IgA血清水平相对比，IgA血清水平分别提高大约4，3.75，2和最小倍数。在一另外的实施方案中，这些试验可用在0.01-10mg/kg范围内任何数量的rNeutrokine-α进行。在一优选的实施方案中，施用0.01-3mg/kg范围内的Neutrokine-α(在此实施方案中，特别优选的剂量例如包括但非限于0.01mg/kg，0.02mg/kg，0.03mg/kg，0.04mg/kg，0.05mg/kg，0.06mg/kg，0.07mg/kg，0.08mg/kg，0.09mg/kg，0.1mg/kg，0.2mg/kg，0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg，0.6mg/kg，0.7mg/kg，0.8mg/kg，0.9mg/kg，1.0mg/kg，1.1mg/kg，1.2mg/kg，1.3mg/kg，1.4mg/kg，1.5mg/kg，1.6mg/kg，1.7mg/kg，1.8mg/kg，1.9mg/kg，2.0mg/kg，2.1mg/kg，2.2mg/kg，2.3mg/kg，2.4mg/kg，2.5mg/kg，2.6mg/kg，2.7mg/kg，2.8mg/kg，2.9mg/kg，3.0mg/kg)。在另一优选的实施方案中，施用0.02-2mg/kg范围内的Neutrokine-α(在此实施方案中，特别优选的剂量例如包括但非限于0.02mg/kg，0.03mg/kg，0.04mg/kg，0.05mg/kg，0.06mg/kg，0.07mg/kg，0.08mg/kg，0.09mg/kg，0.1mg/kg，0.2mg/kg，0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg，0.6mg/kg，0.7mg/kg，0.8mg/kg，0.9mg/kg，1.0mg/kg，1.1mg/kg，1.2mg/kg，1.3mg/kg，1.4mg/kg，1.5mg/kg，1.6mg/kg，1.7mg/kg，1.8mg/kg，1.9mg/kg，2.0mg/kg)。
本文所示论据阐明Neutrokine-α是TNF-配体超家族的一个新成员，其在体内和体外均诱导B细胞增殖和分化。通过其单核细胞特异性基因/蛋白表达模式，和其对B淋巴细胞的特异性受体分布和生物活性，Neutrokine-α不同于其它B细胞生长和分化因子如IL2(Metzger，D.W.等，免疫学研究146499-505(1995))，IL4(Armitage，R.J.等，生物学实验方法进展292121-30(1991)；Yokota，T.等，美国科学院院报835894-98(1986))；IL5(Takatsu，K.等，美国科学院院报844234-38(1987)；Bertolini，J.N.等，欧洲免疫学杂志23398-402(1993))，IL6(Poupart，P.等，EMBO杂志61219-24(1987)；Hirano，T.，自然32473-76(1986))，IL7(Goodwin，R.G.等，美国科学院院报86302-06(1989)；Namen，A.E.等，自然333571-73(1988))，IL13(Punnonen，J.等，变态反应49576-86(1994))，IL15(Armitage，R.J.等，免疫学杂志154483-90(1995))，CD40L(Armitage，R.J.等，自然35780-82(1992)；Van Kooten，C.和Banchereau，J.Int，Arch.Allergy.Immunol113393-99(1997))或CD27L(CD70)(Oshima，H.等，Int.Immunol.10517-26(1998)；Lens，S.M.等，Semin.Immunol.10517-26(1998))。这些论据提示Neutrokine-α包含于B细胞和单核细胞或它们分化的子代之间的信号交换中。尽管所有B细胞可利用此信号模式，此限制的表达模式和Ig分泌提示Neutrokine-α在激活CD5+或“非常规”B细胞应答中的作用。这些B细胞提供先天的免疫系统的重要组分，及通过其分泌多反应性的IgM和IgA抗体而提供抵御环境中的病原体(Pennell，C.A.等，欧洲免疫学杂志191289-95(1989)；Hayakawa，K.等，美国科学院院报812494-98(1984))。或者，Neutrokine-α可作为T细胞非依赖性应答的调节剂，该应答与CD40和CD40L在T细胞依赖性抗原活化中的应答方式相同(Eertwegh，A.J.等，实验方法杂志1781555-65(1993)；Grabstein，K.H.等，免疫学杂志1503141-47(1993))。这样，Neutrokine-α，其受体或相关的拮抗剂用于治疗与自身免疫性，瘤形成和/或免疫缺损综合征相关的B细胞疾病。
方法小鼠BALB/cAnNCR(6-8周)购自Charles River实验室，并根据推荐的标准(国家研究委员会，和使用实验动物指导(1999))，在具有重复利用的纸垫的小隔离笼(Harlan Sprague Dawley公司，Indianapolis，IN)中饲养，并提供小球状啮齿动物食物(Harlan SpragueDawley公司)，及在底部随意放置瓶装饮用水。在此研究中使用的动物方案是参考并经动物饲养和使用委员会的HGS制度核准的。
分离全长Neutrokine-α的cDNA使用BLAST程序探查人体基因组科学有限公司表达序列标记(EST)数据库，寻求与TNF家族的受体结合结构域同源的序列。对全长Neutrokine-α克隆进行鉴别，测序并提交至基因库(登记号AF132600)。Neutrokine-α开放读框是利用5’引物和3’引物经PCR扩增的，5’引物(5’-CAGACT GGA TCC GCC ACC ATG GAT GAC TCC ACA GAA AG-3’)在预定的起始密码子退火，3’引物(5’-CAG ACT GGT ACC GTCCTG CGT GCA CTA CAT GGC-3’)在预定的下游终止密码子退火。所得扩增子用BamHI和Asp718限制位点加尾，并亚克隆入哺乳动物表达载体中。Neutrokine-α也在p-CMV-1(Sigma Chemicals)中表达。
