结合于24p4c12蛋白的抗体药物偶联物(adc)的制作方法

专利名称：结合于24p4c12蛋白的抗体药物偶联物(adc)的制作方法
技术领域：
本文所描述的本发明涉及结合于称为24P4C12的蛋白质的抗体、结合片段及其抗体药物偶联物(ADC)。本发明还涉及可用于表达24P4C12的癌症治疗的预后、预防和治疗方法及组合物。
背景技术：
癌症是仅次于冠心病的第二大人类死亡原因。世界范围内每年有数百万人死于癌症。仅在美国，如美国癌症协会的报告，癌症每年造成50万以上的人死亡，每年诊断到120 万人的新病例。虽然死于心脏病的人数明显减少，但死于癌症的人数正在逐渐上升。在下世纪初，预计癌症将成为头号死亡原因。在世界范围内，有几种癌症是主要的杀手。尤其是肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌和膀胱癌，它们是癌症死亡的主要原因。这些癌以及事实上所有其它癌都具有相同的致命特征。除了极少的例外，转移性癌疾病是致命的。此外，即便对于那些在原发性癌中存活下来的癌症患者而言，一般经验显示，他们的生活都发生了显著的改变。许多癌症患者由于担心可能复发或治疗失败而产生强烈的焦虑感。许多癌症患者在治疗后身体虚弱。此外，许多癌症患者会经历复发。世界范围内，前列腺癌是男性第四大流行癌症。在北美和北欧，它几乎是男性中最常见的癌症，同时是造成男性癌症死亡的第二大原因。仅在美国，每年有30，000以上的男性死于这种疾病一仅次于肺癌。尽管这些数值如此巨大，但仍没有治疗转移性前列腺癌的有效方法。外科前列腺切除术、放疗、激素消融治疗(hormone ablation therapy)、手术去势和化疗仍然是主要的治疗手段。不幸的是，这些治疗方法对于许多人无效，并且常常会带来不利结果。就诊断而言，缺乏能准确检测早期局部性肿瘤的前列腺肿瘤标记仍旧是这种疾病诊断和治疗中的一个重要限制。尽管血清前列腺特异性抗原(PSA)检测已经成为一种有效工具，但广泛认为它在一些重要方面缺乏特异性和通用性。通过产生可再现小鼠中疾病不同阶段的前列腺癌异种移植物促进了其它前列腺癌特异性标记的鉴定。LAPC(洛杉矶前列腺癌)异种移植物是在严重联合免疫缺陷(SCID) 小鼠中有存活传代的前列腺癌异种移植物，其显示能模拟从雄激素依赖转变为非雄激素依赖(Klein等，1997，Nat. Med. 3 402)。最近鉴定的前列腺癌标记包括PCTA-I (Su等，1996， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 7252)、前列腺特异性膜抗原(PSMA) (Pinto 等，Clin Cancer Res 1996-9-2 (9) 1445-51)、STEAP (Hubert 等，Proc Natl Acad Sci U S A. 1999-12-7 ； 96(25) 14523-8)和前列腺干细胞抗原(PSCA) (Reiter 等，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 1735)。
尽管以前鉴定的 标记物(如PSA)具有有助于诊断和治疗前列腺癌的作用，但还需要鉴定出前列腺癌和相关癌症的其它标记物和治疗靶以进一步改善诊断和治疗。2000年估计美国发生了 130，200例的结肠直肠癌病例，其中包括93，800例结肠癌和36，400例直肠癌。结肠直肠癌是男性和女性中的第三大常见癌症。在1992-1996年间其发病率显著减低(每年降低2.1%)。研究表明，这些降低是由于筛查和息肉切除增加，从而防止了息肉发展成侵入性癌症。估计2000年有56，300人死亡(47，700人死于结肠癌，8，600人死于直肠癌)，占美国癌症死亡总人数的约11%。目前，外科手术是最常见的治疗结肠直肠癌的方法，对于还未扩散的癌症该方法经常是治愈性的。对于大多数已经深度肠壁穿孔或已经扩散到淋巴结的癌症患者，通常在手术前或手术后进行化疗或化疗加放疗。对结肠癌有时也需要永久性结肠造口术(在腹部形成一开口以排除人体废物)，同时直肠癌也偶尔需要这种手术。仍持续需要有效的诊断和治疗结肠直肠癌的方法。在美国所有的新癌症病例中，膀胱癌在男性中约占5% (第五种最常见的瘤)，在女性中占3% (第八种最常见的瘤)。该发病率缓慢增加，且该增加伴随着老年人口的增力口。在1998年，估计有54，500病例，其中包括39，500名男性和15，000名女性。在美国， 这种年龄调整发病率为每100，000名男性32人，每100，000名女性8人。历史上男性/女性3 1的比例可能会由于女性中的吸烟模式而降低。估计1998年有11，000人死于膀胱癌(7，800名男性和3，900名女性)。膀胱癌的发病率和死亡率随着年龄增加而急剧上升， 并且随着人口老龄化而成为日益严重的问题。大多数膀胱癌在膀胱中会复发。联用经尿道膀胱切除术(TUR)和膀胱内化疗或免疫疗法来治疗膀胱癌。膀胱癌的多病灶和复发特性指出了 TUR的局限性。单凭TUR不能治愈大多数肌肉侵入性癌症。根治性膀胱切除术和尿流改道术是最有效的根治这种癌症的方法，但会对泌尿和性功能造成不可否认的影响。显然还持续需要对膀胱癌患者有益的治疗方法。