驴奶中分离的益生微生物的制作方法

专利名称：驴奶中分离的益生微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及已知为益生菌的微生物领域及其在食品工业、人或动物食品中的使用。特别地，本发明涉及从生驴奶中分离的益生菌。
背景技术：
益生微生物，或简称为益生菌，可定义为当以适当的剂量给予时可能赋予健康或营养益处的微生物。它们属于所谓的功能食品的范畴。已知益生菌在乳制品中，如DANONE出售的Actimel⑧或Activia 牌产品、YakultHonsha出售的Yakult 牌产品、或NESTLE出售的LCl 牌产品。这些细菌属于乳酸细菌的 不同属种，例如双歧杆菌属某些种(Bifidus spp.)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)或约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)尽管不知道益生菌作用的具体机制，但是广泛认为益生菌通过其能够对肠道菌群平衡具有影响而有益于健康或营养。近年来，对驴奶的兴趣大大提高，主要是因为其组分，所以认为驴奶是婴幼儿营养奶粉、豆奶粉或其他配方的有效替换物。事实上，由于其多不饱和脂肪酸的组成、其钙/磷比率及其蛋白质含量，驴奶被认为非常接近于人奶。此外，驴奶富含溶菌酶，一种能够水解微生物细胞壁多糖的糖苷酶。多种科学证据证明了溶菌酶对营养和健康的重要性。高含量 的乳糖对于钙的肠吸收具有积极效果，并负责口味。即使在生命的最初几个月后，驴奶也可增强骨质矿化并在那些严重Ig-E介导的牛奶蛋白过敏的儿童中构成重要的营养支持，因此在有效的免疫系统形成中发挥作用。在较大的年纪中，驴奶可发挥对抗不同心血管疾病和低血胆固醇饮食中的积极效果。

发明内容
本发明的目的是提供新颖的益生乳细菌。为此目的，本发明的实施例提出益生乳细菌，尤其分离自驴奶并选自保藏在布达佩斯条约下的“德国微生物与细胞培养物保藏中心”(DSMZ)(德国布伦瑞克)中的下列编录号的菌株在 2008 年 12 月 8 日的 DSM 22098、DSM 22099、DSM 22100、DSM 22102、DSM22101，以及在2010年4月26日的DSM 23558、DSM 23559和DSM 23560，可从所述菌株获得的突变菌株，以及属于植物乳杆菌群簇的菌株，其呈现出与选自保藏在DSM 22102、DSM22101、DSM 23558、DSM 23559、和DSM 23560下的菌株的菌株至少70%的DNA-DNA同源性和至少99. 5%的16S RNA同一性。这种群簇定义了下文称为驴奶乳杆菌(Lactobacillusasini)的新种。突变体可通过推断本发明菌株遗传物质改变或推断本发明菌株遗传物质与其他分子重组的基因工程技术获得。典型地，为了获得这种突变菌株，本领域技术人员可使用常用的诱变技术，如UV照射或暴露于化学诱变产品。本发明的另一个实施例提出包括一种或众多上述的本发明益生乳细菌种类或菌株的组合物。所述的组合物可以是人或动物食用的食品组合物或饮料组合物。本发明的进一步实施例提供制造食品组合物或饮料组合物的方法。所述的方法可至少包括下列步骤一用上述本发明的活的多种益生乳细菌接种食品，一将接种后的食品放置在利于所述益生乳细菌代谢的条件下，一将所述食品发酵直至得到至少[106]CFU/mL菌群的食品。在另一个实施例中，制造食品组合物或饮料组合物的方法至少包含下列步骤一将上述益生乳细菌发酵直至达到至少[106]CFU/mL的菌群，一例如，通过包裹的方式，保护所述益生乳细菌， 一将食品与所述被保护的益生乳细菌混合。当达到发酵稳定期时终止发酵，优选在将所述的益生乳细菌放在利于其代谢的条件下24小时内终止。本发明的另一个实施例提出益生乳细菌在制备用于治疗与病原微生物粘膜定植关联的疾病的组合物中的用途。粘膜包括但不局限于，肠粘膜、胃粘膜。例如，病原微生物可以是肠病原体。例如，根据本发明所述的乳杆菌菌株的抑制活性可对抗肠病原体(例如肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、霍乱弧菌(Vibrio cholereae)、大肠杆菌(Escherichia coli))。本发明的另一个实施例提出益生乳细菌用于使发酵食品防护食品病原体的用途，所述食品病原体如李斯特菌(Lysteria)或沙门氏菌(Salmonella)、弯曲菌(Campylobacter)或梭菌(Clostridium),通过抑制所述食品病原体滋生的进行。本发明的另一个实施例提出如上定义的本发明益生乳细菌用于在发酵期间利用所述细菌生产丁酸的用途。本发明的另一个实施例提供生产丁酸的方法，包括下列步骤在适当的条件下发酵本发明的益生乳细菌和收集上述细菌的发酵过程中产生的丁酸。本领域技术人员通过阅读此处提供的公开内容与附图
