专利名称：用于检测微生物的智能包装的制作方法
技术领域：
本发明属于食品、化学药品和化妆品领域。具体地，本发明涉及一种由用香草醛溶液浸渍的部分极性的吸附性固体支持物组成的新材料，以及其作为色度传感器在用于检测食品、化妆品或药品中微生物的存在中的应用。
背景技术：
每年世界上有无数因微生物的存在导致的有毒食品感染而在医院就诊的病例。就常规产品的损害而言，二十一世纪的消费者要求具有高感官品质和高营养价值的食品，即，最低限度地加工。显然这种较温和的加工条件的应用会导致微生物风险的增加，因此，微生物行为的变化变得非常重要，由于在任何产品中的残留微生物的存活和发展的确实可能性必须被认识到，以准确地确定产品的使用寿命或生产者愿意承担的微生物危害。就食品安全方面而言，食品中病原体的发病率和患病率的研究是欧盟的首要任务之一。其目的是评估食品中实际涉及的风险，以及对某些类型食品采用的微生物标准和食品安全目标。目前还没有市售的能够可视化检测包装的产品中大范围微生物存在的含有天然化合物的材料。因此，消费者以及零售商或分销商均不能确定包装的产品是否被微生物污染。在病原微生物的存在下，这种情况带来了严重的健康风险。为了控制它们，有必要采取显微镜镜检和微生物分析或接种在选择性培养基中，从而导致了大量的人力和物力消耗。 此外，这些方法是破坏性的，这就意味着被分析的产品不能再用于商业链中；它们是非常耗时的，因为从进行接种开始到对微生物计数期间有2-7天，还不包括需要预富集的时间。这些测试还需要较大的实验室成本。在任何情况下，这些测试是采用代表性数量的样品随机进行的，它们不可能对所有食品项目的所有食品单元进行检测，因此产品中的微生物污染始终是一个潜在风险，且无法由生产商或最终消费者检测到。在药品领域这种风险要高得多，因为只在已经造成了损害时才通过检测发现存在这种性质的问题，，往往无法挽回。近年来，食品包装系统已逐步演变，以响应消费者在保存期、保质、新鲜度、外观等方面的需求。一方面，现代营销方式要求有吸引力的包装，以在某些方面能够感染消费者使他/她购买该产品。其次，为了应对生活方式的深刻变化，包装多年来一直在进行演变，而且包装行业不得不应对这些变化。包装需要具有尤其是以下功能 盛装食品， 保护食品免受物理、化学和微生物影响， 保持食品质量和卫生， 防止欺诈， 使产品适应商品化处理， 显示和标识产品，
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告知消费者食品的特点， 延长使用寿命，等等。最近，由于消费者需求中的新要求，有两个新的包装概念，活性包装(active packaging)和智能包装(intelligent packaging) 0活性包装和智能包装可以被看作是下一代的食品包装。欧盟指令1935/2004定义了与食品接触的活性材料和物品，它们旨在延长货架期或维持或改善包装食品的条件，其设计为刻意纳入某些向包装的食品或它们的环境传输物质，或从包装的食品或它们的环境中吸收物质的成分。近年来在活性包装领域有重要发展，有大量涉及这一主题的出版物(Rodriguez, Α.，Battle, R.，Nerin，C(2007) “天然油脂作为重要的抗菌溶液在纸质包装中的应用。第二部分(The use of natural oils as antimicrobial solutions essential in paper packaging. Part II)，，。“^" Ι ^Μ的; 展(Progress in Organic Coatings) 60 (1) :33-38), Rodri guez, A. , Neri n, C,禾口 Battle, R(2008) “预防匍枝根霉食品变质的新型基于肉桂的活性纸质包装(New cinnamon-based active paper packaging against Rhizopusstolonifer food spoilage)。，，农、丨k 与食品化学杂志(Journal of Agricultural and Food Chemistry) 56 (15)), Lopez. P., Sanchez C，Batlle, R，和Nerin，C. (2007b)。