化合物的制作方法

专利名称：化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用作抗癌剂的苯甲醛衍生物。有些本发明化合物是新化合物。
大多数目前使用的抗癌剂在其作用过程中有细胞毒性。虽然这些活性剂已经在某些癌症例如淋巴瘤、白血病和睾丸癌的治疗中获得了良好结果，但是它们经常产生严重且不可接受的副作用，这限制了其进行有效治疗的可能性。此外，在几种癌症例如实体瘤(癌)中，迄今为止据证明化疗的作用很有限，因为既定的细胞抑制药物很少能改善患者的预后。癌细胞产生抗细胞毒性产品的能力也是其没有能成功地应用于治疗实体瘤的主要原因。因此非常需要具有较小副作用并且对恶性细胞有更好选择性作用的新抗癌剂。
从EP-0215395、JP-63264411、JP-8800940、JP-55069510和EP-0283139中可知苯甲醛及其衍生物表现出选择性的抗癌作用。
醛与O、S或N亲核实体例如羟基、巯基和氨基反应生成羰基缩合产物例如醛缩醇、缩硫醛、缩醛胺等。然而，当与伯胺反应时，该反应通常会生成席夫碱(亚胺)加成物。众所周知的是，体内席夫碱形成涉及重要生化过程例如氨基转移、脱羧和由磷酸吡哆醛介导的其它氨基酸修饰反应，在糖酵解中醛缩酶对二磷酸果糖的作用和视觉产生过程中视黄醛与视紫红的缩合。还已知羰基缩合反应涉及跨膜信号传导事件，例如涉及产生免疫应答。
亚胺的形成是经由两步骤机制进行的氨基亲核试剂对羰基的加成形成甲醇胺(氨基醇)中间体，然后进行脱水步骤生成C＝N双键。这两个步骤都是可逆的，但是在不同pH被促进。结果是，该反应依据特征的钟形pH/速度轮廓图进行，发现在中等酸性下总反应速度最高。 然而，已知席夫碱的形成在生理条件下也易于发生，并且在体内有很多众所周知的羰基缩合反应(E.Schauenstein等人，Aldehydesin biological systems.London，Pion Ltd.1977)。
席夫碱自身是反应性物质，并趋于进一步反应，使得亲核剂与双键加成。对于某些含硫胺，特别是氨基酸半胱氨酸和甲硫氨酸，以及对于谷胱甘肽，最初形成的席夫碱可经历可逆的内环化，在这样的内环化中巯基加成到亚胺上形成噻唑烷甲酸酯(M.Friedman，Thechemistry and biochemistry of the sulfhydryl group in aminoacids，peptides and proteins，Oxford，Pergamon Press，1973)。 G.E.Means和R.E.Feeney (Chemical Modification ofPoteins，pp.125-138，San Francisco，Holden-Day，1971)报道了关于羰基化合物与蛋白游离氨基之间的反应形成可逆席夫碱连接的事实。芳香醛通常比饱和脂族醛的反应性更强，并且甚至在不除去反应期间所形成的水的情况下也可以形成席夫碱(R.W.LayerChem.Rev.63(1963)，489-510)。考虑到在生理条件下的席夫碱形成，这一事实非常重要。使用血红蛋白作为氨基酸来源，Zaugg等人(J.Biol.Chem.252(1977)，8542-8548)已表明，在席夫碱形成方面，芳香醛的反应性比脂族醛高2-3倍。对于链烷醛的有限反应性的一个解释是，在水溶液中于中性pH下，需要大大过量的游离醛来使反应平衡朝着有利于席夫碱形成的方向移动(E.Schauenstein等人，Aldehydes in biological systems.London，Pion Ltd.1977)。
苯甲醛易于和膜上的氨基形成席夫碱亚胺，并且对于苯甲醛与胺的反应，已经测得了高的平衡常数(J.J.Pesek和J.H.Frost，Org.Magnet.Res.8(1976)，173-176；J.N.Williams Jr.和R.M.Jacobs Biochim Biophys Acta.154，(1968)323-331)。
我们以前已经通过放射标记影像表明，苯甲醛不进入细胞内，而是粘着在细胞膜上(Dornish，J.M.和Pettersen，E.O.CancerLetters 29(1985)235-243)。这与表明苯甲醛与大肠杆菌的膜蛋白相互作用的更早期研究(K.Sakaguchi等人.Agric.Biol.Chem.，(1979)，43，1775-1777)相一致。还发现吡哆醛和吡哆醛-5-磷酸都保护细胞抗细胞毒性抗癌剂顺-DDP。顺-DDP在细胞内的细胞核中发挥其作用。而吡哆醛一般可穿透亲脂性细胞膜，对于吡哆醛-5-磷酸来说该可能性则被阻断，这是因为后者具有磷酸根基团所致。因此吡哆醛-5-磷酸必须通过从细胞膜外的作用来发挥其保护作用。同时所观测到的吡哆醛-5-磷酸的吸收向较低波长移动这一事实与该醛和细胞膜氨基之间形成席夫碱加成物是一致的(J.M.Dornish和E.O.Pettersen，Cancer Lett.29，(1985)，235-243)。
这些发现表明，醛与细胞膜上的胺和其它亲核实体结合，以形成席夫碱和其它缩合产物。已知细胞生长的刺激是由在细胞膜外作用的事件级联介导的。同样，本专利申请的衍生物可通过与细胞膜上的配体形成加成物来发挥作用，引发细胞内的脉冲，从而显著影响细胞生长参数例如蛋白合成和有丝分裂，和影响肿瘤抑制基因的表达以及免疫应答。因为缩合反应是可逆的，所以细胞作用可作为涉及连接物种(ligating species)的平衡移动的结果而得到调节。在化学水平上存在的动态平衡与所观察到的苯甲醛衍生物的可逆且非毒性作用方式是一致的。
在我们的研究组中，已经通过体外试验对苯甲醛衍生物的蛋白合成抑制作用进行了充分研究。在实体瘤中，降低蛋白合成可使得导致细胞死亡的生命蛋白缺乏。在正常细胞中，蛋白合成的能力要高于大多数实体瘤癌细胞。这是通过比较正常干细胞和大多数实体瘤癌细胞的细胞周期而得以证实的，其中正常干细胞的细胞周期通常低于10小时，因此比大多数实体瘤癌细胞的细胞周期(一般为30-150小时)短(参见Gustavo和PileriThe Cell Cycle and Cancer.Ed.Baserga，Marcel Dekker Inc.，N.Y.1971，p 99)。因为平均来说，细胞的蛋白在细胞周期期间要翻倍，这意味着在生长刺激的正常细胞中的蛋白积聚要高于大多数类型癌细胞。
