包含具有非经典生物活性的组氨酰-tRNA合成酶剪接变异体的组合物及方法

专利名称：包含具有非经典生物活性的组氨酰-tRNA合成酶剪接变异体的组合物及方法
技术领域：
本发明大体上涉及组氨酰-tRNA合成酶(HRS)剪接变异体多核苷酸和多肽，包含这些多核苷酸和多肽的组合物及其使用方法。相关技术说明催化tRNA分子氨酰化的氨酰-tRNA合成酶(AARQ蛋白质，对翻译过程中解码遗传信息是必不可少的。每个真核tRNA合成酶由与原核tRNA合成酶密切相关的核心酶， 以及添加到氨基末端、羧基末端或插入到核心酶内部的其他结构域组成。例如，人类酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)具有不属于原核和低等真核生物TyrRS分子部分的羧基末端结构域。已经证实有几个氨酰-tRNA合成酶具有不同于其参与翻译过程的非经典功能。例如，微型酪氨酰-tRNA合成酶(mini-TyrRS)，即对应于第1_364位氨基酸残基、被多形核细胞弹性蛋白酶和纤溶酶切割的TyrRS的N端结构域，是氨酰-tRNA合成酶(AARS)多功能细胞因子样蛋白质和肽的成员。已证明微型-TyrRS在体外刺激中性粒细胞激活和趋化作用，刺激内皮细胞增殖和迁移，并在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)和小鼠基质胶检测(matrigel assay)中促血管生成。微型-TyrRS具有ELR基序，所述ELR基序和诸如IL-8的CXC-趋化因子类似，可赋予微型-TyrRS趋化因子活性和血管生成活性。和其他含ELR的细胞因子类似，所述基序的突变抑制微型-TyrRS对白细胞的结合和刺激，并抑制血管生成。此外，已证明TrpRS的截短形式具有血管生成性能。在正常人体细胞中，有两种可检测的TrpRS形式由全长分子(第1-471位氨基酸残基)组成的主要形式和次要的截短形式。次要形式是通过前体mRNA(pre-mRNA)的可选剪接而使氨基末端结构域缺失所产生的。已确定微型TrpRS的氨基末端为全长TrpRS分子第48位的蛋氨酸残基。或者，截短 TrpRS可以通过蛋白水解产生。例如，牛TrpRS在胰脏中高表达并分泌到胰液中，从而导致产生截短的TrpRS分子。进一步的研究表明，微型-TrpRS抑制VEGF诱导的细胞增殖和迁移(Wakasugi et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. 99 173-177 (2002)) 具体而言，鸡 CAM 实验表明，微型-TrpRS可阻止VEGF的血管生成活性。相比之下，全长TrpRS不抑制血管生成。因此，去除前48位氨基酸残基可显现出TrpRS抗血管生成活性。因此，与TyrRS—样，某些形式的TrpRS具有除tRNA氨酰化以外的活性。鉴于这些与可变形式TyrRS和TrpRS相关的、非经典的治疗相关活性的观察结果， 需要鉴定其他氨酰-tRNA合成酶蛋白质的生物相关形式和/或活性，以开发该蛋白质家族的全部治疗潜力。因此，本发明满足这些需要，并提供其他相关的优点。发明概述本发明大体上涉及具有非经典活性的分离的HRS剪接变异体多肽；编码HRS剪接变异体多肽的HRS剪接变异体多核苷酸；与HRS多肽结合的结合剂；HRS多肽和多核苷酸的类似物、变异体和片段，以及前述任一物质的组合物和其制备和使用方法。因此，根据一个方面，本发明提供具有至少一种非经典生物活性的分离的HRS剪接变异体多肽，及其活性片段和变异体。本文所用的“非经典”活性，一般是指本发明HRS 多肽所具有的除氨酰化以外的活性，更具体地说，除了将组氨酸添加到tRNAms分子上以外的活性。如本文所述，在某些实施方案中，本发明HRS多肽所显示的非经典生物活性可以包括，但不仅限于，细胞因子产生调节、细胞增殖调节、凋亡调节、细胞信号传导调节、血管生成调节、细胞迁移调节、细胞结合调节、细胞代谢调节等。在一个说明性实施方案中，本发明HRS剪接变异体多肽是至少包含HRS的WHEP结构域，如人类全长HRS蛋白质的第3-43位氨基酸残基，的HRS片段。在另一个实施方案中， 本发明HRS剪接变异体多肽是至少包含HRS的反密码子结合结构域，如人类全长HRS蛋白质的第406-501位氨基酸残基的HRS片段。在又一个实施方案中，HRS剪接变异体多肽是缺失功能性氨酰化结构域，如人类全长HRS蛋白质的第M-398位氨基酸残基的HRS片段。 在一个更具体的实施方案中，HRS剪接变异体多肽至少包含WHEP结构域和反密码子结合结构域，但缺失功能性氨酰化结构域。在一个更具体的实施方案中，本发明HRS多肽包含SEQ ID NO 6、9或11中公布的序列，或者是SEQ ID NO 6、9或11所示序列或是的SEQ ID NO 6、9或11所示多肽的连续片段。需要说明的是，所述片段实质上可以基本上是任意长度的，只要其保留至少一种感兴趣的非经典生物活性。例如，如本文进一步所述，这样的片段可以包含SEQ ID NO 6、9或11 的至少约5、10、15、20、25、50、75、80或更多个连续氨基酸残基。在本发明的其他实施方案中，HRS多肽包含SEQ ID NOs :6、9或11所示序列的活性变异体(即保留至少一个感兴趣的非经典生物活性)。在一个更具体的实施方案中，活性变异体是一种沿着其长度与SEQ ID NO 6、9或11所示序列具有至少70%、80%、90%、95% 或99%同一性的多肽。在另一个具体实施方案中，本发明HRS多肽不是由全长人类HRS蛋白第1_48位残基组成的多肽。根据本发明的另一个方面，提供了至少包含至少一个本文所述的HRS多肽和一个异源融合伴侣的融合蛋白。根据本发明的另一个方面，提供了编码本文所述多肽和融合蛋白的分离的多核苷酸，以及包含这种多核苷酸的表达载体和包含这种表达载体的宿主细胞。此外，还包括与 HRS多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸，如SEQ ID N0:5、8或10的多核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸为引物、探针或反义寡核苷酸。其他实施方案涉及靶向HRS多核苷酸的RNAi剂(RNAi agents) 0在某些实施方案中，寡核苷酸或RNAi剂与HRS剪接变异体特有的剪接点特异性地杂交，或靶向所述剪接点。根据本发明的另一个方面，提供了对本发明HRS剪接变异体多肽(例如，SEQ ID N0:6、9或11)具有结合特异性的结合剂(例如，抗体和其抗原结合片段)，或其细胞结合伴侣之一。在某些实施方案中，所述结合剂为抗体、所述抗体的抗原结合片段、肽、肽模拟物、 小分子或适体。在一些实施方案中，所述结合剂拮抗HRS多肽的非经典活性。在其他实施方案中，所述结合剂促进HRS多肽的非经典活性。根据本发明的又一个方面，提供了包含生理上可接受的载体和至少一个本文所述的本发明的分离的多肽、融合蛋白、抗体、分离的多核苷酸、表达载体、宿主细胞等的组合物，如药物组合物。此外，还包括确定样品中HRS剪接变异体的多核苷酸序列的存在或水平的方法， 所述方法包括使样品接触与SEQ ID NO :5、8或10所示的HRS剪接变异体特异性杂交的一种或更多种寡核苷酸，检测样品中寡核苷酸存在与否，并由此确定HRS剪接变异体的多核苷酸序列的存在或水平。