专利名称：有益微生物稳定化预处理工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物的预处理工艺，尤其涉及一种微生物菌种的稳定化预处理工艺。
背景技术：
目前国内外工业化生产过程中常常会遇到菌种老化的问题，菌种往往在繁殖10-15代之后，菌株的活性降低，性能也大大降低。为此，采取措施提高菌种的稳定性、增加菌种的传代次数、保持菌株的高活性是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有益微生物稳定化预处理工艺，以提高菌种的稳定性、增加菌种的传代次数、保持菌株的高活性。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现本发明提供的一种有益微生物稳定化预处理工艺，其步骤为a.在菌种液体培养基中加入2％琼酯，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基；在菌种液体培养基中加入2％琼酯，倒入无菌平板中，制成种子固体平板培养基；在益生元复壮液体培养基中加入2％琼脂，倒入无菌试管中，制成益生元复壮固体斜面培养基；b.从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于36-37℃温度下培养12-16小时；c.待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于36-37℃温度下培养12-16小时；d.将种子斜面固体培养基上长出的菌体，以1％的接种量接种到菌种液体培养基中，于36-37℃温度下，150-170rpm，摇床培养16-20小时，直到OD600＝0.7-0.9，停止培养；e.将步骤d中的菌液转至种子固体斜面培养基上，于36-37℃温度下培养6小时；f.从步骤e的固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至益生元复壮液体培养基上，于37℃温度下，150-170rpm，摇床培养16-20小时后，直到OD600＝0.7-0.9，停止培养；g.步骤f的益生元复壮液体培养基中长出的菌体中无菌吸取0.1ml菌体接种到益生元复壮固体斜面培养基上，于37℃温度下培养20-24小时，作为发酵菌种；或在步骤f中培养的菌液中按体积百分比添加菌液的12-15％的甘油，放置于-20℃温度下保存。
本发明步骤a中所述的菌种液体培养基按重量百分比含有0.3-0.5％的葡萄糖、0.3-0.5％的氯化钠和0.3-0.5％的蛋白胨；益生元复壮液体培养基按重量百分比含有0.3-0.5％的葡萄糖、0.5-1％的氯化钠、0.8-1％的蛋白胨和1.5-2.0％的大豆低聚糖。
本发明步骤b中所述的菌种为施氏假单胞菌属细菌(Pseudomonas stutzeri)2株、枯草杆菌属细菌(Bacillus subtilis)10株以及乳酸菌属细菌(Lactobacillus)1株。
本发明具有以下有益效果本发明能够提高菌种的稳定性、增加菌种的传代次数、保持菌株的高活性。经本发明处理的菌种可以保存2年，菌种在传代100次后依然保持高活性。
具体实施例方式
本发明提供的一种有益微生物稳定化预处理工艺的实施例如下
本实施例所用的菌种为施氏假单胞菌属细菌(Pseudomonas stutzeri)2株、枯草杆菌属细菌(Bacillus subtilis)10株以及乳酸菌属细菌(Lactobacillus)1株。其步骤为a.在由5克葡萄糖、5克氯化钠、3克蛋白胨和1升水(pH6.5)组成的菌种液体培养基中加入2％琼酯，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基；在上述菌种液体培养基中加入2％琼酯，倒入无菌平板中，制成种子固体平板培养基；在由5克葡萄糖、5克氯化钠、3克蛋白胨、20克食用级大豆低聚糖和1升水(pH6.5)组成的益生元复壮液体培养基中加入2％琼脂，倒入无菌试管中，制成益生元复壮固体斜面培养基；b.用无菌接种环从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于37℃温度下培养16小时；c.待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，用无菌接种环挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于37℃温度下培养16小时；d.