抑制光感受器凋亡的方法

专利名称：抑制光感受器凋亡的方法
技术领域：
本发明提供防止光感受器死亡的方法。特别是，本发明提供防止FAS介导的光感受器凋亡的肽。
背景技术：
凋亡(程序性细胞死亡)在所有多细胞生物的发育和稳态中起主导作用。凋亡途径的改变牵涉多种人体病理学类型，其包括发育障碍、癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病以及视网膜变性。它是控制各个细胞死亡过程的紧密调节途径并可外源地或内源地启动。后者为由线粒体触发的胞内机制，而前者包括“死亡受体”与在细胞膜处的其相应的配体的相互作用。因此，程序性细胞死亡途径已变成治疗药物开发中的具有吸引力的目标。特别是， 由于在概念上来讲，杀死细胞比维持细胞更容易，因此人们把注意力集中在使用促凋亡剂的抗癌疗法，例如传统的放疗和化疗。这些治疗通常被认为触发了线粒体介导的凋亡途径的活化。但是，这些疗法缺乏分子特异性，并且需要更具体的分子靶标。视网膜脱离(RD)被定义为感觉神经视网膜与底下的视网膜色素上皮细胞(RPE) 的分离，其导致感光细胞的凋亡(Cook等人，1995年第36卷第6期第990-996页；Hisatomi 等人，Curr Eye Res，2002 年第 M 卷第 3 期第 161-172 页；Zacks 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2003 年第 44 卷第 3 期第 1262-1267 页；Yang 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci， 2004年第45卷第2期第648-6M页；通过引用以其整体结合到本文中)。RD的啮齿动物和猫科动物模型表明，在视网膜与RPE分离后，促凋亡途径几乎立即活化(Cook等人，1995 年第36卷第6期第990-996页；Hisatomi等人，Curr Eye Res, 2002年第M卷第3期第 161-172 页；Zacks 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2003 年第 44 卷第 3 期第 1262-U67 页；Yang 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2004 年第 45 卷第 2 期第 648-6 页；通过引用以其整体结合到本文中)。凋亡的组织学标记例如末端脱氧核苷酸转移酶缺口末端标记 (TUNEL)染色在RD后约3天达到峰值，其中凋亡活性和渐进性细胞死亡在脱离期间持续。 但是，视网膜脱离修复的临床经验表明，存在修复并维持良好视力的机会窗。回顾性的病例系列表明，大量在脱离发生后5-10日内修复的黄斑脱离RD患者可保持好的视觉功能，但随着脱离和修复之间的时间延长，视力下降显著(Burton，Trans Am Ophthalmol Soc，1982年第 80 卷第 475-497 页；Ross 等人，Ophthalmology, 1998 年第 105 卷第 11 期第 2149-2153 页；Hassan等人，Ophthalmology，2002年第109卷第1期第146-152页；通过引用以其整体结合到本文中)。促凋亡途径的活化和视力丧失的临床发生之间的延迟时间提示，内源性神经保护因子可在神经视网膜内被活化，并可有助于制衡由视网膜-RPE分离活化的促凋亡途径的影响。
概述在一些实施方案中，本发明提供抑制光感受器凋亡的方法，其包括给予光感受器保护组合物。在一些实施方案中，光感受器保护组合物包含光感受器保护多肽或编码光感受器保护多肽的核酸。在一些实施方案中，光感受器保护多肽包括IL-6或其片段。在一些实施方案中，光感受器保护多肽包括XIAP或其片段。在一些实施方案中，光感受器保护多肽包括MET或其片段。在一些实施方案中，MET的片段包括MET12。在一些实施方案中，MET 的片段包含与MET12至少70% (例如，至少80%、85%、90%、95% )的序列相似性。在一些实施方案中，光感受器凋亡包括FAS介导的光感受器凋亡。在一些实施方案中，将光感受器保护组合物给予细胞群。在一些实施方案中，将光感受器保护组合物以足以减少细胞群内的细胞死亡的量给予。在一些实施方案中，将光感受器保护多肽给予受试者。在一些实施方案中，受试者患有视网膜脱离。在一些实施方案中，受试者具有视网膜脱离的风险。在一些实施方案中，将光感受器保护组合物以足以减少受试者内的细胞死亡的量给予。在一些实施方案中，本发明提供增加光感受器存活率的方法，包括给予光感受器保护组合物。在一些实施方案中，增加光感受器存活率包括抑制光感受器凋亡。在一些实施方案中，光感受器保护组合物包含光感受器保护多肽或编码光感受器保护多肽的核酸。在一些实施方案中，光感受器保护多肽包括IL-6或其片段。在一些实施方案中，光感受器保护多肽包括XIAP或其片段。在一些实施方案中，光感受器保护多肽包括MET或其片段。在一些实施方案中，MET的片段包括MET12。在一些实施方案中，MET的片段包含与MET12至少 70%的序列相似性。在一些实施方案中，光感受器凋亡包括FAS介导的光感受器凋亡。在一些实施方案中，将光感受器保护组合物给予细胞群。在一些实施方案中，将光感受器保护组合物以足以减少所述细胞群内的细胞死亡的量给予。在一些实施方案中，将光感受器保护组合物以足以增加所述细胞群中的光感受器存活率的量给予。在一些实施方案中，将光感受器保护组合物给予受试者。在一些实施方案中，受试者患有眼部病况、疾病或者影响眼部健康的病况或疾病。在一些实施方案中，受试者处于眼部病况、疾病或者影响眼部健康的病况或疾病的风险中。在一些实施方案中，眼部病况、疾病或者影响眼部健康的病况或疾病包括视网膜脱离、黄斑变性、视网膜色素变性、眼部炎症、自身免疫性视网膜病变、创伤、癌症、 肿瘤、葡萄膜炎、遗传性视网膜变性、糖尿病视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜缺血、 病理性近视、血管样条纹症、黄斑水肿或中心性浆液性脉络膜视网膜病变。在一些实施方案中，眼部病况、疾病或者影响眼部健康的病况或疾病包括视网膜脱离。在一些实施方案中， 眼部病况、疾病或者影响眼部健康的病况或疾病包括黄斑变性。在一些实施方案中，将光感受器保护组合物以足以减少所述受试者内的细胞死亡的量给予。在一些实施方案中，将光感受器保护组合物以足以增加所述受试者内的光感受器存活率的量给予。在一些实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含光感受器保护组合物以及配置用于眼部递送的药用载体。在一些实施方案中，光感受器保护组合物包含光感受器保护多肽或编码光感受器保护多肽的核酸。在一些实施方案中，光感受器保护多肽包括IL-6或其片段。在一些实施方案中，光感受器保护多肽包括XIAP或其片段。在一些实施方案中， 光感受器保护多肽包括MET或其片段。在一些实施方案中，MET的片段包括MET12。在一些实施方案中，MET的片段包含与MET12至少70% (例如，至少80%、85%、90%、95% )的序列相似性。在一些实施方案中，光感受器凋亡包括FAS介导的光感受器凋亡。在一些实施方案中，配置药用载体用于注射入受试者眼内。在一些实施方案中，配置药用载体用于视网膜下注射。在一些实施方案中，配置药用载体用于局部施用于受试者眼睛上。在一些实施方案中，本发明包括试剂盒，其包含光感受器保护组合物以及一种或多种其它组合物。在一些实施方案中，其它组合物包含光感受器保护组合物、药用载体、药物、止痛药、麻醉药、抗凋亡剂等。在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种光感受器保护组合物以及配置用于共同给药至细胞或受试者的其它物质。附图简述当结合附图阅读时，更好地理解前面的概述和详细的说明，通过举例方式而非限制方式包括附图。

图1显示了附着和脱离视网膜中STATl和STAT3活化形式的水平的蛋白质印迹分析。最左边的2条泳道脱离后一天。中间的2条泳道脱离后三天。最右边的2条泳道 脱离后七天。视网膜-RPE分离在左眼产生。附着的视网膜从相同动物的对侧眼获得。在所有泳道内校验相等加样。图2显示了脱离后3天采集的野生型对比IL6-/-小鼠视网膜的TUNEL染色。A、B 野生型小鼠。C、D:IL-6-/_小鼠。A、C:TUNEL阳性细胞的异硫氰酸荧光素(FITC)荧光。B、 D 所有核的碘化丙锭(PI)荧光。E 脱离后三天野生型和IL-6-/-小鼠视网膜TUNEL染色的概述图。结果为均值士均值的标准误差。图3显示了视网膜脱离后野生型对比IL6-/-小鼠的外核层细胞计数。A-C:野生型小鼠。D-F:IL-6-/_小鼠。A、D 附着的视网膜。B、E 脱离产生后1个月采集的视网膜。C、F:脱离产生后2个月采集的视网膜。G 视网膜脱离后1个月和2个月野生型和IL-6-/-小鼠中ONL细胞计数/总视网膜厚度的概述图。结果为均值士均值的标准误差。图4显示了用IL-6中和抗体或外源性IL-6处理的脱离大鼠视网膜的TUNEL染色。 A、B 在脱离产生时仅于视网膜下注射溶媒。C、D 在脱离产生时于视网膜下注射0. 15 μ g抗 IL-6NAB。E、F 在脱离产生时于视网膜下注射15ng外源性IL-6。A、C、E TUNEL阳性核的 FITC荧光。B、D、F 所有核的PI荧光。G 脱离后3天视网膜下抗IL-6NAB和外源性IL-6 对大鼠视网膜TUNEL染色的影响的概述图。结果为均值士均值的标准误差。图5显示了 IL-6中和抗体对比外源性IL-6对大鼠视网膜外核层细胞计数的影响。A 附着的视网膜。B、C:在脱离产生时仅于视网膜下注射溶媒后1和2个月分别采集的视网膜。D、E 脱离产生时在视网膜下注射0. 15 μ g抗IL-6NAB后1和2个月分别采集的视网膜。F、G 脱离产生时在视网膜下注射15ng外源性IL-6后1和2个月分别采集的视网膜。H 视网膜脱离后1和2个月视网膜下抗IL-6NAB和外源性IL-6对大鼠视网膜外核层细胞计数的影响的概述图。结果为均值士均值的标准误差。图6显示了经GFP和XIAP处理的视网膜中视网膜脱离后的胱天蛋白酶3和9试验。视网膜下注射rAAV-GFP或rAAV-XIAP后在动物的左眼(OS)进行视网膜脱离。右眼 (OD)用作完好的对照。图7显示了用GFP抗体㈧和XIAP的HA标记抗体⑶的免疫组织化学，XIAP被证实在来自两个rAAV构建体的光感受器的细胞体及内区段(IS)和外区段(OS)中强烈过量表达。