“使用精油作为活性剂的柔性抗菌薄膜的发展(Development of flexible antimicrobial films using essential oils as active agents) ”，农业与食品化学杂志 55(21) :8814-8824)Gutierrez, L, Sanchez C, Batlle, R. ；Nerin, C. Q009)。“面包产品的新的抗菌活性包装(New antimicrobial active package for bakery products)，，食品禾斗学与技术趋势(Trends in Food Science & Technology)20(2) :92_99。至于智能包装，其目的是不同的，这也证明了它们用一种特定名称以示区别的合理性。包装本身体现其所包含的产品的质量或标志其加工的事件，作为对可能变质或退化以及不适当的保存、运输或分销的告知者，它们的这些作用可以实现现代世界消费者的要求。根据指令1935/2004，智能包装被定义为能控制包装食品或周围环境的条件的那些材料。“智能包装(smart packages) ”将被归类为那些使用食品或某些包装材料的性质或组分作为产品质量和历史的指标的包装；到目前为止，它们基本上是时间-温度指标、微生物质量指标、氧气或二氧化碳指标。因此，智能包装被定义为通过提供在运输和贮存过程中包装食品质量的信息来监控包装食品状况的一种包装，所述食品状况的含义为 生理过程(水果和新鲜蔬菜的呼吸) 化学过程(脂质氧化) 物理过程(食品变硬，脱水) 微生物方面(由微生物导致的损坏)，以及 感染(由昆虫引起)这些包装在食品工业中引起极大兴趣，通过目前正在对这种类型包装的开发和研究付出的巨大努力可以证实这点。在本组中包装携带有标签、染料或搪瓷，用作包装产品的质量、安全或处理的指示物。它们基于物理化学、酶反应或其它方面，一般使设备产生颜色变化，从而表明在食品中发生的危害或变化。因此，利用食品和包装之间的相互作用作为积极因素的可能性，可从通过阻断或抑制食品变质的原因开始。许多现有的智能指标都非常适用于食品包装行业，如时间-温度指标、包装的完整性、微生物的生长、包装的真伪等。其中的一些是专有系统，但只有少数是商业化的，最明显的是时间-温度指标。涉及在获得或摄取食品时能够快速有效地检测食品中微生物存在的智能包装发展的相关文献并不多。鉴于从微生物的观点来看变质食品的摄取是健康疾病(食品中毒) 的最大原因之一，尽早，即摄取前，检测包装产品的被感染程度很重要。因此，销售者可以及时除去它们，且消费者可避免摄取它们，不会危害健康。与这种类型智能包装有关的披露的的开发需要微生物和传感器直接接触，其作为一种智能包装起作用，如在专利EP13^653、W003093784、W02008(^6119 (金佰利全球公司，Kimberly-Clark ffordlwide, INC)中，其中需要发色检测器，或W00013009，(庄信万丰公众有限公司Johnson Matthey Public Limited Company)，其中将金属配合物作为反应底物。在文献 Desbordes，J :C0NIVE, L Prevot. Α.法国药品年鉴(Annales Francaises Pharmaceutiques) 1972，30 (7_8)，507-518中利用香草醛在硫酸和磷酸中的有色反应，来确定细菌研究中脂类的存在，并最终通过薄层色谱和气相色谱鉴定出脂肪酸。同样，在这一发展进程中，细菌和试剂之间的直接接触对产生反应是必要的。此外，这种类型的传感器制造系统非常复杂，这使得其较难以工业规模生产。此外，驱动机制较复杂，首先需要产生有颜色的化合物，当与微生物接触时就会消失。此外，作为发色体使用的化合物是化学化合物， 在某些情况下，需要特殊的条件如酸化，或复杂的化学化合物以使反应发生，其中有一些现今已经不可以用于与食品接触，或者在其浓度上有很大的限制。在任何情况下，天然化合物被用作发色化合物，很少化合物被接受作为食品添加剂，这伴随着技术和健康效益。鉴于到目前为止所描述的包装的缺陷，本发明的发明人，经过大量的研究，已开发出一种新的材料，其包括用香草醛溶液浸渍的部分极性的吸附性固体基质，可以作为色度传感器用于检测不同性质产品中的微生物。有利的是，已经获准作为食品添加剂的香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)，可以通过一个简单、易于识别的显色反应检测微生物的生长。它还可以作用于传感器，而无需直接接触食品或包装产品，但是要发生作用，需要在汽相中存在低水分浓度。香草醛是发现于多种蔬菜特别是在香草荚中的一种天然化合物。它从丁香油的主要成分丁子香酚中通过工业获得。它还可以通过对植物木质组织中发现的复杂的聚合物木质素进行氧化获得。香草醛在食品尤其是在糕点中被广泛用作调味剂。它也可以用在制药行业中作为胃部的兴奋剂以及用在香料行业中。现有技术中有一些文献，也举出香草醛作为前体物或其它试剂的应用，但它需要一个漫长的合成过程及与溶剂如乙醇和试剂如浓盐酸、哌啶、碘甲烷或其它试剂混合。例如，在文献W02008026119中，香草醛不是发明的主要组分，但它需要另一种化合物的存在使颜色变化的反应发生。
