专利名称：：治疗c型肝炎的医药组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种治疗C型肝炎的医药组合物，特别地是涉及治疗C型肝炎的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物。
背景技术：
：根据世界卫生组织(WHO)的统计，全球约有3%(约3亿)人口感染C型肝炎，成为世界性公共卫生问题。大多数受到感染的人并不会出现早期症状，因而未被诊断出来。受到急性感染的人约20%会自体清除病毒而痊愈，但是有高达80%的人会发展为慢性肝炎，其中20%会导致肝硬化。C型肝炎病毒(HCV)为正单股RNA病毒，主要是经由打针注射或者被污染的血液制剂传染，产生肝炎复合症，包括黄疸、食欲不振、倦怠、腹痛、肝功能间歇性异常、肝脏酵素指数异常升高等。目前使用传统型和长效型的干扰素以及核酸类似物(ribavirin)来控制慢性病毒性肝炎。但是这些药剂本身具有显著的副作用，而且大多会产生抗药性。因此临床上期望能发展具有低副作用的替代药物，用于治疗C型肝炎。一种植物多酚的白黎芦醇(Reveratrol)，已知具有低密度胆固醇(LDL)的氧化抑制作用、血小板凝集抑制作用、抗发炎反应、抗癌效应等(RokaYoboShokuhinnoKaihatsu,DevelopmentofAnti-AgingFoods,CMCPublishingCo.,Ltd.,pp.156-168,1999)。在医药上也已被作为例如抗血小板凝结剂(JP-A-61-171427)、抑制循环系统疾病进程药剂(JP-A-2003-300904)、高脂血症的预防及治疗剂(JP-A-2001-72583)、或硬骨疾病的预防及治疗剂(JP-A-2000-281567)等。白黎芦醇(Reveratrol)的化学名称为3，4，5_三羟基二苯代乙烯(3，4，5-trihydroxystibene)，在自然界常以寡聚合物型态存在，产生于葡萄科、蓼科、豆科等多种植物之中，是植株在真菌、细菌、寄生虫等感染时产生的反应物质，成为植物体内一种重要的植物抗毒素(phytoalexin)。也因为具有抗氧化功能，白黎芦醇(Reveratrol)目前也被广泛作成保健食品或化妆品(W02004/103265A2)。本发明人等基于白黎芦醇为天然植物衍生物并具有的种种生理特性，期望发展天然、具有低副作用的抗C型肝炎的治疗药剂，进行白黎芦醇寡聚合物与C型肝炎之间的作用关系的研究，进而完成本发明。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于治疗C型肝炎的医药组合物。本发明的一实施例提供一种治疗C型肝炎的医药组合物，包括以3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物为活性成分。上述的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物较佳为一六个单体。上述的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物较佳为三或四个单体。上述的3，4，5_三羟基二苯代乙烯寡聚合物较佳具有呋喃结构。上述的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物较佳具有12个呋喃结构。上述的3，4，5_三羟基二苯代乙烯寡聚合物较佳为法第酚A(Vaticanc)IA)、法第酚B(vaticanolB)、法第酚C(vaticanolC)、及(-)-霍毕酚((-)-hopeaphenol)。上述的3，4，5_三羟基二苯代乙烯寡聚合物可由相关的羟基二苯代乙烯氧化缩合(OxidativeCoupling)制备(如J.Org.Chem.2004，69，2598-2600)。或者，上述的3，4，5_三羟基二苯代乙烯寡聚合物可萃取自例如蓼科(polygonaceae)、豆科(Leguminosae)、葡萄科(Vitaceae)、或桃金娘科(Myrtaceae)等植株，例如萃取自蓼科虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.)的根及茎。本发明的另一实施例提供一种上述3，4，5_三羟基二苯代乙烯寡聚合物在制备治疗C型肝炎的药物中的应用。本发明的医药组合物中的活性成分——法第酚A、法第酚B、法第酚C、及(-)_霍毕酚具有抑制C型肝炎病毒复制的能力，可有效对抗C型肝炎。具体实施例方式3，4，5-三羟基二苯代乙烯(Reveratrol)的分子式为C14H12O3,化学式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>，在植物体内可以例如二聚体、三聚体、或四聚体的型态存在。三聚体例如法第酚A(vaticanolΑ)；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>四聚体例如法第酚B(vaticanolB)、法第酚C(vaticanolC)、及(-)-霍毕酚((-)-hopeaphenol)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>上述的3，4，5_三羟基二苯代乙烯寡聚合物由相关的羟基二苯代乙烯氧化缩合(OxidativeCoupling)制备(如J.Org.Chem.2004，69，2598-2600)，或萃取自例如蓼科(polygonaceae)、豆科(Leguminosae)、葡萄科(Vitaceae)、或桃金娘科(Myrtaceae)等植株，例如萃取自蓼科虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.)