C和D中分别显示无GFP和XIAP的初级抗体对照。TUNEL分析证实，经GFP处理的视网膜比经XIAP处理的视网膜具有更多的凋亡核(E、F中的褐色色素以及插图的黑色箭号)。TUNEL阳性像素计数(盒图，G)支持免疫组织化学的结果。每个盒包括第25至第75 百分位之间的值，并且盒内的线代表中值。每个盒上面和下面的棒形线分别指示第90和第 10百分位。该盒图用SigmaPlot，8. 0版本(SPSS，Inc.)产生。0NL，外核层。图8显示了 GFP(A、B)和XIAP(D、E)的免疫组织化学，其证实了脱离后2个月的持续表达。因为许多表达病毒转基因的光感受器已死亡，所以GFP信号(绿色)微弱。相反， XIAP信号(红色)明亮，并且伴随光感受器数目的增加。注意，在XIAP信号减弱(箭头) 的视网膜区域，光感受器大量损失。GFP注射(C)和XIAP注射(F)的视网膜中的视紫红质染色(红色)显示，保留下来的光感受器能够合成功能蛋白质。外核层由箭号指示。缩放比例条=50謹。图9显示了经XIAP和GFP处理的动物中附着(A、C)和脱离(B、D)视网膜之间的比较。脱离后2个月，经XIAP处理的视网膜⑶始终比经GFP处理的视网膜⑶厚，并且其内外区段更有条理。通过将眼睛脱离区域ONL中的核层数目除以相同眼睛附着视网膜ONL 中的核层数目获得比率(E)。缩放比例条=50mm。图10显示了 MET对视网膜脱离后TUNEL阳性细胞数目的影响图。图11显示了 MET对由视网膜脱离引起的胱天蛋白酶活性的影响图。图12显示了 661W细胞中，Fas诱导的胱天蛋白酶8的活化被Metl2阻断。A)用不同浓度的Fas活化抗体(Fas-Ab)处理661W细胞。胱天蛋白酶8的活性在48小时测定。 与未处理相比，胱天蛋白酶8活性的增加对所有浓度的!^as-Ab在统计学上是显著的。B)用 500ng/ml的!^is-Ab处理661W细胞，并且在不同时间点测定胱天蛋白酶8的活性。在每个时间点，将数据针对未经处理的对照进行标准化。C)在Metl2、mMet或溶媒(DMSO)存在下用500ng/ml Fas-Ab处理66IW细胞。对照组不用!^as-Ab处理。在48小时测定胱天蛋白酶8的活性。图13显示Metl2抑制胱天蛋白酶的活化。A)将Metl2注射入脱离视网膜的视网膜下间隙降低了胱天蛋白酶8的活性。在Metl2 (50 μ g)、mMet (50 μ g)或溶媒(DMSO)存在下脱离大鼠视网膜。测定如所描述脱离对小时后采集的视网膜中的胱天蛋白酶8活性。数据以脱离视网膜相对于附着视网膜的胱天蛋白酶活性的增加倍数给出。蛋白质印迹显示， 在Metl2的存在下，胱天蛋白酶8的裂解降低(插图)。显示了包含无裂解物样品(空白) 的试验对照和重组胱天蛋白酶8。B)在视网膜脱离期间通过Metl2处理显著降低胱天蛋白酶3的活性。C)胱天蛋白酶9的活性也被Metl2显著降低。数据以脱离视网膜相对于附着视网膜的胱天蛋白酶活性的增加倍数给出。显示了包含无裂解物样品(空白)的试验对照和重组胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9。图14显示了 Fas途径信号转导的Metl2介导性抑制防止光感受器进入凋亡级联。 在MetU(SOyg)、mMetGOyg)或溶媒(DMSO)的存在下脱离大鼠视网膜。72小时后摘眼并将视网膜切片用于TUNEL染色。A)视网膜脱离72小时后TUNEL染色光感受器的代表性显微照片。视网膜细胞的核用碘化丙啶(PI)染色。INL:内核层，0NL:外核层。B)0NL中 TUNEL阳性细胞的定量，均值士标准误差，η = 3-6。附着视网膜的ONL中无TUNEL染色细胞。图15显示了胱天蛋白酶活化的减少，TUNEL阳性细胞数目对应于光感受器长期存活率的增加。在临丨12(5(^0、!111讨(5(^0或溶媒(DMSO)的存在下脱离视网膜，Metl2(50yg) ,mMet(50yg)或溶媒(DMSO)在脱离时注入视网膜下的间隙。脱离2个月后摘眼并将石蜡切片用0.5%甲苯胺蓝染色。A)代表性显微照片，INL:内核层，0NL:外核层， B)标准化至视网膜厚度的ONL细胞计数，C)标准化至视网膜厚度的ONL厚度。定义如本文所使用，术语“核酸分子”是指任何包含核酸的分子，包括但不限于DNA或 RNA。该术语包括含有DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，所述类似物包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基) 尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、 1-甲基肌苷、2，2_ 二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖辫苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、 5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2_硫胞嘧啶、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶及2，6- 二氨基嘌呤。如本文所使用，术语“寡核苷酸”是指长度短的单链多核苷酸链。寡核苷酸长度通常小于200个(例如，在15与100个之间)残基，但是，如本文所用，该术语也意图包括较长的多核苷酸链。寡核苷酸常用其长度来提及。例如12残基寡核苷酸称为“12-聚体”。寡核苷酸可通过自杂交或与其它多核苷酸杂交形成二级和三级结构。这类结构可包括但不限于双链体、发夹、十字形、转角和三链体。如本文所使用，术语“有效量”是指足以引起有益或所需结果的组合物(例如，光感受器保护组合物)的量。有效量可以以一个或多个给药、施用或剂量进行给予，并不意图限制为特定的制剂或给予途径。如本文所使用，术语“给予”是指给予受试者(例如，受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官)药物、前药或其它物质或治疗性处理(例如，本发明组合物)的行为。给予至人体的示范性途径可通过注射(例如，静脉内、皮下、瘤内、腹膜内注射等)等经眼睛 (眼)、嘴(口腔)、皮肤(经皮)、鼻(鼻部)、肺(吸入)、口腔粘膜(含服)、耳、直肠给予。如本文所使用，术语“共同给予”和“共给予”是指至少两种物质(例如，光感受器保护肽、编码光感受器保护组合物的寡核苷酸以及一种或多种其它物质)或治疗给予至受试者。在一些实施方案中，两种或更多种物质或治疗的共同给予是并行的。在其它实施方案中，第一物质/治疗在第二物质/治疗前给予。本领域技术人员理解的是，所用各种物质或治疗的制剂和/或给药途径可不同。共同给予的合适剂量可由本领域技术人员容易地确定。在一些实施方案中，共同给予物质或治疗时，各物质或治疗以低于其合适的单独给药剂量给予。因此，当物质或治疗的共同给予降低潜在有害(例如，毒性)物质的必要剂量时在实施方案中尤其需要共同给予。如本文所使用，术语“药物组合物”是指活性剂(例如，光感受器保护组合物)与惰性或活性载体的组合，该组合使组合物尤其适合用于体外、体内或离体诊断或治疗应用。如本文所使用，术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指给予受试者时基本上不产生不良反应(例如，毒性、过敏或免疫反应)的组合物。如本文所使用，术语“药学上可接受的载体”是指任何标准药用载体，包括但不限于磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(例如，油/水或水/油乳剂)以及各种类型的湿润剂、 任何和所有溶剂、分散介质、包衣材料、十二烷基硫酸钠、等渗剂和延缓吸收剂、崩解剂 (disintigrantM例如，马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)等。组合物还可包含稳定剂和防腐剂° 例如载体、稳定剂禾口佐剂(见例如，Martin,Remington' s Pharmaceutical Sciences, 第十五版，Mack Publ. Co.，Easton，Pa. (1975)，通过引用结合到本文中)。如本文所使用，术语“药学上可接受的盐”是指目标受试者(例如，哺乳动物受试者和/或体内或离体细胞、组织或器官)生理学上耐受的本发明化合物的任何盐(例如，通过与酸或碱反应而获得)。本发明化合物的“盐”可由无机或有机酸和碱获得。酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其它酸例如草酸，虽然其本身并非药学上可接受的，但是可在获取本发明化合物及其药学上可接受的酸加成盐中用于制备可用作中间体的盐。实施方案的详细描述在开发本发明实施方案的过程中进行的实验表明，IL-6是感觉神经视网膜与底下的RPE分离后光感受器凋亡的控制者。用基因缺损或通过给予IL-6中和抗体抑制IL-6，显著增加光感受器的凋亡率。脱离后一个月，与其各自的对照相比，接受视网膜下IL-6NAB的 IL-6-/-小鼠和大鼠两者的ONL细胞计数均显著降低。这些数据表明，IL-6对于与RPE脱离后光感受器的存活是必需的。在开发本发明实施方案的过程中进行了研究渐增的IL-6水平的作用的实验， IL-6水平具有混合作用，这取决于研究的时间点和所测定的试验。当与仅注射溶媒相比时， RD后3天，在视网膜下注射外源性IL-6并不显著地影响TUNEL阳性细胞的百分比，但却显著增加在较长期脱落中幸存的光感受器数目。RD患者中的视网膜下IL-6水平高于对照的玻璃体，并且RD患者中视网膜下IL-6的量在RD后5-8周最高(Bakunowicz-Lazarczyk等人，Ophthalmologica, 1999年第213卷第1期第25- 页，通过引用以其整体结合到本文中)。IL-6通过其配体结合亚基(gp80，也称为IL-6R)与普通信号转导亚基(gpl30)的结合发出信号(Heinrich等人，Ann N Y Acad Sci.，1995年第762卷第222-236页，通过引用以其整体结合到本文中)。单独给予外源性IL-6所具有的抗凋亡活性比不上IL-6与IL6-R 可溶形式联合给予所具有的抗凋亡活性(Inomata等人，Biochem Biophys Res Commun., 2003年第302卷第2期第2沈-232页；Curnow等人，J Immunol.