除了正常细胞和癌细胞之间的这种差异以外，还有另一个类似重要差异正常细胞对生长调节刺激起反应，而癌细胞降低了或根本没有这种应答。因此，正常细胞在普通生长条件下可具有生长潜力储备，而癌细胞具有很少或没有这样的储备。如果在长时间内继续对正常细胞以及癌细胞施加蛋白合成抑制作用，这两种不同类型的细胞可以有不同反应正常组织可利用一些其生长潜力储备并由此保持正常细胞繁殖。而癌组织具有很少或没有这样的储备。同时在大多数癌细胞中蛋白积聚的速度相当低(即蛋白合成仅稍大于蛋白降解)。因此，蛋白合成抑制可足以使得肿瘤组织在蛋白积聚方面失衡，从而对于一些蛋白导致负平衡。在持续处理几天期间，这将导致肿瘤组织中的细胞失活和坏死，而正常组织没有受害。
迄今为止，测试最充分的能引起可逆蛋白合成抑制并表现出抗癌活性的化合物是5，6-亚苄基-d1-抗坏血酸[亚苄维C(2H)]。Pettersen等人(Anticancer Res.，vol.11，pp.1077-1082，1991)和EP-0283139中详细描述了该现有技术化合物的蛋白合成抑制活性。亚苄维C(2H)在裸鼠中的人肿瘤异种移植物内体内引起肿瘤坏死(Pettersen等人，Br.J.Cancer，vol.67，pp.650-656，1993)。除了亚苄维C(2H)以外，涉及癌症治疗的最接近的现有技术化合物是4，6-O-亚苄基-D-吡喃葡萄糖(化合物1)。已知这两种化合物具有常规抗癌活性，并在临床试验中测试过其抗多种癌症的作用。然而，没有特别的患癌症的器官或组织适于用这些化合物治疗，并且证明不适合商业开发。
我们现在已经惊奇地发现，己糖型糖的苯甲醛衍生物(包括4，6-O-(亚苄基-d1)-D-吡喃葡萄糖，化合物2)对一些器官和组织中的癌症表现出了料想不到的强作用。我们还不能解释这种选择性的机制，但是我们认为这与这类衍生物的糖部分对一些细胞或组织的亲和力有关。例如化合物2(氘代苯甲醛的葡萄糖衍生物)较亚苄维C(2H)(氘代苯甲醛衍生物和抗坏血酸)对肝癌表现出令人吃惊的好作用(见实施例6)。也在源于人类胰腺癌的Panc-1细胞中我们惊奇的发现化合物2产生比亚苄维C(2H)强的蛋白合成抑制(见实施例2，图3)。对这些组织而言，高水平的一些葡萄糖转运体和受体是常见的。在现有技术中没有预见用化合物2治疗肝癌和胰腺癌比亚苄维C(2H)更好的事实。相反，基于早先EP-0283139中已知的实验我们预计化合物2会有与亚苄维C(2H)类似或较亚苄维C(2H)稍差的作用。
我们还在实验中发现，这些化合物的氘代类似物比相应的质子类似物更有效。在我们的细胞粘着实验中，这种作用差异非常醒目(见实施例3和实施例7)。当氢原子被质量数是其两倍的原子例如重氘同位素取代时，该分子的动力学特征发生了改变，因为断开C-D键的速度比断开C-H键的速度慢。M.I.Blake等人，J.Pharm.Sci.64(1975)，367-391描述药物的氘代可改变其药理功能。
从现有技术(EP 0 283 139和Anticancer Res.151921-1928(1995))中可知，当4，6-O-亚苄基-D-吡喃葡萄糖中的乙缩醛质子被氘取代时(化合物1对化合物2)，可影响蛋白合成和细胞存活分数(体外测定)。我们认为，对于这种D-同位素效应在化学水平上的一个可能解释是，氘代的苯甲醛氧化成无活性苯甲酸的速度较慢，从而使得氘代的活性组分在细胞水平上的半衰期较长。然而，为了证实分别暴露于化合物1和化合物2的NHIK 3025细胞在存活分数方面的显著差异，必须施用6mM以上的药物浓度。当把这些细胞暴露于1-10mM浓度下时，在蛋白合成抑制方面的差异非常小。
本发明者们现在进行了一类完全不同的实验将NHIK 3025细胞在化合物1和2的溶液中预培养后，测定细胞与底物之间的粘着力(见实施例3)。甚至在1mM浓度下，也表现出了令人惊讶的D-同位素效应。令人惊奇的是，化合物2将粘着力显著降低至对照的1/3，而化合物1没有导致显著降低。本发明者们认为，化合物2可能干扰了整联蛋白的生物合成，降低了细胞粘着到底物上的能力。整联蛋白是结构跨膜蛋白，其对于细胞结合到细胞外基质上和细胞间相互作用有决定性作用。因此，抑制整联蛋白的功能可直接影响癌细胞的转移能力。该实验表明，整联蛋白可能对蛋白合成抑制尤其敏感。因此，化合物2可较好地用于阻止癌症发展中的转移过程。
在比较化合物1和2的体内模型中，将来源于侵袭肝脏的人类结肠直肠癌细胞系C170HM2癌细胞腹膜内注入裸鼠，然后进行药物治疗。用化合物2治疗的动物的肝脏肿瘤重量(burdon)与用化合物1治疗的动物相比令人惊奇的低(见实施例7)。
在上述实验中我们表明用醛衍生物治疗癌症D-同位素效应比过去本领域已知的更恰当。这两个实验(实施例3和实施例7)共同表明化合物2和类似药物可能对肝脏原发癌症和续发癌症的治疗特别有益。
特别是用化合物1(4，6-O-亚苄基-D-吡喃葡萄糖)治疗肝肿瘤公开于US-4882314中。按照US-4882314的实验2患有结肠癌伴转移肝癌的病人被治愈。然而根据该美国专利的实验5患有原发肝肿瘤的病人在治疗4个月后死亡。
后来G.Tanum等，Am.J.Clin.Oncol.(CCT)，13(2)，1990，第161-163页总结为化合物1对患有结肠直肠癌症的病人无活性。在这一研究中每天治疗持续2个月，治疗作用通过测量肿瘤大小进行评估。
在本发明者进行的实验中，静脉内治疗化学诱导的Wistar大鼠肝癌10天，令人吃惊的表明在5只用化合物2治疗的动物中有2只发展为大块的坏死面积，而在用化合物1治疗的5只动物中一只也没有(见实施例6)。
本发明的发明者对注射C170HM2细胞的裸鼠用化合物1和化合物2治疗进行了进一步的研究。肿瘤系C170HM2是来源于病人原发肿瘤的人类结肠直肠细胞系。结束时暴露肝脏，计数可见的肝脏肿瘤并测量其总的截面积。化合物2对人类结肠直肠肿瘤，C170HM2的肝侵袭的作用远好于化合物1(实施例7)。
此外，发明者惊奇的观察到化合物2对大鼠肝癌的发展与亚苄维C(2H)相比基本上有较好的作用。在用亚硝胺和部分肝切除初期治疗幼大鼠后，这些动物的肝癌生长3-6个月。再用亚苄维C(2H)或化合物2治疗11个月，动物生长的肝肿瘤的数量及肿瘤中肿瘤组织的量在化合物2治疗的动物中比在亚苄维C(2H)治疗的动物中减少了数倍(见这样，已发现化合物2与过去已知作用相比对(原发性及转移性)肝癌具有令人惊奇的更好的治疗作用。