估计2000年新增164，100例肺和支气管癌症，占美国总癌症诊出人数的14%。肺和支气管癌症症的发病率在男性中显著降低，从1984年的86. 5人/100，000人降低到1996 年的70.0人。在20世纪90年代，女性中发病率的增加势头开始放慢。在1996年，女性中的发病率为42. 3人/100，000人。估计2000年肺和支气管癌症造成156，900人死亡，占总癌症死亡人数的28 %。 1992-1996年间，肺癌的死亡率在男性中显著降低(每年降低1. 7% )，而在女性中该比例却显著上升(每年上升0.9%)。从1987年以来，相比乳腺癌，每年有更多的女性死于肺癌， 而乳腺癌在过去40年中都是女性癌症死亡的主要原因。肺癌发病率和死亡率降低很大可能与过去30年吸烟率降低有关；然而，女性吸烟率的降低模式滞后于男性。需要关注的是， 尽管成年人的吸烟率已经慢慢降低，但青年人的吸烟率却又在升高。肺和支气管癌症的治疗方案是由癌症的类型和阶段决定的，其中包括手术、放疗和化疗。对许多局部性癌症而言，通常选择手术治疗。由于这种疾病通常随发现时间而扩散，通常需要联用放疗和化疗与手术。可选择单用化疗或与放疗联用来治疗小细胞肺癌；采用这种方案时，大多数患者的症状会缓解，其中有些是长效的。然而，仍旧持续需要有效的治疗和诊断肺和支气管癌症的方法。2000年，估计美国妇女中有182，800例侵入性乳腺癌病例。此外，估计2000年在男性中将新诊断出约1，400例乳腺癌。在20世纪80年代，女性中乳腺癌的发病率每年增加约4%，随后在90年代该发病率比较平稳，约为每100，000人约110. 6例。仅在美国，估计2000年有41，200人(40 ，800名女性，400名男性)死于乳腺癌。 乳腺癌在女性癌症死亡中位居第二。根据最新数据，无论是白人还是黑人，该死亡率在 1992-1996年间显著降低，且在年轻妇女中降低程度最大。这些降低可能是由于早期检查和治疗方法改进的结果。考虑到医疗环境和患者的偏好，乳腺癌的治疗方法可包括病灶切除术(局部切除肿瘤)并除去手臂下的淋巴结；乳房切除术(手术切除乳房)并除去手臂下的淋巴结；放疗；化疗；或激素疗法。通常可联用两种或更多种方法。大量研究显示，对于早期疾病，病灶切除术加放疗后的长期存活率与改良根治性乳房切除术后的存活率类似。重建技术的重大进步能够在乳房切除术后为乳房再造术提供一些选择。最近，这种再造术已经与乳房切除术同时进行。原位导管癌(DCIS)及周围适量正常乳房组织的局部切除可防止DCIS局部复发。 照射乳房和/或他莫昔芬治疗可降低剩余乳房组织发生DCIS的机会。这是重要的，因为如果DCIS不治疗的话将发展成侵入性乳腺癌。而且，这些治疗方法有严重的副作用或后遗症。因此，需要有治疗乳腺癌的有效方法。估计2000年在美国新发23，100例卵巢癌。这占所有女性癌症的4%并且是第二大妇科癌症。1992-1996年间，卵巢癌发病率显著降低。卵巢癌的结果是，估计2000年有 14，000人死亡。相比妇女生殖系统的其它癌症，卵巢癌造成更多人死亡。治疗卵巢癌的可选方法有手术、放疗和化疗。手术通常包括除去一侧或两侧的卵巢、输卵管(输卵管-卵巢切除术)以及子宫(子宫切除术)。在一些非常早期的肿瘤中， 只有相关的卵巢会被切除，尤其是对于那些希望生孩子的年轻女性。在晚期疾病中，需要除去腹内所有疾病部位以增强化疗效果。有效治疗卵巢癌的方法仍是持续的重要需求。估计2000年在美国新发28，300例胰腺癌。在过去20年中，男性胰腺癌的发病率有所降低。女性发病率仍保持几乎恒定，但也可能开始减低。估计2000年在美国胰腺癌造成28，200人死亡。在过去20年中，男性中死亡率有轻微但明显的降低(每年约降低 0. 9% )，而该比例在女性中轻微升高。手术、放疗和化疗是治疗胰腺癌的可选方法。在大多数患者中，这些治疗选择可延长存活时间和/或缓解症状，但绝大部分患者不可能全部治愈。迫切需要有其它治疗和诊断癌症的可选方法。这些方法包括将抗体、疫苗和小分子用作治疗形式(modality)。此夕卜，还需要将这些形式用作癌症治疗和研究所有领域中的诊断、检测、监测和技术发展水平的研究工具。人们已认识到单克隆抗体(mAb)的治疗用途(G. Kohler和C. Milstein, Nature 256 :495-497(1975))。目前，单克隆抗体已获准用于移植、癌症、传染病、心血管疾病和炎症的治疗。不同的同种型具有不同的效应物功能。这些功能上的不同对应于各种免疫球蛋白同种型的不同三维结构(P.M. Alzari 等，Annual Rev. Immunol.，6 :555_580 (1988))。由于将小鼠便于免疫接种并识别大多数外来的人抗原，针对具有治疗潜力的人靶标的mAb通常均为鼠源性。然而，鼠mAb在人类治疗中本身有缺陷。由于mAb在人体中的循环半衰期比人抗体短，需要更频繁地给予mAb。更关键的是，将鼠抗体反复给予人免疫系统会造成人免疫系统将小鼠蛋白质识别为异物并产生人抗小鼠抗体(HAMA)应答。这种HAMA 应答会造成过敏反应，并从免疫系统中迅速清除鼠源抗体，从而使得采用鼠源抗体的治疗无效。为了避免这种影响，已尝试在小鼠中建立人免疫系统。