，2004年第173卷第8期第5290-5297页，通过引用以其整体结合到本文中)。尽管内源性IL-6的活化，仍然存在相对线性的细胞损失率。该死亡率被外源性 IL-6的加入显著降低。RD后1个月，与对照组相比，在脱离时用外源性IL-6处理的大鼠组中存在显著较高的光感受器保存，该差别在RD后2个月由于第二个月外源性IL-6组中光感受器的加速损失而消失。在一个月时间点重注射外源性IL-6提示，可通过允许更大的治疗性“机会窗口”延长IL-6的作用持续时间，以达到视网膜-RPE重附着。在呈现给眼科医师前视网膜脱离常已存在未知的一段时间。与对照相比，自脱离产生延迟2周首次视网膜下注射外源性IL-6，仍然允许光感受器在脱离后1个月的显著较大的保存，表明尽管患者的延迟呈现，IL-6可在保存光感受器方面仍然有用。视网膜-RPE 分离2周后单次注射IL-6的作用持续2周。已知IL-6为詹纳斯(Janus)激酶(JAK)/信号转导蛋白的强活化剂以及转录 (STAT)途径的活化剂(Samardzija等人，FASEB J.，2006年第20卷第13期第Ml 1-2413页， 通过引用以其整体结合到本文中)。视网膜-RPE分离有效地活化STATl和STAT3。STATl与肿瘤抑制和促凋亡活性相关，而STAT3主要与细胞增殖相关并被认为抗凋亡(Samardzi ja 等人，FASEB J.，2006 年第 20 卷第 13 期第 2411-2413 页；Aaronson 等人，Science，2002 年第 296 卷第 5573 期第 1653-1655 页 ft 印 hanou 等人，Int J Exp Pathol.，2003 年第 84 卷第 6 期第 239-244 页 Jtephanou 等人，Growth Factors, 2005 年第 23 卷第 3 期第 177-182 页；Battle等人，Curr Mol Med，2002年第2卷第4期第381-392页，通过引用以其整体结合到本文中)。IL-6的作用主要通过STAT3而非STATl介导。通过STAT对凋亡途径的调节可通过下游转录调节触发细胞死亡的因子(例如FAS和胱天蛋白酶)或促进细胞存活的因子(例如Bcl-xL和FLICE(FADD(Fas相关死亡结构域)样白细胞介素_1 β -转换酶)抑制蛋白质(FLIP)来进行(Haga等人，J Clin Invest, 2003年第112卷第7期第989-998页； Budd等人，Nat Rev Immunol，2006年第6卷第3期第196-204页，通过引用以其整体结合到本文中)。FLIP是胱天蛋白酶8的酶促无活性同源物，其可与胱天蛋白酶8竞争募集至诱导死亡信号传递复合物(DISC)，并因此作为显著的凋亡负抑制剂。34IL-6可稳定FLIP 的蛋白质水平，因为FLIP在IL-6-/"小鼠中较快速降解(Kovalovich等人，J Biol Chem, 2001年第276卷第28期第2660546613页，通过引用以其整体结合到本文中)。研究显示，IL-6可防止由多种损伤引起的视网膜变性，所述损伤包括缺血再灌注损伤、NDMA毒性、压力诱导性死亡和视网膜脱离(Sanchez等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2003 年第 44 卷第 9 期第 4006-4011 页；Inomata 等人，Biochem Biophys Res Commun, 2003 年第 302 卷第 2 期第 M6-232 页；Sappington 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006年第47卷第7期第四32-2942页，通过引用以其整体结合到本文中)。IL-6在视网膜-RPE分离的情形中的光感受器保护作用提示，这是治疗性干预的有价值之处，用于改善患有该种类型视网膜损伤的患者中的视力结果。为在视网膜脱离后获得良好的视力结果，迫切需要进行快速重附着。动物研究表明，胱天蛋白酶(凋亡的执行者)在脱离后对小时内被活化。如果视网膜脱离持续时间维持5天或更长，患者通常不能恢复20/20的视力(BurtonJrans Am Ophthalmol Soc, 1982 年第80卷第475-497页，通过引用以其整体结合到本文中)。在许多疾病过程中，不能很快地实现视网膜与RPE的重新附着(reapposition)，导致光感受器连续凋亡。使用光感受器保护剂可潜在地限制光感受器死亡的程度直至可进行重附着。在开发本发明实施方案的过程中进行的实验表明，X连锁凋亡抑制剂(X-Iinked inhibitor of apoptosis，XIAP)可保护光感受器达至少2个月的持续脱离。经XIAP处理的视网膜在ONL中维持较大数目的核层，并且其内外区段较有条理。另外，它们被视紫红质的抗体强烈染色，提示它们维持有活力的。XIAP的保护作用提示，阻断胱天蛋白酶在阻断细胞死亡途径中是有效的。但是，我们并不排除XIAP具有胱天蛋白酶抑制以外的其它作用的可能性，但实施本发明不需要理解特定的作用机制并且本发明不限于任何具体的作用机制。据显示，XIAP通过其它机制阻抑细胞死亡。通过其RING锌指结构域，XIAP具有E3遍在蛋白连接酶活性并可促进凋亡前体蛋白的降解(综述于10)。XIAP也通过TAKl参与促存活途径的转录激活(Hofer-Warbinek 等人，J Biol Chem，2000 年第 275 卷第 22064-22068 页；Sanna 等人，Mol Cell Biol, 2002 年第22卷第17M-1766页，通过引用以其整体结合到本文中)。TAKl是促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)，其参与NF-kB和JNKl两个促存活途径的活化。因此，XIAP保护光感受器高达2个月的能力可部分归因于多种途径的活化或抑制。但是，XIAP转染眼中胱天蛋白酶活性的抑制和TUNEL计数的降低确实支持胱天蛋白酶抑制其作为XIAP发挥光感受器保护作用的主要机制。在开发本发明实施方案期间进行的实验表明XIAP在治疗视网膜脱离中的功效。 XIAP快速递送至视网膜脱离部位具有限制光感受器受到急性损害的潜在性，因此可为患者赢取至关重要的时间直至成功重附着。在开发本发明实施方案期间进行的实验提供在视网膜脱离后抑制Fas信号传导和防止光感受器凋亡的方法。例如，实验结果表明，Fas死亡受体的小肽抑制剂在视网膜-RPE分离后阻断胱天蛋白酶的活化并增加光感受器的存活率。例如，在视锥光感受器的体外模型中，小肽Metl2防止胱天蛋白酶8的Fas依赖性活化。实验性视网膜脱离的体内模型中，Metl2显著降低Fas信号传导和光感受器凋亡。视网膜脱离活化Fas受体(Zacks等人，Arch Ophthalmol, 2007年第125卷第 1389-1395页；Zacks等人，I0VS，2004年第45卷第12期第4563-4569. 8.页，通过引用以其整体结合到本文中)，并且该事件控制光感受器中内源性细胞死亡途径的活化。可使用大分子例如中和抗体以抑制Fas受体，或通过用抑制性RNA防止!^as-受体转录的脱离诱导性增加，来防止光感受器凋亡。在开发本发明实施方案期间进行的实验表明利用小肽Metl2 的相同显著水平的光感受器保存。使用啮齿动物模型来研究调节视网膜脱离后的光感受器死亡的分子机制。另外， Fas-Ab处理以剂量和时间依赖的方式活化体外661W细胞中的胱天蛋白酶8，表明Fas受体信号转导途径在这些细胞中完好。661W细胞系是由Fas信号转导介导的光感受器凋亡的功能性体外模型。本文的方法表明在Metl2介导的Fas抑制后显著水平的光感受器存活。因此，通过 Metl2的Fas抑制导致体内感光细胞的显著保存。使用本文公开的方法可优化在视网膜脱离时注射入视网膜下间隙的Metl2剂量用于完全的保护。在661W细胞中，在Metl2到达所有的细胞时，Metl2处理导致胱天蛋白酶8活化的完全抑制。视网膜下的Metl2可能不能充分到达凋亡的脱离光感受器。预期肽的改进给予获得改进的光感受器存活率。Metl2仅在视网膜/RPE分离产生期间视网膜下注射。视网膜下间隙可利用的Metl2的量最可能随时间减少，从而增加可用于i^asL结合的Fas受体数目。这类似于另一神经保护剂IL_6的情形。外源性IL-6增加脱离光感受器的存活率(Chong等人，Invest Ophthalmol Vis Sci, 2008年第49卷第7期第3193-3200页，通过引用以其整体结合到本文中)。当IL-6在脱离时被注射入视网膜下间隙时，其对脱离的光感受器的保护作用持续一个月。但是，在一个月的时间点重注射外源性IL-6延长了视网膜/RPE分离后光感受器的存活持续时间。预期最佳处理策略和Metl2增加的促存活作用允许较大的治疗性“机会窗口”，以在视网膜-RPE 重附着后达到最高的光感受器存活率。
考虑光感受器群执行独立于Fas死亡受体信号转导的凋亡。分离引起的线粒体凋亡途径的活化仅部分地被Fas的活化控制(Zacks等人，Arch Ophthalmol，2007年第125卷第1389-1395页，通过引用以其整体结合到本文中)。考虑第二和替代的信号转导途径可在刺激光感受器的内源性死亡途径中发挥作用。内源性途径胱天蛋白酶在视网膜脱离引起的光感受器凋亡中发挥关键作用(Zadro-Lamoureux等人，Invest Ophthalmol Vis Sci,2009 年第50卷第3期第1448-1453页，通过引用以其整体结合到本文中)。用重组腺伴随病毒递送X连锁凋亡抑制剂(XIAP)可抑制胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的活性并保护光感受器免受脱离引起的凋亡。除了线粒体凋亡途径，独立于胱天蛋白酶的死亡途径可在视网膜脱离后的光感受器损失中发挥作用。凋亡诱导因子(AIF)活化依赖性死亡在视网膜-RPE 分离实验大鼠模型中导致凋亡(Hisatomi等人，Am J Pathol，2001年4月，第158卷第4期第 1271-1278 页；Hisatomi 等人，2008 年，J Clin Invest，第 118 卷第 2025-2038 页，通过引用以其整体结合到本文中)。视网膜脱离引起的光感受器死亡在携带编码AIF基因的减效突变的小鼠中减少(Hisatomi等人，2008 J Clin Invest，第118卷第2025-2038页，通过引用以其整体结合到本文中)。