，本发明的这些方面以及其他方面、特征和优点将变的明显。详细的描述，同时指出本发明的优选实施例，将仅以举例说明的方式给出。附图简述图I显示驴奶中本发明的克隆和参比菌株在24h温育过程中pH的演变。图2显示从生驴奶中分离的8个克隆的DNA指纹图谱。图3a至3e分别显示DNA指纹分析后克隆37、38、41、43和48的电泳图谱。图4显示使用dUTP地高辛作为探针标记的植物乳杆菌DNA，克隆37、38和48之间DNA-DNA杂交的结果。图5显示克隆37、38和48之间DNA-DNA杂交的结果是在植物乳杆菌(L. plantarum)、类植物乳杆菌(L. paraplantarum)、戍糖乳杆菌(L. pentosus)菌株类型DNA内与克隆37中标记的DNA探针的DNA-DNA杂交。详细说明在过去的几十年里，益生菌在人类健康中的作用通过引起其市场需求的显著增长，以及其更大规模的产品生产和消费，在科学水平和工业水平都取得了紧密关联。在生存力方面，益生菌菌株具有克服胃酸的极低PH和胆汁盐的清洗效果并以存活生理状态到达作用位点肠上皮的能力，这是极为重要的。益生细菌能够在结肠定植，以积极影响病原细菌的感染效果，从而刺激免疫系统并减少不利的代谢物浓度。此外，一些菌株，包括本发明的细菌，能够一定程度地减少胆固醇和甘油三酯的血浆浓度。在通过肠胃道的过程中，要求益生菌培养物耐受胃部胃蛋白酶和低pH的存在、十二指肠中富含蛋白酶的环境、和胆汁盐的抗微生物活性。尽管胃部的pH在摄取食物后可升高至6. 0或更高，但是其主要范围是从2. 5至3. 5。通过胃部以后，小肠是肠胃道中的第二个主要障碍。尽管小肠的pH( S卩，7.0至8. 5)更有利于细菌生存，但是胆汁盐的存在可具有不利效果。传统地，益生菌候选物在消化道运输中的生存能力使用常规镀饰技术进行评估，该技术在模拟消化道液中进行温育的过程中，提供活的并且可再生的细胞数目的信息，例如，如 Charteris 等《Development of an in vitro methodology to determine thetransit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacteriumspecies in the upper gastrointestinal tract)), J. Appl. Microbiol 84, 759-768 (1998) 中描述的。因而，多种基于培养的方法可用于表征益生微生物，如胃液抗性、胆汁盐抗性、胆汁盐水解能力、疏水性评价、抗微生物活性、抗生素敏感性。这些测试方法在下列实例部分充分描述。在本发明的实施例中，益生细菌符合至少一项下列标准一至少75% CFU/mL在此处描述的胃液抗性评价后得以保留，一至少75% CFU/mL在此处描述的胃液抗性和胆汁盐抗性评价后得以保留，一在此处描述的疏水性测试中，具有0. 5M硫酸铵或更少，优选0. IM硫酸铵或更少的显微镜玻片上可见微生物聚集，一对其他乳杆菌某些种的抗微生物活性低，S卩，用晕圈法(halo test)测量，小于
0.5cm的晕圈,优选如此处所述的小于0. 2cm,—对绿胺杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、腊状杆菌(Bacillus cereus)、或大肠杆菌(Escherichia coli)的抑制活性，即，用晕圈法测量，即，大于0. 5cm的晕圈,优选如此处所述的大于0. 8cm。克隆37、38、48、43、41、32、34和57代表本发明的特定实施例。它们已于2008年12月8日(克隆37、38、48、43、41)和2010年4月26日(克隆32、34、57)保藏在符合布达佩斯条约的“德国微生物与细胞培养物保藏中心”(DSMZ)中，编录号为克隆37 DSM 22098克隆38 DSM 22099克隆48 DSM 22100克隆43 DSM 22102克隆41 DSM 22101克隆32 DSM 23558克隆34 DSM 23559克隆57 DSM 23560。克隆37、38 和 48 属于植物乳杆菌驴奶亚种(Lactobacillus plantarum asini),并且克隆43、32、34、57和41属于驴奶乳杆菌种。更具体地，克隆32属于称为驴奶乳杆菌丁酸菌(Lactobacillus asini ssp. butyricus)的亚种、克隆34属于称为驴奶乳杆菌乳酸菌(Lactobacillus asini ssp. lactis)的亚种、以及克隆57属于称为驴奶乳杆菌尾状菌(Lactobacillus asini ssp. caudatus)的亚种。