的根及茎。本发明的萃取方法可使用例如蒸馏法、柱层析法、C02超临界萃取法、超音波萃取法、薄膜层析法、毛细管电泳法(capillaryelectrophoresis;CE)、固相萃取法(solidphaseextraction;SPE)、或ι效液才匿层析夕去(highperformanceIiquidchromatography；HPLC)。将上述3，4，5_三羟基二苯代乙烯寡聚合物作为候选化合物(candidatecompound)进行生体夕卜(invitro)活性评估。利用Huh-luc/neo-ET细胞带有I3891uc-ubi-NS3_3’/ET构筑基因的C肝病毒细胞复制系统，此复制系统可通过HCV的IRES(internalribosomeentrysite)所转译表现出的萤火虫冷光酵素(fireflyluciferase)-泛素(ubiquitin)-新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase)的聚合蛋白质，以及由EMCV(encephalomyocarditis)的IRES所转译表现出的C肝病毒非结构性蛋白质(NS3-5B)包含蛋白酶(protease)、解旋酶(helicase)及聚合酶(polymerase)多蛋白。当HCV的IRES或HCV非结构性蛋白质组成的复制复合体(implicationcomplex)受到候选物(candidate)影响时，可通过测定萤火虫冷光酵素活性的强度，评估候选物对抑制HCV复制子活性的效果，进而筛选出具有抑制C肝病毒能力的潜力候选物。使此Huh-luc/neo-ET细胞与候选化合物(例如法第酚A、法第酚B、法第酚C)等接触，测量通过HCV的5’NTR非转录区域的IRES转译表现出萤火虫冷光酵素_泛素_新霉素磷酸转移酶的聚合蛋白质，以及由EMCV的IRES转译表现出C型肝炎病毒非结构性蛋白质(NS3-5B)的表现活性，测定萤火虫冷光酵素的活性强度，评估候选化合物对抑制HCV复制子(Rplicon)活性的效果，筛选出具有抑制C型肝炎病毒的潜力候选物。实施例1法第酚A(vaticanolΑ)对C型肝炎病毒的抑制作用将Huh-luc/neo-ET细胞以每100μ1密度2.5X104个细胞/孔位接种于96孔细胞培养盘中，置于37°C二氧化碳细胞培养箱进行培养，隔天将96孔盘中原培养液以真空泵吸除，将待测样品(法第酚A)以培养液稀释成所需浓度加入96孔盘中(ΙΟΟμΙ/孔位)，对照组则为加任何药物的培养液。培养二天后将培养液吸除，再以100μ1IxPBSdmMKH2PO4,IOmMNa2HPO4,137mMNaCl,2.7mMKCl)清洗上述细胞两次，将此细胞进行以下的细胞毒性测试及萤火虫冷光活性测试。细胞毒性测试每孔加入含有0.5mg/mlMTT(Sigma,M2128)的培养液50μ1/孔位，置于二氧化碳细胞培养箱中培养45分钟后，加入150μ1DMS0,以摇摆震荡器将紫色沉淀摇勻后于连续波长微孔盘分析系统中，测量560nm的波长测吸光值。以对照组的平均吸光代表100%的细胞的存活率(％)，计算实验组加入各种不同浓度样品的细胞的存活率)。细胞存活率计算公式为(与样品培养后吸光值/对照组吸光值)X100%。以样品的各种浓度所造成的细胞存活率作xy散布图，原则上求得R2值超过0.9的趋势线公式，以此公式代入y=50，χ即为可造成细胞50%死亡的样品浓度(样品物的CC50值)，或是y=85时，χ为可造成细胞15%死亡的样品浓度(样品物的CC15值)。试萤火虫冷光活性测试加入35μ1Ix被动溶胞缓冲液(passivelysisbuffer)(Promega)后以摇摆震荡器震荡10分钟后用定量吸管反复冲吸将细胞均勻打散，从中吸取30μ1换至测萤火虫冷光用的96孔白盘，再依序分别加入40μ1的冷光分析缓冲液(21.5mMMgCl2,3.7mMΑΤΡ,Ο.IMKH2PO4)以及20μ1的冷光受质(ImMD-Luciferin，以二次水稀释)，并在加入受质后立即以微盘冷光仪测量冷光的活性(Rlu/s)。以对照组的冷光活性为标准计算各样品实验组的抑制C肝病毒效率(抑制率(％))。抑制率(％)的计算公式为{[(对照组冷光活性)_(实验组冷光活性)]/(实验组冷光活性)}X100%。其中对于C肝病毒复制子有良好抑制效果的样品，在经过连续稀释然后测定其不同浓度的抑制百分比后，以grafit5软件计算出该样品抑制病毒效率50%时的样品浓度(样品物的IC50值)。实施例2法第酚B(vaticanolB)对C型肝炎病毒的抑制作用以实施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET细胞测试法第酚B(vaticanolB)对C型肝炎病毒的抑制活性。实施例3法第酚C(vaticanolC)对C型肝炎病毒的抑制作用以实施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET细胞测试法第酚C(Vaticanc)IC)对C型肝炎病毒的抑制活性。实施例4(-)-霍毕酚((_)-hopeaphenol)对C型肝炎病毒的抑制作用以实施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET细胞测试(_)_霍毕酚((“)-hopeaphenol)对C型肝炎病毒的抑制活性。