其它方法，利用香草醛检测微生物的存在需要用HCl强烈酸化培养基，这带来了弊端，并且它们也只能够检测到能够产生吲哚的那些微生物的存在。因此，文献!^rlimHJ 和Karabiner (J. V. Euclides 1954，14，345-353)公开了含有色氨酸源的培养基，基于从色氨酸生产吲哚的不同，从混合物中分离大肠杆菌(E. coli)和普通变形糖菌(P. vulgaris) 0 接着，他们还开发了用于进行吲哚试验的试剂。在这些情况下，他们采用添加了 0. 25%香草醛溶液的浓盐酸，通过在液相中并直接接触吲哚产生紫色。也就是说，在所述溶液中发现了生产吲哚的微生物，产生的吲哚使得显色反应发生。鉴于这些弊端，本发明的主要优点之一，正好是使用一种不会对人体有害的天然化合物、食品添加剂，如香草醛，而且检测微生物存在的能力不需要微生物和包装材料之间直接接触。其应用的目的是解决一个对社会构成巨大风险的问题，即食品、化妆品和药品，或其它包装产品中病原微生物的存在。本发明的材料已被纳入食品包装材料，或任何容易被微生物污染的其它产品，因而通过一个容易辨认的颜色变化(从无色到紫色)，消费者可以拒绝该产品和避免该食品的摄取或使用微生物感染和污染的对健康有害的产品。另一方面，它是一个能大大有助于包装商品的质量控制的系统，其通过及时去除受污染的批次，从而阻止它们到达最终消费者手中以及由潜在召回导致的问题和费用。在这个新设备的开发和实施中所涉及的部门，一方面将是负责生产并将整合到包装内的材料投放市场的包装行业，另一方面是食品、化妆品或医药等行业。该部门需要处理优化该材料在包装内的位置，考虑工业包装加工，以使该位置很容易被最终用户看到，且不会干扰包装的产品或阻碍工业包装加工。使用如本发明的传感器的主要优点是，例如它能让消费者知道在获得和摄取食品时，他或她要吃的食品或者他或她要使用的产品没有微生物的可能性，因此他或她可以不消费它，并拒绝该产品。
图1传感器材料在聚丙烯薄膜中的应用；大肠杆菌培养基。图2传感器材料在不存在微生物(空白)、存在培养基(左栏)和不存在培养基 (右栏)的滤纸中的应用。图3传感器材料在不胶粘纸标签中的应用；。大肠杆菌培养基。图4传感器材料在存在微生物(大肠杆菌)或不存在微生物(空白)的滤纸中的应用；培养基为穆勒-韩丁(MUller-Hinton)。图5在针对不同微生物的不同培养基(穆勒-韩丁，TSA ；MEA)中，要求实现变色的天数图。图6传感器材料在不含微生物的穆勒-韩丁培养基中在不同PH值的滤纸中的应用。图7香草醛的浓度随时间在a)不含微生物(空白)；b)白色念珠菌(Candida albicans) ；c)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和d)猪霍乱沙门氏菌 (Salmonella cholerasuis)中的演变图。
发明目的首先，本发明的目的是一种包括用含有香草醛的溶液浸渍的部分极性的吸附性固体支持物的材料。本发明的另一个目的是所述材料作为色度传感器在可视化检测微生物生长中的应用，其中所述传感器不需要与微生物或与含有它们的培养基直接接触而产生颜色变化。最后，本发明的另一个目的是香草醛作为色度试剂在可视化检测微生物生长中的应用。发明详述本发明涉及一种新的智能包装，由一种新材料设计而成，该新材料允许在不直接与有机体或含有该有机体的培养基接触，就能可视化检测不同性质的产品中微生物的生长。因此，在本发明的一个主要方面中，涉及包括用含有香草醛的溶液浸渍的部分极性的吸附性固体支持物的材料。材料组合物中存在的香草醛，可以通过简单且易于识别的显色反应来检测微生物的生长。在试验条件下，无论是在纯培养基中，在培养皿中进行，还是在食品，例如自制的， 不含防腐剂的蛋黄酱、药物或化妆品中，颜色的变化(从无色到紫色)能明确显示微生物的存在。