所述的益生细菌可作为鲜培养物或干燥食品补充物提供，如膳食补充物。就后者而言，生物质可以是冷冻干燥或喷雾干燥的，以提供高质量的培养物粉末，包括例如至少108CFU/g，优选超过 109CFU/g。根据本发明，益生细菌可用于制备食品或饮料，以供人或动物消费。食品和饮料包括发酵的食品，如鲜乳制品、发酵奶、酸奶。奶通常指牛奶。在本发明的语境中，尽管其他奶也可用于制备乳制品，包含马奶、山羊奶、骆驼奶、绵羊奶，但是优选驴奶。制备这种发酵乳制食品的方法是本领域普通技术人员力所能及的。优选地，以存活形式提供或保持所述益生细菌，直到使用。可使用鲜奶或奶粉并用水重新调和。可向奶中加入各种成分，以改进发酵或向消费者提供额外的健康益处(如添加维生素或矿物质)。 发酵后，奶可转化为白干酪(cottage-cheese)或夸克蛋糕(quark),例如通过向发酵的奶中添加凝乳酶(rennet)。本领域技术人员熟知这些过程。在另一个实施例中，益生细菌作为成分用于食品或饮料组合物中，而不对所述组合物进行发酵。换句话说，所述的益生细菌是膳食或营养补充物。在这种情形中，益生细菌优选以活菌形式提供。根据本发明所述的益生乳细菌也可用于保护食品，如发酵食品，通过抑制上述食品病原体的滋生而抵御食品病原体，如李斯特菌或沙门氏菌、弯曲菌或梭菌。在上述情形中，食品或饮料中混合了包括如此处所述的期望益生细菌的组合物。混合后的产品独立于包括期望益生细菌的组合物而发酵。无论如何，发酵持续时间优选不超过约24小时。通常，益生菌株在上述时间内达到发酵的稳定期。在本发明的实施例中，发酵在达到发酵稳定期时停止，优选在将接种后的食品放在有利于所述益生乳细菌代谢的条件下24小时内。本发明也涉及益生乳细菌在制备用于治疗与病原微生物粘膜定植关联的疾病的组合物中的用途。粘膜包含但不局限于，肠粘膜和胃粘膜。例如，原微生物可以是肠病原体。例如，根据本发明所述的乳杆菌菌株的抑制活性可对抗肠病原体(例如沙门氏菌、霍乱弧菌、大肠杆菌)。这与益生细菌附着上皮细胞，如肠道细胞的能力相关联，如目前已知的，能力可在一定程度上将此类病原细菌逐出肠道。相应地，这可能与益生细菌的疏水性有关。本发明也涉及本发明的益生乳细菌用于在发酵期间利用所述细菌生产丁酸的用途，例如发酵已接种有这种细菌的食品，然后由用户摄取，菌落在结肠内的内部发酵或在适当条件中合适培养基的发酵，允许收集所述细菌发酵过程中生产的丁酸。优选的细菌是DSM23558、DSM 22098、DSM 22100、和 DSM 22099。
具体实施例方式基于培养的方法(益生菌测试、胆汁盐水解能力、疏水性评价、抗微生物活性、抗生素敏感性、有机酸的生产、温育过程中PH的演变)用无菌生理液(NaCl 0. 85% )连续稀释从有机饲养获得的生驴奶，并接种在特用于乳杆菌属分离的MRS (Man, de Rogosa and Sharpe)琼脂平板上。在不同温度下将平板在厌氧环境(Anaerogen, Oxoid)中温育48h。从最高稀释度的MRS琼脂平板中任意选择乳酸细菌分离物(约150个)。分离物在MRS液体培养基中次培养，并划线至MRS琼脂上。益生性测试I)胃液抗性生长后，将每个菌落离心，并在无菌生理液中洗涤，并用相同的溶液重新悬浮至原始体积。胃液抗性的评价根据De Giulio等《Use of alginate and cryo-protectivesugars to improve the viability of lactic acid bacteria after freezing andfreeze-drying》World Journal of Microbiology & Biotechnology 2005 年 21 期，739-746页中的描述进行评估，但作一些修改。等分样品在模拟胃液(胃蛋白酶3g/L，pH2.5)中温育，在温育的不同时间取出，直至180分钟，并进行铺平板。使用并接种未处理的细胞作为阴性对照。对胃液的抗性通过菌落形成单位(CFU)/mL进行评价并与阴性对照比 较。2)对胃液和胆汁盐的抗性对胃液具有的抗性的菌落在由含有0. 3%胆汁盐的MRS组成的模拟胆汁液中温育，最多3h，然后接种到MRS琼脂平板上，根据De Giulio等(2005)所述。未处理的菌落用作阴性对照。对胆汁盐的抗性通过菌落形成单位(CFU)/mL进行评价并与阴性对照比较。结果在从生驴奶中分离的150个细菌菌落中，只有8个鉴定为属于乳杆菌属(暂时命名为克隆32、克隆34、克隆37、克隆38、克隆41、克隆43、克隆48、和克隆57)，展示出对胃液和胆汁盐的抗性，并显示形成约75%的CFU/mL，对比于未处理的对照乳杆菌的100%。