在临床实践中，患者通常以已经发生脱离呈现。视网膜-RPE分离的动物模型显示，Fas途径活化在早期发生并在整个脱离期间维持上升(Zacks等人，Arch Ophthalmol, 2007 年第 125 期第 1389-1395 页；Zacks 等人，10VS, 2004 年第 45 卷第 12 期 4563-4569. 8 页)。考虑光感受器保护性治疗的一个应用可以是帮助防止进一步的光感受器损失直至视网膜可重附着(例如，手术地)以及恢复正常的视网膜-RPE稳态。视网膜和RPE的分离还在大范围的视网膜疾病中遇到。考虑抗Fas治疗在光感受器存活方面的临床相关性不限于视网膜脱离。例如，Fas介导的凋亡可在年龄相关性黄斑变性(AMD)的感光细胞死亡中发挥作用(Dunaief等人，Arch Ophthalmol，2002年第120卷第11期第1435-1442页，通过引用以其整体结合到本文中)。年龄相关性黄斑变性的特征在于RPE的进行性变性并导致外视网膜变性和类似视网膜脱离后发生的重组(Jager等人，N Engl J Med，2008年第358卷第 2606-2617 页 Johnson等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2003年第 44卷第 4481-448.页， 通过引用以其整体结合到本文中)。在AMD新生血管形成中，视网膜下还存在液体渗出，产生该组织与下层RPE的实际分离(Jager等人，N Engl J Med, 2008年第358卷第沈06_17. 页，通过引用以其整体结合到本文中)。新生血管AMD可导致视网膜-RPE分离和Fas途径活化时期的延长。抗Fas治疗的应用最有可能是作为在治疗基础病症时针对延长光感受器的存活的辅助(Brown等人，N Engl J Med，2006年10月5日，第355卷第14期第1432-44. 页，通过引用以其整体结合到本文中)。尽管另外的凋亡途径可在视网膜-RPE分离后被活化，但在开发本发明实施方案期间进行的实验表明，可观量的光感受器通过抑制Fas死亡受体得以保存。考虑将Metl2处理与另一抗凋亡例如XIAP或者与促存活分子例如IL-6结合，增加光感受器存活的效率。在一些实施方案中，本发明提供组合物、试剂盒、系统和/或方法，以防止、抑制、 阻断和/或减少感光细胞的死亡。在一些实施方案中，本发明抑制光感受器的凋亡。在一些实施方案中，光感受器死亡和/或凋亡由视网膜脱离、年龄相关性黄斑变性、创伤、癌症、 肿瘤、炎症、葡萄膜炎、糖尿病、遗传性视网膜变性和/或影响感光细胞的疾病引起。在一些实施方案中，本发明提高光感受器的生存能力和/或抑制光感受器的死亡(例如在视网膜脱离期间和/或为不包括视网膜脱离的眼部病况)。在一些实施方案中，本发明在多种病况和/或疾病中在提高光感受器生存能力和/或抑制光感受器死亡方面具有应用，所述病况和/或疾病包括但不限于黄斑变性(例如干、湿、非渗出性或渗出性/新生血管黄斑变性)、 眼瘤、遗传性视网膜变性(例如视网膜色素变性、斯塔加特病(Margardt' s disease)、乌斯赫尔综合征(Usher Syndrome)等)、眼部炎性疾病(例如葡萄膜炎)、眼部感染(例如细菌、真菌、病毒感染)、自身免疫性视网膜炎(例如由感染触发的)、创伤、糖尿病视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜缺血、视网膜血管阻塞性疾病(例如视网膜静脉分枝阻塞、 视网膜中央静脉阻塞、视网膜动脉分枝阻塞、视网膜中央动脉阻塞等)、病理性近视、血管样条纹症、黄斑水肿(例如任何病因的)、中心性浆液性脉络膜视网膜病变。在一些实施方案中，本发明包括给予组合物以抑制光感受器死亡(例如凋亡)。在一些实施方案中，组合物包括药剂、小分子、肽、核酸、分子复合体等。在一些实施方案中，本发明提供光感受器保护多肽的给予以抑制光感受器凋亡。在一些实施方案中，本发明的多肽可用本领域普通技术人员已知的方法制备。例如，要求保护的多肽可用固相多肽合成技术(例如Fmoc)合成。或者，多肽可用重组DNA技术(例如，使用细菌或真核表达系统)合成。因此，为促进使用这些方法，本发明提供包含编码本发明多肽的序列的遗传载体(例如，质粒)和包含所述载体的宿主细胞。此外，本发明提供通过重组方法产生的多肽。在一些实施方案中，本发明提供光感受器保护组合物(例如光感受器保护肽、多肽、小分子、核酸、编码保护肽的核酸等)的给予。在一些实施方案中，本发明提供抑制感光细胞凋亡的多肽(例如IL-6、XIAP、MET、其片段等)的给予。在一些实施方案中，本发明提供编码抑制感光细胞凋亡的多肽(例如IL-6、XIAP, MET、其片段等)的核酸的给予。在一些实施方案中，给予的组合物抑制凋亡途径。在一些实施方案中，MET多肽作为凋亡抑制剂和/或光感受器保护肽给予(例如给予至受试者、一个或多个细胞)。在一些实施方案中， 给予MET12多肽。在一些实施方案中，给予与MET或MET12具有至少50%同源性(例如至少60%同源性、至少70%同源性、至少80%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少99%同源性等)的多肽。在一些实施方案中，给予与IL-6具有至少50%同源性(例如至少60%同源性、至少70%同源性、至少80%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、 至少99%同源性等)的多肽。在一些实施方案中，给予与XIAP具有至少50%同源性(例如至少60%同源性、至少70%同源性、至少80%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少99%同源性等)的多肽。在一些实施方案中，将肽、核酸或药物样小分子给予受试者或细胞，抑制凋亡途径、抑制凋亡和/或针对光感受器死亡提供保护。在一些实施方案中，本发明多肽为分离和/或纯化的(或基本分离和/或基本纯化的)。因此，本发明提供基本分离形式的多肽。在一些实施方案中，例如，多肽因固相蛋白质合成所致而与其它多肽分离。或者，多肽可在重组产生的细胞裂解后与其它蛋白质基本分离。可用蛋白质纯化的标准方法(例如，HPLC)来基本纯化多肽。在一些实施方案中，本发明根据所需用途提供许多配方中的多肽的制剂。例如，在多肽为基本分离的(或甚至几乎与其它蛋白质完全分离)时，其可配制于合适的介质溶液中用于储存(例如，在冷冻条件或在冻结条件下)。这种制剂可包含保护制剂，例如缓冲液、 防腐剂、冷冻保护剂(例如，糖类如海藻糖)等。这种制剂的形式可为溶液剂、凝胶剂等，并且本发明多肽可在一些实施方案中以冷冻干燥的形式制备。此外，若需要的话，这种制剂可包含其它所需物质，例如小分子或甚至其它多肽和蛋白质。事实上，本发明提供这样的制剂，其包含本发明多肽不同实施方案的混合物(例如，多种本文描述的多肽种类)。在一些实施方案中，本发明还提供药物组合物，其包含一种或多种多肽(包括其混合物)及药学上可接受的载体。任何可提供多肽而不破坏载体内的运载体的载体是合适的载体，并且这类载体在本领域中熟知。该组合物可配制用于胃肠外、口腔或局部给予。例如，胃肠外配方可由即时或缓慢释放液体制剂、干粉、乳剂、混悬剂或任何其它标准制剂构成。药物组合物的口腔制剂可以是，例如，液体溶液剂例如溶解于稀释剂(例如，水、盐水、 汁液等)中的有效量组合物、合适的液体中的混悬剂或合适的乳剂。口腔制剂也可以以片剂形式递送，并且可包括赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂以及药理学上相容的赋形剂。局部制剂可包含提高活性成分通过皮肤或其它受影响区域的吸收或渗透的化合物，例如二甲亚砜和相关类似物。药物组合物也可用透皮装置局部递送，例如膏药，其可包括在合适的溶剂系统中的组合物和粘附系统，例如丙烯酸乳剂和聚酯膏药。组合物可通过滴眼剂或其它局部眼部递送方法递送。组合物可在眼内递送(在眼内的任何地方，包括例如玻璃体腔、前房等)。组合物可在玻璃体内递送，如玻璃体内注射Lucentis (雷珠单抗)、Avastin (贝伐单抗)、曲安奈德、抗生素等通常的做法一样。组合物可在眼周递送(例如至眼球(球状物)周围但在骨性眶内的组织)。组合物可通过眼内植入(例如更昔洛韦植入、氟轻松植入等)来递送。在眼内植入递送中，手术植入包含本发明组合物的装置(例如在玻璃体腔内)，并释放药物到眼中(例如以预定的速率)。组合物可利用包囊化细胞技术(例如通过Neurotech)给予，其中遗传修饰细胞经改造以生产和分泌本发明组合物(例如Met^)。组合物可使用缝合或置于眼球邻近的装置通过经巩膜(transcleral)药物递送来递送，所述装置会缓慢流出药物，药物接着扩散入眼中。在一些实施方案中，本发明提供采用多肽减少一个或多个TNFR超家族成员(理想的是光感受器和/或视网膜中的Fas和/或TNFR)的活化的方法。在一些实施方案中，应用这类方法以例如抑制细胞和组织中的细胞死亡(例如，凋亡)，并且其可在体内、离体或体外应用。因此，根据这类方法，本发明提供本发明多肽在减少细胞死亡(例如视网膜细胞死亡)方面的用途。对于体外应用，将本发明多肽以足以抑制细胞内的凋亡或足以抑制炎症的量和时程内提供给细胞，通常是细胞群(例如，在合适的制剂例如缓冲溶液中)。若需要的话，可观察未用本发明多肽处理的对照群以证实本发明多肽在细胞相似群内减少细胞死亡或炎症的抑制的作用。在一些实施方案中，本发明方法在体内应用。在一些实施方案中，将多肽以足以抑制或减少患者内(例如，所需组织内)的凋亡或炎症的量和部位递送给人或动物受试者。 多肽可配制成合适的药物组合物(例如，如上所述或本领域普通技术人员已知的其它组合物)用于递送到受试者内。递送可为局部的(例如，通过在待治疗的所需组织内注射或植入)或系统的(例如，通过静脉或胃肠外注射)。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患这类视网膜脱离和或视网膜病症以及需要治疗的患者的方法。在一些实施方案中，包含至少一种本发明多肽的药物组合物以足以治疗病症或疾病的量和部位递送给这类患者。在一些实施方案中，本发明多肽(或包含这类多肽的药物组合物)可系统地或局部地递送给患者，并且确定对治疗最合适的递送途径、时程和剂量在治疗这类患者的医学专业人员的普通技能范围内。理解的是，治疗患者的本发明方法的应用，最优选基本缓解或甚至消除这类症状；但是，如许多医疗处理一样，如果在本发明方法期间、之后或者以其它方式作为本发明方法的结果，患者中疾病或病症的症状下降至可确定的程度，则认为本发明方法的应用是成功的。