还提供了确定样品中HRS剪接变异体的多核苷酸序列存在或水平的方法，包括使样品与至少两种特异性扩增SEQ ID NOs :5、8或10所示的HRS剪接变异体的寡核苷酸接触，进行扩增反应，检测扩增产物存在与否，并由此确定HRS剪接变异体的多核苷酸序列的存在或水平。在一些实施方案中，寡核苷酸与HRS剪接变异体特有的剪接点特异性地结合， 或特异性地扩增所述剪接点。某些实施方案包括将HRS剪接变异体的存在或水平与对照样品或预定值比较。具体实施方案包括表征样品的状态，使其区分于对照。在具体实施方案中，所述样品和对照包括细胞或组织，所述方法包括区分不同种类的细胞或组织、不同组织或器官的细胞、不同细胞发育状态的细胞、不同细胞分化状态的细胞或健康和病变细胞。还包括鉴定与SEQ ID NOs :6、9或11所示的HRS剪接变异体多肽或一种或更多种 HRS剪接变异体多肽的细胞结合伴侣特异性结合的化合物的方法，其包括a)使HRS多肽或其细胞结合伴侣或这两者与至少一种测试化合物在适当条件下结合，和b)检测HRS多肽或其细胞结合伴侣或这两者与所述测试化合物的结合，从而鉴定与HRS多肽或其细胞结合伴侣或这两者特异性结合的化合物。在某些实施方案中，所述测试化合物为多肽或肽、抗体或抗体的抗原结合片段、肽模拟物或小分子。在一些实施方案中，测试化合物促进HRS多肽或其细胞结合伴侣的非经典生物活性。在其他实施方案中，测试化合物拮抗HRS多肽或其细胞结合伴侣的非经典生物活性。此外，还包括由本文所提供的任意方法所识别的化合物。在其他方面，本发明还提供了通过使细胞或组织与本文所述的本发明组合物接触而调节细胞活性的方法。例如，在某些实施方案中，待调节的细胞活性选自细胞因子产生、 细胞增殖、凋亡、细胞信号传导、细胞代谢、血管生成、细胞迁移、细胞结合等。在一个具体实施方案中，所述方法是调节细胞因子产生的方法。在一个更具体的实施方案中，所述方法是调节IL-2产生和/或分泌的方法。在一些实施方案中，所述方法是调节TNF-α产生和/ 或分泌的方法。在其他实施方案中，所述方法是调节MIPl-α产生和/或分泌的方法。在某些实施方案中，所述细胞活性为细胞因子受体活性。在具体的实施方案中，所述细胞因子受体是CCR1。在某些实施方案中，所述细胞活性为细胞迁移。一些实施方案包括减少单核细胞的细胞迁移。在某些实施方案中，所述细胞活性为通过Toll样受体(TLR)的细胞信号传导。在其他方面，本发明提供了通过给予本发明的组合物而治疗有需要的个体的疾病、病症或其他状况的方法。举例来说，这类疾病、病症或状况可以包括，但不仅限于，癌症、 炎性疾病、免疫疾病(包括自身免疫疾病)和/或与异常血管生成相关的状况。在某些实施方案中，所述状况是神经系统状况。在具体实施方案中，神经系统状况与6-羟基多巴胺(6-0HDA)诱导的神经元死亡相关。在某些实施方案中，所述状况是炎性疾病。在具体的实施方案中，所述炎性疾病是关节炎性痛风或炎性肠疾病。还在其他方面，本发明的多肽、抗体和/或其他组合物实质上可用于本领域内已知及可用的任何类型的筛选试验。例如，本发明的组合物(例如，多肽、多核苷酸和/或抗体)实质上可以与任何已知的筛选方法结合使用，以鉴定顺应本发明疗法的合适的细胞类型和/或疾病状况。在其他实例中，本发明的组合物(例如，多肽、多核苷酸和/或抗体) 可以与已知的筛选方法结合使用，以鉴定直接或间接介导或调节本文组合物的非经典活性的结合伴侣、竞争性抑制剂和/或其他细胞效应子。例如，在具体的实施例中，提供了鉴定测试化合物的筛选方法，所述测试化合物作为本发明组合物与所述组合物的受调节的结合伴侣、细胞效应子和/或细胞类型中的一种或更多种相互作用的抑制剂或增效剂。例如，这种方法可以包括下列步骤形成反应混合物，所述反应混合物包括(i)本发明的组合物， ( )已知被所述组合物调节的结合伴侣、细胞效应子和/或细胞类型，(iii)测试化合物； 以及检测测试化合物与结合伴侣、细胞效应子和/或细胞类型的相互作用。相对于不存在所述测试化合物时的相互作用，存在所述测试化合物时，所述活性或调节发生统计学上显著的变化(增强或抑制)，表明所述测试化合物为潜在的活性激动剂(模拟物或增强剂)或拮抗剂(抑制剂)。序列标示符的简要说明SEQIDNO1是引物序列(HRS-BPF)。
SEQIDNO2是引物序列(HRS-PlR)。
SEQIDNO3是HRS基因(NM_002109. 3)的核酸序列。
SEQIDNO:4是全长HRS蛋白(NP_002100.幻的氨基酸序列。
SEQIDNO5是HRS-SV9剪接变异体的核酸编码序列。
SEQIDNO6是由SEQ ID NO 5编码的HRS-SV9剪接变异体多肽的氨基酸序列。
SEQIDNO7是引物序列(HRS-3’ -UTR)。
SEQIDNO:8是HRS-SVll剪接变异体的核酸编码序列。
SEQIDNO9是由SEQ ID NO 8编码的HRS-SVll剪接变异体多肽的氨基酸序列。
SEQIDNO10是HRS-SV14剪接变异体的核酸编码序列。
石11SEQIDNO11是由SEQ ID NO 10编码的HRS-SV14剪接变异体多肽的氨基酸序夕IJ O
SEQIDNO:12是引物序列(hsHl-E2Fl)。
SEQIDNO:13 是引物序列(hsHl-E13Rl)。
SEQIDNO:14 是引物序列(rnHl-E02Fl)。
SEQIDNO:15 是引物序列(rnHl-E12J13R2)。
SEQIDNO:16是苏门达腊猩猩(Pongo abelii)(猩猩)HRS的第112-171位氨基酸。SEQ ID NO 17 是牛 HRS 的第 112-171 位氨基酸。SEQ ID NO 18是小鼠HRS的第112-171位氨基酸。SEQ ID NO 19 是金黄地鼠(Mesocricetus auratus)(金仓鼠)HRS 的第 112-171
位氨基酸。SEQ ID NO 20 是红鳍东方飩(Fugu rubripes)(日本河豚)HRS 的第 112-166 位
氨基酸。SEQ ID NO :21 是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)HRS 的第 112-167 位
氨基酸。SEQ ID NO :22 是盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)HRS 的第 112-169 位
氨基酸。SEQ ID NO :23 是粳稻(Oryza sativa subsp. japonica)(水稻)HRS 的第 112-167