在纯系Wistar大鼠中(见Eker R.，Acta Path.Microbiol.Scand.，34，(1954)，554-562)动物生长肾癌作为常染色体的显性基因的结果。在11个月大时对动物进行手术以检查哪些发展为癌(50％有肾癌)。具有2-4mm直径癌的动物包括在实验中，由于根据经验这些小肿瘤没有坏死面积。对其每天注射等渗盐水(安慰剂)或含有亚苄维C(2H)的盐水，未氘代的亚苄维C(2H)类似物(5，6-O-亚苄基-抗坏血酸钠盐)或化合物2，进行10天。治疗10天后施用未氘代的亚苄维C(2H)类似物及安慰剂治疗的动物很少或没有坏死，而用亚苄维C(2H)或化合物2治疗的动物的肿瘤一半是坏死的(见实施例8)。
化学诱导的致癌作用(如在实施例6中)与一些病毒例如乙肝病毒和丙肝病毒、一些乳头状瘤病毒、一些疱疹病毒等引起的致癌作用有类似机制。乙肝和丙肝患者发展成肝癌尤其是这种情况。因此推测用本发明产物进行预防性治疗可预防或延迟肝癌的发展。而且本发明产物的低毒性(例如化合物2)使得其适于进行这样的治疗。
在免疫识别过程中，外来蛋白的片段被限制在抗原呈递细胞(APC)表面的II类MHC蛋白的沟中。T辅助细胞的受体也附着在该MHC-抗体复合物上。为了激活T辅助细胞，必须至少提供两个信号初始信号由抗原自身经由II类MHC复合物介导，并被CD4共受体增强。次级信号可由APC表面上的特异浆-膜结合信号传递分子提供。配对共受体蛋白位于T辅助细胞的表面上。这两个信号都是T细胞激活所必需的。当激活时，它们通过分泌白介素生长因子和合成配对细胞表面受体刺激其自身的增殖。然后白介素与这些受体的结合可直接刺激T细胞增殖。
在20世纪80年代，人们认识到，在鼠模型中环糊精苯甲醛包合复合物可通过增强淋巴因子激活的杀伤细胞来刺激免疫系统(Y.Kuroki等人，J.Cancer Res.Clin.Oncol.117，(1991)，109-114)。后来进行的体外实验表明了引起次级共刺激信号的在APC-供体/T-细胞受体相互作用位点的化学反应的性质，和这些反应采取羰基-氨基缩合形式(形成席夫碱)。此外，通过合成化学实体可模拟这些相互作用。这些发现在人为增强免疫系统方面提供了新的治疗机会。WO94/07479要求保护与T-细胞表面氨基形成席夫碱和腙的一些醛与酮的应用。在EP 0609606 A1中，优选的免疫刺激物质是4-(2-甲酰基-3-羟基苯氧基甲基)苯甲酸(妥卡雷琐)—一种最初设计用来治疗镰状细胞性贫血的化合物。该化合物是通过口服给药，并且是系统生物可利用物质。目前正在研究妥卡雷琐在治疗多种疾病包括细菌、病毒和原生动物感染、自身免疫性疾病和癌症方面的效力(H.Chen和J.Rhodes，J.Mol.Med(1996)74497-504)，目前正在开发将妥卡雷琐与疫苗联合施用来治疗慢性乙肝、HIV和恶性黑素瘤的联合治疗方案。
通过测定体外免疫参数，并评价体内作用，显示了钟形剂量/反应曲线(H.Chen和J.Rhodes，J.Mol.Med(1996)74497-504)。另外这种有些不寻常的剂量/反应关系可通过下述假定来解释即高浓度醛药物将使得APC与T-细胞有效结合所必需的共刺激配体饱和，因此具有抑制作用。足以获得能提供共刺激同时又不阻断细胞间连接的动态平衡的剂量看上去是最佳的。
一般情况下，由于氧化醛在本质上是不稳定的。在EP-0609606中公开的4-(2-甲酰基-3-羟基苯氧基甲基)苯甲酸(妥卡雷琐)在体内的效力要显著高于在体外的效力。这可能是因为药物在体外水溶液中易于被氧化(H.Chen和J.Rhodes，J.Mol.Med(1996)74497-504)。许多醛由于反应性太强而不能以自身形式给药，并且苯甲醛虽然据证明在体外是活性抗癌药物，但是具有高度刺激作用，并不适于直接在体内应用。在生命体系中，醛的羰基能迅速与在所有体液中都显著存在的亲核实体反应。这些多余副反应可导致药物迅速代谢，并难以控制活性药物的血清水平。在细胞水平上将药物控制在窄的浓度窗口内对于获得有效免疫加强很重要。妥卡雷琐是作为未保护的醛口服给药，并且人们可以怀疑药物变质和难于控制药动学。
苯甲醛衍生物4，6-亚苄基-D-葡萄糖和氘代类似物(化合物1和2)已被证明在静脉内和口服给药时都具有高生物利用度。将化合物2口服施用给BALB小鼠后，在血清水平上测定的生物利用度为93-99％(C.B.Dunsaed，J.M.Dornish和E.O.Pettersen，CancerChemother.Pharmacol.(1995)35464-470)。此外，葡萄糖部分对存在于细胞表面上的受体具有亲和力，因此能在细胞水平上改善药物利用度。游离醛可易于通过水解醛缩醇来释放，使得羰基能被利用以在靶配体上形成席夫碱。
在本专利申请中，醛用生物可接受碳水化合物例如葡萄糖、半乳糖等衍生化以形成醛缩醇。因此，糖部分通过改善醛官能团的稳定性和增强其生物利用度而有助于对靶细胞的作用。通过使用本发明化合物与现有技术已知的化合物比较，这令人惊奇地导致羰基缩合反应更有效和更易于控制药动学。
为了比较化合物2与妥卡雷琐，在同等浓度的两种药物存在下测定细胞失活和蛋白合成抑制。从附

图1和附图2中可看出，在这两个测定的参数方面，化合物2比妥卡雷琐更有效。
本发明化合物的免疫刺激作用也可用于与其它抗病毒治疗例如抗病毒药物或疫苗联合施用来治疗一些病毒疾病。初次感染后，许多类型病毒与细胞核惨合，并长时间不活动。致癌基因病毒例如乙肝病毒和丙肝病毒、一些逆转录病毒和一些乳头状瘤病毒可引起癌症。在这些潜伏期，非常难以治愈病毒感染。这些病毒经常被免疫反应引发以引起病毒血症，并且在该阶段，可以清除病毒感染。苯甲醛衍生物引发免疫反应的能力可用于与抗病毒药物或疫苗联合使用以治疗这些疾病。
本发明的主要目的是提供预防和/或治疗癌症的新化合物。
本发明的另一目的是提供用于预防或治疗癌症且无毒性副作用的化合物。
本发明的第三个目的是提供有效且有益于预防和/或治疗肝癌(原发性及由其它癌症如结肠直肠癌的肝转移)的化合物。预防治疗对阻止乙肝或丙肝患者发展为肝癌也很重要。
本发明的第四个目的是提供有效且有益于预防和/或治疗具有对相应的糖部分有亲和性的受体的组织和细胞中的癌症的化合物。
本发明的第五个目的是提供能有效且有益地预防和/或治疗肾癌的化合物。
本发明的第六个目的是提供有效且有益于预防和/或治疗肺癌的化合物。
本发明的第七个目的是提供有效且有益于预防和/或治疗胰腺癌的化合物。
本发明的这些和其它目的可通过权利要求书实现。
本发明化合物是4，6-O-(亚苄基-d1)-D-吡喃葡萄糖(化合物2)、4，6-O-亚苄基-L-吡喃葡萄糖(化合物3)和4，6-O-(亚苄基-d1)-L-吡喃葡萄糖(化合我4)或其可药用盐。
化合物3和4是新化合物。
发明详述在下文中通过实施例和表格及附图进一步解释本发明。