在一些实施方案中，本发明提供用于增加光感受器存活率的方法，包括给予光感受器保护药物组合物。药物化合物可以以组合物的形式给予，该组合物按照良好药物实践用药学上可接受载体和任选赋形剂、佐剂等配制成。光感受器保护药物组合物可呈固体、半固体或液体剂型形式例如散剂、溶液剂、酏剂、糖浆剂、混悬剂、乳膏、滴剂、糊剂和喷雾剂。 本领域技术人员认识到，根据选定的给予途径(例如滴眼剂、注射等)，确定组合物的形式。 一般来说，优选使用本发明抑制剂的单位剂型以实现活性药物化合物的容易和准确给予。 一般来说，治疗上有效的药物化合物以浓度水平范围为总组合物的约0. 5% -约99%重量的这样的剂型存在即，以足以提供所需单位剂量的量。在一些实施方案中，药物组合物可以以单剂量或多剂量给予。特定的给予途径和剂量方案由协调待治疗个体的病况和所述个体对治疗的反应的技术人员确定。在一些实施方案中，用于给予受试者的单位剂型中的光感受器保护药物组合物包含药物化合物和一种或多种无毒的药学上可接受的载体、佐剂或溶媒。如上所述，可与这类材料组合以产生单一剂型的活性成分的量可根据不同的因素而改变。如在药物领域可获得的，多种材料可在本发明组合物中用作载体、佐剂和溶媒。可注射制剂例如油性溶液剂、混悬剂或乳剂可按照需要使用合适的分散剂或湿润剂和助悬剂， 如本领域所知进行配制。无菌可注射制剂可采用无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂例如无菌无热源水或1，3_ 丁二醇。可使用的其它可接受的溶媒和溶剂有5%右旋糖注射液、林格氏注射液和等渗氯化钠注射液(如USP/NF中所描述)。另外，可常规地采用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。对于该目的，可使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯。脂肪酸例如油酸也可用于制备可注射组合物。在一些实施方案中，将本发明光感受器保护组合物例如使用本文描述的技术和/ 或其它本领域技术人员已知的技术(例如注射、局部给予等)眼部地(optically)给予(参见，例如 Janoria 等人，Expert Opinion on Drug Delivery，2007 年 7 月，第 4 卷第 4 期第 371-388 页；Ghate & Edelhauser,Expert Opin Drug Deliv，2006 年 3 月第 3 卷第 2 期第 275-87.页；Bourges 等人，Adv Drug Deliv Rev，2006 年 11 月 15 日第 58 卷第 11 期第 1182-202.页，Epub 2006 年 9 月 22 日；Gomes Dos Santos 等人，Curr Pharm Biotechnol， 2005年2月第6卷第1期第7-15.页；通过引用以其整体结合到本文中)。在一些实施方案中，本发明光感受器保护组合物作为试剂盒的一部分提供。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括一种或多种光感受器保护组合物和/或光感受器保护药物组合物。在一些实施方案中，配置包括光感受器保护组合物的试剂盒用于与一种或多种另外的组合物(例如药物组合物)共同给予。在一些实施方案中，一种或多种光感受器保护组合物与一种或多种用于有效保护光感受器和/或抑制凋亡的其它物质共同给予。实验实施例1组合物及方法视网膜脱离实验模型所有在开发本发明实施方案期间进行的实验都根据关于动物在眼科和视觉研究中的使用的ARVO声明和由密执安大学动物使用与护理大学委员会(the University Committee on Use and Care of Animals of the University of Michigan)建立的指 It。Kl 个生 Brown—Norway 力鼠(300_400g) (Charles River Laboratories,
Wilmington, MA)、野生型 C57BL 小鼠(3-6 周龄)(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)，和 C57BL 背景的 IL-6-/-小鼠(3-6 周龄)(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)中产生脱离(Zacks 等人，Arch Ophthalmol，2007 年第 125 卷第 10 期第 1389-1395 页；通过引用以其整体结合到本文中)。用50 50混合的氯胺酮(lOOmg/mL)和赛拉嗪 (20mg/mL)麻醉啮齿动物，并用局部去氧肾上腺素)和托吡卡胺(1 % )扩瞳。使用20规微玻璃体视网膜刀(Walcott Scientific, Marmora, NJ)在缘后2mm产生巩膜切开术，小心避免晶状体损坏。将Glaser视网膜下注射器(32规尖；BD Ophthalmic Systems, Sarasota, FL)，通过巩膜切开术引入玻璃体腔，然后通过外周视网膜切开术引入视网膜下间隙。缓慢注射透明质酸钠(10mg/mL) (Pharmacia and Upjohn Co. , Kalamazoo, MI)以从底下的视网膜色素上皮细胞分离感觉神经视网膜。大约三分之一至二分之一的感觉神经视网膜被脱离。在左眼产生脱离，留下右眼作为对照。在一些眼中，在脱离产生时或在随后的时间点，将 0. 15 μ g 抗人 IL-6 中和抗体(NAB) (R&D Systems, Minneapolis, MN)或 15ng 外源性人IL-6(R&D Systems,Minneapolis,MN)以10 μ 1的体积注射入脱离的视网膜下间隙。 剂量基于制造商在体外活性试验基础上的推荐。蛋白质印迹分析在视网膜脱离后3天，将来自带有脱离的实验眼和没有脱离的对照眼的视网膜与 RPE-脉络膜切开、勻浆并在缓冲液中裂解，所述缓冲液每IOmL含有IOmM HEPES (ρΗ7. 6)、 0. 5% IgEPal,42mM KC1、ImM 苯甲基磺酰氟(PMSF)、lmM EDTAUmM EGTA、ImM 二硫苏糖醇 (DTT)和 5mM MgCl2 以及 1 片蛋白酶抑制剂(Complete Mini ；Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)。该勻浆在冰上温育并在4°C下以22，000g离心60分钟。然后确定上清液中的蛋白质浓度(DC蛋白质测定试剂盒；Bio-Rad Laboratories,Hercules CA)。将蛋白质样品上样在SDSPage聚丙烯酰胺凝胶(Tris-HCl Ready Gels ；Bio-Rad Laboratories) 上并运行。电泳分离后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(ImmobiIon-P ;AmerSham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)上。用丽春红S染色使蛋白质条带可见，并通过对存在于所有泳道的非特异性条带进行密度测定来评估等量上样的泳道。然后根据制造商的说明书，利用1 1000稀释的初级抗体，用免疫印迹试剂盒(分别为WiosphoPlus Statl (Tyr701)抗体试剂盒 #9170 或 PhosphoPlus Mat3 (Tyr705)抗体试剂盒 #9130, Cell Signaling Technology, Danvers, MA)针对磷酸化 STATl (phospho-STATl) (Tyr701) 或磷酸化STAT3 (ph0Sph0-STAT3) (Tyr705)对膜进行免疫印迹分析。TUNEL染色和组织学在脱离产生后的不同间隔，动物被施行安乐死并将眼睛摘除。对于TUNEL染色，将整个眼睛在4°C下在含4%多聚甲醛的磷酸缓冲盐水(pH7.4)中固定过夜。将样本包埋于石蜡中并切成5-6 μ m厚。根据制造商的说明书(Millipore,Billerica,MA)用ApopTag荧光素原位凋亡检测试剂盒(ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit)对切片进行TUNEL染色。对于光显微镜分析，用含0.5%甲苯胺蓝的0. 硼酸盐缓冲液对石蜡切片染色。
数据分析将感光细胞凋亡定量为外核层(ONL)中TUNEL阳性的总细胞的百分比。每个切片选择在RD最高处的三个非重叠高倍视野(40X)并取均值，除非存在少于三个非重叠高倍视野，这种情况下使用较少视野。每个眼使用一个代表性的切割。以类似的方式测定ONL 中的总细胞数目。在每个切片的三个RD最高处非重叠高倍视野(40X)的每个视野的三个地方测定视网膜的总厚度(从ONL的外缘测定至内界膜)并对每只眼取均值。假定这些元件在感觉神经视网膜脱离后可变退缩，则光感受器内区段和外区段不包括在总视网膜厚度测定内，该可变退缩无需与光感受器重附着后的生存能力相关(Guerin等人，hvest Ophthalmol Vis Sci，1993 年第；34卷第 1 期第 175-183 页；Lewis 等人，Invest Ophthalmol Vis ki，1995年第36卷第12期第M04-2416页；通过引用以其整体结合到本文中)。对于甲苯胺蓝染色的样本，将每个切片的ONL细胞计数对总视网膜厚度进行标准化(S卩，ONL 细胞计数除以总视网膜厚度)，以说明切片角度可能的差异并允许样品间比较。将大鼠实验每组中的ONL细胞计数和总视网膜厚度也标准化至该组附着视网膜的相应值以允许样品间比较。对于每个实验组，对来自4-11只眼睛的3个切片进行测量，每只眼睛来自单独的动物。用2尾斯氏t检验(不假设相等的方差)进行比较组间ONL中TUNEL阳性细胞的百分比和比较组间ONL细胞计数/总视网膜厚度比率的统计学分析。实施例2视网膜脱离实验模型中白细胞介素-6作为光感受器神经保护剂IL-6受体信号转导的立即下游转导蛋白为信号转导及转录激活蛋白(STAT) (Heinrich 等人，Biochem J，2003 年第 374 卷(Pt 1)第 1-20 页；Samardzija 等人，FASEB J，2006年第20卷第13期第M11-2413页；通过引用以其整体结合到本文中)。