在初期的尝试中希望建立能对抗原起反应而产生具有人序列的抗体的转基因小鼠(参见 Bruggemann 等，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 86 :6709_6713 (1989))，但却受限于可用克隆载体所稳定保持的DNA量。采用酵母人工染色体(YAC)克隆载体将人Ig基因座的大种系片段导入转基因哺乳动物。采用YAC将基本上大部分人V、D和J区域基因(它们的排列间隔与人基因组中发现的相同)和人恒定区导入小鼠。已知一种此类转基因小鼠品系，其称作XenoMouse 小鼠，可购自阿目金弗里蒙特公司(Amgen Fremont, Inc.，加拿大弗里蒙特)。发明概 述本发明提供了结合于24P4C12蛋白和24P4C12蛋白的多肽片段的抗体、及其结合片段和抗体药物偶联物(ADC)。在一些实施方式中，本发明包括偶联于治疗剂的全长人抗体。在某些实施方式中，前提是不编码图3中的整个核酸序列和/或不制备图2中的整个氨基酸序列。在某些实施方式中，编码图3的整个核酸序列和/或制备图2的整个氨基酸序列，两者均为各自的人单位剂型。本发明还提供了治疗表达24P4C12的癌症(例如表I中列出的组织的癌症)的各种免疫原性或治疗性组合物(例如抗体药物偶联物)以及方案。附图简述

图1. 24P4C12的核酸和氨基酸序列。图1A. 24P4C12变体1 (也称为“24P4C12v. 1” 或“24P4C12变体1”)的cDNA和氨基酸序列示于图IA中。起始的甲硫氨酸以下划线标示。 开放阅读框从核酸6延伸至2138，包括终止密码子。图IB. 24P4C12变体2(也称为“24P4C12v. 2”)的cDNA和氨基酸序列示于图IB 中。起始甲硫氨酸的密码子以下划线标示。开放阅读框从核酸6延伸至2138，包括终止密码子。图1C。24P4C12变体3(也称为“24P4C12v. 3”)的cDNA和氨基酸序列示于图IC 中。起始甲硫氨酸的密码子以下划线标示。开放阅读框从核酸6延伸至2138，包括终止密码子。图ID。24P4C12变体4(也称为“24P4C12v. 4”)的cDNA和氨基酸序列示于图ID 中。起始甲硫氨酸的密码子以下划线标示。开放阅读框从核酸6延伸至2138，包括终止密码子。图IE。24P4C12变体5(也称为“24P4C12v. 5”)的cDNA和氨基酸序列示于图IE 中。起始甲硫氨酸的密码子以下划线标示。开放阅读框从核酸6延伸至2138，包括终止密码子。图IF。24P4C12变体6(也称为“24P4C12v. 6”)的cDNA和氨基酸序列示于图IF 中。起始甲硫氨酸的密码子以下划线标示。开放阅读框从核酸6延伸至2138，包括终止密码子。
图1G。24P4C12变体7(也称为“24P4C12v. 7”)的cDNA和氨基酸序列示于图IG 中。起始甲硫氨酸的密码子以下划线标示。开放阅读框从核酸6延伸至1802，包括终止密码子。图1H。24P4C12变体8(也称为“24P4C12v. 8”)的cDNA和氨基酸序列示于图IH 中。起始甲硫氨酸的密码子以下划线标示。开放阅读框从核酸6延伸至2174，包括终止密码子。

图II。24P4C12变体9(也称为“24P4C12v. 9”)的cDNA和氨基酸序列示于图II 中。起始甲硫氨酸的密码子以下划线标示。开放阅读框从核酸6延伸至2144，包括终止密码子。图2。24P4C12抗体的核酸和氨基酸序列。图2A. Ha5-1 (5) 2. 1重链的cDNA和氨基酸序列。双下划线所示的是前导序列，下划线所示的是重链可变区，以虚线下划标示的是人IgG2恒定区。图2B.Ha5_l(5)2. 1轻链的cDNA和氨基酸序列。双下划线所示的是前导序列，下划线所示的是轻链可变区，以虚线下划标示的是人κ恒定区。图3. 24P4C12抗体的氨基酸序列。图3A.Ha5_l(5)2. 1重链的氨基酸序列。双下划线所示的是前导序列，下划线所示的是重链可变区，以虚线下划标示的是人IgG2恒定区。图3B.Ha5_l(5)2. 1轻链的氨基酸序列。双下划线所示的是前导序列，下划线所示的是轻链可变区，以虚线下划标示的是人κ恒定区。图4. Ha5-1 (5)2. 1抗体与人Ig种系的比对。图4A. Ha5-1 (5) 2. 1重链与人Ig种系的比对。图4B. Ha5-1 (5)2. 1轻链与人Ig种系的比对。图 5. Ha5-1(5)2. IMAb 结合于 24P4C12 的细胞表面。用从 Ha5_l (5) 2. 1 重链和轻链载体构建物转染的CHO细胞或杂交瘤纯化的Ha5-1 (5) 2. IMAb染色PC3-对照和 PC3-24P4C12细胞。采用流式细胞术检测结合。结果显示CHO细胞产生的Ha5_l (5) 2. 1与杂交瘤产生的Ha5-1 (5) 2. 1类似地结合24P4C12。图6. Ha5-1 (5)2. 1-vcMMAE的细胞毒性。在经工程改造表达24P4C12的PC3细胞中评估Ha5-1(5)2. 1-vcMMAE的细胞毒性。在第1天将PC3_Neo或PC3-24P4C12细胞(1000 个细胞/孔)接种至96孔板上。第2天将包含所示浓度的Ha5-1 (5) 2. 1-vcMMAE或偶联于 vc-MMAE的对照MAb的等体积培养基加入各孔中。