附图描述附图1数据代表这样的实验，其中在37℃用化合物2(Δ)或妥卡雷琐(●)将NHIK 3025-细胞处理20小时，同时附着在塑料Petri培养皿上。存活分数表示处理后能形成肉眼可见集落的细胞的分数。每一点代表5个平行培养皿的集落数目的平均值。当标准误差大于符号的大小时标出。
附图2在37℃用化合物2(■)或妥卡雷琐(▲)将NHIK 3025-细胞处理1小时相对于未处理的NHIK3025细胞的蛋白合成速度。通过药物处理开始后第一个小时期间掺入的[3H]-缬氨酸的量测定蛋白合成速度。蛋白合成速度是相对于细胞中总蛋白量测定的。数据是以一式四份进行的一个实验的代表数据。标准误差在超过符号大小时显示。
附图3用化合物2(■)或亚苄维C(2H)(▲)处理的相对于未处理的Panc-1细胞的蛋白合成速率。蛋白的合成速率是通过在开始处理后第一个小时期间掺入的[3H]-缬氨酸的量来测定的。蛋白合成速率是相对于细胞中总蛋白量测定的。标准差小于符号的大小。
附图4暴露于不同苯甲醛衍生物的细胞的中值粘着力。将细胞暴露于1 mM浓度的化合物1和2中。
附图5将在Ex Vivo 10培养基中的外周血液单核细胞和超级抗原暴露于苯甲醛、氘代苯甲醛、化合物2或亚苄维C(2H)中。通过测定在不同药物浓度下掺入的含氚胸腺嘧啶脱氧核苷来测定外周血液单核细胞的增殖。
附图6通过腹膜内注射使脾侵入Friend红白血病病毒来感染NMRI小鼠。通过每天腹膜内施用5mg/kg化合物2来治疗感染和未感染的小鼠。治疗19天后，切下并取出脾脏进行称重。
附图7尸体解剖时具有肝肿瘤组织动物的分数。
附图8在显示肿瘤反应的动物中每一肝脏的平均肿瘤物量。
附图9对于每一组每只动物的平均体重增长曲线。时间坐标代表动物的年龄。为使曲线清晰仅表示出了几次测量的标准偏差。
附图10在该图中，在大小轴上用对数标度将肝脏肿瘤的发生率和大小绘在同一曲线上。
附图11表示的是化合物1和2对肝脏侵入的人结肠直肠肿瘤C170HM2的作用。
附图12通过测定从加入测试化合物后立即开始(实心符号)或2小时后开始(空心符号)的1小时脉冲期间掺入的[3H]-缬氨酸的量，来测定用化合物1或化合物3处理的人子宫颈癌细胞NHIK 3025的蛋白合成速度。
附图13通过测定从加入测试化合物后立即开始(实心符号)或2小时后开始(空心符号)的1小时脉冲期间掺入的[3H]-缬氨酸的量，来测定用化合物2或化合物4处理的人子宫颈癌细胞NHIK 3025的蛋白合成速度。
附图14表示的是，用化合物1(●)或化合物3(○)处理20小时后，通过测定人子宫颈癌细胞NHIK 3025的集落形成能力来测定细胞存活。
附图15表示的是，用化合物2(○)或化合物4(▲)处理20小时后，通过测定人子宫颈癌细胞NHIK 3025的集落形成能力来测定细胞存活。
附图16表示的是，用L-葡萄糖(●)或化合物3(○)处理20小时后，通过测定人乳腺癌细胞T47-D的集落形成能力来测定细胞存活。
表格描述表2正常和癌组织中的组织观察。第一组未治疗对照。
表3正常和癌组织中的组织观察。第二组安慰剂。
表4正常和癌组织中的组织观察。第三组每公斤每天85mg化合物2。 制备众所周知，醛在酸促下与醇进行缩合反应产生醛缩醇。同时形成副产品水。该反应是可逆的，并且在溶液中形成平衡的醛/醇和醛缩醇/水混合物。平衡的位置主要取决于每一物质的活性和浓度。为了使反应完全，通常从反应混合物中除去一种产物(醛缩醇或水)。
在本专利申请中，D(+)或L(-)葡萄糖与苯甲醛或与苯甲醛等价物缩合形成相应的亚苄基葡萄糖醛。特别优选的是再缩醛化作用策略，其中使用被保护的苯甲醛作为其缩二甲醇代替苯甲醛本身。然后形成副产物甲醇。将反应混合物在减压下适度加热以除去所形成的甲醇。在多种情况下，这些反应条件将驱使平衡平稳地向醛缩醇产物方向进行。
糖的缩醛化作用通常导致产生区域异构体和立体异构体的混合物。还可以发生缩环转化，得到吡喃糖和呋喃糖的混合物，并且在某些情况下形成二-缩醛化加合物。结果是，除非采用保护策略，通常会得到复杂的反应混合物。然而，经过适当地处理后，用液相色谱分离，或者在大量合成中优选用结晶技术，出人意料地制备了纯的产物级分。用GC-MS-光谱和各种NMR技术对产品进行了鉴定。
具体的反应条件、溶剂和催化剂可根据实验者的偏爱进行改变。催化剂可以是无机酸例如硫酸，有机酸例如对甲苯磺酸，酸性离子交换树脂例如大孔树脂15、路易斯酸矿物粘土例如蒙脱石K-10或载于树脂上的酸例如Nafion NR 50。反应可以方便地在偶极非质子传递溶剂如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮或二甲氧基乙烷等中进行。在二甲基甲酰胺中的对甲苯磺酸是优选的并且是最多使用的反应条件。
氘代化合物可以如上所述进行制备，不同的是由苯甲醛-d1的缩二甲醇开始。氘代苯甲醛的制备可以使用氘气在氘代溶剂中通过修改的罗森蒙德反应进行，如在EP 0 283 139 B1中所述。
下列实施例用于说明如何制备本发明化合物。化合物1∶4，6-O-亚苄基-D-吡喃葡萄糖如对化合物2所述，由未氘代苯甲醛缩二甲醇开始，制备现有的化合物。通过在DMSO-d6中进行的1H NMR光谱进行结构确定δrel.to TMS7.58-7.29(5H，m，Ar-H)，6.83(0.4H，d，OH-1-β)，6.60(0.6H，d，OH-1-α)，5.61(1H，s+s，acetal-H)，5.25(0.4H，d，OH-3-β)，5.21(0.4H，d，OH-2-β)，5.62(0.6H，d，OH-3-α)，5.00(0.6H，H-1-α)，4.82(0.6H，d，OH-2-α)，4.49(0.4H，t，H-1-β)，4.18-4.02(1H，m，H-6-α+β)，3.89-3.77(0.6H，m，H-5-α)，3.75-3.57(1.6H，m，H-6＂-α+βand H-3-α)，3.45-3.27(2.5H，m，H-3-β，H-4-α+β，H-5-βand H-2-α)and 3.11-3.00(0.4H，m，H-2-β).化合物24，6-O-(亚苄基-d1)-D-吡喃葡萄糖如EP 0 283 139 B 1所述制备苯甲醛-d1并转化为苯甲醛缩二甲醇-d1。在EP 0 283 139 B 1中也描述了4，6-O-(亚苄基-d1)-D-吡喃葡萄糖的制备，不同的是此时优先按照另一种得到高纯度的方法制备该化合物