在视网膜-RPE分离的情况下，STATl和STAT3转录物和蛋白质水平都增加了(Zacks等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2006年第47卷第4期第1691-1695页，通过引用以其整体结合到本文中)。与附着的视网膜相比，脱离的视网膜中STATl和STAT3磷酸化(S卩，活化)增加。 在脱离时将IL-6中和抗体注射入视网膜下间隙导致磷酸化STAT3的水平大约降低50%。 磷酸化STATl的水平没有任何降低。这些数据提示，视网膜-RPE分离后，IL-6的作用主要通过STAT3而非STATl介导。在开发本发明实施方案期间进行实验，其中视网膜-RPE分离在野生型C57BL和 IL-6-/-小鼠中产生。脱离后三天，收集眼并用TUNEL染色评估视网膜内的凋亡。TUNEL阳性细胞限于光感受器的0NL，符合前面实验性RD. 3的研究。与野生型小鼠相比，TUNEL阳性细胞在脱离视网膜的ONL中的百分比在IL-6-/-小鼠中明显较大(见图2)。在野生型和IL-6-/-小鼠中产生脱离并维持1和2个月。然后收获眼用于甲苯胺蓝染色。野生型小鼠附着视网膜和IL-6-/-小鼠附着视网膜之间的ONL细胞计数/总视网膜厚度比率非常类似(见图3)。与零时间时附着的视网膜相比，野生型和IL-6-/-小鼠两者在1个月时间点时的标准化ONL细胞计数下降，但是IL-6-/-小鼠中的感光细胞死亡率显著较高(见图幻。脱离后两个月，ONL细胞计数/总视网膜厚度的比率进一步下降。 IL-6-/"组的最终ONL细胞计数比野生型动物低(见图幻。在Brown Norway大鼠中产生视网膜-RPE分离并且将仅溶媒或溶媒加0. 15 μ g抗人IL-6NAB在脱离时视网膜下注射入。脱离后3天大鼠眼睛的TUNEL染色显示，与仅用溶媒处理的那些相比，用抗IL-6NAB处理的视网膜ONL中TUNEL阳性细胞的百分比显著较高(见图4A-D、G)。在脱离产生时将15ng 重组IL-6视网膜下注射入。用视网膜下外源性IL-6处理的大鼠组的TUNEL阳性细胞百分比与仅用溶媒处理的大鼠没有不同，但是仍然显著低于用视网膜下抗IL-6NAB处理的大鼠 (见图4)。当视网膜-RPE分离的时期延长至4周和8周，与视网膜下仅注射溶媒相比，在脱离时于视网膜下注射抗IL-6NAB导致脱离后4周标准化ONL细胞计数显著较低(见图5B、 D、H)。相反，与仅用溶媒注射的对照相比，在脱离时于视网膜下给予外源性IL-6导致在脱离后4周显著较高的ONL细胞计数/总视网膜厚度比率(见图5B、F、H)。视网膜下给予外源性IL-6似乎减缓了脱离后第一个月期间感光细胞的损失率，但该速率在脱离后第二个月期间加速，使得外源性IL-6的保护的益处丧失，并且脱离后8周的ONL细胞计数/总视网膜厚度比率在仅用溶媒处理的组、用抗IL-6NAB处理的组和用外源性IL-6处理的组之间类似(见图5C、E、G、H)。在脱离产生时用外源性IL-6注射大鼠，然后在脱离后4周用相同剂量的外源性 IL-6第二次注射。在产生RD后8周，在4周时重复注射IL-6的动物的ONL细胞计数/总视网膜厚度仍然显著高于对照动物(见图5H)。按照上述方案产生视网膜-RPE分离，然后在RD产生后两周注射外源性IL-6。在脱离后4、6和8周(S卩，分别为视网膜下IL-6注射后2、4和6周)采集眼睛并用甲苯胺蓝染色。延迟2周注射IL-6的组的ONL细胞计数/总视网膜厚度，与在脱离产生时给予IL-6 注射的组相比最低限度地降低，并且显著高于对照动物(见图5H)。如与在视网膜-RPE分离时用IL-6处理的动物一样，延迟IL-6注射的作用似乎在脱离时间点后4周后减少，其中到脱离后8周，ONL细胞的数目达到对照值。实施例3与X连锁凋亡抑制剂相关的组合物和方法动物从 Harlan(Indianapolis,IN)禾口 Charles River Laboratories(Wilmington,MA) 购买至少6周龄的成年雄性Brown Norway大鼠。动物在标准实验室条件下维持并且所有程序都符合关于动物在眼科和视觉研究中的使用的ARVO声明和渥太华大学动物护理和兽医月艮务(the University of Ottawa Animal Care and Veterinary Service)的才旨南。将大鼠分成两组，一组接受XIAP基因治疗而另一组接受绿色荧光蛋白(GFP)对照。重组腺伴随病毒(rAAV)载体的构建将编码带有N末端血凝素(HA)标记的人XIAP全长开放阅读框的cDNA构建体插入处于鸡肌动蛋白启动子的控制下的pTR载体中。类似地产生GFP构建体用作手术和病毒对照。通过在构建体的3’非翻译区插入土拔鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)， 提高X连锁凋亡抑制剂(XIAP)病毒转基因表达。将血清型5rAAV产生(Hauswirth等人， Methods Enzymol，2000 年第 316 卷第 743-761 页 Jolotukhin 等人，Methods，2002 年第 28 卷第158-167页，通过引用以其整体结合到本文中)并纯化(Leonard等人，PLoS ONE, 2007 年第2卷e314页，通过引用以其整体结合到本文中)。rAAV-GFP的病毒滴度为2. 33 X 1012 物理颗粒/ml，rAAVXIAP的病毒滴度为1. 87X1013物理颗粒/ml。物理颗粒与感染颗粒的比率小于100。视网膜下注射将携带XIAP或GFP的rAAV注射剂递送至每只大鼠左眼的视网膜下间隙。右眼用作未经处理的对照。动物通过吸入2%异氟烷气体麻醉。将眼睛用托吡卡胺(Mydriacyl ；Alcon Canada, Mississauga, ON, Canada)和 2. 5 % 盐酸去氧肾上腺素 (Mydfrin ；Alcon)扩大。将盐酸丙美卡因滴剂(0.5%，Alcaine, Alcon)作为局部麻醉药给予。通过注射丁丙诺啡(0.(Mmg/kg)实现疼痛管理。为在整个程序过程中维持润滑，将 0.3%轻丙甲纤维素(Genteal gel ；Novartis Pharmaceutical Inc. , Mississauga, ON, Canada)施用至眼。通过用20规V型柳叶刀(V-lance knife) (Alcon)在缘后2mm产生巩膜切开术，进行视网膜下注射。小心避免接触晶状体，因为这会引起白内障形成。将涂覆有Genteal的盖玻片放在眼睛上面以提供眼睛背面的放大和可视化。与IOml注射器 (Hamilton Company, Reno, NV)连接的33规钝针通过巩膜穿刺插入，引至晶状体侧面并插入穿过视网膜。将2yL体积的与荧光素示踪剂组合的rAAV-XIAP或rAAV-GFP(50 1 ν/ ν)递送至眼睛视网膜下间隙。荧光素允许即时可视化和评价注射位置，这允许确定成功的视网膜下递送。以一致的方式在12:00和2:00位置间递送注射剂。术后护理包括在注射后给予抗生素0.3%盐酸环丙沙星(Ciloxan ；Alcon)和非留体抗炎药0. 03%氟比洛芬钠 (Ocufen ；Allergan, Irvine, CA) 5 天。视网膜脱离注射病毒后大约2周，在每只大鼠左眼进行视网膜脱离。通过在病毒注射位点附近将lOmg/mL透明质酸钠(Healon ；ΑΜ0, Santa Ana, CA)注射入视网膜下间隙产生脱离。大约三分之一到二分之一的视网膜脱离，留下余下附着的部分用作内部对照。在脱离后M小时、3天和2个月采样动物。胱天蛋白酶试验-脱离后M小时脱离产生后M小时，从XIAP (N = 15)和GFP (N = 15)动物中采集完好的右视网膜 (内部对照)和左视网膜的脱离部分，并提取rotein (Zacks等人，InvestOphthalmol Vis Sci, 2004年第45卷第4563-4569页，通过引用以其整体结合到本文中)。按照制造商的说明书，用胱天蛋白酶9比色测定试剂盒(Caspase 9 Colorimetric Assay Kit) (BioVision Research Products,Mountain View,CA)测定胱天蛋白酶9的活性。该测定基于标记底物 LEHD-pNA裂解后的生色团对硝基苯胺(pNA)的检测。按照制造商的说明，用胱天蛋白酶3 比色测定试剂盒(Chemicon InternationalBillerica, MA)测定胱天蛋白酶3的活性。该测定基于活化的胱天蛋白酶3对pNADEVD底物的裂解。组织固定和加工对大鼠给予致死性的Euthansol注射，并随后用4%多聚甲醛(PFA)灌注，以保存组织结构。左眼用白热针划痕以在成核和包埋过程中能够定位。用针穿刺眼睛以使固色剂渗透并置于4% PFA中过夜。然后将样品经过一系列脱水步骤，最后包埋于石蜡中。将眼睛以IOmm切片用于组织学分析。组织学分析在IOmm切片上进行苏木素和伊红(H&E)染色以定位视网膜脱离的位置。一旦鉴定脱离，对后续的载玻片进行免疫组织化学分析以证实XIAP或GFP的存在。用抗HA小鼠IgG初级抗体(Roche Applied Science, Laval, QC)然后用山羊抗小鼠IgG 二级抗体 (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. ,West Grove, PA)检测 XIAP0 用抗 GFP 兔 IgG (Invitrogen, Eugene, OR)然后用山羊抗兔 IgG (Invitrogen，Eugene，OR)检测 GFP。用 B630单克隆抗体检测视紫红质。用核染色剂二盐酸4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对 27片载玻片进行复染。用带有kiss AxioCam HRc摄像头的kiss Axioskop光显微镜获取图像。末端尿苷脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色脱离后3天用TUNEL来比较经XIAP处理和经GFP处理的样品脱离区域中的凋亡水平。用Apoptag过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒(Chemicon，Temecula, CA)检测TUNEL 阳性细胞。为消除观察者偏倚，用数学软件MATLAB (R2007a版本，The Mathworks Inc.)开发的程序检测TUNEL阳性细胞。该程序分析脱离视网膜外核层(ONL)的Wiotoshop图像 (Adobe System Inc.)