专利名称：含有益生微生物的冷冻糖食的制作方法
含有益生微生物的冷冻糖食本发明涉及冷冻酸奶领域。特别地，本发明提供包含非复制型益生微生物的冷冻酸奶组合物。这些非复制型益生微生物可以是例如有生物活性的热处理的益生微生物或仍有生物活性的低温挤出的益生微生物。本发明也涉及由这些非复制型益生微生物提供的健康益处。同时，益生菌的健康益处在本领域中被充分接受并且例如由Blum等人，在CurrIssues Intest Microbiol.2003Sep; 4 (2): 53-60中总结。共生制剂中益生菌经常与益生元一起施用，其可以甚至具有增强的健康益处。通常，益生菌目前在例如酸奶和酸奶饮料的构架内出售。然而，仅在益生菌实际上被消费者消费时，它们才可以传递其健康作用。换而言之，在通常受充分喜好的产品中提供益生菌将使广泛消费者可获得益生菌的健康益处。冷冻酸奶是几乎每个人、尤其儿童和青少年充分喜好的产品。另外，通常将冷冻酸奶视为冰淇淋的低热量替代品。对于冰淇淋，M.ff.Modler等人报道，含有双歧杆菌和低聚果糖的冰淇淋对人类健康具有值得关注的意义(Cult.Dairy Prod.J., 25,第 4-9 页,1990 ；Canadian Dairy, 75,第10页，1996)。同样，EP307523(Yakult Honsha KK)报道，含有益生纤维的发酵乳可以按冰淇淋形式包装并且因此用来治疗某些肠胃病。将这种概念用于冷冻酸奶将允许这个原理延用于冷冻酸奶。然而，使膳食纤维与乳酸细菌接触具有明显缺点。这些缺点类型各异并且尤其涉及例如纤维在甜食制备和储存期间的过早破坏并涉及对于产生这些纤维的生物学活性而言不良的体内条件。US6399124旨在通过在含有纤维的支持物和含有益生菌的冰淇淋之间提供可食用屏障而将使冷冻甜食中的膳食纤维和益生菌分隔来克服这些缺点。益生细菌已知能够黏附于人肠道细胞并且逐出人肠道细胞上的病原菌。为具有这种活性，益生细菌必须在产品中保持有活力直至被消费。对产业而言，这是一项难题，并且例如，US4308287提出一种方法来实现这一点。合乎需要的是获得一种冷冻酸奶组合物，所述组合物能够甚至在益生菌的临界条件下较长储存时间后递送益生益处，同时制备简单。如果通过使用现有产业技术，利用施用安全且无副作用并且容易掺入冷冻酸奶组合物的天然成分实现这一点，这将是优选的。进一步改善这类制品中益生菌的免疫增强作用也将是合乎需要的。进一步改善这类制品中益生菌的抗炎作用还将是合乎需要的。本发明人已经满足这种需要。因此本发明的目的是改善现有技术并提供满足上述需要的冷冻酸奶组合物。本发明人出人意料地看到他们能通过独立权利要求的主题实现该目的。从属权利要求进一步发展本发明的想法。因此，本发明人提出，提供包含非复制型益生微生物的冷冻酸奶组合物。冷冻酸奶是由酸奶制成或含有酸奶的冷冻乳产品。冷冻酸奶可以充当例如甜食或点心。本发明人能够显示甚至非复制型益生菌可以提供益生菌的健康益处并且可以甚至具有改善的益处。因此，保持益生菌在成品中活着并且确保它们活着抵达肠中的复杂措施似乎是不必要的。另外，在冷冻酸奶产品中使用非复制型益生菌也允许这种产品在一个制备物中使益生菌和益生元在一起，而不存在纤维在产品制备和储存期间不希望的过早破坏风险。非复制型微生物在本发明的冰淇淋组合物中的量可以对应于每份次约IO6至1012cfu。显然，非复制型微生物不形成菌落，因而，该术语应理解从IO4和1012cfu/g复制型细菌中获得非复制型微生物的量。这包括灭活的、无活力的或死的或作为片段如DNA或者细胞壁或细胞质化合物存在的微生物。换而言之，组合物含有的微生物的量就这个量的微生物的菌落形成能力(cfu)而言进行表述，如同全部微生物是活的那样，而无论它们实际上是否不复制，如是灭活或死的、片段化的或这些状态中任意者或全部的混合体。 任何冷冻酸奶组合物可以用于本发明的目的。例子是普通冷冻酸奶、低脂冷冻酸奶、不加糖的冷冻酸奶或不加糖的低脂冷冻酸奶。例如，这类冷冻酸奶组合物可以包含约0-12重量％的脂肪、约5-15重量％的非脂肪乳固形物，约5-32重量％的碳水化合物、约1-5重量％的蛋白质和约30-45重量％的总固形物含量。当然，可以添加水果、巧克力、香夹兰、焦糖、咖啡、坚果、谷物、蜜和或其他风味组分。冷冻酸奶组合物还可以包含约1-25重量％的添加糖。冷冻酸奶也可以包含益生元。“益生元”意指促进肠中益生菌生长的食用物质。它们在胃和/或上肠道中不分解或者吸附于摄取它们的人的胃肠道中，但是它们被胃肠道微生物区系和/或被益生菌发酵。益生兀例如由 Glenn R.Gibson 和 Marcel B.Roberfroid, Dietary Modulation of theHuman Colonic Microbiota:1ntroducing the Concept of Prebiotics (人结肠小型生物群的膳食调节:引入益生元概念)，J.Nutr.1995125:1401-1412定义。不特别地限制可以根据本发明使用的益生元并且它们包括促进肠中益生菌生长的所有食用物质。优选地，它们可以选自低聚糖，其任选地包括果糖、半乳糖、甘露糖；膳食纤维，特别地，可溶性纤维、大豆纤维；菊粉；或它们的混合物。优选的益生元是低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(IOS)、低聚异麦芽糖、低聚木糖、大豆低聚糖、糖基蔗糖(GS)、乳蔗糖(LS)、乳果糖(LA)、低聚帕拉金糖(PAO)、低聚麦芽糖(MOS)、树胶和/或其水解物、果胶和/或其水解物。益生元的常见例子是低聚果糖和菊粉。本发明的冷冻酸奶组合物还可以包含与冷冻酸奶联合的可食用支持物，所述支持物是人类可食用的并且包含益生元。这些益生元可以是蛋白质性质或糖性质的，例如选自植物果胶、壳寡糖(chito-oligosaccharides)、低聚果糖、龙胆寡糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚甘露糖或低聚木糖；大豆低聚糖、菊薯(Polymnia sonchifolia)低聚糖、洋蓟低聚糖、洋葱低聚糖或芦笋低聚糖；或抗性淀粉，或[3 ]_葡聚糖含量高的产物，如燕麦浓缩物，例如(Playne等人；Fukai 等人，Soil Sc1.Plant Nutr.