在37°C下孵育细胞4天。在孵育期结束时在各孔中加入阿尔玛蓝(Alamar Blue)，然后再孵育4小时。采用保特(Biotek)读板仪在620nm的激发波长和540nm的发射波长下检测所得荧光。结果显示Ha5_l (5) 2. 1-vcMMAE 介导PC3-24P4C12细胞中的细胞毒性，而与vcMMAE偶联的对照人IgG没有效果。这些结果表明Ha5-1 (5) 2. 1-vcMMAE能将细胞毒性药物选择性递送到表达24P4C12的细胞，从而杀伤这些细胞。图7. Ha5-1 (5) 2. IvcMMAE抑制SCID小鼠中皮下建立的人非雄激素依赖性前列腺癌异种移植物的生长。在该实验中，将非雄激素依赖性人前列腺癌PC-3-HU24P4C12肿瘤细胞(3. OX IO6个细胞/小鼠)皮下注射到雄性SCID小鼠中。当肿瘤达到IOOmm3时，将小鼠随机分为Ha5-1 (5) 2. 1-vcMMAE组和PBS对照组(每组中η = 5)。在第0天时，用单剂量Ha5-1(5)2. 1-vcMMAE (10mg/kg)或PBS静脉给药(i. v.)处理小鼠。按指示每3-4天用游标卡尺测量以监控肿瘤的生长。肿瘤体积计算为宽度2X长度/2，其中宽度是最小尺寸，长度是最大尺寸。结果显示用Ha5-1(5)2. 1-vcMMAE处理显著抑制了 SCID小鼠中 PC-3-HU24P4C12前列腺肿瘤的生长(ρ < 0. 01)，并在绝大多数动物中使得肿瘤完全消退。图8. Ha5-1 (5) 2. IvcMMAE抑制SCID小鼠中常位建立的人非雄激素依赖性前列腺癌异种移植物的生长。将LAPC-9AI非雄激素依赖性人前列腺癌细胞(2. O X IO6个细胞/小鼠)植入雄性SCID小鼠的前列腺。移 植后15天肿瘤良好建立且可触及，此时将小鼠随机分为两组(每组中η = 8)。如下对小鼠进行处理用Ha5-1 (5) 2. 1-vcMMAE或偶联于vcMMAE 的同种型对照MAb每4天以3mg/kg静脉内给药，共4剂。在研究结束时，切取小鼠前列腺中的肿瘤并用电子称称重。结果显示用Ha5-1 (5)2. 1-vcMMAE处理显著抑制了 SCID小鼠中常位移植的人LAPC9-AI前列腺肿瘤的生长(ρ < 0. 01)。图9. Ha5-1 (5)2. IvcMMAE抑制SCID小鼠中皮下建立的人非雄激素依赖性结肠癌异种移植物的生长。将HT-29人结肠癌细胞(1. OX IO6个细胞/小鼠)经皮下注射到SCID 小鼠中。当肿瘤达到IOOmm3时，将小鼠随机分为两组(每组中η = 6)。从第0天开始，每4 天静脉内给予Ha5-1 (5) 2. 1-vcMMAE (3mg/kg)或PBS，共给予4剂。按指示每3_4天用游标卡尺检测监控肿瘤的生长。肿瘤体积计算为宽度2X长度/2，其中宽度是最小尺寸，长度是最大尺寸。结果显示用Ha5-1 (5)2. 1-vcMMAE处理显著抑制了皮下植入SCID小鼠的HT-29 结肠肿瘤异种移植物的生长(P < 0. 01)。图10.Ha5_l(5)2. IvcMMAE抑制SCID小鼠中皮下建立的患者来源结肠癌异种移植物的生长。将AG-C4(患者来源的结肠癌异种移植物肿瘤切片)皮下植入SCID小鼠。当肿瘤达到IOOmm3时，将小鼠随机分为两组(每组中η = 6)。从第0天开始，每3_4天静脉内给予Ha5-1 (5) 2. 1-vcMMAE (3mg/kg)或PBS，共给予4剂。按指示每3_4天用游标卡尺检测监控肿瘤的生长。肿瘤体积计算为宽度2X长度/2，其中宽度是最小尺寸，长度是最大尺寸。结果显示用Ha5-1(5)2. 1-vcMMAE处理显著抑制了皮下植入SCID小鼠的AG-C4人结肠肿瘤异种移植物的生长(P < 0. 05)。图ll.Ha5-l(5)2. IvcMMAE抑制裸鼠中皮下建立的人卵巢癌异种移植物的生长。 将0VCAR-5人卵巢癌肿瘤细胞(2.0X106个细胞/小鼠)皮下注射到裸鼠中。当肿瘤达至IJ IOOmm3时，将小鼠随机分为两组(每组中n = 6)。从第0天开始，每3_4天静脉内给予 Ha5-1 (5) 2. 1-vcMMAE (5mg/kg)或PBSl次，共给予4剂。按指示每3-4天用游标卡尺测量以监控肿瘤的生长。肿瘤体积计算为宽度2X长度/2，其中宽度是最小尺寸，长度是最大尺寸。结果显示用Ha5-1 (5)2. 1-vcMMAE处理显著抑制了皮下植入裸鼠的0VCAR-5人卵巢癌肿瘤异种移植物的生长(P < 0. 01)。图12. Ha5_l (5)2. IvcMMAE抑制SCID小鼠中皮下建立的患者来源的胰腺癌异种移植物的生长。将AG-Panc3患者来源胰腺肿瘤切片皮下植入SCID小鼠。当肿瘤达到85mm3时，将小鼠随机分为两组(每组中η = 6)。从第0天开始，每3_4天静脉内给予 Ha5-1 (5) 2. 1-vcMMAE (5mg/kg)或PBSl次，共给予4剂。按指示每3_4天用游标卡尺检测监控肿瘤的生长。肿瘤体积计算为宽度2X长度/2，其中宽度是最小尺寸，长度是最大尺寸。 结果显示用Ha5-1 (5)2. 1-vcMMAE处理显著抑制了皮下植入SCID小鼠的AG-PanC3肿瘤异种移植物的生长(P < 0. 01)。