位氨基酸。SEQ ID NO 24是人HRS外显子3和外显子4的部分编码序列。SEQ ID NO 25是人HRS外显子3和外显子4的部分氨基酸序列。SEQ ID NO 26是人HRS外显子3和外显子4的部分编码序列。SEQ ID NO 27是人HRS外显子10和外显子11的部分编码序列。SEQ ID NO 28是人HRS外显子10和外显子11的部分氨基酸序列。SEQ ID NO :29 是 HRS-SV11 的第 112-171 位氨基酸。附图简要说明图IA-B显示从人类骨骼肌文库中识别HRS-SV9剪接变异体。图IA显示HRS基因的mRNA转录本和PCR反应引物位置(BPF 正向引物，P4R 反向引物)的图解。图IB显示人类骨骼肌、IMR32细胞和HEK293T细胞的PCR反应产物的凝胶照片。上面的箭头指向从 HRS-SV9转录本扩增的DNA片段。下面的箭头指向从HRS参考序列扩增的DNA片段。图2A-C显示从IMR32细胞库和来自人脑的样品中识别HRS-SVll剪接变异体。 图2A显示HRS基因的mRNA转录本和PCR反应引物位置(BPF 正向引物，HRS-3‘ UTR 反向引物)的图解。图2B显示IMR32细胞的PCR反应产物的凝胶照片。下面的箭头指向从 HRS-SVll转录本扩增的DNA片段。上面的箭头指向从HRS参考序列扩增的DNA片段。图 2C显示在人脑组织中识别的HRS-SVll剪接变异体转录本。图 3A-D 显示野生型全长 HRS(HRS-ref)、HRS-SV9、HRS_SV11 和 HRS-SV14 的 mRNA 转录本和蛋白质序列。图3A显示mRNA转录本的图解，其表明HRS-SV9具有从内含子2开始的插入，且HRS-SVll缺失外显子3至外显子10。图:3B显示mRNA转录本编码的蛋白质的结构信息，其表明HRS-SV9仅具有HRS的前60位氨基酸，包括完整的WHEP结构域，而HRS-SVll 缺失了整个氨酰化结构域，只留下WHEP结构域和反密码子结构域。图3C和图3D分别显示 HRS-SV9、HRS-SVll和HRS-SV14的核酸编码序列(SEQ ID NO :5、8和10)及编码的蛋白质序列(SEQ ID NO :6、9 和 11)。图4A-B显示在大鼠胫骨肌(Tib)、比目鱼肌(Sol)、C2C12肌管(C2)、成年大鼠脑 (Br)和HEK293T细胞Q93T)中使用抗-HRS抗体进行免疫印迹的结果。图4A显示使用 N-末端HRS抗体(抗第1-97位氨基酸)的免疫印迹。图4A上面的箭头显示参考条带。图
94A中下面的箭头指向的条带，其大小与HRS-SVll剪接变异体多肽的预测大小一致。图4B 显示使用C-末端HRS抗体(抗靠近C-末端的50-200位氨基酸)的免疫印迹。上面的箭头指向参考蛋白，而下面的箭头指向的条带，其大小与使用N-末端抗体所观察的条带大小相似。图5A-C显示使用N-末端HRS单克隆抗体(制备来抗野生型人HRS蛋白第1_97 位氨基酸)的免疫沉淀实验。图5A显示HEK293T细胞、C2C12成肌细胞(MB)和C2C12肌管(MT)的结果；下面的箭头指向的条带，其大小与HRS-SV9剪接变异体多肽的预测大小一致。图5B-C显示过量表达myc标记的HRS-SVll的IMR32和HEK293T细胞的全细胞裂解物的结果；用N-末端HRS mAb进行所述细胞的免疫印迹(图5B)，或用多克隆HRS抗体(制备来抗野生型人HRS蛋白C-末端)进行免疫印迹(图5C)。在IMR32细胞裂解物中使用两种抗体均检测到一蛋白质条带(B和C中下面的箭头)，其迁移比myc标记的HRS-SVll蛋白稍快，可能是HRS-SVll蛋白。图6A-C显示HRS、HRS-SV9和HRS-SVll在HEK293T细胞中重组产生后的分泌情况。 野生型全长HRS (HRS-Ref)、HRS-SV9和HRS-SVll在HEI^93T细胞中强烈表达。图6A即上面的图面(panel)，显示指向在全细胞裂解物(TCL)中过量表达的蛋白质的箭头。图6B下面的图面显示，在培养基部分中，所有三种蛋白质均被检测出。HRS-Ref以抗Myc抗体探测， 而HRS-SV9和HRS-SVl 1以抗HRS (N-末端)抗体探测。TCL中的微管蛋白印迹显示相同的装载，而培养基部分的微管蛋白印迹显示泄漏对照(leaky control) 0图6C表明，当EGFP 在HEK293T细胞中过量表达时，不会被分泌，如培养基部分中不存在EGFP条带(约35kDa) 所示。图7显示重组HRS-SV9和HRS-SV11剪接变异体多肽在激活的Jurkat T细胞中增强IL-2分泌。在存在或不存在HRS-SV9或HRS-SVll的情况下，细胞经PMA(25ng/ml)和离子霉素O50ng/ml)处理48小时后，用ELISA分析培养基。图8显示HRS-SV9刺激PBMC (外周血单核细胞)释放TNF α到培养上清中。使用 LPS作为阳性对照。图9显示HRS-SV11保护培养的皮层神经元和PC12细胞抗神经毒素6-0HDA。 图9A显示，用HRS-SVll预处理大鼠皮层神经元显著减少由25 μ M 6-0HDA诱导的皮层神经元死亡，其细胞生存力用MTT试验测量。HRS-SVll还有效地保护PC12细胞不会因 6-0HDA(200 μ Μ)诱导而死亡，如MTT试验(图9Β)和LDH试验(图9C)所示。如图9D所示，HRS-SVll的保护作用是一种急性效应，短时间预处理即可实现与M小时预处理类似的保护作用。数据为三个独立实验的平均值士标准差(S.D.)。叔丁基对苯二酚(tBHQ)和 Triton X-100 (简写为Triton) (2% )分别为MTT试验和LDH试验(B、C)的阳性对照。*p < 0. 05，**p < 0· 01。

图10显示HRS-SVll不能保护神经元免受β -淀粉样蛋白、谷氨酸单钠(MSG)和 MPP+诱导的毒性的侵袭。图IOA显示用β -淀粉样蛋白(1-42) (Αβ 42)聚集体孵育M小时的结果，所述聚集体以剂量依赖的方式诱导皮层神经元死亡。图IOB显示，经MTT试验测定，用InM至ΙμΜ 的HRS-SVll预处理皮层神经元M小时没有保护作用。图IOC显示，经测量LDH释放，谷氨酸单钠(MSG)以剂量依赖的方式诱导皮层神经元死亡，图IOD显示，HRS-SVll没有抗谷氨酸单钠导致的毒性的有益效果；作为阳性对照的10 μ M美金刚(memantine)显著防止神经元死亡。图IOE显示，经MTT试验测定，MPP+以剂量依赖的方式诱导PC12细胞死亡，图IOF 则显示，经M小时预处理后，HRS-SVll不保护PC12细胞免受MPP+胁迫。数据为三个独立实验的平均值士 S.D.。图11显示HRS-SVll不利用细胞外机制保护神经元免受6-0HDA的侵袭。如图 IlA所示，添加HRS-SVll没有抑制对苯醌的聚集，而已知的抗氧化剂维生素C则抑制对苯醌聚集。图IlB显示过氧化氢(H2O2)以剂量依赖的方式诱导皮层神经元死亡，图IlC显示 HRS-SVll预处理没有保护这些神经元免于死亡。如图IlD所示，用HRS-SVll预处理皮层神经元减少由6-0HDA攻击所造成的神经元死亡，但HRS-SVl 1和6-0HDA的联合应用没有保护作用。在6-0HDA应用前，在HRS-SVll预处理后洗涤和更新培养基不影响HRS-SVll的保护作用(参见图11E)。数据为三个独立实验的平均值士S. D.。< 0. 05，**p < 0. 01。图12显示HRS-SVll防止PC12细胞中6-0HDA诱导的DNA片段化。通过Hoechst 33258染色检查PC12细胞的凋亡。图12A显示经缓冲液对照单独处理的PC12细胞；图12B 显示用6-0HDA(200 μ Μ)处理8小时；图12C显示用HRS-SVll (500ηΜ)预处理24小时，接着用6-0HDAO00yM)攻击8小时。如图12D所示，通过计数凋亡细胞的数量(以片段化细胞核的存在为特征)，表明用ΙμΜ HRS-SVll预处理大大降低了凋亡细胞的数量。图13显示HRS-SVll C-末端的半胱氨酸(Cys)残基的突变消除了所述保护功能。 图 13Α 显示，HRS-SVll (SEQ ID NO 29)包含三个 Cys 残基(C117、C169 和 C171)。