，39，567-571，1993)。优选的果胶是具有10至400kDa级别分子量的[a ]-1，4_D_半乳糖醛酸聚合物，所述聚合物可以从例如胡萝卜或番茄纯化(JP60164432)。优选的低聚半乳糖包含由2至5 个重复结构单元{_[ a ]-D-Glu-(l->4)_P ]-D-Gal-(l_>6)-}组成的糖部分(YakultHonsa C0.，日本)。优选的低聚果糖是从菊苣提取的菊粉寡果糖，其可以包含例如1_9个重复结构单元{- [ ^ ] -D-Fru- (1->2) - [ ^ ] -D-Fru- (1->2) -} (W094/12541 ；RaffinerieTirlemontoise S.A., Belgium),或从鹿糖单元合成的低聚糖,所述低聚糖可以包含例如由2至9个重复结构单元{-[a ]-D-Glu-(1->2)-[ ^ ]-D-Fru-(1_>2)-}组成的鹿糖部分(Meiji Seika Kasiha C0.,日本)。优选的低聚麦芽糖包含由2至7个重复结构单元{-[ a ]-D-Gal-(1->4)-}组成的糖部分(Nihon Shokuhin Kako C0.,日本)。优选的异麦芽糖包含由2至6个重复结构单元{_[ a ]-D-Glu-(1->6)-}组成的糖部分(Showa SangyoC0.，日本)。优选的龙胆寡糖包含由2至5个重复结构单元{-
-D-Glu-(1->6)-}组成的糖部分(Nihon Shokuhin Kako C0.，日本)。最后，优选的低聚木糖包含例如由2至9个重复结构单元{-[ P ]-xy1-(1-M) _}组成的糖部分(Suntory C0.,日本)。益生元在本发明的冷冻酸奶 组合物中的量取决于它们促进乳酸细菌发育的能力。作为一般原则，支持物可以含有0.1至20%的这类益生元(相对于干物质含量以重量计)。冷冻酸奶组合物可以包含例如与至少103cfu/g益生元、优选地IO4至107cfu/g益生元的量相对应的非复制型益生菌量。本发明人出人意料地发现，例如，就免疫增强作用而言和/或就抗炎作用而言，非复制型益生微生物甚至可以比复制型益生微生物更有效。这是出人意料的，因为益生菌经常定义为“当足量施用时赋予宿主健康益处的活微生物”(FA0/WH0指南)。绝大多数的公开的文献涉及活的益生菌。此外，几项研究调查了由非复制型细菌递送的健康益处，并且这些研究中的大部分表明益生菌的灭活(例如通过热处理)导致所声称的健康益处丧失(Rachmilewitz, D.等人,2004，Gastroenterologyl26:520-528 ；Castagliuolo 等人，2005，FEMS Immunol.Med.Microbiol.43:197-204 ；Gill,H.S.K.J.Rutherfurd, 2001, Br.J.Nutr.86:285-289 ；Kaila,M.等人，1995，Arch.Dis.Child72:51_53.)。一些研究显示死的益生菌可以保留一些健康作用(Rachmilewitz, D.等人，2004，Gastroenterologyl26:520-528 ;Gill，H.S.和 K.J.Rutherfurd, 2001，Br.J.Nutr.86:285-289)，但是显然，本领域迄今认为活的益生菌表现得更好。“非复制型益生微生物”包括已经热处理过的益生细菌和已经挤出的益生细菌。这包括灭活的、死的、无活力的和/或作为片段如DNA、代谢物、细胞质化合物和/或细胞壁物质存在的微生物。“非复制型”意指不能通过常规铺板方法检测到活细胞和/或菌落形成单位。此类常规铺板方法概述于微生物学书籍:James Monroe Jay, Martin J.Loessner, DavidA.Golden.2005.Modern food microbiology.第七版，Springer Science, New York, N.Y.第790页中。一般而言，可以如下显示活细胞的不存在:接种不同浓度的细菌制备物(‘非复制型’样品)并且在适宜条件(有氧和/或厌氧气氛持续至少24小时)下培养后，琼脂平板上无可见到的菌落或液体生长培养基中浊度不增加)。
为本发明的目的，将益生菌定义为“有益地影响宿主健康或安康的微生物细胞制备物或微生物细胞组分”(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.等人“Probiotics:howshould they be defined ”(益生菌:应当如何定义它们？)Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。本发明的组合物以足够至少部分地产生健康益处的量包含益生微生物和/或非复制型益生微生物。将足够实现这一点的量定义为“治疗有效剂量”。有效用于这个目的的量将取决于本领域技术人员已知的多种因素，如消费者的体重和总体健康状况，并且取决于食物基质的作用。在预防性应用中，将本发明的组合物以这样量施用至易患某疾病或具有患上该疾病风险的消费者，所述的量足够至少部分地降低发生该疾病的风险。将这种量定义为“预防性有效剂量”。再次地，精确的量取决于多种因素，如消费者的健康状况和体重，并且取决于食物基质的作用。本领域技术人员将能够适宜地调节治疗有效剂量和/或预防性有效剂量。通常，本发明的组合物以治疗有效剂量和/或以预防性有效剂量含有非复制型益生微生物。一般而言，治疗有效剂量和/或预防性有效剂量处于每日剂量约0.005mg-1000mg非复制型益生微生物的范围内。优选地，非复制型 微生物以等同于IO4至109cfu/g干组合物之间的量、甚至更优选地以等同于IO5与IO9CfVg干组合物之间的量存在。可以通过本领域已知的任意方法使益生菌不复制。