其最佳生长温度约为30至31°C。150个菌落中只出现8个展示了对模拟胃液和对胆汁盐存在的良好抗性。然后研究这些菌落的下列活性疏水性测试、筛选具有胆汁盐水解活性的培养物、抗微生物活性和抗生素敏感性。3)疏水性测试菌落潜在地附着到肠上皮细胞的能力通过使用Strus等《The in vitro activityof vaginal Lactobacillus with probiotic properties against Candida)) InfectiousDiseases in obstetrics and Gynaecology, 2005 年 13 卷第 2 期 69-75 页，以及 Ljungh 等((High surface hydrophobicity of autoaggregating Staphylococcus aureus strainsisolated from human infections studied with the salt aggregation test))Infectionand immunity, 1985年47期522-526页中的间接疏水性方法进行评价。菌落在MRS液体培养基中生长24h。微生物悬浮液与等体积硫酸铵混合，硫酸铵预先以不同摩尔浓度制备(范围从20mM至4M)。能够引起显微镜载玻片上可见微生物聚集的硫酸铵最小浓度与盐聚集测试成反比。等渗溶液用作对照。结果—0. IM硫酸铵的可见聚集克隆32、37、43和57—0. 5M硫酸铵的可见聚集克隆34、38、41和48。从这些数据，可假设克隆32、37、43和57对于肠上皮细胞具有更强的体外附着能力。4)筛选具有胆汁盐水解活性的培养物胆汁盐水解是哺乳动物胆汁盐代谢中重要的代谢反应。近年来，使用胆汁盐水解以影响人和动物的胆固醇代谢的兴趣升高。胆汁盐的水解和胆固醇向细胞膜的掺入具有降低人血清胆固醇浓度的潜力。经由小肠中结合胆汁盐水解的游离胆汁盐的释放导致粪便中更多胆汁盐的排泄。胆固醇从人体移除的主要方式是以水解胆汁盐的形式排泄。大部分结合胆汁盐经由进入肝循环而再循环。排泄了的胆汁盐必须由新的胆酸代替，新的胆酸从人体中的胆固醇形成。因此，排泄的胆汁盐越多，人体库中使用的胆固醇越多。此外，游离胆汁盐不支持从小肠吸收胆固醇和其他脂质，但是结合胆汁盐支持。菌落的胆汁盐水解活性遵照Minelli等《Assessment of novel probioticLactobacillus casei strains for the production of functional dairy foods)) Int. Dairy J.，2004年14期723-726页中描述的方法定性评价。简言之，菌株的过夜液体培养物(5 u L)在含有0. 5%结合胆汁盐混合物和0. 37g/L CaCl2的MRS琼脂上形成斑点，并如上所述进行温育。斑点周围析出胆酸(不透明晕圈)的出现被认为是阳性结果，显示菌落水解胆汁盐的能力。结果定性上评价了水解胆汁提取物的能力。所有菌株均能水解胆汁提取物。5)抗微生物活性使用琼脂平板分析上的抑制晕圈测试以研究微生物菌株的抗微生物活性。测试样本对抗下列细菌一非病原株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)DSM 20079、干酿乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 9595、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)DSM 20081、沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)DSM 20494、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)DSM 20711 ；一革兰氏阳性病原株蜡状杆菌GN IOU DSM 4313和DSM 4384，以及粪肠球菌(Enterococcus faecal is)ATCC 29212，一革兰氏阴性病原株大肠杆菌(DSM 8579)和绿脓杆菌(DSM 50071)。所有菌株均购自德国微生物与细胞培养物保藏中心(德国DSMZ)。每种菌株在其特定生长培养基中37°C温育18h :乳酸细菌在Man de Rogosa Sharpe (MRS)液体培养基(Oxoid)中生长,大肠杆菌、粪肠球菌、绿脓杆菌和腊状杆菌在营养液体培养基(Oxoid)中生长。微生物悬浮液(lX108CFU/mL)均匀涂布在特定固体培养基平板上。