其中，如多种 HRS 序歹Ij (SEQ ID NO 16 M SEQ ID NO 24 和 SEQ ID NO 29)的第 112 位氨基酸至约 171位氨基酸的比对所示，C117和C171(图13A，箭头所示)是在不同物种中高度保守的。如图1 所示，C2S(C169和C171突变成丝氨酸残基)和delC(缺失末尾的3位氨基酸，包括 C169和C171)突变体多为单体，而Cl 17S突变体多为二聚体。野生型HRS-SVll在单体和二聚体之间有一个峰，表明这两种形式之间有非常动态的转换。如图13C所示，C169和C171突变成丝氨酸残基(HRS-SV11_C2Q或缺失末尾的三位氨基酸(包括C169和C171 (HRS_SV11_ delC))，消除了 HRS-SVll的神经保护功能，这提示这些半胱氨酸的关键作用。、< 0.01。图14显示，抑制JAK2、JNK和p38抑制了 HRS-SVll的神经保护作用。如图14A-B 所示，HRS-SVll在PC12细胞中的神经保护作用可通过10 μ M SB202190对JNK和10 μ M SP600125对ρ38的共同抑制作用而被抑制(图14Α)，或通过40 μ M AG490抑制JAK2而被抑制(图14Β)。图14Β还显示，HRS-SVll的神经保护作用并没有经由U73122抑制磷脂酶 C(PLC)或牛蒡甙元抑制MKK而被抑制。图14C和图14D显示，皮层神经元有类似的观察结果。数据为三个独立实验的平均值士S. D.。< 0. 05，**ρ < 0.01ο图15显示，HRS-SVll结合到表达CCR5的ΗΕΚ293Τ细胞上，但没有结合到表达CCRl 的细胞或未转染的细胞上。如图15Α和图15Β所示，HRS-SVll不结合ΗΕΚ293Τ细胞(图 15Α)，但结合表达CCR5的ΗΕΚ293Τ细胞(图15Β)。如图15C所示，用Met-RANTES预处理细胞不影响HRS-SVll与表达CCR-5的细胞的结合。图15D显示，由于在表达CCRl的细胞上没有观察到结合，因而这种结合是CCR5特异性的。对照细胞仅用FITC-His抗体进行孵育。图16显示HRS-SV14剪接变异体的识别和HRS-SV14的神经保护作用。图16Α显示在人胎儿脑cDNA中的人HRS新的剪接变异体(箭头所示)的识别。如图16A和图16B 所示，克隆和测序揭示，该HRS剪接变异体由野生型HRS转录本的外显子4至外显子10的跳跃而产生(SEQ ID NO 24至SEQ ID NO 28按从图16B的上部到下部排列)。在蛋白质水平，预测HRS-SV14蛋白包含WHEP结构域、反密码子结合结构域和氨酰化结构域的第一个基序(见图16C)。图16D显示，预处理M小时后，HRS-SV14保护PC12细胞免于6-OHDA诱导的神经元死亡；所述效果与HRS-SVll相当。数据为三个独立实验的平均值士S. D.。Y < 0. 05。图17显示在不同组织和细胞系中检测HRS-SVll和SV14转录本。此图显示位于 HARS外显子2和外显子12侧翼的PCR产物的电泳结果，所述HARS来自成人大脑、胎儿大脑、肺、骨骼肌组织和IMR32、Jurkat和THP-I细胞的cDNA。如水平箭头所示，HRS-SVll存在于除胎儿大脑以外的所有样品中。如斜箭头所示，在人类胎儿大脑、肺、骨骼肌、Jurkat细胞和THP-I细胞中检测到HRS-SV14。图18显示HRS-SVll重组蛋白的保护作用并非来自于非蛋白污染物。图18A显示重组HRS-SVll蛋白制剂在进行或不进行蛋白酶K消化的情况下的考马斯亮蓝染色结果； 与未经处理的HRS-SVll制剂(箭头指示HRS-SVll重组蛋白)相比，在蛋白酶K处理的 HRS-SVll制剂中，没有检测到可见的蛋白质条带。如图18B和图18C所示，用蛋白酶K消化的HRS-SVll预处理皮层神经元(图18B)和PC12细胞(图18C)，消除了其抗6-0HDA的保护作用。tBHQ作为阳性对照。NS表示无显著性。数据为三个独立实验的平均值士S. D.。 *p < 0. 05，**p < 0· 01。图19显示，SV9抑制单核细胞(THP-1细胞)向CCL5的迁移。图20显示，SV9抑制THP-I细胞向CCL-23的CCRl介导的迁移。图21显示，SV9激活巨噬细胞TLRs。LPS为阳性对照。图 22A 和图 22B 显示，SV9 激活 TLR2 (22A)和 TLR4 (22B)，但优先激活 TLR4。图23显示，SV9刺激单核细胞(THP-I)中MIP-I α的分泌。发明的详细描述除非另有专门说明，本发明的实施将采用本领域内分子生物学和重组DNA技术的常规方法，下面介绍其中的很多方法以供说明。这些技术在文献中都进行了充分说明。参见，例如，Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验指南)2nd Edition，1989(第二版，1989 年)；Maniatis et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验指南)(1982 年)；DNA Cloning :A Practical Approach (DNA 克隆实践指南)，Vol. I & II (D. Glover ed.) ；Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)(N. Gait ed.，1984) ；Nucleic Acid Hybridization (核酸杂交)(B. Hames & S. Higgins ed, 1985) ；Transcription and Translation (转录禾口番羽译) (B. Hames & S Higgins ed.，1984) ；Animal Cell Culture (动物细胞培养)(R. Freshney ed. , 1986) ；A Practical Guide to Molecular Cloning (分子克隆实用指南)(B. Perbal ed.，1984)。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容通过引用并入本文。^X除非另有定义，否则，本文所用的所有的技术术语和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然类似于或等同于本文所述方法和材料的任何方法和材料都可用于本发明的实践或测试中，但还是描述了优选的方法和材料。根据本发明的目的，下面定义下列术语。如本说明书和所附权利要求所用的，除非上下文另有明确规定，单数形式“a( — 个)”、“an(—个)”包括复数引用。举例来说，“元件(an element)”是指一个元件或一个以上的元件。“约”是指变化量高达参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的 30%、25%、20%、25%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或的数量、 水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。“激动剂”是指强化或模拟HRS的非经典生物活性的分子。