。鉴定TUNEL阳性核，并记录其RGB值。该软件在逐个像素基础上扫描图像以确定落入阳性核RGB值的两个标准偏差内的像素数目。然后将“TUNEL阳性”像素的数目除以总组织像素，得到该切片的“TUNEL阳性”像素比。视网膜厚度比较加工脱离后2个月取样的眼睛用于组织学分析。采集用H&E染色的10 μ m切片的图像。将ONL的厚度测定为跨越脱离视网膜ONL的核层数目除以跨越相同视网膜附着部分 ONL的核层数目的比率。视网膜厚度随着离视神经的距离而变化，用内核层(INL)的厚度作为对照以确保ONL测量在离视神经头相同距离处进行。对于附着和脱离区域两者，从每只动物中获得至少4次计数，然后取均值。实施例4X连锁凋亡抑制剂胱天蛋白酶活性测定将rAAV-GFP用作载体和手术对照，显示光感受器变性速率。没有证据表明， rAAV-GFP具有神经保护作用或加速了光感受器的变性。与完好的未脱离视网膜相比， rAAV-GFP转染眼(GFP0Q的视网膜脱离显示胱天蛋白酶3和9活性的预期升高(见图6)。 经XIAP处理的视网膜(XIAP-0Q的胱天蛋白酶活性水平未显示脱离引起的增加，并与其对侧附着的对照相当。所有胱天蛋白酶活性均在脱离后M小时测定，该时间先前显示为峰值胱天蛋白酶活性的时间。TUNEL 分析在视网膜脱离产生后3天对眼睛取样，并将其包埋、切片和加工，用于免疫组织化学和TUNEL分析。选择3天的时间点是因为动物模型中的先前实验研究表明视网膜脱离后 3天的峰值TUNEL阳性染色(Zacks等人，Invest Ophthalmol Vis Sci,2003年第44卷第 1262-1267 页，Lewis GP, Charteris 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2002 年第 43 卷第M12-2420页，通过引用以其整体结合到本文中)。免疫组织化学证实来自rAAV-GFP和 rAAV-XIAP病毒注射两者的强烈表达(见图7A、B)。在视网膜脱离区域的细胞体和光感受器内外区段中鉴定GFP或XIAP抗体的强烈染色。该信号并非总是覆盖全部的脱离，并且有时在视网膜附着部分发现，表明病毒转染和脱离并不总是完全重叠。TUNEL染色的自动化的基于计算机的定量显示，rAAV-XIAP眼睛中的TUNEL阳性细胞比rAAV-GFP眼睛中的少(见图7C-E)。尽管与经GFP处理的眼睛相比，XIAP相关的TUNEL阳性细胞数目下降并没有达到统计学上的显著性，但是结果确实与XIAP相关的胱天蛋白酶下降良好关联(见图6)。慢性脱离中的光感受器存活率为评价光感受器的长期结构保护，对视网膜脱离后2个月时取样的眼睛进行组织学。用针对GFP (见图8A、B)或XIAP (见图8D、E)的免疫组织化学显现rAAV病毒注射位点并将其与组织学研究关联。观察经XIAP处理和经GFP处理的视网膜之间的形态学差异。 经XIAP处理样品的内外区段通常比经GFP处理的视网膜更有条理，但没有相同眼的附着区域那么有条理。视紫红质染色证实，保留下来的光感受器可存活并产生功能蛋白质(见图 8C、F)。将ONL中的光感受器核层进行计数并在rAAV-XIAP或rAAV_GFP处理的脱离视网膜与其正常的附着对应物之间进行比较。总是在沿着垂直子午线在离视神经距离相同处进行计数以说明视网膜变薄，因为当朝眼睛周围移动时，视网膜变薄会自然发生。总之，在经 XIAP处理的脱离视网膜中ONL得到显著保存(见图8和9)。这些视网膜具有4_8个核层 (相比于相同眼睛附着区域中的6-11个核层)。经GFP处理的脱离视网膜具有0-7个核层 (而相同眼睛附着部分中具有6-14个核层)。对每只动物，计算相对于附着区域的脱离区域中的ONL核比例(见图9E)。实施例5MET对视网膜凋亡的作用在开发本发明实施方案期间进行的实验中，用标准化动物模型(大鼠)产生视网膜脱离。在视网膜脱离时，注射三种化合物之一(mMET、MET、DMS0)。在脱离后72小时时， 采集并加工眼睛用于TUNEL染色。MET显著减少阳性细胞的数目(见图10)(即减少凋亡细胞的数目)。在开发本发明实施方案期间进行的实验中，用标准化动物模型(大鼠)产生视网膜脱离。在脱离后M小时，采集并加工眼睛用于胱天蛋白酶8活性测定。胱天蛋白酶8 是FAS受体活化的第一个下游靶标。胱天蛋白酶8活性增加意味着更多的FAS受体活化。 α-Met (实验性化合物)防止由视网膜脱离引起的胱天蛋白酶8活性的增加(见图11)。类似的结果在该途径中的甚至更远下游的另两种胱天蛋白酶(胱天蛋白酶3和9)中观察到。实施例6组合物及方法通过视网膜下注射透明质酸在Brown Norway大鼠中产生视网膜-RPE分离。在分离时将从癌蛋白Met的Fas结合细胞外域获得的Metl2注射入视网膜下间隙。以类似方式给予的突变体肽或溶媒充当无活性对照。用Fas活化抗体在Metl2存在或不存下在661W 细胞中诱导外源性凋亡途径。用量热测定和发光测定在视网膜提取物和细胞裂解物中测定胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的活性。分离后3天在视网膜切片中进行末端脱氧核苷酸转移膜dUTP缺口末端标记(TUNEL)。在视网膜脱离后2个月对视网膜切片进行组织学。视网膜脱离实验模型。用50 50混合的氯胺酮(lOOmg/mL)和赛拉嗪QOmg/mL) 麻醉啮齿动物，用局部去氧肾上腺素(2. 5% )和托吡卡胺(1% )扩瞳。用20规微玻璃体视网膜刀(Walcott Scientific, Marmora, NJ)缘前2mm产生巩膜切开术，小心避免晶状体损坏。在通过手术显微镜的直接显现下，将Glaser视网膜下注射器(32规尖；BD OphthalmicSystem, Sarasota, FL)通过巩膜切开术引入玻璃体腔，然后通过周边视网膜切开术引入视网膜下间隙。缓慢注射透明质酸钠(10mg/mL) (Pharmacia and Upjohn Co.，Kalamazoo, MI)以从底下的视网膜色素上皮细胞中分离感觉神经视网膜。在所有实验中，大约三分之一到二分之一的鼻上的感觉神经视网膜被脱离。脱离在所有测试动物的相同位置产生以允许直接比较视网膜细胞计数。脱离在左眼产生，留下右眼作为对照。在一些眼中，在脱离产生后立即将野生型 Met YLGA 12-聚体(HHIYLGAVNYIY (SEQ ID NO :1)，Metl2，50 μ g)、突变体 Metl2-聚体(HHGSDHERNYIY (SEQ ID NO :2)，mMet,50y g)或溶媒(DMSO)以 10 μ 1 体积用 Hamilton注射器(Hamilton Company, Reno, NV)注射入脱离区域视网膜下间隙。细胞培养。将661W细胞系维持在Dulbecco氏改良的fegle氏培养基中，该培养基含有10%胎牛血清、300mg/L谷氨酰胺、3ang/L腐胺、40μ L/Ιβ -巯基乙醇和40 μ g/L的氢化可的松21-半琥酯和孕酮。该培养基还含有青霉素(90单位/ml)和链霉素(0.09mg/ ml)。将细胞在37°C下在5% CO2和95%空气的增湿气氛中生长。胱天蛋白酶活性测定。按照制造商的说明书(Bio-Vision，Mountain View, CA)， 用比色法四肽裂解测定试剂盒测定胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的活性。 按照先前公布的方案提取总视网膜蛋白质(Zacks等人，I0VS，2003年第44卷第3期第 1262-1267页，通过引用以其整体结合到本文中)。将来自附着或脱离视网膜的100微克总视网膜蛋白质与胱天蛋白酶3 (DEVD-pNA)、胱天蛋白酶8 (IETD-pNA)或胱天蛋白酶9底物(LEHD-pNA)以200 μ M终浓度温育60分钟。用微量培养板读数器(Spectra-MAX 190， Molecular Devices, Sunnyvale, CA)在405nm处测定吸光度。作为阴性对照，将视网膜蛋白质与没有四肽的测定缓冲液共同温育。使用第二阴性对照，其中测定缓冲液单独与四肽温育。作为阳性对照，将纯化的胱天蛋白酶3、胱天蛋白8或胱天蛋白酶9单独与四肽温育。 将脱离视网膜中的胱天蛋白酶活性针对在相同时间点的附着视网膜中的胱天蛋白酶活性进行标准化。对于每一组，数据代表数个(例如5个)独立样品的平均胱天蛋白酶活性水平，每个样品由来自5只眼的蛋白质构成。在细胞培养实验中，用市售发光四肽(LETD)裂解测定试剂盒(ftOmega，Madison， WI)测定胱天蛋白酶8的活性。在处理前将661W细胞以1500个细胞/孔接种于96孔板 (Nunc, Rochester, NY)达M小时。用不同浓度的Metl2、mMet或溶媒预处理细胞1小时， 然后用500ng/mFas拮抗性Jo2单克隆抗体(BD Biosciences, San Jose, CA)处理。按照制造商的说明书，通过将细胞与高亮度冷光(pro-luminescent)底物在96孔板中温育，在不同时间点测定胱天蛋白酶8的活性。对照包括未经处理的细胞和没有细胞的孔。用平板读数器发光计(Turner Bio System, Sunnyvale, CA)测定发光。蛋白质印迹分析。将带有脱离的实验眼睛和没有脱离的对照眼睛的视网膜从 RPE脉络膜切开、勻浆并在缓冲液中裂解，每IOmL缓冲液含有IOmM HEPES(pH7. 6) ,0.5% IgEPal、42mM KClUmM苯甲基磺酰氟(PMSF)、lmM EDTAUmM EGTA、ImM二硫苏糖醇(DTT)和 5mM MgCl2 以及 1 片蛋白酶抑制剂(Complete Mini ；Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)。将勻浆在冰上温育并在4°C下于22，OOOg离心60分钟。然后确定上清液的蛋白质浓度(DC蛋白质测定试剂盒；Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)。将蛋白质样品上样在 SDS 聚丙烯酰胺凝胶(Tris-HCl Ready Gels ；Bio-Rad Laboratories)上并运行。在电泳分离后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon-P ；Amersham PharmaciaBiotech, Piscataway, NJ)上。