图13. Ha5-1 (5)2. IvcMMAE与其它24P4C12抗体药物偶联物(ADC)在前列腺癌 LAPC9-AD异种移植物中的效果比较。将LAPC-9AD雄激素依赖性人前列腺癌细胞(1. 5 X IO6 个细胞/小鼠)皮下注射到雄性SCID小鼠中。如图(图13)中所示，将小鼠随机分组 Ha5-1(5)2. 1-vcMMAE 组、Ha5_l (5) 2. l_mcMMAF 组和其它抗体药物偶联物(ADC)组，包括 PBS 对照组(每组中η = 6)。当肿瘤达到IOOmm3时，在第0天以10mg/kg的剂量静脉内给予 Ha5-1 (5) 2. l-vcMMAE、Ha5_l (5) 2. 1-mcMMAF 和所有其它 ADC —次。按指示每 3-4 天用游标卡尺测量以监控肿瘤的生长。肿瘤体积计算为宽度2X长度/2，其中宽度是最小尺寸，长度是最大尺寸。结果显示与Ha5-1(5)2. 1-mcMMAF相比，用Ha5_l (5) 2. 1-vcMMAE处理显著抑制了 LAPC9-AD前列腺癌异种移植物的生长(ρ = 0. 0048)。(图13)。其它偶联于-vcMMAE 和-mcMMAF的抗体不具有任何肿瘤抑制活性，这显示了 Ha5_l (5)2. 1具有抑制肿瘤生长的显著突出效果，且能用于治疗目的以治疗和控制表I中所列的癌症。图14.用IHC在胃癌患者样本中检测24P4C12蛋白。通过免疫组织化学法在胃癌患者的两种不同肿瘤样本中测试24P4C12蛋白的表达。简而言之，将用福尔马林固定、石蜡包埋的组织切成4微米的切片，并固定于载玻片上。对切片进行脱腊、复水，并用胰蛋白酶溶液(0.05%胰蛋白酶(ICN，俄亥俄州欧罗拉公司(Aurora，Ohio))的0.05%氯化钙溶液， PH调节为7. 8)在37°C下处理10分钟。然后用3%过氧化氢溶液处理切片使得内源的过氧化物酶失活。用无血清蛋白封闭物(Dako公司，加拿大卡奔塔利亚(Carpenteria，CA))抑制非特异性结合，然后与单克隆小鼠抗24P4C12抗体或同种型对照共同孵育。随后，用超敏感(Super Sensitive )聚合物辣根过氧化物酶(HRP)检测系统处理切片，包括在超级增强剂(Super Enhancer reagent)中孵育，然后在聚合物-HRP 二抗偶联物(拜吉公司，加拿大圣雷蒙(BioGenex，San Ramon, CA))中孵育。然后，用DAB试剂盒(拜吉公司，加拿大圣雷蒙)对切片进行显影，用苏木精染色细胞核，用亮视野显微术进行分析。用24P4C12免疫反应性抗体在患者样本中检测到特异性染色，如棕色染色所示。(参见，图14(A)和14(C)。 相反，对照抗体未使任一种患者样本染色。(参见，图14(B)和14(D)。该结果显示24P4C12 在患者胃癌组织的肿瘤细胞中表达。这些结果表明24P4C12在人癌症中表达，针对该抗原的抗体(例如Ha5-1(5)2. 1)可用于诊断和治疗目的。(图14(A)-14(D))。发明详述章节概述I.)定义II.)24P4C12 抗体III.)抗体药物偶联物概述III(A).类美坦西醇(Maytansinoids)III(B).耳他汀(Auristatins)和多拉司他汀(dolostatins)III(C).卡奇霉素III(D).其它细胞毒剂IV.)结合24P4C12的抗体药物偶联物 V.)接头单元VI.)延伸物单元VII.)氨基酸单元
VIII.)间隔物单元IX.)药物单元X.)药物加载XI.)测定ADC细胞毒效果的方法XII.)表达24P4C12的癌症的治疗XIII.) 24P4C12作为抗体治疗的靶标XIV. ) 24P4C12ADC 鸡尾酒疗法XV.)联合治疗XVI.)试剂盒/制品的制造I.)定义除非另有说明，本文所用的所有技术术语、符号以及其它科学名词或术语具有本发明所属技术领域的技术人员常规理解的含义。一些情况下，为澄清和/或便于参考在本文定义具有常规理解含义的术语，本文包括这种定义不应解释为它与本领域的通常理解的含义有实质性区别。这里描述或引用的许多技术和方法是熟知的，通常可由本领域技术人员采用常规方法实施，例如Sambrook等的《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning A Laboratory Manual)(第二版，1989，冷泉港实验室出版公司(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约)中所述的广泛采用的在分子克隆法。除非另有说明，使用市售试剂盒和试剂的方法宜通常按照制造商规定的过程和/或参数进行。当本文中采用商品名称时，除非文中另有说明，提及该商品名称还指该商品名称产品的产品成分、普通药物以及活性药物成分。术语“晚期癌症”、“局部晚期癌症”、“晚期疾病”和“局部晚期疾病”是指已经扩展突破相关组织包膜的癌症，意味着包括美国泌尿学会(AUA)系统定义的第C期疾病、惠特莫_朱伊特(Whitmore-Jewett)系统定义的第C1-C2期疾病和 Μ(肿瘤、结节、转移)系统定义的第Τ3-Τ4期及N+期疾病。通常不推荐对局部晚期疾病患者进行手术，相比临床局部性(器官局限性)癌症患者，这些患者的手术结果基本上都不佳。缩写“AFP”是指二甲基缬氨酸_缬氨酸_多拉异亮氨酸_多拉脯氨酸_苯丙氨 - X^t - $二月安(dimethylvaline-valine-dolaisoleuine-dolaproine-phenylalanine-p