目前可用于使益生菌株不复制的技术通常是热处理、Y辐射、紫外线或使用化学物质(甲醛水溶液、低聚甲醛)。也已经发现，通过施加某种剪切处理如低温挤出中所用的剪切处理使益生菌有生物活性的同时不复制。因此，根据另一个实施方案，通过低温挤出使益生菌不复制。低温挤出常用于冷冻糖果产品领域中并且指在负温度、通常在低于-11° C的温度挤出。就数字量而言，例如“短时高温”处理的非复制型微生物可以在这种组合物中以对应于IO4和IO12等同cfu/g的干组合物之间的量存在。将优选使用在食品工业中工业条件下相对容易应用的技术使益生菌不复制。现今市场上含有益生菌的大部分产品在其生产期间经热处理。因此，将便利的是，能够随同产生的产品一起或至少以相似方式热处理益生菌，同时益生菌保留或改善其对消费者而言的有益特征或甚至获得新的有益特征。然而，通过热处理或通过强剪切处理如低温挤出中使用的那些处理灭活益生微生物通常在文献中与益生活性的至少部分丧失有关。本发明人现在已经出人意料地发现，使得益生微生物不复制，例如通过热处理或通过低温挤出，没有导致益生健康益处丧失，而相反，可以增强现有的健康益处并且甚至产生新的健康益处。因而，本发明的一个实施方案是一种冷冻酸奶组合物，其中通过热处理使非复制型益生微生物不复制，并且本发明的第二实施方案是一种冷冻酸奶组合物，其中通过低温挤出使非复制型益生微生物不复制。
关于热处理，优选地，独立地实施微生物的热处理并且随后可以将所得到的非复制型益生微生物添加至冷冻酸奶混合物。这种热处理可以在至少71.5° C实施至少I秒。可以使用长时热处理或短时热处理。如今在工业界，通常优选短时热处理，如优选巴氏杀菌法。这种类型的热处理降低细菌载量，并且缩减加工时间，因而减少养分的破坏。本发明人首次展示，高温短时热处理的益生微生物显示出抗炎免疫谱，无论其初始特征是什么。具体地，通过这种热处理，新的抗炎谱(ant1-1nflammatory profile)形成或现有的抗炎谱增强。因此，现在可以通过使用与可工业应用的常见热处理相对应的具体热处理参数产生具有抗炎免疫谱的非复制型益生微生物，即便活的对应物不是抗炎菌株。因而，例如，热处理可以是在约71.5-150° C持续约1-120秒的高温处理。高温处理可以是高温/短时(HTST)处理、高热短时处理(HHST)或超高温(UHT)处理。益生微生物可以经历在约71.5-150° C持续约1-120秒短时的高温处理。更优选地，益生微生物可以经历在约90-140° C(例如90-120° C)持续约1_30秒短时的高温处理。这种高温处理至少部分地使微生物不复制。该高温处理可以在常压实施，但是也可以在高压下实施。常见的压力范围是从I至50巴，优选地从1-10巴，甚至更优选从2至5巴。显然，当热施加时，如果益生菌在呈液态或固态的培养基中进行热处理，则这是优选的。待施加的理想压力因此将取决于提供所述微生物的组合物的性质并且取决于所用的温度。高温处理可以在约71.5-150 ° C、优选地约90-120 ° C、甚至更优选约120-140° C的温度范围内实施。高温处理可以实施持续约1-120秒、优选地约1-30秒、甚至更优选约5-15秒的短时。这个给定的时间框指益生微生物经历给定温度的时间。注意，取决于提供所述微生物的组合物的性质和量并且取决于所用加热装置的架构，施加热的时间可以不同。然而一般而言，通过高温短时(HTST)处理法、巴氏瞬间杀菌法或超高温(UHT)处理法处理本发明的组合物和/或微生物。UHT处理法是涉及通过在超过135° C(275° F)的温度将某组合物加热持续短时约1-10秒来至少部分消毒该组合物的超高温加工或超高热处理法(二者均缩写为UHT)，其中所述的温度是杀死乳内细菌孢子所需要的温度。例如，以这种方式使用超过135° C的温度加工乳，导致细菌载量在能进行连续流操作的必需保持时间(至2-5秒)内降低。存在两种王要类型的UHT系统:直接系统和间接系统。在直接系统中，通过蒸汽嗔射或蒸汽浸入法处理产品，而在间接系统中，使用板式换热器、管式换热器或刮面式换热器对产品热处理。可以在产品制备过程中的任意步骤或多个步骤使用UHT系统的组合。HTST处理定义如下(高温/短时):设计旨在实现乳中活微生物数目下降5个对数、杀死乳中99.9999%活微生物的巴氏杀菌法。认为这足以摧毁几乎全部酵母、霉菌和常见腐败细菌并且还确保充分摧毁常见的致病性耐热生物。在HTST法中，将乳加热至71.7° C(161° F)持续 15-20 秒。巴氏瞬间杀菌法是对易腐饮料如果汁和植物汁、啤酒和乳产品进行热巴氏杀菌的方法。这种方法在灌装至容器之前进行，目的是杀死腐败微生物，以使产品更安全并延长它们的货架期。液体以受控的连续流运动，同时经历71.5° C(160° F)至74° C(165° F)的温度约15至30秒。为了本发明的目的，术语“短时高温处理”应当包括例如高温短时(HTST)处理、UHT处理和巴氏瞬间杀菌。由于这种热处理提供具有改善抗炎谱的非复制型益生菌，故本发明的组合物可以用于炎性疾病的预防或治疗。不具体地限制可以由本发明的组合物预防或治疗的炎性疾病。例如，这些炎性疾病可以选自急性炎症如败血症；烧伤；和慢性炎症，如炎性肠病例如节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、结肠袋炎(pouchitis);坏死性小肠结肠炎；皮肤炎症，如UV或化学品诱导的皮肤炎症、湿疹、反应性皮肤；肠激惹综合征；眼部炎症；变态反应、哮喘和它们的组合。如果使用长时热处理使益生微生物不复制，这种热处理可以是在约70-150° C的温度范围实施约3分钟-2小时，优选地在80-140° C的范围实施约5分钟-40分钟。尽管现有技术一般教导就显现其益生特征而言，因长时热处理而变得不复制的细菌通常比活细胞低效，然而，本发明人能够显示，热处理的益生菌与它们的活对应物相比在刺激免疫系统方面是优越的。本发明也涉及包含益生微生物的组合物，其中通过在至少约70° C持续至少约3分钟的热处理使所述益生微生物不复制。通过分析体外免疫谱(immunoprofiling)法证实非复制型益生菌的免疫增强作用。