香草醛是一种天然化合物，能与存在的微生物进行反应。不含香草醛的情况下反应颜色不会发生变化。反应是不可逆的，且当微生物生长继续时颜色强度增加。在一个特定的实施方案中，香草醛溶液包括乙醇。使颜色反应可见的所需的香草醛最低浓度是10%，优选从约10% -约50%乙醇。反应需要水介质或至少是可见的水分，其持续且不可逆，且因此作为色度检测器。 因此，固体支持物必须来自能够保留食品本身在汽相中释放的水分的部分极性的吸附性材料，优选使用纸或纸板。当香草醛被引入到疏水介质中时，反应不会是永久性的，因为水分会在疏水性支持物上冷凝，尽管同样显现颜色，但是因为水滴因重力而落下，它无法保持。因此，它不会是一个不可逆且稳定的支持物。如上所述，本发明的材料公开的功能使其适合可视化检测微生物的生长，因此本发明的另一个关键方面涉及这种新材料作为色度传感器在可视化检测微生物存在中的应用。传感器的反应在汽相中发生，因此香草醛无需与微生物或含有微生物的培养基直接接触。因此，传感器和微生物可以彼此远离，它们之间仅通过汽相接触。事实上，该传感器不需要与有机体直接接触是非常有利的，这是与现有技术中公开的传感器的一个重要区别，因为这样，微生物在其新陈代谢中呼出的化合物到达该汽相， 并通过该汽相到达发生显色反应的传感器。这需将传感器放在盖子上，或附着到包装上或成为它的一部分，但要有一定距离。在这些条件下，它还有这样的优势，即在汽相中作用，能够反映微生物在产品中任何部位的存在，而不是当要求直接接触时那样局限于一小部分或其任何部分。此外，基于在汽相中来自微生物的化合物的转移或扩散导致颜色发生变化这一事实，可以实现高灵敏度，这意味着该传感器响应了微生物在培养基中第一批菌落的出现。在微生物的浓度等于或大于10个菌落形成单位(colony forming unit) /毫升或毫克(CFU/ml，CFU/mg)含微生物的食品时，传感器的颜色会发生从无色(或白色，由于存在纸张或支持物)到紫色的不可逆变化。颜色的强度取决于微生物的浓度。传感器可以可视化检测广谱微生物的生长，如霉菌、酵母菌和/或细菌。所有在其代谢中产生吲哚的微生物可与香草醛反应。此外，其它新陈代谢不产生吲哚的微生物，如沙门氏菌(Salmonella)和假单胞菌(I^eudomonas spp.)与香草醛的鉴别反应也呈阳性，因此反应不应为特定的“吲哚-香草醛”，但其应定义为一个更通用的“氮化合物-香草醛”反应。通过本发明的智能传感器或系统检测微生物可以在包装产品中进行。包装产品可以具有不同的性质，优选食品、药品或化妆品。因此，在特定的实施方案中，由材料形成的智能系统作为传感器可以用作包装材料本身，或以纸质标签的形式应用，优选以不干胶的格式，放置在包装内表面，可以是塑料或其它材料，这样使其暴露在包装内部产生的气氛中。在那一区域包装应该是无色透明材料，以便观察微生物存在时将发生的颜色变化。最后，本发明的另一个主要方面涉及香草醛作为色度试剂在汽相中可视化检测微生物生长中的应用，即香草醛和微生物之间不直接接触。
实施例根据不同的支持材料和实验条件对传感器的活性进行了研究。这使得在巨观 (macroscopic)水平下传感器的操作清晰可视化。图1显示了在大肠杆菌培养基中浸渍了香草醛溶液的聚丙烯(PP)薄膜的应用。虽然使用的制剂是为这种传感器适当设计的，但未观察到颜色变化。没有响应(颜色变化) 的原因是，材料不吸收水分或化合物，或者同样地，与含有香草醛的制剂反应没有在支持物上持续，因为它在非极性介质中，在聚丙烯(PP)中吸胀。事实上，有一个彩色的光晕覆盖在 PP上，但最终缩小并从PP薄膜上褪去，认为这种非极性或吸附剂支持物用作传感器的支持物是无效的。图2显示了进行的空白试验(没有微生物)，在培养基的存在下(左栏)和不含培养基(右栏)时，使用几种吸收了香草醛溶液的滤纸支持物。结果表明，在不存在微生物的情况下，培养基的存在不足以使反应发生。图3显示了本发明传感器材料应用在自动不干胶标签上，用于检测大肠杆菌培养基中微生物的存在，其中观察到传感器的颜色变化。图4显示了传感器材料在大肠杆菌和空白即不含微生物的不同培养基的滤纸中的应用。培养基为穆勒-韩丁(MUller-Hinton)。在所有大肠杆菌的培养基中观察到发生的颜色变化，而只有空白培养基中没有颜色出现。为了扩大研究范围，对本发明材料针对广谱微生物的行为进行评估，以确定传感器正常工作所需的最低浓度。对传感器在下述微生物中的功效进行了试验研究霉菌