-phenylenediamine)(参见下文中的式 XVI)。缩写“MMAE”是指单甲基耳他汀E (参见下文中的式XI)。缩写“AEB”是指耳他汀E与对乙酰基苯甲酸反应产生的酯(参见下文中的式XX)。缩写“AEVB”是指耳他汀E与苯甲酰基戊酸反应产生的酯(参见下文中的式XXI)。缩写“MMAF”是指杜缬氨酸_缬氨酸_多拉异亮氨酸_多拉脯氨酸_苯丙氨酸(d ovaline-valine-doIaisoleuine-dolaproine-phenylalanine)(参见下文中的式 XVIV)。除非另有说明，术语“烷基”是指具有约1-20个碳原子(以及其中碳原子的范围和特定数量的所有组合和亚组合)、优选约1-8个碳原子的饱和直链或支链烃基。烷基的例子为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、 2-甲基-2- 丁基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、3-甲基-2 丁基、3-甲基-1- 丁基、2-甲基-1- 丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2，3_二甲基-2-丁基、和3，3_二甲基-2-丁基。不论是单独或是作为其它基团的一部分，烷基可任选被一个或多个基团、优选 1-3个基团(和选自卤素的任何其它取代基)所取代，这些取代基包括但不限于_卤素、-0- (C1-C8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R，、-OC (0) R，、-C (0) OR，、-C (0) NH2、-C (0) NHR，、-C (0) N (R， )2、-NHC (0) R，、-SR，、-SO3R'、-S (0) 2R，、-S (0) R，、-OH、 =0、-N3> -NH2, -NH(R，)、-N(R，)2 和 _CN，其中各 R，独立选自-H、-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8炔基、或-芳基，且其中所述-0-(C1-C8烷基)、-0-(C2-C8烯基)、-0-(C2-C8 炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基和-C2-C8炔基可任选进一步被一个或多个基团所取代，所述一个或多个基团包括但不限于^C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-0- (CfC8 烷基)、-O- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R”、-OC (0) R”、-C (0) OR”、-C(O) NH2, -C(O)NHR", -C (0) N (R，，)2、-NHC(O)R", -SR”、_S03R”、-S(O)2R", -S(O) R”、-OH、-N3> -NH2, -NH(R”)、_N(R”)2 禾口 _CN，其中各 R” 独立选自-H、-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8炔基、或-芳基。除非另有说明，术语“烯基”和“炔基”是指包含约2-20个碳原子(以及其中碳原子的范围和特定数量的所有组合和亚组合)、优选约2-8个碳原子的直链和支链碳链。烯基链在链中至少有一个双键，炔基链在链中至少有一个三键。烯基的例子包括但不限于乙烯或乙烯基、烯丙基、-1- 丁烯基、-2- 丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、和-2，3-二甲基-2-丁烯基。炔基的例子包括但不限于 炔属(acetylenic)、炔丙基(propargyl)、乙炔基、丙炔基、丁炔基、_2_ 丁炔基，戊炔基、-2-戊炔基和-3-甲基-1- 丁炔基。不论是单独或是作为其它基团的一部分，烯基和炔基可任选被一个或多个基团、 优选1-3个基团(以及选自商素的任何其它取代基)所取代，这些取代基包括但不限于_ 卤素、-0- (C1-C8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-0- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R’、-OC (0) R，、-C (0) OR，、-C (0) NH2、-C (0) NHR，、-C (0) N (R，)2、-NHC (0)R，、-SR，、_S03R，、-S(0)2R，、-S(0) R，、-0H、= 0、-N3> -NH2, -NH (R ‘ )、_N(R，)2 禾口 -CN,其中各 R，独立选自-H，-C1-C8 