专利名称：玉米真伪检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体而言是一种利用SSR技术进行玉米真伪检测的试剂盒。
背景技术：
玉米真伪鉴定是玉米种子质量监控及品种权保护的依据。然而，目前全国玉米生产上种植的杂交种有数百个之多，每年参加各省市和国家区试的玉米新品种达数千个，新审定的品种数以百计。在众多品种中，很难通过形态性状将其准确地一一区分加以鉴别。这一方面给种子管理部门、品种保护部门以及广大的种子生产者、经营者和种植者带来很多不便，另一方面也给一些单位和个人以可乘之机。经常出现以甲品种充当乙品种、以未审定品种充当审定品种、以劣品种充当畅销优质品种的现象，或随意更换杂交种亲本改变品种特性以及窃取他人亲本或冒用杂交组合等等。而这些用常规的形态鉴别较难识破，给管理造成较大漏洞。
目前国内外玉米真伪鉴定仍以形态鉴定为主，参考同工酶和种子贮藏蛋白电泳图谱。形态性状的表现受环境影响较大，鉴定工作量大、周期长、受季节限制；同工酶和种子贮藏蛋白多态性不够丰富，此外同工酶存在组织和器官特异性，取材有严格的一致性要求，所以鉴定结果不够稳定。发展高度稳定可靠并有较高区分能力的鉴定技术对新品种登记和保护、品种真伪和种子纯度检验是十分必要的。DNA指纹技术的出现，给种质鉴定带来了革命性的变化，由于它直接反映DNA水平上的差异，具有高度的专一性和特异性，不同物种、同一物种不同品种所得DNA指纹各异，就象人类的指纹一样，成为当今最先进的种质鉴定技术。DNA指纹技术的发展日新月异，除以Southern杂交为基础的RFLP外，近几年已发展出了多种以PCR为基础的新的DNA指纹技术，如RAPD、AFLP、SSR、SCAR、ISSR等及以单核苷酸多态性为基础的SNP技术。但这些技术应用价值不同RFLP技术多态性低，遗传信息有限，需要的DNA模板量大，而且操作复杂；RAPD技术尽管具有简单易行、需DNA量少、易于自动化、实验周期短的优点，但对反应条件较敏感，重复性差；AFLP具有多态性高，稳定性好的优点，但所需DNA模板量大，操作步骤复杂，同时它还是专利技术；SNP技术是以单核苷酸多态性为基础的新型DNA指纹技术，具有高信息含量、高密度和适合自动化操作等优点，然而，除人类外，其它物种的SNP研究较少，且大多数关于SNP的研究仅限于方法上，直接应用的报道极少。与其它标记相比，以微卫星序列为基础的SSR标记显示了独特的优越性SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；具有复等位基因的特性，提供的信息量高；以孟德尔方式遗传，呈共显性；每个位点由设计的引物序列决定，便于不同实验室相互交流合作开发引物，获得的资料能够在不同的实验室重复并共享。虽然SSR引物的开发费用相当高，但由于其巨大的应用潜力，在一些主要农作物中SSR引物的开发正在进行中，目前玉米上已公开的SSR引物序列约2000对，并且每隔一段时间就有新的引物增加，为该技术在玉米纯度及真伪鉴定中的应用提供了良好的条件。
目前，在人类上已经开发了以STR标记为基础的DNA指纹检测试剂盒产品，可以简单快速地进行人类亲子鉴定、真伪鉴定等，然而，在玉米上相应的研究起步较晚，尚无类似的产品出现，限制了DNA指纹技术在玉米品种检测实践中的应用。因此，开发玉米真伪检测试剂盒产品，将为玉米品种质量监控及品种权保护提供有利的工具。
发明内容
为了克服现有检测方法费时费力、稳定性差等不足，本发明以SSR技术为基础，开发了一种适于玉米真伪检测的试剂盒产品，利用该产品不仅检测结果稳定可靠，而且操作简单方便，成本低廉，有利于技术的标准化。
本发明的试剂盒由分离包装的20个玉米SSR引物对、每个引物对的相应的等位梯度分子量标准、PCR反应各组份(MgCl2、Buffer、dNTP、DNA聚合酶)构成，并提供试剂盒使用说明书。其中20个玉米SSR引物对包括bnlg439、bnlg125、bnlg197、phi072、bnlg238、phi126、bnlg161、bnlg240、bnlg162、umcl196、bnlg589、phi116、phi065、phi402893、umc1294、umc1399、umc1559、phi077、phi053、phi080，分别用S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20表示。这些引物是从已公布的玉米SSR引物中筛选出的多态性高、稳定性好、带型清晰的一套引物，经过理论计算及大量筛选试验和检测实践，证明这套引物完全可以满足对所有玉米品种进行真伪检测的需要。选用以上引物的任意组合进行的研究仍在本试剂盒保护范围之内。