50 ii L的每种培养物单个地放在接种的平板上。室温下无菌环境中静置30min后，取决于菌株，在37°C平板温育24至48h。准确测量平板上显示的清澈区直径，其为以cm表示的抗微生物活性。使用无菌去离子水作为阴性对照；标准抗微生物试剂氯霉素用作阳性对照，如Dall' Agnol等《Antimicrobial activity of some Hypericum species》Phytomedicine 10 :511-516.(2003)中的描述。结果a)对其他乳杆菌属某些种的抗微生物活性克隆不展示对沙克乳杆菌20494的抗微生物活性(除了克隆57以非常低的程度外)。一克隆37、38、和48展示对干酪乳杆菌ATCC 9595、保加利亚乳杆菌ATCC 11842、发酵乳杆菌DSM 20052、鼠李糖乳杆菌DSM 20711的低抑制活性；一克隆41展示对发酵乳杆菌DSM 20052、鼠李糖乳杆菌DSM 20711、嗜酸乳杆菌DSM 20079的低抑制活性；一克隆43展示对发酵乳杆菌DSM 20052和嗜酸乳杆菌DSM 20079的低抑制活性。这种结果被认为是正常的，这是因为通过所有乳酸细菌生产的抗微生物物质，如细菌素，其不仅能够对致病细菌进行作用，同时作为“领土防御机制”，也对其他乳杆菌进行作用。b)对致病细菌的抗微生物活性 下表显示结果
权利要求
1.益生乳细菌，所述益生乳细菌特别地从驴奶中分离，并选自以编录号DSM22098、DSM 22099、DSM 22100、DSM 22102、DSM 22101、DSM 23558、DSM 23559、和 DSM 23560保藏在DSMZ中的菌株，可从所述菌株获得的突变菌株，并且所述菌株属于植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)群簇，表现出与选自以编录号 DSM 22102、DSM 22101、DSM23558、DSM 23559、和DSM 23560保藏的菌株的菌株至少70%的DNA-DNA同源性和至少99. 5%的 16S RNA 同一性。
2.组合物，包含根据权利要求I所述的一种或众多益生乳细菌种类或菌株。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述的组合物为食品组合物或饮料组合物。
4.制造食品组合物或饮料组合物的方法，至少包含下列步骤 一用根据权利要求I所述的活益生乳细菌接种食品， 一将接种后的食品放置在有利于所述益生乳细菌代谢的环境中， 一发酵所述食品直至获得至少[106]CFU/mL菌群的食品。
5.制造食品组合物或饮料组合物的方法，至少包含下列步骤 一发酵根据权利要求I所述的益生乳细菌直至获得至少[106]CFU/mL的菌群， 一保护所述的益生乳细菌， 一将食品与所述被保护的益生乳细菌混合。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述的发酵在其到达发酵稳定期时终止，优选在将所述益生乳细菌放置在利于其代谢的条件下约24小时内。
7.根据权利要求I所述的益生乳细菌在制备用于治疗与病原微生物粘膜定植关联的疾病的组合物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述的粘膜选自肠粘膜和胃粘膜。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其中所述的病原微生物是肠病原体，如肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、霍舌匕弧菌(Vibrio cholereae)、大肠杆菌(Escherichiacoli)。
10.根据权利要求I所述的益生乳细菌用于使发酵食品防护食品病原体的用途，所述食品病原体如李斯特菌(Lysteria)或沙门氏菌(Salmonella)、弯曲菌(Campylobacter)或梭菌(Clostridium),通过抑制所述食品病原体滋生的进行。
11.根据权利要求I所述的益生乳细菌用于在发酵期间利用所述细菌生产丁酸的用途。
12.用于生产丁酸的方法，包括下列步骤在适当的条件下发酵根据权利要求I所述的益生乳细菌和收集所述细菌在发酵期间产生的所述丁酸。
全文摘要
本发明公开了分离自驴奶的乳杆菌属的益生乳细菌，及其在食品或饮料组合物如发酵奶制产品中的应用。
文档编号A23C9/12GK102753701SQ201080019943
公开日2012年10月24日 申请日期2010年5月5日 优先权日2009年5月5日
发明者A·康提, F·纳扎罗, P·奥兰度 申请人:优罗拉克提斯集团公司