将D(+)-葡萄糖(706g，3.92mol)、苯甲醛缩二甲醇-d1(571g，3.73mol)、无水DMF(1.68kg)和对甲苯磺酸(4.5g，24mmol)在通过冷却回流冷凝器部分连有真空泵的干馏装置中混合。在30托，将机械搅拌的混合物温热至最高69℃以蒸馏出甲醇，2小时后，收集235g。然后关闭回流冷凝器，并使温度升至最高73℃以蒸馏出DMF。再过2小时后，收集得到另外的1385g馏分，并中断蒸馏。
使残余物冷却至约40℃，并用5分钟加入冰/水(2.9L)。温度降至低于0℃，并且形成沉淀，部分为大块状。将该混合物转入烧杯中，并再加入8-9L冰/水以使块状物分散形成悬浮液。该悬浮液经二个凹口滤器过滤，并使两个滤饼在连有喷水真空的滤器上保留过夜，经反转漏斗，用氮气清洗每一滤饼。将滤饼涂布在两个板上，并在32℃、于真空炉中干燥20小时。真空开始设置为13mbar，然后下调至1mbar。
将粗产物重结晶(用以除去二亚苄基缩醛)并用水洗涤(以除去DMF和葡萄糖)，直至除去这些污染物。因此，将粗产物(500g)溶解在热的二噁烷(800ml)中，并通过折叠滤器将该溶液加入煮沸的氯仿(9L)中。首先使该溶液冷却至室温，然后在冰浴中过夜。滤出沉淀，在滤器上干燥2小时(如上所述用氮气清洗)，并在旋转蒸发器中、于31℃和真空下进一步干燥过夜。将产物(142g)悬浮在冰/水(1L)中，经上下真空滤器过滤(用200ml冰/水洗涤)，并如上所述在滤器上干燥过夜。然后研磨，过筛(0.5mm栅格尺寸)，并在旋转蒸发器中、于31℃真空干燥5小时。将产物(96g)再一次悬浮在冰/水(500ml)中，过滤(用150ml冰/水洗涤)并干燥(用氮气清洗7小时)。最后在研钵中研磨，过筛(0.5mm)并在真空炉中干燥。
产物为白色，经HPLC分析表明，产物为细分散的高纯度粉末。产量为95g，是理论值的10％。在DMSO-d6中进行的NMR表明α与β端基异构体的比例约为7∶3。1H-and13C NMR(DMSO-d6)，δrel.to TMS7.55-7.28(5.00H，m，Ar-H)，6.85(0.27H，d，OH-1-β)，6.58(0.71H，d，OH-1-α)，5.24(0.27H，d，OH-3-β)，5.19(0.28H，d，OH-2-β)，5.61(0.71H，d，OH-3-α)，4.99(0.72H，H-1-α)，4.82(0.71H，d，OH-2-α)，4.48(0.29H，t，H-1-β)，4.20-4.04(1.04H，m，H-6′-α+β)，3.88-3.73(0.78H，m，H-5-α)，3.73-3.56(1.72H，m，H-6＂-α+β and H-3-α)，3.46-3.21(2.61H，m，H-3-b，H-4-α+β，H-5-βand H-2-α)and3.09-2.99(0.28H，m，H-2-β)；137.881，128.854，128.042，126.435(Ar-C).100.462(aαetal-C)，97.642(C-1-β)，93.211(C-1-α)，81.729(C-4-α)，80.897(C-4-β)，75.796(C-2-β)，72.906(C-2-αand C-3-β)，69.701(C-3-α)，68.431(C-6-α)，68.055(C-6-β)，65.810(C-5-β)and 62.032(C-5-α).化合物34.6-O-亚苄基-L-吡喃葡萄糖在蒸馏装置内将L-(-)-葡萄糖(5.0g，27.8mmol)、苯甲醛缩二甲醇(4.66g，30.6mmol)和对甲苯磺酸(32mg，0.17mmol)在无水DMF(20ml)中混合。将水泵经由短路径连接在真空下除去甲醇和DMF。该无色悬浮液在55℃于0.5小时内溶解，将所得溶液在120mbar下搅拌0.5小时，同时将温度逐渐增加至65℃。将真空增加至最大，并将该反应混合物进一步蒸发45分钟。在蒸馏结束时将温度增加至75℃。残余物是淡黄色糖浆状物，通过加入NaHCO3(29mg)将其中和，并冷却。
将粗产物溶于甲醇(10ml)中，并在反相RP-8柱上纯化，用甲醇/水1∶1洗脱。合并产物级分，并蒸发以除去甲醇。将残余溶液用水进一步稀释，并冷冻干燥。收集得自3批单独操作的白色蓬松固体，总共获得了2.42g产物，为理论值的32.5％。
硅烷化样品的GC色谱分析表明产物由比例为35/65的两种异构体(α和β异头物)组成。DMSO-d6中的1H NMR位移与4，6-O-亚苄基-D-吡喃葡萄糖类似
7.51-7.30(5H，m，Ar-H)，6.86(0.6H，broad s，OH-1-β)，6.58(0.3H，broad s，OH-1-α)，5.58(0.9H，s+s，acetal-H-α+β)，5.23(0.7H，d，OH-3-β)，5.20(0.6H，d，OH-2-β)，5.11(0.4H，d，OH-3-α)，5.00(0.4H，H-1-α)，4.82(0.3H，d，OH-2-α)，4.47(0.7H，d，H-1-β)，4.21-4.08(1H，m，H-6′-α+β)，3.87-3.73(0.4H，m，H-5-α)，3.73-3.59(1.3H，m，H-6＂-α+β and H-3-α)，3.46-3.22(3.7H，m，H-3-β，H-4-α+β，H-5-βand H-2-α)and 3.09-2.99(0.6H，m，H-2-β).化合物44.6-O-(亚苄基-d1)-L-吡喃葡萄糖将L-葡萄糖(5.14g，28.6mmol)在DMF(20ml)中加热至95℃直至形成澄清溶液。然后将该反应瓶转移到65℃的水浴中，并加入对甲苯磺酸(33mg，0.17mmol)。然后在80mbar的调控水泵真空下，用20分钟以上通过注射器将亚苄基缩二甲醇d1(4.7ml，31mmol)滴加到该搅拌着的葡萄糖溶液中。然后将DMF在真空下(2mbar)于65℃蒸发，获得颜色非常浅的黄色油状物，向其中加入NaHCO3(345mg)，然后搅拌5分钟。在65℃、搅拌(磁珠)下将温水(67℃，15ml)加到该油状物中，并在温水浴中振摇烧瓶直至油状物看上去溶解。然后将该反应瓶在冷水流下放置大约5分钟。仅1或2分钟后形成了无定形物。将该含水混合物置于冰水浴中，并静置40分钟。通过真空过滤分离出所形成的白色沉淀(从无定形物质倾出)，用冷的泉水(25ml)洗涤，然后用冷的异丙醇(5℃，2×5ml)洗涤，并在氮气流下干燥，获得1.85g干燥的白色粉末。将该产物硅烷化，并通过气相色谱分析，结果表明目的产物的纯度是99％。1H NMR，δ(DMSO-d6)rel.to TMS7.55-7.25(m，5H，Ar-H)，6.85(s，0.48H，OH-1-β)，6.55(s，0.33H，OH-1-α)，5.25(d，0.48H，OH-3-β)，5.20(d，0.49H，OH-2-β)，5.10(d，0.35H，OH-3-α)，4.98(d，0.35H，H-1-α)，4.82(d，0.34H，OH-2-α)，4.48(d，0.51H，H-1-β)，4.20-4.05(m+m，0.53H+0.42H，H-6′α+β)，3.85-3.73(m，0.44H，H-5-α)，3.72-3.57(m，1.27H，H-6＂-α+βand H-3-α)，3.45-3.20(m，7.8H，H-3-β，H-4-α+β，H-5-βand H-2-α)and3.10-2.98(m，0.56H，H-2-β).生物实验从附图1中可看出，化合物2比妥卡雷琐引起较多的细胞灭活。