所用的体外模型使用来自人外周血单个核细胞(PBMC)的细胞因子谱并且在本领域被充分接受作为检验免疫调节复合物的标准模型(Schultz等人，2003，Journal of Dairy Research70, 165-173 ；Taylor 等人，2006，Clinicaland Experimental Allergy, 36, 1227-1235 ；Kekkonen 等人，2008，World Journal ofGastroenterology, 14, 1192-1203)。体外PBMC测定法已经由几位作者/几个研究小组用来例如将益生菌根据其免疫谱即其抗炎或促炎特征分类(Kekkonen等人，2008，World Journalof Gastroenterology, 14, 1192-1203)。例如，已经显示这种测定法允许预测益生菌候选物在小肠结肠炎小鼠模型中的抗炎作用(Foligne，B.等人，2007, WorldJ.Gastroenterol.13:236-243)。另外，这种测定法常规地用作临床试验中的读出并且显示它导致与临床结果相符的结果(Schultz等人，2003，Journal ofDairy Research70, 165-173 ；Taylor 等 人,2006,Clinical and ExperimentalAllergy, 36，1227-1235)。变应性疾病在过去几十年期间稳定上升，并且它们目前被WHO视为流行病。在一般情况下，认为变态反应因免疫系统的Thl和Th2应答之间不平衡，从而引起强烈偏向Th2介质产生所致。因此，可以通过恢复免疫系统的Thl和Th2应答之间的适宜平衡来减轻、下调或预防变态反应。这暗示降低Th2应答或增强(至少短暂增强)Thl应答的必要性。后者是免疫增强应答的特征，经常例如伴以较高水平的IFNy、TNF-a和IL-12 (Kekkonen等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203 ；Viljanen M.等人，2005，Allergy, 60，494-500)。本发明的冷冻酸奶组合物因而允许治疗或预防与受损的免疫防御有关的疾病。因而，不具体地限制可以由本发明的组合物预防或治疗的与受损免疫防御关联的疾病。例如，这些疾病可以选自感染、特别地选自细菌性、病毒性、真菌性和/或寄生虫感染；吞噬细胞缺损症；低度至重度免疫抑制水平(如由压力或免疫抑制药物、化疗法或放疗法引起的那些)；具有较低免疫力的免疫系统的天然状态(如新生儿免疫系统的天然状态)；变态反应；和它们的组合。本发明中所述的冷冻酸奶组合物还允许增强儿童对疫苗、尤其对口服疫苗的反应。根据第二实施方案，通过施加强剪切处理如低温挤出使非复制型微生物不复制。低温挤出，在冷冻糖果产品领域也称作低温冷冻，例如在US7261913中描述，所述专利的内容通过引用的方式在此包含。这种处理例如由以下组成:以I至501/s范围内的剪切速率施加剪切处理或产生2500至75000Pa范围内的剪切应力，同时在螺杆挤出机中维持临界温度。螺杆挤出机可以是如W02005/070225中描述的那种。可以在单螺杆挤出机或双螺杆挤出机中进行挤出。具体而言，通过低温挤出造成不复制的非复制型微生物也显示热处理抗炎益处。任何量的非复制型微生物将是有效的。然而，如果至少90%、优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%、理想地至少99.9%、最理想地全部益生菌是不复制的，这通常是优选的。在本发明的一个实施方案中，全部微生物均是不复制的。因此，在本发明的组合物中，至少90%、优选至少95%、更优选至少98%、最优选至少99%、理想地至少99.9%、最理想地全部的益生菌可以是不复制的。所有益生微生物可以用于本发明的目的。例如，益生微生物可以选自双歧杆菌属(bifidobacteria)、乳杆菌属(Iactobacilli)、丙酸杆菌属(propionibacteria)或它们的组合，例如长双歧杆菌(Bifidobactrerium 1ngum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酿乳杆菌(Lactobacillus casei)、类干酿乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、双乙酸乳酸乳球菌(Lactococcusdiacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和 / 或它们的混合物。本发明的组合物可以例如包含选自以下的益生微生物:长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、约氏乳杆菌Lal、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002(NCC1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC15、乳酸乳球菌NCC2287或它们的组合。全部这些菌株均根据布达佩斯条约保藏和/或是市售的。以下菌株已经根据布达佩斯条约保藏:长双歧杆菌NCC3001:ATCC BAA-999长双歧杆菌NCC2705:CNCM 1-2618短双歧杆菌NCC2950CNCM 1-3865乳双歧杆菌NCC2818:CNCM 1-3446类干酪乳杆菌NCC2461: CNCM 1-2116鼠李糖乳杆菌NCC4007: CGMCC1.3724嗜热链球菌NCC2019:CNCM 1-1422嗜热链球菌NCC2059:CNCM 1-4153乳酸乳球菌NCC2287:CNCM 1-4154干酪乳杆菌NCC4006:CNCM` 1-1518干酪乳杆菌NCC1825:ACA-DC6002嗜酸乳杆菌NCC3009:ATCC700396保加利亚乳杆菌NCC15: CNCM 1-1198约氏乳杆菌LalCNCM 1-1225路氏乳杆菌DSM17983DSM17983路氏乳杆菌ATCC55730 ATCC55730大肠杆菌Nisslel917:DSM6601以ATCC命名的菌株保藏于ATCC专利保藏机构，10801University Blvd.,马纳萨斯，弗吉尼亚州20110，美国。