烷基，-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中所述-0- (C1-C8烷基)、-0- (C2-C8烯基)、-0-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基和-C2-C8炔基可任选的进一步被一个或多个取代基所取代，所述取代基包括但不限于CC1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-卤素、-0-(C1-C8 烷基)、-O-(C2-C8 烯基)、-O-(C2C8 炔基)、-芳基、-C(0) R”、-OC(0) R”、-C (0) or”、-C (O)NH2、-C (O)NHR”、-C (O)N(R”)2、-NHC (0) R”、-SR”、-S03R”、_S (0) 2R”、-S (0) R”、-OH、-N3, -NH2, -NH(R”)、_N(R”)2 禾口 _CN，其中各 R” 独立选自-H、-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8炔基或-芳基。除非另有说明，术语"亚烷基”是指具有约1-20个碳原子(以及其中碳原子的范围和特定数量的所有组合和亚组合)、优选约1-8个碳原子的饱和支链或直链烃基，其具有通过从母体烷烃的同一或两个不同碳原子上去除两个氢原子而产生的两个单价基团中心(radical center)。典型的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、 亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、1，4_亚环己基等。不论是单独或是作为其它基团的一部分，亚烷基可任选被一个或多个基团、优选1-3个基团(以及选自卤素的任何其它取代基)所取代，这些基团包括但不限于_卤素、-0-(C1-C8烷基)、-0-(C2-C8烯基)、-O- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (O) R，、-OC (0) R，、-C (0) OR，、-C (0) NH2, -C (0) NHR，、-C (0) N(R，)2、-nhc(O)R，、-SR，、-SO3R，、-S(O)2R，、-S(O)R，、-OH、= 0、-N3、-NH2、-NH(R，)、-N(R，)2 和-CN，其中各R’独立选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基、其中所述-0- (C1-C8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-0- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基和-C2-C8炔基可进一步任选被一个或多个取代基所取代，这些取代基包括但不限于-Ci-Q 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、-卤素、-0-(C1-C8 烷基)、-0-(C2-C8 烯基)、-0-(C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R”、-OC (0) R”、-C (0) OR”、-C (0) NH2、-C (0) NHR”、-C (0) N (R”)2、-NHC (0) R”、-SR”、-SO3R", -S (O)2R", -S (0)R”、-OH、-N3, -NH2, -NH(R”)、_N(R”)2 禾口 _CN，其中各 R” 独立选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基除非另有说明，术语“亚烯基”是指包含至少一个碳-碳双键的任选取代的亚烃基。示例性的亚烯基包括例如亚乙烯基(-CH = CH-)和亚丙烯基(-CH = CHCH2-)。除非另有说明，术语“亚炔基”是指包含至少一个碳-碳三键的任选取代的亚烃基。示例性的亚炔基包括例如亚乙炔基(-C ^ C")、亚丙炔基(-CH2C ^ C")和4-戊炔基 (-CH2CH2CH2C = CH-)。除非另有说明，术语“芳基”是指6-20个碳原子(以及其中碳原子的范围和特定数量的所有组合和亚组合)的单价芳族烃基，其是从母体芳环系统的单个碳原子上去除一个氢原子而衍生得到的。一些芳基用示例性的结构“Ar”表示。典型的芳基包括但不限于 衍生自苯的基团、取代的苯、苯基、萘、蒽、联苯基等。