重组人Neutrokine-α的纯化将编码Neutrokine-α的全长cDNA亚克隆入杆状病毒表达载体pA2中，并转染入Sf9昆虫细胞中(Pater.V.P.等，表达方法杂志1851163-72(1997))。重组Neutrokine-α纯化自感染92小时后的细胞上清，组合使用阴离子交换，大小排阻和疏水作用层析等方法。纯化的蛋白质在含有0.15M NaCl，50mM NaOAc，pH6的缓冲液中配制，无菌过滤并贮存在4℃直至所需时。SDS-PAGE和RP-HPLC分析均表明rNeutrokine-α是95％以上纯化的。内毒素水平低于在LAL分析中的检测限值(Associatesof Cape Cod，Falmouth，MA)。最终纯化的Neutrokine-α蛋白的N末端的序列为Ala-Val-Gln-Gly-Pro。这相当子衍生自用全长Neutrokine-α基因稳定转染的CHO细胞系的可溶的Neutrokine-α的序列。
产生单克隆抗体将BALB/cAnNCR小鼠用悬浮在完全Freund’s佐剂的50μg的His标记的Neutrokine-α免疫接种，接着在不完全Freund’s佐剂中攻击2次。如述制备杂交瘤和单克隆抗体(Gefter，M.L.等，Somatic.Cbll Genet.3231-36(1977)；Akerstrom，B.等，免疫学杂志1352589-92(1985))。
细胞系所有人细胞系购自ATCC(美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，VA)。
FACS分析Neutrokine-α表达在人细胞系，新分离的正常周围血有核细胞，和体外培养的单核细胞，小鼠抗人Neutrokine-αmAb 2E5(IgG1)，和小鼠IgG的PE缀合的F(ab’)2山羊抗体(CALTAG实验室，Burlingame，CA)上评估。用FACScan(BectonDickinson免疫细胞计量系统，San Jose，CA)分析细胞，用碘化丙锭排除死亡的细胞。Neutrokine-α结合用经N-羟基琥珀酰亚胺生物素试剂(Pierce，Rockford，IL)，和PE缀合的链亲和素(Dako Corp，Glostrup，Denmark)生物素酰化的rNeutrokine-α确定。
染色体作图为确定Neutrokine-α基因的染色体位置，将保留个体染色体的一组单染色体的体细胞杂种(Quantum Biotechnology，加拿大)，用Neutrokine-α特异引物通过PCR筛选(5’引物5’-TGG TGT CTT TCT ACC AGG TGG-3’)，3’引物5’-TTTCTT CTG GAC CCT GAA CGG-3’)。推定的233bp的PCR产物只在人染色体13杂种中检测到。使用一组83个辐射杂种(ResearchGenetics，St.Louis，MO)和斯坦福人类基因组中心数据库(http//www.shgc.stanford.edu.RH/rhserver)。发现Neutrokine-α与染色体13上的SHGC-36171标记连锁。用人染色体13的细胞发生图对此图超定位确定人Neutrokine-α在染色体带13q34上。
B淋巴细胞增殖分析人扁桃体B细胞通过用磁珠(MACS)耗竭CD3阳性细胞而纯化。所得细胞群通过CD19和CD20的表达确定其95％以上是B细胞。将的人rNeutrokine-α或对照蛋白重组人IL2的各种稀释物置于96孔平板的各个孔中，向其中加入悬浮在培养液中的105个B细胞，总体积为150μl，所用培养液为含有10％FBS，5×10-5M的2ME，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，和10-5Pansorbin(SAC)或抗IgM抗体的RPMI1640。在加入上述因子72小时之后，通过3H-胸苷(6.7Ci/Mm)的20小时脉冲(1μCi/孔)，对增殖进行定量。
组织学分析将脾组织在10％中性缓冲的福尔马林中固定，包埋于石腊中，切成5μm的切片，置于载玻片上，并用HE染色或通过对CD45R(B220)进行酶标记的间接免疫组织化学方法染色(Hilbert，D.M.，欧洲免疫学杂志232412-18(1993))。
表5Neutrokine-α的细胞表面表达
实施例7检测刺激或抑制B细胞增殖和分化的分析功能性体液免疫应答的产生要求在B细胞系及其微环境之间的可溶和关联的信号。信号可给予一阳性刺激，使B细胞系细胞持续其程序发育，或给予一阴性刺激，指导细胞抑制其当前的发育途径。现已发现许多刺激和抑制信号影响B细胞应答，包括IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，IL-13，IL14和IL15。令人感兴趣的是，这些信号是通过自身微弱的效应器但可与各种共刺激蛋白组合，以诱导B细胞群的活化，增殖，分化，归巢，耐受和死亡。最佳的B细胞共刺激蛋白之一是TNF超家族。已发现此家族中的CD40，CD27和CD30及其各自的配体CD154，CD70和CD153调节各种免疫应答。检测和/或观测这些B细胞群及其前体的增殖和分化的分析，在确定各种蛋白质在增殖和分化期间可对这些B细胞群的作用中是非常有用的。以下列出的是检测B细胞群及其前体的分化，增殖或抑制的两种分析。
体外分析确定纯化的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白或其截短形式，诱导B细胞群及其前体活化，增殖，分化或抑制和/或死亡的能力。Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白对纯化的人扁桃体B细胞的作用，在0.1-10000ng/ml剂量范围内定量测定，在标准B淋巴细胞共刺激中确定，其中纯化的扁桃体B细胞在存在福尔马林固定的金黄色葡萄球菌Cowan I(SAC)，或固定的抗人IgM抗体作为引发剂的条件下培养。第二信号如IL-2和IL-15协同SAC和IgM交联激发B细胞增殖通过掺入含氚胸苷而测定。新协同剂使用此分析可易于鉴别。此分析包括通过磁珠(MACS)耗竭CD3阳性细胞而分离人扁桃体B细胞。所得细胞群通过CD45R(B220)的表达确定95％以上是B细胞。将每个样品的各种稀释物置于96孔平板的各个孔中，向其中加入悬浮在培养液中的105个B细胞，总体积为150μl，所用培养液为含有10％FBS，5×10-5M的2ME，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，和10-5Pansorbin(SAC)的RPMI 1640。在加入上述因子72小时之后，通过3H-胸苷(6.7Ci/Mm)的20小时脉冲(1μCi/孔)，对增殖进行定量。阳性和阴性对照组分别为IL2和培养基。