以CNCM命名的菌株保藏于法国微生物保藏中心(COLLECTION NATIONALE DECULTURES DE MICROORGANISMES) (CNCM)，25 杜博士路，F-75724 巴黎 15 区，法国。以CGMCC命名的菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center),中国科学院微生物学研究所，中关村，由政信箱2714，北京100080，中国。以ACA-DC命名的菌株保藏于希腊协作微生物保藏中心(Greek CoordinatedCollections of Microorganisms),乳品实验室，食品科学与技术系，雅典农业大学,75,Iera odos, Botanikos,雅典,11855,希腊。以DSM命名的菌株保藏于DSMZ-德国微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen)GmbH,Inhoffenstr.7B',38124Braunschweig,国。本领域技术人员将理解他们可以自由地组合本文中所述发明的全部特征，而不偏离如所公开的本发明的范围。
本发明的其他优点和特征从以下实施例和附图中显而易见。
图1A和B显示以“短时高温”处理的益生菌增强抗炎免疫谱。图2显示变得抗炎的，即以“短时高温”处理后显示明显的体外抗炎免疫谱的非抗炎性益生菌株。图3A和3B显示市售产品中使用的益生菌株，其以“短时高温”处理后显示增强的或新的体外抗炎免疫谱。图4A和4B显示在高温热处理时显示增强的或新的体外抗炎免疫谱的乳品起子菌株(即Lcl起子菌株)。图5显示以HTST处理法处理后显示抗炎免疫谱的非抗炎益生菌株。图6:对用活形式和热处理形式(140° C持续15秒)下的益生菌株和乳品起子菌株产生PBMC数据(IL-12p40、IFN- y , TNF- a、IL-10)的主要组分分析。每个圆点代表由其NCC编号或名称鉴别的一种活的或热处理的菌株。图7显示活菌株和热处理菌株(85° C，20分钟)的IL-12p40/IL_10比。总体而言，与本发明的“短时高温”处理(图1、2、3、4和5)相反，在85° C持续20分钟的热处理导致IL-12p40/IL-10比的增加。图8显示来自用热处理的细菌刺激的人PBMC中的体外细胞因子分泌增强。图9显示以盐水攻击的OVA致敏小鼠(阴性对照)、以OVA攻击的OVA致敏小鼠(阳性对照)和以OVA攻击并用热处理或活的短双歧杆菌NCC2950治疗的OVA致敏小鼠中观察到的腹泻强度百分数。结果显示为腹泻强度百分数(从4个独立实验计算的均数土SEM)，而100%腹泻强度对应于(用过敏原致敏和攻击的)阳性对照组中出现的症状。图10显示用来产生含有非复制型益生微生物(作为湿混合物注入挤出机的益生微生物)的挤出基质的工艺的流程图。图11显示用来利用冷挤压法产生含有非复制型益生微生物(作为湿混合物注入挤出机的益生微生物)的挤出基质的工艺的流程图。图12显示可以用来产生含有非复制型益生微生物(益生微生物是干混合物的部分)的挤出基质的备选工艺的流程图。图13显示PCA分析几份挤出样品的细胞因子谱的结果。图注:A:BL818800转/分钟，B:BL8181000 转 / 分钟，C:BL8181200 转 / 分钟，D:BL81885° C，E:BL818100° C，F:BL818120。C，G:BL818140。C，H:BL818120。C/15 秒，1:BL818140。C/15 秒，J:LPR800 转 / 分钟，K:LPR1000 转 / 分钟，L:LPR1200 转 / 分钟，M:LPR85° C,N:LPR100° C，
O:LPR120 ° C，P:LPR140 ° C，Q:LPR120 ° C/15 秒，R:LPR140 ° C/15 秒，S:ST11800 转/ 分钟，T:ST111000 转 / 分钟，U:ST111200 转 / 分钟，V:ST1185° C，W:ST111000 C，X:ST11120。C, Y:ST11140° C，Z:ST11120。C/15 秒，AZ:ST11140。C/15 秒。图14显示对长双歧杆菌BL818的不同挤出制品的细胞因子谱进行PCA分析的结果O图15显示对类干酪乳杆菌STll的不同挤出制品的细胞因子谱进行PCA分析的结
果O实施例1:方法学
细菌制备物:由活益生菌对宿主免疫系统递送的健康益处通常视为具有菌株特异性。体外诱导高水平IL-10和/或诱导低水平促炎细胞因子(PBMC测定法)的益生菌已经在体内显示是强力抗炎菌株(FoligneB.等人，2007, World J.Gastroenterol.13:236-243)。使用几种益生菌株来研究热处理的益生菌的抗炎特征。这些菌株是长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002 (NCC1825)和大肠杆菌Nissle。也测试了包括商业上用来产生Nestl6Lcl发酵产品的一些菌株在内的几种起子培养菌株:嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、保加利亚乳杆菌NCC15和乳酸乳球菌NCC2287。在5至15L生物反应器中为每种菌株优化的条件下培养细菌细胞。全部常见的细菌生长培养基是可用的。此类培养基是本领域技术人员已知的。当调节pH至5.5时，连续地添加30%碱溶液(NaOH或Ca (OH) 2)。当充分时，通过用CO2顶空充气维持厌氧条件。大肠杆菌在标准的有氧条件下培养。