将种子斜面固体培养基上长出的菌体，以1％的接种量接种到菌种液体培养基中，于37℃温度下，170rpm，摇床培养20小时，每小时测定一次OD600直到OD600＝0.9，停止培养；e.将步骤d中的菌液转至种子固体斜面培养基上，于37℃温度下培养6小时；f.用无菌接种环从步骤e的固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至益生元复壮液体培养基上，于37℃温度下，170rpm，摇床培养20小时后，每小时测定一次OD600直到OD600＝0.9，停止培养；g.用无菌接种环从步骤f的益生元复壮液体培养基中长出的菌体中挑取一环菌体接种到益生元复壮固体斜面培养基上，于37℃温度下培养24小时，作为发酵菌种；或在步骤f中培养的菌液1ml中按体积百分比添加菌液的12-15％的甘油，放置于-20℃温度下，可保存2年。
经上述稳定化预处理工艺处理的菌种可传代100次，仍能保持活性不降低。其效果见表1-3。
表1稳定化预处理对芽孢杆菌的效果
表2稳定化预处理对假单胞菌的效果
表3稳定化预处理对乳酸杆菌的效果
权利要求
1.一种有益微生物稳定化预处理工艺，其步骤为a.在菌种液体培养基中加入2％琼酯，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基；在菌种液体培养基中加入2％琼酯，倒入无菌平板中，制成种子固体平板培养基；在益生元复壮液体培养基中加入2％琼脂，倒入无菌试管中，制成益生元复壮固体斜面培养基；b.从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于36-37℃温度下培养12-16小时；c.待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于36-37℃温度下培养12-16小时；d.将种子斜面固体培养基上长出的菌体，以1％的接种量接种到菌种液体培养基中，于36-37℃温度下，150-170rpm，摇床培养16-20小时，直到OD600＝0.7-0.9，停止培养；e.将步骤d中的菌液转至种子固体斜面培养基上，于36-37℃温度下培养6小时；f.从步骤e的固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至益生元复壮液体培养基上，于37℃温度下，150-170rpm，摇床培养16-20小时后，直到OD600＝0.7-0.9，停止培养；g.步骤f的益生元复壮液体培养基中长出的菌体中无菌吸取0.1ml菌体接种到益生元复壮固体斜面培养基上，于37℃温度下培养20-24小时，作为发酵菌种；或在步骤f中培养的菌液中按体积百分比添加菌液的12-15％的甘油，放置于-20℃温度下保存。
2.根据权利要求1所述的有益微生物稳定化预处理工艺，其步骤a中所述的菌种液体培养基按重量百分比含有0.3-0.5％的葡萄糖、0.3-0.5％的氯化钠和0.3-0.5％的蛋白胨；益生元复壮液体培养基按重量百分比含有0.3-0.5％的葡萄糖、0.5-1％的氯化钠、0.8-1％的蛋白胨和1.5-2.0％的大豆低聚糖。
3.根据权利要求1所述的有益微生物稳定化预处理工艺，其步骤b中所述的菌种为施氏假单胞菌属细菌(Pseudomonas stutzeri)2株、枯草杆菌属细菌(Bacillussubtilis)10株以及乳酸菌属细菌(Lactobacillus)1株。
全文摘要
本发明公开了一种有益微生物稳定化预处理工艺，将菌种在按重量百分比含有0.3－0.5％葡萄糖、0.3－0.5％氯化钠和0.3－0.5％蛋白胨的菌种液体或固体培养基中，以及在按重量百分比含有0.3－0.5％葡萄糖、0.5－1％氯化钠、0.8－1％蛋白胨和1.5－2.0％大豆低聚糖的益生元复壮液体或固体培养基中进行培养处理。本发明能够提高菌种的稳定性、增加菌种的传代次数、保持菌株的高活性。经本发明处理的菌种可以保存2年，菌种在传代100次后依然保持高活性。
文档编号C12N1/20GK1554745SQ20031011751
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月24日 优先权日2003年12月24日
发明者张玲华, 田兴山, 邝哲师, 陈薇, 李健雄 申请人:广东省农业科学院农业生物技术研究所