从附图2中可看出，化合物2比妥卡雷琐引起较强的蛋白合成抑制。
从图3中可以看出化合物2产生的蛋白合成抑制作用比亚苄维C(2H)强。在这一实验中所用的细胞是源于在E2a介质中长成的人类胰腺癌Panc-1细胞(Lieber等，Int.J.Cancer，15741-747，1975)。
将施加在每个细胞上的最大力作为从把细胞接种在基质上开始的时间的函数记录。附图4显示的是，对于暴露于化合物1或化合物2中的细胞，一组19次测定的中值力，以及没有暴露于这些化合物中中的细胞的粘着力对平均时间的函数关系。化合物2在该浓度下在降低粘着力上显示强的作用，而化合物1没有表现出显著反应。化合物的作用主要是降低细胞粘着力，而不是影响粘着时间。
粘着在基质上的能力的下降可能与阻断了整联蛋白介导的细胞固定有关。已经表明这样的阻断可在肝细胞瘤和黑素瘤癌中诱导细胞程序死亡(Paulsen JE，Hall KS，Rugstad HE，Reichelt KL和ElgjoK，合成的肝肽焦谷氨酰基谷氨酰基甘氨酰基丝氨酰天冬酰胺和焦谷氨酰基谷氨酰基甘氨酰基丝氨酰天冬氨酸抑制移植到buffalo大鼠和无胸腺大鼠中的MH1C1大鼠肝细胞瘤细胞的生长.Cancer Res.52(1992)1218-1221.和Mason MD，Allman R和Quibell M“Adhesionmo1ecules in melanoma-more than just superglue？”J.Royal Soc.Med.89(1992)393-395.)。
将在化合物1和2的溶液中的细胞预培养后，测定NHIK 3025细胞与基质之间的粘着力。甚至在1 mM浓度下，也表现出令人惊奇的D-同位素效应。令人惊讶的是，化合物2将粘着力显著降低至对照的1/3，而化合物1没有显著降低粘着力。本发明者们认为，化合物2可能干扰整联蛋白的生物合成，降低细胞粘着在基质上的能力。整联蛋白是结构跨膜蛋白，其对于细胞粘着到细胞外基质上和细胞-细胞相互作用是至关重要的。因此抑制整联蛋白的功能可直接影响癌细胞的转移能力。该实验表明整联蛋白对蛋白合成抑制尤其敏感。因此，化合物2可很好地用于阻止癌恶化中的转移过程。
实验设计如下10只未感染的对照小鼠10只感染的对照小鼠用化合物2治疗的5只未感染小鼠用化合物2治疗的10只感染小鼠每天给小鼠腹膜内注射一次，注射19天。从6月1日开始直到6月16日它们被处死时，没有给予任何治疗。在6月16日，将小鼠处死。取出血液(用于将来分析)。取出脾并称重(参见下表1)。将一小片脾在氮中冷冻以切成薄的切片，并且用福尔马林将一小片脾固定。表1
结果还参见附图6。
我们可以看到，感染小鼠与未感染对照小鼠的脾重量有显著差异。用化合物2治疗的未感染小鼠的脾重量比未感染对照小鼠的脾重量大，虽然这种差异并不显著。我们注意到，与用化合物2治疗的未感染小鼠相比，用化合物2治疗的感染小鼠实际上具有更低的平均脾重量(对于此，我们假定这种结果是由于对照组中的一只小鼠具有比较大的脾所致)。
组织学检查表明，未感染对照具有正常的脾解剖学。在感染的未治疗组中，所有动物都在红髓中发生了病理性白血病细胞的侵袭。未感染的化合物2治疗动物的脾具有肥大的生发中心，这意味着免疫刺激的表达。从化合物2治疗的感染组中没有发现脾的白血病变化。
结果促使我们考虑小鼠中FLV的攻击性质，并且也在用叠氮基胸腺嘧啶脱氧核苷和其它抗病毒治疗获得的结果与该作用进行比较时。实施例5外周血液单核细胞的增殖本发明者们进行了实验，其中是将外周血液单核细胞暴露于超级抗原以及苯甲醛、氘代苯甲醛、化合物2或亚苄维C(2H)中。超级抗原用作T细胞增殖的强活性标准，并经由抗原呈递细胞呈递给T细胞。
该实验证明(见附图5)通过加入苯甲醛、氘代苯甲醛、或化合物2，外周血液单核细胞的增殖以钟形剂量依赖方式显著增加，而对于亚苄维C(2H)则观察到了非常小的作用。我们能够增加超级抗原的增殖信号的事实表明这些化合物通过另外的共刺激作用作用于T细胞。
将56只动物随机分成4组，每组14只动物，并按下列每日静注药物剂量进行治疗第一组对照组，不注射第二组安慰剂组，只注射盐水第三组85mg/kg的化合物2第四组100mg/kg的亚苄维C(2H)治疗按5周周期循环头三周每天静脉注射，然后停2周。总共进行9次完整的5周循环治疗。从第一次治疗到治疗结束和尸体解剖的整个周期为11个月。
在尸体解剖时，大约估计肝脏肿瘤的体积，但不彻底切除肝物质。在福尔马啉中固定后，John M.Nesland教授(Norwegian Radium医院病理学科主任)首先通过切除和目测检查组织精确估计肿瘤块，然后对肿瘤组织(主要呈现在肝脏中)及来自所有相关器官和组织的正常组织进行组织学检查。
在每一动物中从组织学上检查了多病灶及恶化前的结的发生率。结果通过在尸体解剖时患肝肿瘤的动物的频率分析肿瘤药物作用，结果表明，与安慰剂治疗组相比在化合物2治疗组中患肝肿瘤的动物的频率明显降低。通过单侧Fischers准确试验分析得出p-值为0.05。如果将两对照组合并到一起共28只对照动物，其中25只发展为肝癌，而14只化合物2治疗动物中7只发展为肝癌。在这种情况下动物数量对于卡方检验足够高，该检验表明差异是显著的，P＝0.015。在亚苄维C(2H)治疗组中14只动物中的11只发展为肝癌。只比对照组少一只，差异不显著。
肝脏肿瘤的大小从图7和图8很容易分析。其中可以看出化合物2发挥了有说服力的作用在安慰剂对照组中50％的动物具有总共大于10cm3的肝癌，而化合物2组中的动物没有这样大的癌(卡方检验p＝0.0038)。此外，在化合物2组中只有3只动物(即21％)具有总共大于1cm3的癌，而在安慰剂组中有10只动物(即71％)超过了这一限度(Fischers准确检验P＝0.0002)。因此，对化合物2而言，考虑肿瘤体积比只分析癌发展的频率更能清楚地看出抗癌作用。