激动剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物、小分子或通过与HRS或其结合伴侣直接相互作用或通过作用于HRS 参与的生物途径的组分而调节HRS活性的任何其他化合物或组合物。包括部分激动剂和完全激动剂。术语“拮抗剂”是指抑制或削弱HRS的非经典生物活性的分子。拮抗剂可以包括诸如抗体的蛋白质、核酸、碳水化合物、小分子或通过与HRS或其结合伴侣直接相互作用或通过作用于HRS参与的生物途径的组分而调节HRS或其结合伴侣活性的任何其他化合物或组合物。包括部分和完全拮抗剂。“编码序列”是指对基因的多肽产物的编码有贡献的任何核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指对基因的多肽产物的编码没有贡献的任何核酸序列。除非上下文另有要求，贯穿本说明书始终，短语“包含(comprise) ”、“包含 (comprises) ”、“包含(comprising) ”应当理解为，意味着包括所述步骤或元件或步骤或元件组，但不排除任何其他步骤或元件或步骤或元件组。“由……组成”是指，包括并限于短语“由……组成”后面的任何内容。因此，短语 “由……组成”表示所列出的元件是必需的或强制性的，不可有其他成分。“基本上由……组成”是指，包括所述短语后所列出的任何元件，并限于不干扰或有助于公开内容中指定的所列元件的活性或作用的其他成分。因此，短语“基本上由……组成”是指，所列元件是必需的或强制性的，但其他成分都是可选的，可以有或没有，取决于它们是否对所列元件的活性或作用有实质影响。本文所用的术语“功能”、“功能性的“等术语是指生物功能、酶促功能或治疗功能。“基因”是占据染色体上的特定位点、由转录和/或翻译调节序列和/或编码区和 /或非翻译序列(即，内含子、5'和3'非编码序列)组成的遗传单位。“同源性”是指相同或构成保守取代的氨基酸的百分比数字。可使用序列比较程序如 GAP(Deveraux et al.，1984，Nucleic Acids Research 12,387-395)确定同源性，该程序通过弓I用并入本文。这样，与本文所弓I用的序列的长度类似或基本上不同的序列，可通过将缺口插入到队列(alignment)中来比较，这些缺口可通过例如GAP使用的比较算法而确定。术语“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，所述单个细胞或细胞培养物可以是或已经是本发明任何重组载体或分离的多核苷酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，因自然、意外或故意突变和/或改变，所述子代可以不必与原亲本细胞完全一致(在形态上或在总DNA补体(complement)上)。宿主细胞包括用本发明重组载体或多核苷酸体内或体外转染或感染的细胞。包含本发明重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。
“分离的”是指材料基本上或实质上不含在其原生状态下通常伴随所述材料的组分。例如，本文所用的“分离的多核苷酸”，包括从序列中纯化的多核苷酸，所述序列在多核苷酸的天然存成的状态下位于所述多核苷酸的侧翼，例如，从序列中去除的DNA片段，所述序列通常与所述DNA片段相邻。或者，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等，包括从其天然细胞环境或与细胞其他组分关联中体外分离和/或纯化的肽或多肽分子；即，所述材料与体内物质不显著关联。本文所用的术语“mRNA”或有时称为的“mRNA转录本”，包括但不限于前体mRNA转录本、转录本加工中间体、用于翻译的成熟的mRNA及一个或多个基因的转录本，或源于所述mRNA转录本的核酸。转录本加工可以包括剪接、编辑和降解。如本申请所用，源于mRNA 转录本的核酸指最终以mRNA转录本或其子序列作为其合成模板的核酸。从mRNA反转录的 cDNA、从所述cDNA转录的RNA、从所述cDNA扩增的DNA、从所述扩增的DNA转录的RNA等， 均源自于mRNA转录本，检测这些衍生产物，可表明样品中原转录本的存在和/或丰度。因此，源自于mRNA的样品包括，但不仅限于，一个或多个基因的mRNA转录本、从mRNA反转录的cDNA、从所述cDNA转录的cRNA、从基因扩增的DNA、从DNA转录的RNA等等。本文所用的“非经典”活性，一般是指本发明HRS多肽所拥有的除氨酰化以外的活性，更具体地说，除将关联氨基酸添加到其关联tRNA分子以外的活性。非经典活性的非限制性实例包括RNA结合、氨基酸结合、细胞增殖调节、细胞迁移调节、细胞分化(如血细胞生成)调节、凋亡或其他形式的细胞死亡调节、细胞信号传导调节、血管生成调节、细胞结合调节、细胞代谢调节、细胞因子产生或细胞因子活性调节、细胞因子受体活性调节、炎症调节等。术语“调节”，包括与对照物相比以统计学上显著的或生理上显著的量“增加”或 “刺激”、以及“减少”或“降低”。通常，“增加的”或“增强的”量，是“统计学上显著的”量， 并且可以包括没有组合物(没有试剂或化合物)或对照组合物所产生的量增加1. 1、1. 2、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或以上倍数(如，500、1000倍)(包括大于1的所有整数和其间的小数点，如1.5、1.6、1.7、1.8等)。通常，“减少的”或“降低的”量为“统计学上显著的”量，可以包括没有组合物(没有试剂或化合物)或对照组合物所产生的量减少1%、 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18%, 19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%, 75%,80%,85%, 90%、95%、或100%，包括其间的所有整数。本文还描述了“统计学上显著”的量的其他实例。“获得自，，是指，样品例如多核苷酸提取物或多肽提取物是分离或源自个体的特定来源。例如，可以从直接分离自个体的组织或生物流体获得提取物。“源自”或“获得自”也可以指多肽或多核苷酸序列的来源。例如，本发明的HRS序列可以“源自”于HRS蛋白水解片段或HRS剪接变异体的序列信息或其中的部分，无论是天然存在还是人工产生的，因此， HRS序列可包含该序列，或基本上由该序列组成，或由该序列组成。如本文所用的“序列同一性”或例如包括“序列与……具有50%的同一性”，是指在以核苷酸对核苷酸为基础或氨基酸对氨基酸为基础的比较窗口中，序列的同一性程度。 因此，“序列同一性百分比”可以通过下列步骤计算在比较窗口中，比较两个最佳比对的序列，确定位置数，在所述位置上，相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基