黄曲霉菌(Aspergillus flavus)(西班牙典型培养物保藏中心，CECT，2687) 罗克福尔青霉菌(Penicillium roqueforti)(真菌菌种保藏中心，IBT,21319) 匍匐散囊菌原变种(Eurotium repens) (IBT 1800) 岛青霉菌(Penicillium islandicum) (CECT 2762) 青黴菌(Penicillium ammune) (IBT 21314) 棒曲霉素产生菌(Penicillium expansum)眷纳地青霉(Penicillium nalgiovensis)酵母菌 白色念珠菌(Candida albicans) (ATCC，美国典型培养物保藏中心，64550) 汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii) (CECT 10353) 鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii) (CECT 11928) 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)细菌參粪肠球菌(Enterococcus faecal is) (ATCC 29212)參李斯特菌(Listeria monocytogenes) (ATCC 7644) 赌样芽胞杆菌(Bacillus cereus) (CECT 495)參金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (ATCC 29213) 猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis) (CECT 4000) 小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica) (CECT 4315) 大肠杆菌(Escherichia coli) (ATCC 29252)參铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) (ATCC 27853)在细菌、霉菌和酵母菌中观察到阳性反应。被测试的微生物的阳性反应见下表 (表1)，根据接种的微生物的浓度和在传感器的颜色变化所需的时间，可以清楚地表示出微生物浓度值。表1不同浓度的颜色变化
权利要求
1.材料，包括在含有香草醛的溶液中浸渍的部分极性的吸附性固体支持物。
2.根据权利要求1所述的材料，其特征在于，所述溶液包括乙醇。
3.根据权利要求2所述的材料，其特征在于，所述香草醛的浓度至少为10%。
4.根据权利要求3所述的材料，其特征在于，所述香草醛的浓度为10-50%。
5.根据前述权利要求任一项所述的材料，其特征在于，所述支持物为纸。
6.前述权利要求任一项所述的材料作为色度传感器在可视化检测微生物生长中的应用。
7.根据前一权利要求所述的材料的应用，其特征在于，所述检测在汽相中进行，所述材料与所述微生物之间不直接接触。
8.根据权利要求6或7所述的材料的应用，其中当微生物的浓度等于或高于lOcfu/ml 食品或lOcfu/mg食品时，视觉上能明显观察到颜色变化。
9.根据权利要求6-8任一项所述的材料的应用，其特征在于，被检测的微生物为霉菌、 酵母和/或细菌。
10.根据权利要求6-9任一项所述的材料的应用，其特征在于，微生物的检测在包装的产品中进行。
11.根据前一权利要求所述的材料的应用，其特征在于，所述包装的产品为食品、药品或化妆品。
12.根据权利要求10或11所述的材料的应用，其特征在于，所述包装由所述材料形成。
13.根据权利要求10或11所述的材料的应用，其特征在于，所述材料通过粘合剂附着于产品包装的内表面。
14.香草醛作为色度试剂在于汽相中可视化检测微生物生长中的应用。
全文摘要
本发明涉及新型智能包装，其设计采用一种包括用香草醛溶液浸渍的部分极性的吸附性固体基质的新型材料，其允许微生物在不同类型的产品中生长，可以进行可视化检测，无需直接接触微生物或含有该微生物的培养基。
文档编号C12Q1/04GK102439166SQ201080020206
公开日2012年5月2日 申请日期2010年4月21日 优先权日2009年5月7日
发明者M·C·克里斯蒂娜·纳瑞德拉普拉塔, 克里斯蒂娜·桑切斯乔拉宝, 劳拉·古雷斯巴托洛米 申请人:萨拉戈萨大学