图9表示每组动物从部分肝切除和亚硝胺处理(时间0)开始整个过程的平均体重测定。体重测量和正常组织的组织学评价都清楚的表明无副作用。体重增长曲线的牙边型(图9)无疑是由于治疗，而不是由于药物。相反注射本身影响动物，因为只用盐水治疗的动物具有与用盐水和药物治疗的动物完全相同的体重变化特征。
在11个月中静脉注射210次治疗的动物显示出体重的影响并不令人惊奇对于每一次注射将动物在电热灯泡下稍稍温热，此后固定在一个特别制造的夹子中以能够注射。尽管这一过程在一个安静的房间进行并由受过训练使动物平静的专业人员实施，但并不令人惊奇这将在动物中产生一种生物反应。
涉及副作用研究的一个方面是源于身体各器官的正常组织的组织学评价。这一相当深入的研究很容易从表2到表4(已附)总结出。没有发现任何与药物治疗有关的异常。值得注意的是即使是大鼠尾巴，在此局部区域每天进行静脉注射达如此长的时间，也没有受到治疗的伤害。
然而，从肝脏肿瘤发生前损害的频率得出一个有意义的结论表2到表4所有动物发展为多病灶。这种损害被认为是肝脏恶性发展过程中的一个早期阶段，并且未观察到受药物治疗的影响。此外，在所有组中都存在肝脏肿瘤发生前结的出现，虽然这局限于少数动物。因此，这些数据表明对这一损害没有任何药物作用，这进一步加深了化合物2在肝脏中真正发挥癌症特异性作用的印象。
在图10中用大小轴的对数标度将肝脏肿瘤的频率和大小绘制在同一曲线上。肝脏中发展为肿瘤的频率对照组和安慰剂组各14只动物中发展为癌症的动物的数量分别为13和12只(表2和3)。在第三组(85mg/kg化合物2)14只动物中仅有7只发展为肝癌(表4)。在统计学检验第二组(安慰剂组)和第三组的差别中例数对卡方检验太少。但是，可进行单侧Fishers准确检验，并表明两组关于肝肿瘤频率的表现显著不同(p＝0.05)。但如果我们将对照组(第一组)中未治疗的动物也包括在检验中，在统计学上这一差异更大。那样的话28只对照动物中的25只发展为肝癌，并且可进行卡方检验。在这种情况下第三组与对照组的差异是显著的，p＝0.015。
在第四组(100mg/kg亚苄维C(2H))中14只动物中的11只发展为肝癌。仅比安慰剂组少一只，没有显著差异。这样，通过分析发展为肝癌的频率我们得出结论用化合物2治疗能显著降低发展为肝癌的频率，而用亚苄维C(2H)治疗无这种效果。发展的肝癌的大小从图10中可以很容易的分析肝脏肿瘤的大小，但也在表2到表4中给出。在这里可以看出化合物2发挥了有说服力的作用在对照组和安慰剂组中50％的动物具有总共大于10cm3的肝癌，而在化合物2组中没有动物具有如此大的癌(卡方检验p＝0.0038)。此外，在化合物2组中仅有3只动物(即21％)具有总计大于1cm3的癌，而在安慰剂组和对照组中分别有10和13只动物(即71和93％)的癌高于此限度(Fishers准确检验分别为p＝0.0002和p＝0.011)。
因此，将肿瘤大小考虑在内比只分析癌症发展的频率更清楚的看出化合物2的抗癌作用。实际上，当只主要进行目测动物肝脏就可在尸体解剖时明显看出这一作用。
即使考虑肿瘤的大小，对于用亚苄维C(2H)治疗的动物，这一作用较用化合物2治疗的动物弱得多。用亚苄维C(2H)治疗的动物中具有大于1cm3的肝癌的动物数是7。如用化合物2治疗的动物所进行的检验，对于对照组和安慰剂组的显著性检验表明p值分别为0.036和0.44。因此，当与未治疗的对照比较时，差异是显著的，而当与安慰剂组比较时，很清楚差异是不显著的。在此应该考虑到安慰剂组中3只动物具有肿瘤恰刚好1cm3，如果比较的水平选为0.5cm3，将对安慰剂组也会有显著性差异(见图10)。然而，这一分析表明亚苄维C(2H)的作用弱，并且可能在显著性的限度上。此外，对于具有大于3大约5cm3肿瘤的动物，亚苄维C(2H)治疗组和对照或安慰剂组动物之间没有差异。
在另外的实验中，给大鼠给药亚苄维C(2H)和化合物2仅10天，肝脏肿瘤的组织学检验表明用亚苄维C(2H)治疗的动物无变化，而5只用化合物2治疗的动物中2只肿瘤坏死增加。表2正常组织和癌组织的组织学观察第一组未治疗对照组
缩写NF进行了组织学观察，所见正常MF多病灶no指无坏死*对一些动物的左腿前爪进行了显微镜检查.Normal findings were done in all cases.表3正常组织和癌组织的组织学观察第二组安慰剂组
缩写NF进行了组织学观察，所见正常MF多病灶no指无坏死*对一些动物的左腿前爪进行了显微镜检查。Normal findings were done in all cases.表4正常组织和癌组织的组织学观察第3组化合物285mg/kg天
缩写NF 进行了组织学观察，所见正常MF 多病灶DFF 弥散病灶变化OLIGL间胶质瘤GRANU肉芽瘤*动物编号15气管中具有鳞状细胞瘤。该瘤为囊性并在一定程度上囊性区域(+)呈坏死性外表。动物编号20肝脏中具有囊性变性变化。实施例7对裸鼠中肝脏侵袭性结肠直肠癌的作用材料和方法所评价的细胞系C170HM2是建立的人结肠直肠细胞系(S.A.Watson等人，Eur.J.Cancer 29A(1993)，1740-1745)，并且最初源自患者的原发肿瘤。在37℃、5％CO2以及湿润条件下，将C170HM2细胞在体外保持在含有10％(v/v)热灭活胎牛血清(Sigma，Poole，UK)的RPMI 1640培养基(Gibco，Paisley，UK)中。用0.025％EDTA从半融合单层中收集细胞，并在上述培养基中洗涤2次。
将从半融合细胞单层中收集的C170HM2细胞以1×106/ml的浓度重悬在无菌磷酸盐缓冲盐水pH7.4[PBS]中，并以1ml体积注射到20 MFI雄性裸鼠(在the University of Nottingh的Cancer StudiesUnit中心饲养的)的腹膜腔内。通过电子标记系统(RS BiotechDL2000 Datalogger)标识小鼠。细胞注射后第10天，将小鼠随机分配以改变安慰剂对照组(n＝2只小鼠)或实验组(n＝6/组)。
组1化合物15mg/kg(n＝2只小鼠)30mg/kg(n＝2只小鼠)90mg/kg(n＝2只小鼠)组2化合物25mg/kg(n＝2只小鼠)30mg/kg(n＝2只小鼠)90mg/kg(n＝2只小鼠)从第10天开始将药物静脉内(iv)给药直至治疗结束。在细胞移植后第40天终止实验。在整个实验期间定期称重小鼠。