不论是单独或是作为其它基团的一部分，芳基可任选被一个或多个基团、优选1-5个基团或甚至1-2个基团所取代，这些基团包括但不限于-卤素、-C1-C8烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、-O-(C1-C8 烷基)、-0-(C2-C8 烯基)、-0-(C2-C8 炔基)、-芳基、-C(O)R', -OC(O)R', -C(O) OR，、-C(O)NH2, -C(O) NHR，、_C(0)N(R，)2、-NHC(O) R，、-SR，、-S03R，、-S(0)2R，、-S(0)R，、-0H、-N02、-N3、-NH2、-NH(R，)、-N(R，)2 禾口 -CN，其中各 R ’独立选自-I-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，其中所述-C1-C8烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8炔基、0-(C1-C8烷基)、-0-(C2-C8烯基)、-0-(C2-C8炔基)和-芳基可进一步任选的被一个或多个取代基所取代，这些取代基包括但不限于^C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8 炔基、-卤素、-0-(C1-C8 烷基),-ο-(C2-C8 烯基),-ο-(C2-C8 炔基)、-芳基、-C(0)R”、-OC(O) R”、-C (0) OR”、-C (0)NH2、-C (0) NHR”、-C (0)N(R”)2、-NHC (0) R”、-SR”、-S03R”、_S (0) 2R”、_S (0) R”、-OH、-N3, -NH2, -NH(R”)、_N(R”)2 禾口 _CN，其中各 R” 独立选自-H、-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8炔基或-芳基。除非另有说明，术语“亚芳基”是指任选取代的二价芳基(即，从母体芳环系统的同一个或两个不同碳原子上去除两个氢原子而衍生得到)，其可为如下结构所示的对位、间位或邻位构型，其中苯基是示范性芳基。
权利要求
1.一种包含与单甲基耳他汀E(MMAE)偶联的抗体或抗原结合片段的抗体药物偶联物， 其特征在于，所述抗体或片段包含由SEQ ID NO :20的第20位Q至第143位S的氨基酸序列组成的重链可变区，以及由SEQ ID NO 22的第23位D至第130位R的氨基酸序列组成的轻链可变区。
2.一种包含与单甲基耳他汀E(MMAE)偶联的抗体或片段的抗体药物偶联物，所述抗体或片段包含由美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏的、保藏号为PTA-8602的杂交瘤产生的抗体的重链和轻链可变区。
3.如权利要求3所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体包含ATCC保藏号为 PTA-8602的杂交瘤产生的抗体的重链和轻链。
4.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体包含由SEQID N0:20 的第20位Q至第469位K的氨基酸序列组成的重链，以及由SEQ ID NO 22的第23位D至第236位C的氨基酸序列组成的轻链。
5.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述片段是Fab、F(ab')2、Fv 或Sfv片段。
6.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体是全长人抗体。
7.如权利要求1所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体是重组产生的。
8.—种药物组合物，其包含人单位剂型的权利要求1所述的抗体药物偶联物。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物用于癌症治疗。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症是结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌或胃癌。
11.一种抑制对象中癌细胞生长的方法，包括给予所述对象权利要求1所述的抗体药物偶联物。
12.—种治疗哺乳动物中肿瘤的方法，包括给予所述哺乳动物有效量的权利要求1所述的抗体药物偶联物。
13.一种减缓哺乳动物中肿瘤生长的方法，包括联用有效量的抗体药物偶联物与辐射治疗所述哺乳动物。
14.一种减缓哺乳动物中肿瘤生长的方法，包括联用有效量的抗体药物偶联物与化疗剂治疗所述哺乳动物。
15.一种减缓哺乳动物中肿瘤生长的方法，包括联用有效量的抗体药物偶联物与药物或生物活性治疗剂来治疗所述哺乳动物。
全文摘要
本申请描述了结合于24P4C12蛋白及其变体的抗体药物偶联物(ADC)。24P4C12在正常成人组织中表现出组织特异性表达，且在表I所列的癌症中异常表达。因此，本发明的ADC提供了用于癌症治疗的治疗性组合物。
文档编号C12P21/08GK102448486SQ201080020336
公开日2012年5月9日 申请日期2010年3月5日 优先权日2009年3月6日
发明者A·雅各波维茨, D·本杰明, J·古达斯, K·J·M·莫里森, P·森特, R·K·莫里森, R·莫泽, X-C·贾, Z·安 申请人:艾更斯司股份有限公司, 西雅图基因公司