等位梯度分子量标准是进行结果检测时分型的对照物，也是本试剂盒的一个重要组成部分，尽管在人类上已有了商品化的STR的等位梯度分子量标准，但玉米上至今尚无制作玉米SSR的等位基因分子量标准的研究报道，也无相关产品出售，本试剂盒首次提供了玉米SSR引物等位基因分子量标准。其制备方法有多种，基本制备程序如下先用本专利提供的引物扩增玉米不同基因型个体；收集每个SSR位点的各个等位基因片段，经纯化后进行DNA测序分析，参考人类STR位点基因分型标准命名原则(玉米上尚无相关命名原则)，命名每个SSR引物的各等位基因片段；将纯化的等位基因片段连接到质粒载体上，经转染、扩大培养、再扩增及再鉴定后，将同一引物的各个等位基因片段等量混合，即获得该引物的等位梯度分子量标准。20个SSR引物对的等位梯度分子量标准分别用M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18、M19、M20表示。
PCR反应各组份(MgCl2、Buffer、dNTP、DNA聚合酶)为可选试剂，既可由本试剂盒提供，也可由用户自己单独购置。
本发明的有益效果本玉米真伪检测试剂盒主要用于检测两个玉米样品是否相同或是否具有亲缘关系(主要是亲子关系)，检测过程简单快速，检测结果稳定可靠，检测一份样品仅需4-5小时，保证了送检样品当日即可出结果。利用该试剂盒，一般种子质检室只需具备常规的分子生物学设备就可按提供的操作步骤进行实际检测。
检测方法比较灵活，用户可结合自己的实际条件选用不同的实施方式既可选用全部引物，也可选用不同的引物组合；提供的SSR引物既可单独扩增，也可通过引物的不同组合进行复合扩增；既可采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，也可采用高浓度琼脂糖、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，染色既可采用银染法，也可采用EB染色、放射性标记等，还可采用四色荧光技术以提高检测效率。
具体实施例方式
实施例1本实施例中试剂盒用于检测待测样品A是否是某已知品种B，即A与B是否为同一品种。操作流程如下(1)DNA提取 将待测样品A及已知品种B的标准样品各提取5份个体DNA，试材可为幼苗、种子、叶片等，可采用CTAB法、SDS法等进行DNA提取。
(2)SSR扩增 利用试剂盒提供的SSR引物对DNA样品进行扩增，反应体系20μl反应液中包括10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，0.001％Gelatin，2.5mmol/L MgCl2，0.16mmol/L 4dNTP，0.25μmol/L SSR引物，1单位Taq DNA聚合酶，2μl DNA模板。反应程序94℃预变性5min，一个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环。PCR扩增在PTC-100 PCR仪(MJ Research，Watertown，MA)上进行。
(3)电泳检测 PCR产物变性后，将每个引物的扩增产物及对应的等位梯度分子量标准在4.5％测序胶上分离，预电泳85W，20min；电泳80W，40min。银染10％冰醋酸固定3min；双蒸水快速漂洗1次，不超过10s；0.2％AgNO3溶液染色5min；显影液(3％NaOH，0.5％甲醛)显影；10％冰醋酸定影。统计并比较待测样品带型与标准样品带型在上述SSR引物位点扩增带型情况，根据相应的公式判断二者是否为同一品种。
实施例2本实施例中试剂盒用于检测待测样品杂交种A是否使用了某一自交系B，即A与B是否具有亲子关系。操作流程如下(1)DNA提取 将待测样品A及已知自交系B的标准样品各提取5份个体DNA，试材可为幼苗、种子、叶片等，可采用CTAB法、SDS法等进行DNA提取。