14(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、lie、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、 Gin、Cys和Met)在两种序列中均存在，从而得到匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口内的总位置数(即窗口大小)，并将结果乘以100，得到序列相同性的百分数。本文所用的“剪接点”包括在成熟mRNA转录本或编码的多肽的区域，在所述区域， 第一个外显子的3’端和第二个外显子5’端相连。所述区域的大小可以不同，并可以包括 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、95、100或更多(包括其间的所有整数)个在提取物残基任一侧的核苷酸或氨基酸残基，其中，一个外显子的3’端和另一个外显子的5’端相连。“外显子”是指，通过顺式剪接去除前体RNA的任一部分(内含子)或通过反式剪接连接两个或更多个前体 RNA分子后，RNA分子成熟形式所代表的核酸序列。成熟RNA分子可以是信使RNA或非编码 RNA如rRNA或tRNA的功能形式。根据上下文，外显子可以指DNA或其RNA转录本中的序列。“内含子”是指基因内的不翻译成蛋白质的非编码核酸区域。非编码内含子部分转录为前体mRNA (前体RNA (pre-mRNA))和一些其他的RNA (如长非编码RNA)，随后在加工为成熟 RNA的过程中通过剪接而去除。“剪接变异体”是指经可选剪接而产生的成熟mRNA及其编码的蛋白质，通过所述可选剪接，RNA (初级基因转录本或前体mRNA)的外显子在RNA剪接过程中以多种方式重新连接。由此产生的不同mRNA可以被翻译成不同的蛋白同种型，从而使单个基因编码多种蛋白质。本文所用的“个体”，包括表现出症状或有表现出症状风险的任何动物，所述动物可以使用本发明HRS多核苷酸或多肽治疗或诊断。合适的个体(患者)包括实验动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(如猫或狗)。包括非人类灵长类动物，优选人类患者。本文所用的“治疗(treatment) ”或“治疗(treating) ”，包括对疾病或状况的症状或病理的任何期望的效果，所述效果可以通过如本文所述的HRS多核苷酸或多肽的非经典活性影响实现，甚至可以包括在一个或多个正在接受治疗的疾病或状况的可测量标记物的极小变化或改善。此外，还包括涉及非HRS疗法的治疗，在所述治疗中，本文所述的HRS序列提供临床治疗标记物。“治疗”并不一定表示疾病或状况或其相关症状的彻底根除或治愈。接受这种治疗的个体是任何需要治疗的个体。临床改善的示例性标记物对本领域内技术人员来说是显而易见。“载体”或“核酸构建体”是指多核苷酸分子，优选源自于例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子，在其中可以插入或克隆入多核苷酸。优选地，载体含有一个或更多个独特的限制位点，并能够在限定的宿主细胞包括靶细胞或组织或其祖细胞或组织中自主复制， 或能够与限定宿主的基因组整合，这样，克隆的序列可以复制。因此，所述载体可以是可自主复制载体，即作为染色体外的实体存在的载体，所述载体的复制不依赖于染色体复制，例如，线性或闭环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有保证自我复制的任何手段。或者，所述载体可以是一个导入宿主细胞时被整合到基因组中并与整合所述载体的染色体一同复制的载体。术语“野生型”和“天然存在的”可互换使用，指基因或基因产物，所述基因或基因产物从天然存在的来源分离时，具有该基因或基因产物的特性。野生型基因或基因产物(如多肽)是群体中最频繁观察到的基因或基因产物，因此，“正常”或“野生型”基因形式是任意设计的。HRS翦接变异体多肽如上所述，根据本发明的一个方面，提供了具有与治疗相关的非经典活性的 HRS “剪接变异体”多肽，以及包含所述多肽的组合物。在本文中术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用，指氨基酸残基的聚合物， 及其变异体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，在所述氨基酸聚合物中， 一个或更多个氨基酸残基是人工合成的非天然存在的氨基酸，如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，还适用于天然存在的氨基酸聚合物。多肽没有特别的长度限定，但是，在本发明的上下文中，通常表示全长蛋白质的片段，可以包括翻译后修饰，例如糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等，以及本领域内已知的其他修饰，可以是天然存在的，也可以是非天然存在的。本发明多肽和蛋白质可以使用任何一种众所周知的重组和/或合成技术制备，下面进一步讨论其说明性实例。提到“多肽变异体”是指，通过添加、缺失和/或取代至少一个氨基酸残基而区别于参考HRS剪接变异体多肽(例如，SEQ ID NO :6,9,11)的多肽，其通常保留参考HRS剪接变异体多肽的非经典活性。在某些实施方案中，多肽变异体通过一个或多个取代而区别于参考多肽，如本申请所述以及本领域公知的，所述取代可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，多肽变异体包括保守取代，在这点上，本领域公知，一些氨基酸可以变为具有大致相似特性但未改变多肽活性本质的其他氨基酸。在某些实施方案中，多肽变异体包括与本文所述HRS参考多肽的相应序列具有至少约 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96^^97^^98%或更高同一性或相似性的氨基酸序列，并保留了所述参考多肽的非经典活性。此外，还包括通过添加、缺失或取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150 或更多个氨基酸而区别于参考HRS序列，但所述序列保留参考HRS多肽性质的序列。在其他实施方案中，变异体多肽与相应的HRS参考序列相差至少1 %，但低于20 %、15 %、10 %或5 %的残基(如果这种比较需要比对，则所述序列应以最大相似性进行比对。缺失或插入造成的“环出”序列或错配视为差异)。适当地，所述差异是在非必需残基或保守取代上的差异或变化。还包括HRS参考多肽的生物活性“片段”。代表性的生物活性片段通常参与相互作用，例如，分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可以是特异结合相互作用或酶促相互作用。分子间相互作用可以位于HRS多肽和细胞结合伴侣之间，如细胞受体或参与HRS多肽非经典活性的其他宿主分子的相互作用。通常，生物活性片段包含具有HRS参考多肽的至少一种活性的结构域或基序，可以包括各种活性结构域中的一个或更多个(在某些情形下，包括所有)活性结构域，并包括具有非经典活性的片段。在某些情形下，HRS多肽的生物活性片段具有该具体的截短片段所特有的生物活性，这样，全长HRS多肽可能不具有该活性。在某些情形下，生物活性可通过以下方式显示从其他全长HRS多肽序列中分离生物活性HRS多肽，或改变全长HRS野生型多肽序列的某些残基以暴露生物活性结构域。例如，在一个说明性实施方案中，HRS剪接变异体多肽是至少包含HRS的WHEP结构域的HRS片段，或其活性片段或变异体。