终止治疗后，将肝脏暴露，计数可见的肝脏肿瘤数目，并测定其总的横断面面积。还给肿瘤照相。没有发生任何肿瘤液化，因此将其从正常肝脏组织上解剖下来，称重并固定在缩甲醛盐水中。解剖下来腹膜结，测定其横断面面积和重量。进行肿瘤的详细病理评定。
化合物1和2对人结肠直肠肿瘤C170HM2的肝脏侵袭作用如附图11所示。
附图13表示的是，通过测定从加入测试化合物后立即开始(实心符号)或2小时后开始(空心符号)的1小时脉冲期间掺入的[3H]-缬氨酸的量，来测定人子宫颈癌细胞NHIK 3025的蛋白合成速度。测试化合物，化合物2和化合物4从时间0到脉冲结束时都存在。用[14C]-缬氨酸将细胞预标记至少4天以使所有标记的细胞蛋白饱和。掺入的[3H]的量与掺入的[14C]的量有关，因此蛋白合成计算为细胞中蛋白总量的百分比。蛋白合成速度以占未处理对照的百分比来表示。蛋白合成的绘制曲线值代表4个同时且类似处理的孔的平均值。在所有情况下，当超过符号的大小时，标准误差由垂直棒表示。这些数据表明，化合物2和化合物4在大约相同水平上引起有效的蛋白合成抑制。如附图12所示，这两种氘代化合物都比其相应的未氘代化合物更有效。细胞存活附图14表示的是，用化合物1(●)或化合物3(○)处理20小时后，通过测定人子宫颈癌细胞NHIK 3025的集落形成能力来测定细胞存活。将细胞在敞口塑料Petri培养皿中在CO2恒温箱中于37℃处理。绘制曲线的存活值代表5个同时且类似处理培养皿的平均值。在所有情况下，当超过符号的大小时，标准误差由垂直棒表示。从该数据可知，这两种化合物的剂量回应曲线具有不同形状，这表明在以低浓度灭活细胞方面，化合物3比化合物1更有效。曲线形状的不同意味着这两种药物具有不同的细胞灭活机制。
附图15表示的是，用化合物2(○)或化合物4(▲)处理20小时后，通过测定人子宫颈癌细胞NHIK 3025的集落形成能力来测定细胞存活。将细胞在敞口塑料Petri培养皿中在CO2恒温箱中于37℃处理。绘制曲线的存活值代表5个同时且类似处理培养皿的平均值。在所有情况下，当超过符号的大小时，标准误差由垂直棒表示。在灭活细胞方面，尤其是在低剂量区，化合物4比化合物2更有效。例如，分别用0.5mM化合物4和4mM化合物2处理后，细胞存活降至50％，这表明在该特定作用水平上，化合物4的灭活效力比化合物2高8倍。在10％的存活水平上，该差异要小得多。
附图16表示的是，用L-葡萄糖(●)或化合物3(○)处理20小时后，通过测定人乳腺癌细胞T47-D的集落形成能力来测定细胞存活。将细胞在敞口塑料Petri培养皿中在CO2恒温箱中于37℃处理。绘制曲线的存活值代表5个同时且类似处理培养皿的平均值。在所有情况下，当超过符号的大小时，标准误差由垂直棒表示。该数据表明，L-葡萄糖在最高达至少10mM的浓度下(最高测试剂量)对细胞存活具有很小或没有任何作用。化合物3在最高达2mM的剂量下对细胞存活几乎没有作用，但是在较高浓度下会引起显著的灭活作用，在8mM该化合物存在下，20小时后1000个细胞仅存活1个。结论所测试的两种L-吡喃葡萄糖衍生物(化合物3和4)都比相应的D-吡喃葡萄糖衍生物(化合物1和2)更有效地灭活细胞。然而，L-葡萄糖自身在测试浓度下没有引起任何显著的细胞灭活作用。因此，是在亚苄基衍生物范畴内发现L葡萄糖的作用比D葡萄糖强。给药本发明药物组合物可在抗癌治疗中给药。
为了这一目的，本发明化合物可以适于给患者施用的任意方式单独或者与合适的药物载体或辅料一起配制。
尤其优选制备作为口服制剂或非胃肠道用制剂用于系统治疗的制剂。
合适的肠内制剂有片剂、胶囊剂例如软或硬明胶胶囊、粒剂、细粒剂或粉剂、糖浆剂、悬浮剂、溶液剂或栓剂。这样的制剂可按照本领域已知方法通过将一种或多种本发明化合物与无毒、惰性、固体或液体载体混合而制得。
本发明化合物的合适的非胃肠道给药用制剂是注射或输注溶液。
当局部给药时，可将化合物配制成含有该化合物与无毒、惰性、固体或液体局部制剂用载体的混合物的洗剂、软膏剂、霜剂、凝胶剂、酊剂、喷雾剂等。尤其适于使用保护活性组分不受空气、水等影响的制剂。
制剂可含有惰性或药效活性添加剂。例如片剂或粒剂可含有一系列粘合剂、填充剂、载体和/或稀释剂。液体制剂可以以例如无菌溶液的形式存在。除了活性组分以外，胶囊可含有填充剂或增稠剂。此外，还可以使用味道改善剂以及防腐剂、稳定剂、保湿剂和乳化剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂以及其它添加剂。
制剂的给药剂量可依据适应症、使用方式和给药途径、以及患者的需求而改变。对于成人患者的系统治疗，日剂量一般为约0.01-500mg/kg体重，每天给药一次或两次，优选0.5-100mg/kg体重，每天给药一次或两次，最优选1-20mg/kg体重，每天给药一次或两次。
如果需要的话，该化合物的药物制剂可含有抗氧化剂例如生育酚、N-甲基生育胺、丁基化的羟基茴香醚、抗坏血酸或丁基化的羟基甲苯。
权利要求
1.4，6-O-(亚苄基-d1)-D-吡喃葡萄糖、4，6-O-亚苄基-L-吡喃葡萄糖和/或4，6-O-(亚苄基-d1)-L-吡喃葡萄糖或其可药用盐在制备用于预防和/或治疗肝癌、肺癌、肾癌和胰腺癌的治疗剂中的应用。
2.权利要求1的应用，该应用是用于制备预防性治疗由病毒如乙肝病毒和丙肝病毒、癌基因乳头状瘤病毒和其它癌基因病毒等引起的癌症的治疗剂。
3.用作治疗剂的苯甲醛衍生物，其中的苯甲醛衍生物是4，6-O-亚苄基-L-吡喃葡萄糖和/或4，6-O-(亚苄基-d1)-L-吡喃葡萄糖或其可药用盐。
4.一种药物组合物，它包含前述权利要求任一项的苯甲醛衍生物和可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
5.制备药物组合物的方法，其中包含将前述权利要求任一项限定的苯甲醛衍生物与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂掺合的步骤。
6.定义为4，6-O-亚苄基-L-吡喃葡萄糖、4，6-O-(亚苄基-d1)-L-吡喃葡萄糖或其可药用盐的苯甲醛衍生物。
全文摘要
本发明涉及可用作抗癌剂的苯甲醛衍生物。有些本发明化合物是新化合物。
文档编号A61P43/00GK1347323SQ00806488
公开日2002年5月1日 申请日期2000年2月18日 优先权日1999年2月19日
发明者B·波雷岑, V·莫恩, R·O·拉森, E·O·彼得森, G·萨沃尔登, C·B·敦塞德 申请人:挪威海德罗公开有限公司