(2)SSR扩增 利用试剂盒提供的SSR引物对DNA样品进行扩增，反应体系20μl反应液中包括10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，0.001％Gelatin，2.5mmol/L MgCl2，0.16mmol/L 4dNTP，0.25μmol/L SSR引物，1单位Taq DNA聚合酶，2μl DNA模板。反应程序94℃预变性5min，一个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环。PCR扩增在PTC-100 PCR仪(MJ Research，Watertown，MA)上进行。
(3)电泳检测 PCR产物变性后，将每个引物的扩增产物及对应的等位梯度分子量标准在4.5％测序胶上分离，预电泳85W，20min；电泳80W，40min。银染10％冰醋酸固定3min；双蒸水快速漂洗1次，不超过10s；0.2％AgNO3溶液染色5min；显影液(3％NaOH，0.5％甲醛)显影；10％冰醋酸定影。统计并比较待测样品带型与标准样品带型在上述SSR引物位点扩增带型情况，根据相应的公式可以判断二者是否具有亲子关系。
权利要求
1.一种玉米真伪检测试剂盒，可用于检测两个样品是否相同或是否具有亲缘关系。其特征在于由分离包装的20个玉米SSR引物对、每个引物对的相应的等位梯度分子量标准、PCR反应各组份(MgCl2、Buffer、dNTP、DNA聚合酶)构成，并提供试剂盒使用说明书。其中20个玉米SSR引物对包括bnlg439、bnlg125、bnlg197、phi072、bnlg238、phi126、bnlg161、bnlg240、bnlg162、umc1196、bnlg589、phi116、phi065、phi402893、umc1294、umc1399、umc1559、phi077、phi053、phi080，分别用S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20表示。经过理论计算及大量筛选试验和检测实践，证明这套引物完全可以满足对所有玉米品种进行真伪检测的需要。等位梯度分子量标准是进行结果检测时分型的对照物，也是本试剂盒的一个重要组成部分，本试剂盒首次提供了玉米SSR引物等位基因分子量标准，20个SSR引物对的等位梯度分子量标准分别用M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10表示。MgCl2、Buffer、dNTP、DNA聚合酶为可选试剂，既可由本试剂盒提供，也可由用户自己单独购置。
2.由权利1所述的玉米真伪检测试剂盒，其特征在于20个玉米SSR引物为bnlg439、bnlg125、bnlg197、phi072、bnlg238、phi126、bnlg161、bnlg240、bnlg162、umc1196、bnlg589、phi116、phi065、phi402893、umc1294、umc1399、umc1559、phi077、phi053、phi080。提供的这些引物既可全部使用，也可单独使用，或者以不同的引物组合方式使用；既可分别扩增，也可通过引物的不同组合进行复合扩增；既可采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，也可采用高浓度琼脂糖、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，染色既可采用银染法，也可采用EB染色、放射性标记等，还可采用四色荧光技术以提高检测效率。在这20个SSR引物基础上的各种变化方式均在本试剂盒保护范围之内。
3.由权利1所述的玉米真伪检测试剂盒，其特征在于提供的20个SSR引物均配有相应的等位梯度分子量标准，分别以M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18、M19、M20表示。
全文摘要
一种玉米真伪检测试剂盒。其特征在于由分离包装的20个玉米SSR引物对、每个引物对的相应等位梯度分子量标准、PCR反应各组份(MgCl
文档编号C12Q1/68GK1546688SQ200310117180
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月5日 优先权日2003年12月5日
发明者王凤格, 赵久然, 郭景伦 申请人:北京市农林科学院玉米研究中心