将细菌细胞通过离心(5000Xg, 4° C)收集并且重悬于足够体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，旨在达到约109-101QCfu/ml终浓度。将部分的制备物以15%甘油冷冻在-80° C。另一部分的细胞通过以下方式作热处理:-超高温:140°持续15秒；通过间接蒸汽注入。-高温短时(HTST):74° C、90° C和120° C持续15秒，通过间接蒸汽注入-水浴中长时间低温(85°C，20分钟)热处理后，将样品保持在-80 ° C冷冻直至使用。细菌制备物的体外免疫谱:评估活细菌制备物和热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导特定细胞因子从人血细胞分泌的能力)。自血液滤器分离人外周血单个核细胞(PBMC)。在通过细胞密度梯度分开后，将单个核细胞收集并且用Hank平衡盐溶液洗涤两次。细胞随后重悬于补充有10%胎牛血清(Bioconcept,巴黎,法国)、1%L_谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/链霉素(Sigma)和 0.1% 庆大霉素(Sigma)的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基(IMDM, Sigma)中。PBMC(7xl05个细胞/孔)随后与48孔板中的活细菌和热处理细菌(等同于7xl06cfu/孔)温育36小时。检验活细菌和热处理细菌对PBMC的影响，其中所述的PBMC来自分配至2个分别实验中的8位个体。在36小时温育后，将培养板冷冻并且保存在-20° C直至细胞因子测量。对活细菌及其热处理的对应物平行地(即在相同的实验中对相同批次的PBMC)实施细胞因子谱分析。按照制造商的说明书，通过ELISA (R&D DuoSet 人 IL-10、BD OptEIA 人 IL12p40、BD OptEIA人TNF a、BD OptEIA人IFN- Y )测定36小时温育后细胞培养上清液中细胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-a 和 IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40 和 TNF-a 是促炎细胞因子，而IL-10是强力抗炎介质。结果表述为4位个体供体的均值(pg/ml)+/-SEM并且是各自用4位供体进行的2个独立实验的代表。对每种菌株，计算IL-12p40/IL-10比作为体内抗炎作用的预测值(FoligneB.等人，2007，World J.Gastroenterol.13:236-243)。通过ELISA对每种菌株测定(见上文)的细胞因子数字值(pg/ml)转移入BioNumerics v5.10 软件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利时)。对这组数据实行主要组分分析法(PCA，量度技术)。在这个分析中包括从数值减去平均值和数值除以方差。结果通过超高温(UHT)/高温短时(HTST)样处理法产生的抗炎谱使研究的益生菌株经历一系列热处理(超高温(UHT)、高温短时(HTST)和85° C持续20分钟)，并且将它们的免疫谱与体外活细胞的免疫谱比较。与人PBMC —起培养时，活微生物(益生菌和/或乳品起子培养物)诱导不同水平的细胞因子产生(图1、2、3、4和5)。对这些微生物的热处理以温度依赖性方式调节由PBMC产生的细胞因子的水平。“短时高温”处理(120° C或140° C持续15秒)产生具有抗炎免疫谱的非复制型细菌(图1、
2、3和4)。实际上，UHT样处理的菌株(140° C，15秒)诱导较少的促炎细胞因子(TNF-α、IFN- Y、IL-12p40)，同时维持或诱导额外的IL-10产生(与活的对应物相比)。与活细胞相比，得到的IL-12p40/IL-10比对于任何UHT样处理的菌株是较低的(图1、2、3和4)。这个观察结果也对经受HTST样处理(即经历120° C持续15秒(图1、2、3和4)或74° C和90° C持续15秒(图5))的细菌有效。热处理(UHT样处理或HTST样处理)对益生菌株(图1、2、3和5)和乳品起子培养物(图4)的体外免疫谱具有相似的影响。针对用活益生菌株及乳品起子菌株和热处理(140° C，15秒)的益生菌株及乳品起子菌株所产生的PBMC数据进行主要组分分析，显示活菌株均沿X轴展开，这说明菌株显示非常不同的体外免疫谱，从促炎细胞因子的低级(左侧)至高级(右侧)诱导物。热处理的菌株群集在该图的左侧，从而表明热处理的菌株诱导的促炎细胞因子少得多(图6)。相反，在85° C热处理20分钟的细菌比活细胞诱导更多的促炎细胞因子和更少的IL-10，从而产生较高的IL-12p40/IL-10 比(图 7)。通过UHT样和HTST样处理法增强或产生抗炎谱UHT和HTST处理的菌株显示抗炎谱，无论它们各自的初始免疫谱(活细胞)是什么。显示了已知在体内抗炎并且显示体外抗炎谱的益生菌株(长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818)在“短时高温”处理后展示出增强的抗炎谱。如图1中所示，UHT样处理的双歧杆菌菌株的IL-12p40/IL-10比低于来自活对应物的IL-12p40/IL-10比，因而显示经UHT样处理的样品的改善的抗炎谱。更令人震惊地，还证实非抗炎性活菌株因UHT样和HTST样处理产生抗炎谱。活的鼠李糖乳杆菌NCC4007和类干酪乳杆菌NCC2461均显示高的体外IL-12p40/IL-10比(图2和5)。这两种活菌株显示对小鼠中TNBS诱导的结肠炎无保护性。“短时高温”处理(UHT或HTST)后，由鼠李糖乳杆菌NCC4007和类干酪乳杆菌NCC2461诱导的IL-12p40/IL_10比大幅度下降，达到与采用双歧杆菌菌株所获得的那些水平一样低的水平。