将蛋白质条带用丽春红S染色显现，并通过对存在于所有泳道上的非特异性条带进行密度测定来评估等量上样的泳道。然后根据制造商的说明书， 针对裂解的胱天蛋白酶3、裂解的胱天蛋白酶8和裂解的胱天蛋白酶9 (Ce 11 Signal ing Technology, Danvers, ΜΑ)进行免疫印迹。TUNEL染色和组织学。在脱离产生后的不同间隔，将动物施行安乐死并摘下眼睛。对于TUNEL染色，将全眼在4°C下于具有4%多聚甲醛的磷酸缓冲盐水(pH7.4) 中固定过夜。将样品包埋于石蜡中并以5-6μπι的厚度切片。根据制造商的说明书 (MilliporeBillerica, MA)，用ApopTag荧光素原位凋亡检测试剂盒对切片进行TUNEL染色。对于光显微镜分析，用含0.5%甲苯胺蓝的0. 硼酸盐缓冲液对石蜡切片进行染色。细胞计数和视网膜厚度测定。将感光细胞凋亡定量为外核层(ONL)中TUNEL阳性的总细胞的百分比。每个切片选择视网膜脱离最大高度处的三个非重叠高倍视野(40Χ) 并取平均值，除非存在少于三个非重叠高倍视野，在这种情况下使用较少视野。每只眼睛使用一个代表性的切片。以类似的方式测定ONL中的细胞总数目。在每个切片视网膜脱离最大高度处的三个非重叠高倍视野(40Χ)中每个视野的三个地方测定视网膜的总厚度(从 ONL外缘测定至内界膜)并对每个眼取均值。假定感觉神经视网膜脱离后这些元件可变退缩，则光感受器内区段和外区段不包括在总视网膜厚度测量中，该可变退缩无需与光感受器的重附着后的生存能力相关(Zou等人，Nat Med, 2007年9月第13卷第9期第1078-85. 页；Guerin 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci, 1993 年第 34 卷第 1 期第 175-183 页，通过引用以其整体结合到本文中)。对于甲苯胺蓝染色的样本，将每个切片的ONL细胞计数对总视网膜厚度进行标准化(即，ONL细胞计数除以总视网膜厚度)，以说明切片角度的可能差异并允许进行样品间比较。每个大鼠实验组的ONL细胞计数和总视网膜厚度也针对该组的附着视网膜的相应值进行标准化以允许进行样品间比较。对于每个实验组，对来自多只眼睛(例如，10只)的多个切片(例如，3个)进行测量，每只眼睛来自单独的动物。实施例7Metl2的体外分析661W细胞系为感光细胞系，其通过在人光感受器间视黄醇结合蛋白(IRBP)启动子的控制下表达SV40-T抗原而永生化(Al-Ubaidi等人，J Cell Biol, 1992年第119卷第6期第1681-1687页，通过引用以其整体结合到本文中)。661W细胞表达视锥光感受器标记，包括蓝色和绿色视锥色素、转导蛋白和视锥抑制蛋白(Tan等人，Invest Ophthalmol Vis Sci, 2004年第3期第764-768页，通过引用以其整体结合到本文中)，并可经受胱天蛋白酶介导的细胞死亡(Kanan等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2007年第48卷第1期第40-51页，通过引用以其整体结合到本文中)。在开发本发明期间进行的在先实验表明， Fas信号转导在体内胱天蛋白酶8活化和光感受器凋亡中发挥关键作用。用Fas活化抗体(Fas-Ab)处理661W细胞。Fas-Ab的添加导致细胞死亡。在661W细胞裂解物中测定的胱天蛋白酶8活性随!^is-Ab浓度的增加而增加，峰值在500ng/ml剂量处(见图12A)。用 500ng/ml Fas-Ab处理661W细胞并在不同时间点测定活性水平。在暴露于!^as-Ab的661W 细胞中，胱天蛋白酶8的活性在48小时处显著增加(见图12B)。Met抑制Fas途径。小的12-聚体肽Metl2包含Met的Fas结合YLGA模体周围的氨基酸，其保护Jurkat细胞免受！^认诱导的凋亡(Zou等人，Nat Med，2007年9月，第13卷第9期第1078-85.页，通过引用以其整体结合到本文中)。在Met2或无活性突变体肽 mMet的存在下用Fas-Ab处理66IW细胞，mMet中随机改变包含YLGA模体的中央6个氨基酸。在处理后48小时确定胱天蛋白酶8的活性，作为!^s-受体途径活化的衡量。Fas-Ab诱导的胱天蛋白酶8的活化被Metl2处理以剂量依赖方式抑制(见图12C)。相反，仅用mMet 肽或溶媒对细胞的处理对Fas介导的胱天蛋白酶8活化无影响。661W细胞具有完好的Fas 死亡受体途径。Metl2肽可在体外光感受器模型中抑制Fas信号转导。实施例8Metl2的体内作用在开发本发明期间进行的实验表明，视网膜脱离导致hs/i^sL途径活化和胱天蛋白酶8裂解(Zacks等人，I0VS，2003年第44卷第3期第1262-1267 M ；Zacks等人，Arch Ophthalmol, 2007 年第 125 卷第 1389-1395 页；Zacks 等人，10VS, 2004 年第 45 卷第 12 期第4563-4569. 8页，通过引用以其整体结合到本文中)。在视网膜脱离后M小时研究Metl2 对光感受器胱天蛋白酶8活化的影响。大鼠视网膜在Metl2 (50 μ g)、mMet (50 μ g)或溶媒的存在下被脱离。与附着的视网膜相比，胱天蛋白酶8的活性在用溶媒或mMet注射的脱离的视网膜中显著增加(见图13)。在视网膜脱离时于视网膜下注射Metl2肽使胱天蛋白酶 8的活性减少大约50%。这些结果表明，与661W细胞类似，用Metl2处理脱离的视网膜抑制光感受器中Fas介导的胱天蛋白酶8的活化。在啮齿动物光感受器凋亡期间，Fas/FasL信号转导作为内源性死亡途径的上游调节物。这通过将抗Fas或!^asL的中和抗体注射入脱离视网膜的视网膜下间隙后胱天蛋白酶9活性减少而表明(Zacks等人，10VS, 2004年第45卷第12期第4563-4569. 8页，通过引用以其整体结合到本文中)。在彻{12(5(^0、!111讨(5(^0或溶媒的存在下的视网膜脱离后M小时测定胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的活性水平。M小时后视网膜下Metl2注射使胱天蛋白酶3的活性减少了大约50% (见图13)。类似地，用Metl2注射的脱离视网膜中，胱天蛋白酶9的活性也减少了约50% (见图13)。相反，视网膜下注射mMet并不影响任一种这些胱天蛋白酶的活性水平。蛋白质印迹确证了胱天蛋白酶8酶原转化为裂解胱天蛋白酶8(见图13)，如胱天蛋白酶3和9的裂解一样。这些结果表明，Metl2介导的!^s 受体抑制导致脱离的光感受器中内源性细胞死亡途径活化减少。在啮齿动物的眼睛中，TUNEL染色峰值出现在视网膜/RPE分离后3天，到第7天， TUNEL阳性细胞快速下降至接近分离前的水平(Zacks等人，I0VS, 2003年第44卷第3期第 1262-1267 页；Zacks 等人，Arch Ophthalmol，2007 年第 125 卷第 1389-1395 页，通过引用以其整体结合到本文中)。在Metl2、mMet或溶媒的存在下使大鼠视网膜脱离。在视网膜脱离后3天，TUNEL阳性细胞局限于光感受器的ONL(见图14A)。约5%的ONL细胞在分离后3天表现出TUNEL阳性染色(见图14B)。与用mMet注射的独立视网膜相比，将Metl2注射入视网膜下间隙导致TUNEL阳性光感受器减少约77% (见图14B)。由于单独注射溶媒， 总组织学改变不可检测。如上所述脱离大鼠视网膜并在脱离时将Metl2、mMet或溶媒注射入视网膜下间隙。2个月后，与附着的视网膜相比，脱离的视网膜的ONL厚度显示出显著的减少(见图 15A)。视网膜脱离后2个月，与用mMet注射的视网膜相比，用Metl2注射的大鼠视网膜显示出ONL细胞计数增加37% (见图15B)以及ONL厚度测量增加27% (见图15C)。这些结果表明，通过Metl2抑制Fas信号转导和胱天蛋白酶活化在延长的视网膜/RPE分离后增加光感受器的存活率。
权利要求
1.一种增加光感受器存活率的方法，包括给予光感受器保护组合物。
2.权利要求1的方法，其中所述增加光感受器存活率包括抑制光感受器凋亡。
3.权利要求1的方法，其中所述光感受器保护组合物包含光感受器保护多肽或编码光感受器保护多肽的核酸。
4.权利要求3的方法，其中所述光感受器保护多肽包括IL-6或其片段。
5.权利要求3的方法，其中所述光感受器保护多肽包括XIAP或其片段。
6.权利要求3的方法，其中所述光感受器保护多肽包括MET或其片段。
7.权利要求6的方法，其中所述MET片段包括MET12。
8.权利要求6的方法，其中所述MET片段包含与MET12至少70%的序列相似性。
9.权利要求2的方法，其中所述光感受器凋亡包括FAS介导的光感受器凋亡。
10.权利要求1的方法，其中将所述光感受器保护组合物给予细胞群。
11.权利要求10的方法，其中将所述光感受器保护组合物以足以增加所述细胞群内的光感受器存活率的量给予。
12.权利要求1的方法，其中将所述光感受器保护组合物给予受试者。
13.权利要求12的方法，其中所述受试者处于眼部病况、疾病或者影响眼部健康的病况或疾病的风险中。
14.权利要求13的方法，其中所述受试者患有眼部病况、疾病或者影响眼部健康的病况或疾病。
15.权利要求14的方法，其中所述眼部病况、疾病或者影响眼部健康的病况或疾病包括视网膜脱离、黄斑变性、视网膜色素变性、眼部炎症、自身免疫性视网膜病变、创伤、癌症、 肿瘤、葡萄膜炎、遗传性视网膜变性、糖尿病视网膜病变、脉络膜新血管形成、视网膜缺血、 病理性近视、血管样条纹症、黄斑水肿或中心性浆液性脉络膜视网膜病变。
16.权利要求15的方法，其中所述眼部病况、疾病或者影响眼部健康的病况或疾病包括视网膜脱离。
17.权利要求15方法，其中所述眼部病况、疾病或者影响眼部健康的病况或疾病包括黄斑变性。
18.权利要求12方法，其中将所述光感受器保护组合物以足以提高所述受试者内的光感受器存活率的量给予。
19.一种组合物，其包含光感受器保护组合物和配置用于眼部递送的药用载体。
20.权利要求19的组合物，其中所述光感受器保护组合物包含光感受器保护多肽或编码光感受器保护多肽的核酸。
全文摘要
本发明提供防止光感受器死亡的方法。具体而言，本发明提供防止FAS介导的光感受器凋亡的肽。
文档编号C12N5/02GK102449140SQ201080020137
公开日2012年5月9日 申请日期2010年3月3日 优先权日2009年3月3日
发明者D·N·扎克斯 申请人:密执安大学评议会