激动剂(包括Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV多肽片段)证明，当与相同数目的B细胞与相同浓度的引发剂接触时所观测的结果相比时，B细胞增殖增加。根据本发明的拮抗剂当与对照组相比时呈现B细胞增殖降低，对照组含有相同数目的B细胞，相同浓度的引发剂，和相同浓度可溶形式的激发B细胞增殖活性提高的Neutrokine-α(例如SEQ ID NO2所示Neutrokine-α多肽的71-285，81-285，112-285或134-285位氨基酸)，没有拮抗剂。
体内分析将BALB/c小鼠每天注射(i.p.)两次缓冲液，或2mg/kg的Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白，或其截短形式。将小鼠连续4天接受这种处理，然后处死，并收集各种组织和血清以进行分析。对比正常的HE组织切片和Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白处理的脾组织，鉴别Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白对脾细胞的作用的结果，如动脉周围淋巴鞘的扩散，和/或红髓区的成核细胞结构明显增加，可表明B细胞群分化和增殖的激活。使用B细胞标记，抗CD45R(B220)的免疫组织化学研究，用于确定脾细胞的任何生理改变如脾组织结构改变，是否是由于侵润建立的T细胞区的松散确定的B细胞区带内B细胞表现度提高所致。
对经Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白处理的小鼠的脾组织进行的流式细胞计量分析，用于表明与对照鼠相比，Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV是否特异的提高ThB+，CD45R(B220)空B细胞的比例。
另外，在体内成熟B细胞表现度提高的推定结果是在血清Ig滴定中相对提高。因此，对比缓冲液与Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV蛋白处理的小鼠之间血清IgM和IgA水平。实施例8Neutrokine-α及其激动剂在治疗移植物对抗宿主疾病相关的小鼠淋巴萎缩和发育不全中的作用使用Neutrokine-α治疗，预防和/或诊断移植物对抗宿主疾病(GVHD)相关的小鼠淋巴萎缩和发育不全的分析，是通过使用C57BL/6亲代移植至(BALB/c×C57BL/6)F1(CBF1)小鼠模型中而进行的。此进入F1小鼠模型的亲代是充分定性的，是在骨髓移植患者中GVHD的可再生动物模型，这是本领域技术人员熟知的(见Gleichemann等，现代免疫学5324，1984)。可溶的Neutrokine-α预期诱导B淋巴细胞增殖和分化，并纠正在GVHD的动物模型中观测到的淋巴萎缩和发育不全(Piguet等，J.Exp.Med.1661280(1987)；Hattori等，血液90542(1997))。
GVHD开始是通过将大约1-5×108个C57BL/6的脾细胞，经静脉内注射入(BALB/c×C57BL/6)F1小鼠中(均购自Jackson Lab，Bar Harbor，Maine)。在注射亲代细胞后，当淋巴萎缩和发育不全是轻度(大约5天)，中度(大约12天)或重度(大约20天)时，开始将6-8只小鼠每天腹膜内，肌内或皮内注射0.1-5.0mg/kg的Neutrokine-α或对照缓冲液。Neutrokine-α对脾的淋巴萎缩和发育不全的作用，在10-30天之间的多个时间点(3-4)通过FACS和组织病理学分析。简而言之，从正常的CBF1，GVHD，或Neutrokine-α处理的小鼠中制备脾细胞，用荧光素藻红蛋白缀合的抗H-2Kb抗体，生物素缀合的抗H-2Kd抗体，和FITC-缀合的抗CD4抗体，抗CD8抗体，或抗B220抗体，接着用CyChrome缀合的亲和素染色。所有这些抗体均可购自PharMingen(San Diego，CA)。然后在FACScan上(Becton Dickinson，San Jose，CA)分析细胞。受体和供体淋巴细胞分别鉴别为H-2Kb+Kd+和H-2Kb+Kd-细胞。受体或供体的CD4+T，CD8+T和B220+B细胞的数目，是从回收的脾细胞总数中计算的，每个亚群的百分率是通过三色分析确定的。对其它GVHD相关的器官(肝，皮肤和小肠)中组织损伤的相对程度的组织学评价，在处死动物后进行。
最后，Neutrokine-α和缓冲液处理的动物每隔一天进行一次临床评价，确定恶病质，体重和致死性。
在此急性GVHD小鼠模型中也可测试Neutrokine-α的激动剂和拮抗剂。实施例9从scFvs文库中分离抗Neutrokine-α多肽的抗体片段将分离自人PBLs的天然发生的V基因构建成抗体片段的大文库，该文库含有抗Neutrokine-α和/或Neutrokine-αSV的反应性，其可接触或不接触供体(见美国专利5885793，在此全文并入参考)。
文库的拯救scFvs文库构建自人PBLs的RNA，如WO92/01047所述(在此全文并入参考)。为拯救噬菌体展示抗体片段，大约109个携带噬菌粒的大肠杆菌，用于接种含有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的50ml的2×TY(2×TY-AMP-GLU)，并摇动生长至O.D.为0.8。将5ml该培养物用于接种50ml的2×TY-AMP-GLU，加入2×108TU的δ基因3辅助基因(M13δ基因III，见WO92/01047)，并将培养物在37℃不摇动温育45分钟，然后在37℃摇动温育45分钟。将此培养物在4000r.p.m.离心10分钟，并将沉淀物重悬浮于含有100μg/ml氨苄青霉素和50g/ml卡那霉素的2L的2×TY中，生长过夜。如WO92/01047所述制备噬菌体。