这些低IL-12p40/IL-10比归因于低水平的IL-12p40产生，以及IL-10分泌无变化(鼠李糖乳杆菌NCC4007)或大幅度诱导IL-10分泌(类干酪乳杆菌NCC2461)(图2)。作为结果:-可以通过UHT样热处理和HTST样热处理增强活微生物的抗炎谱(例如长双歧杆菌NCC2705、长双歧杆菌NCC3001、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818)。-可以通过UHT样热处理和HTST样热处理从非抗炎性活微生物(例如鼠李糖乳杆菌NCC4007、类干酪乳杆菌NCC2461、乳品起子嗜热链球菌NCC2019)产生抗炎谱。-也展示了自市售产品分离的菌株(包括益生性大肠杆菌菌株)的抗炎谱(图3A和B)。UHT/HTST样处理对全部受检益生菌和乳品起子(例如乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属)的影响是相似的。将UHT/HTST样处理应用至显示不同体外免疫谱的几种乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属的菌株。全部菌株均在UHT/HTST样处理后比其活的对应物诱导更少的促炎细胞因子(图1、2、3、4、5和6)，这显示UHT/HTST样处理对得到的非复制型细菌的免疫特征的影响可以推广至全部益生菌，特别地至乳杆菌属和双歧杆菌属和特定大肠杆菌的菌株，并且推广至全部乳品起子培养物，特别地至链球菌属、乳球菌属和乳杆菌属。实施例2:方法学细菌制备物:使用5种益生菌株来研究非复制型益生菌的免疫增强特征:3种双歧杆菌(长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、短双歧杆菌NCC2950)和2种乳杆菌(类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007)。细菌细胞以分批发酵法在37° C于MRS上培育16-18小时，同时不控制pH。将细菌细胞离心下来(5，000Xg，4° C)并且重悬于磷酸盐缓冲盐水中，随后稀释于盐水中，以达到约10E10Cfu/ml的终浓度。将长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007在水浴中于85。C热处理20分钟。将短双歧杆菌NCC2950在水浴中于90° C热处理30分钟。将热处理的细菌悬液分装并且保持冷冻在-80° C直至使用。将活细菌在PBS-甘油15%中贮存在-80° C直至使用。细菌制备物的体外免疫谱:评估了活细菌制备物和热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导特定细胞因子从人血细胞分泌的能力)。自血液滤器分离人外周血单个核细胞(PBMC)。在通过细胞密度梯度分开后，将单个核细胞收集并且用Hank平衡盐溶液洗涤两次。细胞随后重悬于补充有10%胎牛血清(Bioconcept,巴黎,法国)、1%L-谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/链霉素(Sigma)和 0.1% 庆大霉素(Sigma)的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基(IMDM, Sigma)中。PBMC (7 XlO5个细胞/孔)随后与48孔板中的活细菌和热处理细菌(等同于7 X IO6Cfu/孔)温育36小时。检验活细菌和热处理细菌对PBMC的影响，其中所述的PBMC来自分配至2个独立实验中的8位个体供者。在36小时孵育后，将培养板冷冻并且保存在-20° C直至细胞因子测量。对活细菌及其热处理的对应物平行地(即在相同的实验中对相同批次的PBMC)实施细胞因子谱分析。按照制造商的说明书，通过ELISA (R&D DuoSet 人 IL-10、BD OptEIA 人 IL12p40、BD OptEIA人TNF、BD OptEIA人IFN- Y )测定36小时温育后细胞培养上清液中细胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-a 和 IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40 和 TNF-a 是促炎细胞因子，而IL-10是强力抗炎介质。结果表述为4位个体供体的均值(pg/ml)+/-SEM并且是各自用4位供体进行的2个独立实验的代表。活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950在预防变态反应性腹泻中的体内作用。
使用变态反应性腹泻小鼠模型来检验短双歧杆菌NCC2950的Thl促进作用(Brandt Ε.B等人.JCI2003 ;112 (11):1666-1667)。致敏(间隔14日2次腹膜内注射卵清蛋白(OVA)和硫酸铝钾；第O和第14日)后，雄性Balb/c小鼠以口服方式用OVA攻击6次(第27、29、32、34、36、39日)，导致临时临床症状(腹泻)和免疫参数(总IgE血浆浓度、OVA特异性IgE、小鼠肥大细胞蛋白酶I即MMCP-1)的变化。通过管饲法在OVA致敏之前4日(第-3、-2、-1、0日和第11、12、13和14日)和攻击期间(第23至39日)施用活的短双歧杆菌NCC2950或在90° C热处理30分钟的短双歧杆菌NCC2950。使用约IO9菌落形成单位(Cfu)或等价cfu/小鼠的日细菌剂量。热处理后‘促炎’细胞因子分泌的诱导体外评估了热处理的细菌菌株刺激人外周血单个核细胞(PBMC)分泌细胞因子的能力。将基于热处理细菌刺激PBMC时的4种细胞因子的免疫谱与相同体外测定法中由活细菌细胞诱导的4种细胞因 子的免疫谱比较。将热处理的制备物铺板并且评估任何活计数的不存在。铺板后，热处理的细菌制备物不产生菌落。与人PBMC—起培养时，活益生菌诱导不同且菌株依赖性水平的细胞因子产生(图8)。