比较例5法第苷B(vaticasideB)对C型肝炎病毒的抑制作用以实施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET细胞测试法第苷B(vaticasideB)对C型肝炎病毒的抑制活性。比较例6法第苷C(vaticasideC)对C型肝炎病毒的抑制作用以实施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET细胞测试法第苷C(vaticasideC)对C型肝炎病毒的抑制活性。比较例7汉斯里糖苷AQiemsleyanosideA)对C型肝炎病毒的抑制作用以实施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET细胞测试汉斯里糖苷AQiemsleyanosideΑ)对C型肝炎病毒的抑制活性。比较例8汉斯里糖苷B(hemsleyanosideB)对C型肝炎病毒的抑制作用以实施例1相同方法，利用上述Huh-luc/neo-ET细胞测试汉斯里糖苷B(hemsleyanosideB)对C型肝炎病毒的抑制活性。各化合物对C型肝炎病毒的抑制活性如下表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表1数据可知，法第酚A(Vaticanc)IA)、法第酚B(vaticanolB)、法第酚C(vaticanolC)、及(-)-霍毕酚((-)-hopeaphhenol)具有抑制C型肝炎病毒复制的能力。因此使用取自天然植物的3，4，5_三羟基二苯代乙烯寡聚合物不但副作用少，而且有效对抗C型肝炎。而含糖结构法第酚B(vaticanolB)的法第苷B(vaticasideB)与含糖结构法第酚C(VaticaiK)IC)的法第苷C(vaticasideC)却无抑制C型肝炎病毒复制的能力，可知抑制C型肝炎病毒复制的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物具有结构性的专一性。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此项技术的人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求书所界定的范围为准。权利要求一种抗C型肝炎的医药组合物，包括以3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物为活性成分。2.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的医药组合物，其中所述的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物为一至六个单体。3.根据权利要求2所述的抗C型肝炎的医药组合物，其中所述的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物为三或四个单体。4.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的医药组合物，其中所述的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物具有呋喃结构。5.根据权利要求4所述的抗C型肝炎的医药组合物，其中所述的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物具有12个呋喃结构。6.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的医药组合物，其中所述的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物为法第酚A、法第酚B、法第酚C、或(-)-霍毕酚。7.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的医药组合物，其中所述的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物由羟基二苯代乙烯氧化缩合制造。8.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的医药组合物，其中所述的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物萃取自蓼科、豆科、葡萄科、或桃金娘科的植株。9.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的医药组合物，其中所述的3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物萃取自蓼科虎杖植株的根及茎。10.一种3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物在制备治疗C型肝炎的药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种治疗C型肝炎的医药组合物，包括以3，4，5-三羟基二苯代乙烯寡聚合物为活性成分。文档编号A61K36/87GK101810598SQ20091000659公开日2010年8月25日申请日期2009年2月25日优先权日2009年2月25日发明者伊藤哲朗,张秀凤,李连滋,殷韶禅,饭沼宗和申请人:财团法人工业技术研究院