M13δ基因III如下制备M13δ基因III辅助噬菌体不编码基因III蛋白，然而噬菌体(粒)展示抗体片段具有较强的结合抗原的能力。感染的M13δ基因III颗粒，是通过在噬菌体形态发生期间，将辅助噬菌体在携带提供野生型基因III蛋白的pUC19衍生物的细胞中生长而产生。将此培养物在37℃不摇动温育1小时，然后在37℃摇动温育1小时。将细胞倒转(IEC-Centra 84000revs/分，10分钟)，重悬浮于含有100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的300ml 2×TY肉汤(2×TY-AMP-KAN)中，在37℃摇动生长过夜。通过两次PEG沉淀(Sambrook等，1990)，从培养基中纯化和浓缩噬菌体颗粒，重悬浮于2ml PBS中，并经过0.45μm滤膜(MinisartNML；Sartorius)过滤，至终浓度为大约1013个转导单位/ml(氨苄青霉素抗性克隆)。
淘选文库将免疫试管(Nunc)在PBS中用4ml的100μg/ml或10μg/ml的本发明的多肽包被过夜。将试管用2％Marvel-PBS在37℃封阻2小时，然后用PBS冲洗3次。在试管中加入大约1013TU的噬菌体，并在室温翻转温育30分钟，然后静止1.5小时。将试管用PBS0.1％Tween-20冲洗10次，及用PBS冲洗10次。加入1ml的100mM三乙胺洗脱噬菌体，上下转动15分钟，之后立即用0.5ml的1.0MTris-HCl，pH7.4中和。然后通过用细菌在37℃温育洗脱的噬菌体30分钟，而将噬菌体用于感染10ml的对数中期大肠杆菌TG1。将大肠杆菌铺板于含有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE平板上。所得细菌文库然后用上述δ基因3辅助噬菌体淘选，以制备噬菌体进行接下来的选择。重复进行此步骤共4次，将用PBS，0.1％Tween-20冲洗试管的亲和纯化增加为20次，用PBS冲洗20次。
定性结合物经过第三和第四次选择的洗脱的噬菌体用于感染大肠杆菌HB2151，并从单一的菌落中产生可溶的scFv(Marks等，1991)。用在50mM碳酸氢盐，pH9.6中的10pg/ml本发明的多肽包被的微滴定平板进行ELISAs。对ELISA中的阳性克隆通过PCR指纹分析进一步定性(见WO92/01047)，然后测序。实施例10用抗Neutrokine-α单克隆抗体中和Neutrokine-α/Neutrokine-α受体间相互作用根据以下方法产生抗Neutrokine-α蛋白的单克隆抗体。简而言之，将小鼠皮下注射通过实施例2的方法产生的50μg的His标记的Neutrokine-α，所述Neutrokine-α在100μl完全Freunds佐剂中乳化的100μl PBS中。间隔两周皮下注射一次在非完全Freunds佐剂中的25μg Neutrokine-α，共注射三次。将动物静息一个月，最后经腹膜内推进25μg的在PBS中的Neutrokine-α。四天后处死动物，取脾细胞进行融合。
“融合”过程是通过将取自脾的细胞与2×10E7 P3X63Ag8.653浆细胞瘤细胞融合而进行的，使用PEG1500(Boehringer Mannheim)，根据生产者的指导进行(见Gefter，M.L.等，Somatic Cell Genet3231-36(1977)；Boehringer Mannheim PEG1500(Cat.No.783641)，产品描述)。
在融合之后，将细胞重悬浮于补加20％FBS和4％杂交瘤补剂(Boehringer Mannheim)的400ml HAT培养基中，并以200μl/孔的密度分布于96孔平板中。在融合7天后，将100μl的培养基吸出并换以100μl的新鲜培养基。在融合14天后，筛选杂交瘤以进行抗体产生。
将杂交瘤上清通过ELISA筛选，以与固定在平板上的Neutrokine-α蛋白结合。将平板用Neutrokine-α通过温育浓度为2μg/ml在PBS中的100μl/孔的Neutrokine-α过夜而包被。将杂交瘤上清用PBS稀释为1∶10，置于Neutrokine-α包被的平板的各个孔中，并在4℃温育过夜。第二天，将平板用含有0.1％Tween-20的PBS冲洗3次，并用抗鼠IgG ABC系统(Vector Laboratories)进行显色反应。加入25ml/孔的2M H2SO4终止显色反应。在450nm阅读平板。
用Isostrips检测杂交瘤上清的Ig同种型。通过在HT培养基上限制性稀释的方法进行克隆。将在0.9ml的HBSS中的大约3×10E6细胞注射入降植烷引发的小鼠中。在7-9天后，用19g注射器收集腹水。所有抗体用Acta FPLC系统(Pharmacia)通过蛋白G亲和层析而纯化。
在开始及两次连续的皮下注射之后，所有的三只小鼠均呈现强免疫应答；通过在Neutrokine-α包被的平板上进行ELISA确定血清滴定为10E-7。
在一试验中，使用阳性小鼠的脾细胞产生1000个以上的初级杂交瘤。筛选其中的917个产生抗Neutrokine-α抗体。用1∶1稀释的上清进行筛选以检测所有阳性克隆。筛选的917个杂交瘤中，发现76个是阳性的，其中17个是IgG的生产者。在亲和测试和克隆后，选择其中9个进一步扩展和纯化。
所有纯化的单克隆抗体在Western印迹分析和ELISA中，均能结合不同形式的Neutrokine-α(包括His标记的和产自杆状病毒系统的蛋白质(见实施例2))。这9个克隆中的6个还能在THP-1细胞表面结合Neutrokine-α。然而，没有一个测试的抗体能从溶液中捕捉Neutrokine-α。
产生高亲和性的抗Neutrokine-α单克隆抗体，其识别在细胞表面表达的Neutrokine-α，但不能识别在溶液中的Neutrokine-α，所述抗体可用于在体内的中和研究，和在体外的单核细胞和B细胞分析。这些抗体还用于在Western印迹分析中对Neutrokine-α进行敏感检测。
在一试验中，使用阳性小鼠的脾细胞产生1000个以上的初级杂交瘤。筛选其中的729个产生抗Neutrokine-α抗体。用1∶10稀释的上清在严格条件下进行筛选，以挑取较高亲和性的最合适的克隆。筛选的729个杂交瘤中，23个是阳性的，包括16个IgM和7个IgG生产者(后者中有4个提供强IgM背景)。在此试验中，IgG杂交瘤的同种型分布偏向于IgG2亚类。7个IgG杂交瘤有3个产生IgG2a亚类的抗体，有2个产生IgG2b亚类的抗体，剩余2个是IgG1生产者。