与其活的对应物相比，对益生菌的热处理改变了由PBMC产生的细胞因子的水平。热处理的细菌比其活的对应物诱导更多的促炎细胞因子(TNF-α、IFN-Y、IL-12p40)。相反，与活细胞相比，热处理的细菌诱导相似或更低的量的IL-10 (图8)。这些数据显示热处理的细菌比其活的对应物更能够刺激免疫系统并且因此更能够增强削弱的免疫防御。换而言之，体外数据显示细菌菌株在热处理后增强的免疫增强作用。为了展示热处理的短双歧杆菌NCC2950 (与活细胞相比)对免疫系统的增强作用，在变态反应性腹泻动物模型中测试活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950 (菌株A)。与阳性对照组相比，腹泻的强度在用热处理的短双歧杆菌NCC2950治疗后显著且一致地减低(41.1%±4.8)，而腹泻的强度在用活短双歧杆菌NCC2950治疗后仅降低20±28.3%。这些结果表明热处理的短双歧杆菌NCC2950比其活的对应物显示出增强的抗变态反应性腹泻保护作用(图9)。因此，显示在热处理后改善了益生菌增强免疫防御的能力。实施例3:可以使用本领域已知的标准冷冻技术或低温挤出技术制备以下冷冻酸奶组合物:
成分g/100g
mWΓθ8
无脂肪固形物11.57
总固形物38.5权利要求
1.以对应于每份次约IO6至IO12Cfu的量包含非复制型益生微生物的冷冻酸奶组合物，其中所述非复制型益生微生物是通过热处理或挤出剪切处理而导致的不复制。
2.根据权利要求1所述的冷冻酸奶组合物，其包含约0-12重量％的脂肪、约5-15重量％的非脂肪乳固形物，约5-32重量％的碳水化合物、约1-5重量％的蛋白质和约30-45重量％的总固形物含量。
3.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻酸奶组合物，还包含约1-25重量％的糖。
4.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻酸奶组合物，还包含与所述冷冻酸奶联合的可食用支持物，所述支持物是人类可食用的并且包含益生元。
5.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻酸奶组合物，还包含益生元，例如，低聚果糖和菊粉。
6.根据权利要求4所述的冷冻酸奶组合物，其中所述可食用支持物包含约0.1%至约10%益生元和/或所述益生元选自植物果胶；壳寡糖、低聚果糖、龙胆寡糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚甘露糖或低聚 木糖；大豆低聚糖、菊薯(Polymnia sonchifolia)低聚糖、洋蓟低聚糖、燕麦低聚糖、洋葱低聚糖或芦笋低聚糖；或它们的组合。
7.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻酸奶组合物，其中通过在至少71.5°C持续至少I秒的高温处理使益生微生物不复制。
8.根据权利要求7所述的冷冻酸奶组合物，其中热处理是在约71.5 -15 (TC持续约1-120秒的高温处理，并且优选地是高温/短时(HTST)处理或超高温(UHT)处理。
9.根据权利要求8所述的冷冻酸奶组合物，用于炎性疾病的预防或治疗。
10.根据权利要求7所述的冷冻酸奶组合物，其中在约70-150°C的温度范围实施约3分钟-2小时，优选地在80-140°C的范围5分钟-40分钟实施热处理。
11.根据权利要求10所述的冷冻酸奶组合物，用于预防或治疗与受损的免疫防御有关的疾病。
12.根据前述权利要求任一项所述的冷冻酸奶组合物，其中至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、最优选地至少99%、理想地至少99.9%、最理想地全部益生菌是非复制型的。
13.根据前述权利要求任一项所述的冷冻酸奶组合物，其中益生微生物选自双歧杆菌属(bifidobacteria)、乳杆菌属(Iactobacilli)、丙酸杆菌属(propionibacteria)或它们的组合，例如长双歧杆菌(Bifidobactrerium 1ngum)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、类干酿乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillusp I ant arum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、双乙酸乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和/或它们的混合物。
14.根据前述权利要求任一项所述的冷冻酸奶组合物，其中益生微生物选自长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、约氏乳杆菌LaU类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002(NCC1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC15、乳酸乳球菌NCC2287或它们的组合。
15.根据前述权利要求任一项所述的冷冻酸奶组合物，其含有每日剂量约·0.005mg-1000mg非复制型微生 物。
全文摘要
本发明涉及冷冻酸奶领域。特别地，本发明提供了包含非复制型益生微生物的冷冻酸奶组合物。这些非复制型益生微生物可以是例如有生物活性的热处理的益生微生物。本发明也涉及由这些非复制型益生微生物提供的健康益处。
文档编号A61P37/00GK103209596SQ201180054393
公开日2013年7月17日 申请日期2011年11月11日 优先权日2010年11月11日
发明者A·梅赛尼尔, G·普里乌特, S·努特恩 申请人:雀巢产品技术援助有限公司