在另一个说明性实施方案中，多肽是包含HRS的至少反密码子结合结构域的HRS片段，或其活性片段或变异体。在另一个说明性实施方案中，多肽是包含HRS的至少WHEP结构域和反密码子结合结构域的HRS片段。在另一个说明性实施方案中，多肽是缺少氨酰化结构域且基本无氨酰化活性的HRS片段。在一个更具体的实施方案中，HRS剪接变异体多肽是包含SEQ ID NO :6、9或11所示序列的多肽。在另一个实施方案中，HRS剪接变异体多肽是包含SEQ ID N0:6、9或11的活性片段(即基本上保留SEQ ID NO :6、9或11所表现的至少一种非经典活性的SEQ ID NO :6，9或11的片段)的多肽。例如，这种片段可以包含SEQ ID NO :6、9或11的至少约5、 10、15、20、25、50或更多个连续氨基酸残基，以及所有的中间长度。中间长度意在包括其间的所有整数，例如6、7、8等，51、52、53等。此外，这种片段可以包含SEQ ID NO :9的至少约 5、10、15、20、25、50、75、100、125、150个或更多个连续氨基酸残基，以及所有的中间长度。HRS参考多肽的生物活性片段可以是多肽片段，其是例如SEQ ID NO :6、9或11所示氨基酸序列的 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170 或更多个连续或不连续的氨基酸，包括中间的整数。在某些实施方案中，任何HRS参考多肽的C 端或 N 端区可以被截短约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、 90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或更多个氨基酸，包括中间的所有整数和范围 (如101、102、103、104、105)，只要截短的HRS多肽保留参考HRS剪接变异体多肽的非经典活性。适当地，所述生物活性片段具有不低于生物活性(即非经典活性)HRS参考多肽活性的约1^^10^^25%或50%的活性，所述生物活性片段来源于所述HRS参考多肽。在其他说明性实施方案中，SEQ ID NO :6、9或11的HRS片段的长度大小范围可以为约 20-30、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-125、20-150 或 20-175 个氨基酸。在其他实施方案中，所述片段的长度大小范围为约30-40、30-50、30-60、30-70、 30-80、30-90、30-100、30-125、30-150或30-175个氨基酸。在其他实施方案中，所述片段的长度大小范围为约 40-50、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、40-125、40-150 或 40-175 个氨基酸。在另一个说明性实施方案中，所述片段的长度大小范围为约50-60、50-70、50-80、 50-90、50-100、50-125、50-150 或 50-175 个氨基酸。在其他实施方案中，本发明提供了 HRS剪接变异体多肽(例如，SEQ ID NO :6、9或 11)的活性变异体，其中，所述变异体基本上保留了 SEQ ID NO :6、9或11表现出的至少一种非经典活性。SEQ ID NO :6、9或11所示序列的某些说明性变异体，包括沿着其长度与 SEQ ID NO :6、9或 11 具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%95%、 96%、97%、98%或99%同一性(如下所述确定)的变异体。变异体可以通过一个或更多个取代、缺失、添加和/或插入区别于SEQ ID NO :6、 9或11。这些变异体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过使用本领域内众所周知的多种技术中的任何技术修饰SEQ ID NO :6、9或11 (或编码SEQ ID NO :6、9或11的多核苷酸)并评估本文所述的生物活性。在某些实施方案中，变异体会含有保守取代。“保守取代”是这样的一种取代，其中，氨基酸被取代为具有类似性质的另一种氨基酸，这样，肽化学领域内的技术人员会预期所述多肽的二级结构和亲水本质基本上不变。可以修饰本发明多核苷酸和多肽的结构，并
17可仍然获得编码具有期望特性的变异体或衍生多肽的功能性分子。当期望改变多肽的氨基酸序列，从而创造一个相当的甚至改进的本发明HRS剪接变异体多肽的变异体时，本领域内技术人员，例如，可以根据表1，改变编码DNA序列的一个或更多个密码子。在蛋白质结构中，某些氨基酸可以被取代为其他氨基酸，而与例如抗体的抗原结合区或底物分子的结合位点等结构的相互作用结合能力没有可感知的损失。由于蛋白质的相互作用能力和本质通常限定该蛋白质的生物功能活性，因此，可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸序列的取代，当然，也可以对其基本的DNA编码序列进行取代，仍然获得具有类似性质的蛋白质。因此，考虑可以在所公开的组合物的多肽序列或编码所述多肽的相应DNA 序列中进行各种变化，而不明显损失其期望的效用或活性。表 权利要求
1.具有非经典生物活性的分离的组氨酰-tRNA合成酶(HRS)剪接变异体多肽，或其活性片段或变异体。
2.根据权利要求1所述的分离的组氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述多肽包含至少 HRS的WHEP结构域。
3.根据权利要求1所述的分离的组氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述多肽包含至少 HRS的反密码子结合结构域。
4.根据权利要求1所述的分离的组氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述多肽缺少功能性氨酰化结构域。
5.根据权利要求1所述的分离的组氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述多肽包含至少 HRS的WHEP结构域和HRS的反密码子结合结构域，但是缺少功能性氨酰化结构域。
6.根据权利要求1所述的分离的组氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :6、9或11所示的序列。
7.根据权利要求1所述的分离的组氨酰-tRNA合成酶多肽，其所述其活性变异体是与 SEQ ID NO :6、9或11所示的序列具有至少90%同一性的多肽。
8.根据权利要求1所述的分离的组氨酰-tRNA合成酶多肽，其所述其活性片段包含SEQ ID NO :6、9或11所示序列的至少20个连续氨基酸残基。
9.根据权利要求1所述的分离的组氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述非经典生物活性选自RNA结合、氨基酸结合、细胞增殖调节、细胞迁移调节、细胞分化调节、凋亡或细胞死亡调节、细胞信号传导调节、血管生成调节、细胞结合调节、细胞代谢调节、细胞因子产生或细胞因子活性调节、细胞因子受体活性调节和炎症调节。