测试在第二个试验中产生的所有阳性杂交瘤的上清抑制Neutrokine-α介导的B细胞增殖的能力。在第一个筛选试验中，检测产生IgG中和抗体(这些是抗体16C9和12C5)的两个杂交瘤。在另一个试验中，确定杂交瘤(即16C9和12C5)的IgG中和活性，另两个杂交瘤15C10和4A6的强中和上清未鉴别。
随后将这3个克隆在体内扩展(一个克隆即15C10也在中空纤维系统中扩展)，提供亲和层析纯化抗体。所有这三个克隆均能在THP-1细胞表面结合Neutrokine-α，且也能从溶液结合(即捕捉)Neutrokine-α。
特别地，用上述第二个试验中所述的抗Neutrokine-α单克隆抗体进行试验，确定抗体是否中和Neutrokine-α/Neutrokine-α受体结合。简而言之，用EZ连接的TNHS-生物素试剂(Pierce，Rockford，IL)对Neutrokine-α蛋白进行生物素酰化。然后将生物素酰化的Neutrokine-α用于鉴别结合Neutrokine-α的细胞表面蛋白。初步试验表明Neutrokine-α结合B淋巴细胞上的受体。
在上述第二个试验中产生的抗Neutrokine-α抗体中和Neutrokine-α与Neutrokine-α受体的结合。在一特异的实施方案中，抗Neutrokine-α抗体15C10中和Neutrokine-α与Neutrokine-α受体的结合。
因此，在上述第二个试验中产生的抗Neutrokine-α抗体(尤其抗体15C10)识别并结合膜结合的及可溶的Neutrokine-α蛋白，并在体外中和Neutrokine-α与Neutrokine-α受体的结合。
应清楚本发明可不同于前文特别所述和实施例而实际应用。根据以上教导及在所附权利要求范围内，可对本发明加以各种修改。
所引用的所有出版物(包括专利，专利申请，杂志文章，实验手册，书籍或其它文献)在此全文并入参考。
另外，在此提交的序列表，及1998年1月12日提交的申请09/005874，1997年1月14日提交的US60/036100，和1996年10月25日提交的PCT/US96/17957中提交的序列表，均全部并入参考。
序列表<110>人体基因组科学有限公司<120>Neutrokine-α和Neutrokine-α剪接变体<130>PF343PCT2<140>未给出<141>2000-02-22<150>60/122,388<151>1999-03-02<150>60/124,097<151>1999-03-12<150>60/126,599<151>1999-03-26<150>60/127,598<151>1999-04-02<150>60/130,412<151>1999-04-16<150>60/130,696<151>1999-04-23<150>60/131,278<151>1999-04-27<150>09/255,794<151>1999-02-23<150>60/131,673<151>1999-04-29<150>60/136,784<151>1999-05-28<150>60/142,659<151>1999-07-06<150>60/145,824<151>1999-07-27<150>60/167,239<151>1999-11-24<150>60/168,624<151>1999-12-03<150>60/171,108<151>1999-12-16<150>60/171,626<151>1999-12-23<150>60/176,015<151>2000-01-14<160>38<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>1100<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(147)..(1001)<400>1aaattcagga taactctcct gaggggtgag ccaagccctg ccatgtagtg cacgcaggac 60atcaacaaac acagataaca ggaaatgatc cattccctgt ggtcacttat tctaaaggcc 120ccaaccttca aagttcaagt agtgat atg gat gac tcc aca gaa agg gag cag 173Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln1 5tca cgc ctt act tct tgc ctt aag aaa aga gaa gaa atg aaa ctg aag 221Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys10 15 20 25gag tgt gtt tcc atc ctc cca cgg aag gaa agc ccc tct gtc cga tcc 269Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser30 35 40tcc aaa gac gga aag ctg ctg gct gca acc ttg ctg ctg gca ctg ctg 317Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu45 50 55tct tgc tgc ctc acg gtg gtg tct ttc tac cag gtg gcc gcc ctg caa 365Ser Cys Cys Leu Thr Val Val Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln60 65 70ggg gac ctg gcc agc ctc cgg gca gag ctg cag ggc cac cac gcg gag 413Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu75 80 85aag ctg cca gca gga gca gga gcc ccc aag gcc ggc ctg gag gaa gct 461Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala90 95 100 105cca gct gtc acc gcg gga ctg aaa atc ttt gaa cca cca gct cca gga 509Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly110 115 120gaa ggc aac tcc agt cag aac agc aga aat aag cgt gcc gtt cag ggt 557Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly125 130 135cca gaa gaa aca gtc act caa gac tgc ttg caa ctg att gca gac agt 605Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser
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195 200 205act ttg ttt cga tgt att caa aat atg cct gaa aca cta ccc aat aat 672Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn210 215220tcc tgc tat tca gct ggc att gca aaa ctg gaa gaa gga gat gaa ctc 720Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu225 230 235 240caa ctt gca ata cca aga gaa aat gca caa ata tca ctg gat gga gat 768Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly Asp245 250 255gtc aca ttt ttt ggt gca ttg aaa ctg ctg tgacctactt acaccatgtc 818Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu260 265tgtagctatt ttcctccctt tctctgtacc tctaagaaga aagaatctaa ctgaaaatac 878caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 903<210>19<211>266<212>PRT<213>Homo sapiens<400>19Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu1 5 10 15Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro20 25 30Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu35 40 45Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val50 55 60Ser Phe Tyr Gln Val 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PCT/R0/134表关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二) PCT/RO/134表(1992年7月)ATCC保藏号97768加拿大申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时，才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家，申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。联合王国申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。丹麦申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时，才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局，以两者中较早日为准。
关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二) PCT/RO/134表(1992年7月)ATCC保藏号203518加拿大申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时，才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家，申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。联合王国申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。丹麦申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时，才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局，以两者中较早日为准。
关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二) PCT/RO/134表(1992年7月)ATCC保藏号PTA-1158加拿大申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时，才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家，申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。联合王国申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。丹麦申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时，才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局，以两者中较早日为准。