10.融合多肽，其包含如权利要求1-9中任一权利要求所述的多肽和异源融合伴侣。
11.二聚或多聚复合物，其包含至少一种权利要求1所述的分离的多肽。
12.分离的多核苷酸，其编码权利要求1-10中任一权利要求所述的多肽。
13.根据权利要求12所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID NO :5、8 或10所示的序列，或其补体。
14.表达载体，其包含权利要求13所述的分离的多核苷酸。
15.宿主细胞，其包含权利要求14所述的表达载体。
16.与SEQID NO :5、8或10的多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸。
17.根据权利要求16所述的寡核苷酸，其选自引物、探针和反义寡核苷酸。
18.结合剂，其对于权利要求1所述的分离的HRS多肽、所述HRS多肽的细胞结合伴侣或两者都表现出结合特异性。
19.根据权利要求18所述的结合剂，其选自抗体、所述抗体的抗原结合片段、肽、肽模拟物、小分子和适体。
20.根据权利要求18所述的结合剂，其中所述结合剂拮抗所述HRS多肽的非经典活性。
21.根据权利要求18所述的结合剂，其中所述结合剂促进所述HRS多肽的非经典活性。
22.确定样品中组氨酰-tRNA合成酶(HRQ剪接变异体的多核苷酸序列的存在或水平的方法，包括使所述样品接触与SEQ ID NO :5、8或10所示的HRS剪接变异体特异性杂交的一种或更多种寡核苷酸，检测样品中寡核苷酸存在与否，并由此确定所述HRS剪接变异体的多核苷酸序列的存在或水平。
23.确定样品中组氨酰-tRNA合成酶(HRQ剪接变异体的多核苷酸序列的存在或水平的方法，包括使所述样品与至少两种特异性扩增SEQ ID NO :5、8或10所示的HRS剪接变异体的寡核苷酸接触，进行扩增反应，检测扩增产物存在与否，并由此确定所述HRS剪接变异体的多核苷酸序列的存在或水平。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述HRS剪接变异体特有的剪接点特异性杂交或者特异性扩增所述剪接点。
25.根据权利要求22或23所述的方法，包括将所述HRS剪接变异体的存在或水平与对照样品或预定值比较。
26.根据权利要求25所述的方法，其包括表征所述样品的状态以区分所述样品和所述对照。
27.根据权利要求沈所述的方法，其中所述样品和对照包含细胞或组织，且所述方法包括区分不同种类的细胞或组织，不同组织或器官的细胞、处于不同细胞发育状态的细胞、 处于不同细胞分化状态的细胞或者健康细胞和病变细胞。
28.鉴定与SEQID NO :6、9或11所示的组氨酰-tRNA合成酶(HRS)剪接变异体多肽或其一种或更多种细胞结合伴侣特异性结合的化合物的方法，其包括a)在合适的条件下使所述HRS多肽或其细胞结合伴侣或两者与至少一种测试化合物结合，和b)检测所述HRS 多肽或其细胞结合伴侣或两者与所述测试化合物的结合，从而鉴定与所述HRS多肽或其细胞结合伴侣或两者特异性结合的化合物。
29.根据权利要求观所述的方法，其中所述测试化合物为多肽或肽、抗体或其抗原结合片段、肽模拟物或小分子。
30.根据权利要求观所述的方法，其中所述测试化合物促进所述HRS多肽或其细胞结合伴侣的非经典生物活性。
31.根据权利要求观所述的方法，其中所述测试化合物拮抗所述HRS多肽或其细胞结合伴侣的非经典生物活性。
32.根据权利要求观-31中任一权利要求所述的方法鉴定的化合物。
33.药物组合物，其包含生理上可接受的载体以及至少一种组分，所述组分选自(i) 权利要求1所述的分离多肽；(ii)权利要求10所述的融合蛋白；(iii)权利要求11所述的二聚复合物或多聚复合物；(iv)权利要求12所述的分离的多核苷酸；(V)权利要求13 所述的表达载体；(vi)权利要求16所述的寡核苷酸；(vii)权利要求18所述的结合剂；和 (viii)权利要求32所述的化合物。
34.调节细胞活性的方法，其包括使细胞或组织与权利要求33所述的组合物接触。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述细胞活性选自细胞增殖、细胞迁移、细胞分化、凋亡或细胞死亡、细胞信号传导、血管生成、细胞结合、代谢、细胞因子产生或活性、细胞因子受体活性和炎症。
36.根据权利要求37所述的方法，其中所述细胞活性为细胞因子产生或分泌。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞因子为IL-2、TNF_α或ΜΙΡΙ-α中的任一种或更多种。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述细胞活性为细胞因子受体活性。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述细胞因子受体为CCRl。
40.根据权利要求35所述的方法，其中所述细胞活性为细胞迁移。
41.根据权利要求40所述的方法，其包括减少单核细胞的细胞迁移。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞活性为通过Toll样受体(TLR)的细胞信号传导。
43.根据权利要求35所述的方法，其中所述细胞在个体内。
44.治疗状况的方法，其包括给予有需要的个体权利要求33所述的药物组合物，其中所述状况选自炎性疾病、自身免疫疾病、肿瘤性疾病、代谢性疾病、神经疾病、感染、心血管疾病、与异常血管发生相关的疾病和与异常细胞存活相关的疾病。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述状况为神经疾病。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述神经疾病与6-羟基多巴胺(6-0HDA)诱发的神经元死亡相关。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述状况为炎性疾病。
48.根据权利要求47所述的方法，其中炎性疾病为关节炎性痛风或炎性肠疾病。
49.鉴定细胞活性调节剂的筛选方法，其包括下列步骤(a)形成反应混合物，该混合物包括(i)选自下述的组分权利要求1-9中任一权利要求所述的多肽；权利10所述的融合多肽；权利要求12所述的多核苷酸；以及权利要求13所述的表达载体。( )已知被所述组分结合和/或调节的结合伴侣、细胞效应子和/或细胞类型；和 (iii)测试化合物；和(b)检测所述组分与所述结合伴侣、细胞效应子和/或细胞类型的相互作用，其中，相对于所述测试化合物不存在时的相互作用，所述测试化合物存在时的相互作用发生变化， 从而鉴定细胞信号传导的调节剂。
全文摘要
提供了具有非经典生物活性的分离的组氨酰-tRNA合成酶剪接变异体多核苷酸和多肽，及其相关组合物和方法。
文档编号C12N9/00GK102428175SQ201080020335
公开日2012年4月25日 申请日期2010年3月16日 优先权日2009年3月16日
发明者克瑞斯蒂·海伦·派尔, 刘静芬, 周洁, 罗咏诗, 莱斯利·安·格林, 许志雯 申请人:盘古生物制药有限公司