关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二) PCT/RO/134表(1992年7月)ATCC保藏号PTA-1159加拿大申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时，才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家，申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。联合王国申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。丹麦申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时，才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局，以两者中较早日为准。
权利要求
1.一种分离的核酸分子，包含具有与选自以下一组的序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)编码具有图1A和1B(SEQ ID No2)所示完整氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的核苷酸序列；(b)编码具有由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的核苷酸序列；(c)编码Neutrokine-α多肽胞外域的核苷酸序列；(d)编码Neutrokine-α多肽跨膜域的核苷酸序列(e)编码Neutrokine-α多肽胞内域的核苷酸序列；(f)编码包含胞外域和胞内域，但缺失跨膜域的可溶的Neutrokine-α多肽的核苷酸序列；和(g)互补于上述(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有图1A和1B(SEQ ID No1)所示的完整核苷酸序列。
3.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有图1A和1B(SEQ ID No1)所示的编码具有图1A和1B(SEQ ID No2)所示完整氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的核苷酸序列。
4.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有编码包含图1A和1B(SEQ ID No2)所示胞外域的可溶的Neutrokine-α多肽的核苷酸序列。
5.一种分离的核酸分子，包含具有与选自以下一组的序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)编码具有由SEQ ID No2的n-285位残基组成的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n是2-190之间的一个整数；(b)编码具有由SEQ ID No2的1-m位残基组成的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中m是274-284之间的一个整数；(c)编码具有由SEQ ID No2的n-m位残基组成的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n和m是分别如上述(a)和(b)中所定义的整数；及(d)编码由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA克隆编码的完整的Neutrokine-α氨基酸序列的一部分组成的多肽的核苷酸序列，其中所述的一部分序列不包括所述完整氨基酸序列氨基端的1-190个氨基酸和C末端的1-11个氨基酸。
6.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA克隆的完整核苷酸序列。
7.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有编码Neutrokine-α多肽的核苷酸序列，该Neutrokine-α多肽具有由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列。
8.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有编码可溶的Neutrokine-α多肽的核苷酸序列，该多肽包含由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA克隆编码的胞外域。
9.一种分离的核酸分子，包含在严格杂交条件下，与具有与权利要求1的(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中的核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸。
10.一种分离的核酸分子，包含编码具有权利要求1的(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中的氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的携带表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
11.权利要求10的分离的核酸分子，其编码选自以下一组的Neutrokine-α多肽的携带表位部分包含大约Phe-115至大约Leu-147(SEQ ID NO2)氨基酸残基的多肽；包含大约Ile-150至大约Tyr-163(SEQ ID NO2)氨基酸残基的多肽；包含大约Ser-171至大约Phe-194(SEQ ID NO2)氨基酸残基的多肽；包含大约Glu-223至Tyr-246(SEQ ID NO2)氨基酸残基的多肽；包含大约Ser-271至Phe-278(SEQ ID NO2)氨基酸残基的多肽。
12.一种生产重组载体的方法，包括将权利要求1的分离的核酸分子插入一载体。
13.一种通过权利要求12的方法生产的重组载体。
14.一种生产重组宿主细胞的方法，包括将权利要求13的重组载体导入一宿主细胞。
15.一种通过权利要求14的方法生产的重组宿主细胞。
16.一种生产Neutrokine-α多肽的重组方法，包括在所述多肽被表达的条件下培养权利要求15的重组宿主细胞，并回收所述多肽。
17.一种分离的Neutrokine-α多肽，包含与选自以下一组的序列有至少95％相同性的氨基酸序列(a)具有图1A和1B(SEQ ID NO2)所示完整氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的氨基酸序列；(b)具有由ATCC保藏号97768的保藏物所含的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列的Neutrokine-α多肽的氨基酸序列；(c)Neutrokine-α多肽胞外域的氨基酸序列；(d)Neutrokine-α多肽跨膜域的氨基酸序列；(e)Neutrokine-α多肽胞内域的氨基酸序列；(f)包含结构域的可溶的Neutrokine-α多肽的氨基酸序列；及(g)(a)，(b)，(c)(d)(e)或(f)中任一多肽的携带表位部分的氨基酸序列。
18.权利要求17的分离的多肽，包含Neutrokine-α蛋白的携带表位的部分，其中所述部分选自以下一组包含大约Phe-115至Leu-147(SEQ ID NO2)氨基酸残基的多肽；包含大约Ile-150至Tyr-163(SEQ ID NO2)氨基酸残基的多肽；包含大约Ser-171至Phe-194(SEQ ID NO2)氨基酸残基的多肽；包含大约Glu-223至Tyr-246 SEQ ID NO2)氨基酸残基的多肽；包含大约Ser-271至Phe-278(SEQ ID NO2)氨基酸残基的多肽。
19.一种与权利要求17的Neutrokine-α多肽特异结合的分离的抗体。
20.一种包含权利要求17的多肽和药物学可接受的载体的药物组合物。
21.一种编码修饰的Neutrokine-α蛋白的分离的多核苷酸，其中除了至少一个保守氨基酸取代之外，所述修饰的肽具有与选自以下一组的序列相同的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2的1-285位氨基酸；(b)SEQ ID NO2的2-285位氨基酸；(c)SEQ ID NO2的1-46位氨基酸；(d)SEQ ID NO2的47-72位氨基酸；和(e)SEQ ID NO2的73-286位氨基酸。
22.一种修饰的Neutrokine-α多肽分子，其中除了至少一个保守氨基酸取代之外，所述修饰的肽具有与选自以下一组的序列相同的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2的1-285位氨基酸；(b)SEQ ID NO2的2-285位氨基酸；(c)SEQ ID NO2的1-46位氨基酸；(d)SEQ ID NO2的47-72位氨基酸；和(e)SEQ ID NO2的73-286位氨基酸。
23.一种分离的核酸分子，包含具有与选自以下一组的序列有至少95％相同性的序列的多核苷酸(a)SEQ ID NO7的核苷酸序列(b)SEQ ID NO8的核苷酸序列(c)SEQ ID NO9的核苷酸序列(d)图1A和1B(SEQ ID No1)所示序列的一部分的核苷酸序列，其中所述部分包含1-2442位核苷酸的至少30个连续核苷酸，但不包括1387-1421位核苷酸的序列，9-382位核苷酸的序列，1674-1996位核苷酸的序列，1401-1784位核苷酸的序列，900-1237位核苷酸的序列，及位于这些序列内的任何片段；及(e)互补于上述(a)，(b)，(c)或(d)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
24.一种分离的核酸分子，包含具有与选自以下一组的序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)编码具有图5A和5B(SEQ ID NO19)所示完整氨基酸序列的Neutrokine-αSV多肽的核苷酸序列；(b)编码具有由ATCC保藏号203518的保藏物所含的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列的Neutrokine-αSV多肽的核苷酸序列；(c)编码Neutrokine-αSV多肽胞外域的核苷酸序列；(d)编码Neutrokine-αSV多肽跨膜域的核苷酸序列；(e)编码Neutrokine-αSV多肽胞内域的核苷酸序列；(f)编码包含胞外域和胞内域，但缺失跨膜域的可溶的Neutrokine-αSV多肽的核苷酸序列；及(g)互补于上述(a)，(b)，(c)(d)，(e)或(f)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
25.权利要求19的分离的抗体，其中所述分离的抗体抑制SEQ IDNO2的蛋白与Neutrokine-α受体的结合。
全文摘要
本发明涉及一种新的被称为Neutrokine－α的细胞因子。另外，已鉴别了一种Neutrokine－α的剪接变体，称为Neutrokine－αSV。在具体的实施方案中，本发明提供了编码Neutrokine－α和Neutrokine－αSV多肽的核酸分子。在另外的实施方案中，还提供了Neutrokine－α和Neutrokine－αSV多肽，以及载体，宿主细胞，以及生产它们的重组方法及其应用。
文档编号A61K38/19GK1451044SQ00806541
公开日2003年10月22日 申请日期2000年2月22日 优先权日1999年2月23日
发明者克雷格·A·罗森, 倪健, 莱因哈德·埃布纳, 余国良 申请人:人体基因组科学有限公司