专利名称：N-[2-甲基-1-(吡咯烷-1-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学合成的小分子化合物N-[2-曱基小(吡咯烷-l-碳酰基)-丙 基]-3-苯基丙酰胺(hydrocinnamoyl-L-valyl pyrrolidine , AS-1)的用途，尤其涉 及在制药领域内的应用。
二背景技术：
二十世纪九十年代以来，心血管疾病在世界范围内的发病率和死亡率明显增 加，心力衰竭已成为首要致死病因。心力衰竭(heart failure)是指在各种致病因 素的作用下心脏的收缩和/或舒张功能发生障碍,^使心输出量绝对或相对下降，即 心泵功能减弱，以致不能满足机体代谢的病理生理过程或综合征。高血压、心肌 梗死、主动脉瓣膜狭窄、心肌炎等是心力衰竭的常见病因。心力衰竭发生的基础 是心室重构(Ventricular Remodeling, VR),逆转心室重构是心力衰竭治疗的 关键。
心脏肥厚和重塑既是心脏功能由正常到衰竭的转变过程，也是心脏组织中大 量蛋白质表达异常、心脏形态结构发生改变的过程。在此过程中，各种致心脏肥 厚和重塑因素(如心脏负荷过重等)通过心脏细胞内信号转导途径改变相关核转 录因子的活性，导致心脏组织中大量基因/蛋白质的表达出现异常，使得心脏的形 态结构和功能发生变化。
临床上常用的抗心力衰竭药物包括利尿剂、正性肌力药物如洋地黄类、血 管紧张素酶抑制剂、p-受体阻滞剂、扩血管药物等。这些药物虽然能够緩解心力 衰竭的症状，但远期疗效并不理想。
近期的研究发现核因子kB (NF-kB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号 通路在心室重构的发生发展中发挥了重要的调控作用。在心肌肥大或缺血性心肌 病中该信号通路表达上调，抑制或沉默该信号通路的激活可以明显改善心肌肥大 或缺血性心肌病的症状，减少炎症细胞的浸润。
Tamas 831^^等人的研究发现一种小分子化合物^[2-曱基-1-(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-笨基丙酰胺(AS-1)可抑制核因子kB (NF-kB)、丝裂原活化蛋白 激酶(MAPK)信号通路的激活。该化合物在EL4小鼠胸腺瘤细胞和小鼠淋巴细 胞中能抑制IL-1 p诱导的MAPK信号通路的激活。此外，Christopher N. Davis等人 的研究发现在下丘脑神经元细胞，AS-1具有抗炎和神经保护的双重作用。它的化 学结构如下
具体合成方法见Tamas Bartfai等人2003年发表在PNAS上7971-7976页的文章。目 前，对其在心室重构和心力衰竭中的防治作用尚未见"J艮道。
发明内容
技术问题本发明针对上述技术空白，提供一种N-[2-曱基小(吡咯烷-l-碳 酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(hydrocinnamoyl-L-valyl pyrrolidine , AS-1 )的用途。
技术方案N-[2-曱基小(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1) 在防治心室重构和心力衰竭药中的应用。
N-[2-曱基小(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治压力 负荷诱导的心肌肥大和心室重构药中的应用。
N-[2-曱基小(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治急性 缺血性心脏病和心脏缺血/再灌注损伤药中的应用。
有益效果本发明对已知化合物N-[2-曱基-l.(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
本发明的N-p-曱基-l-(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺安全无毒， 药理作用强，有着良好的药用前景。
N-[2-曱基-l-(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)能够抑制心 肌细胞的肥大生长，改善心肌细胞的纤维化程度，提高因压力负荷过高而损伤的 心脏的心功能，从而防治心肌细^^的肥大和心室重构，延M^心力衰竭的产生。N-[2-甲基-1-(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)能够改善遭受急性心 肌缺血和缺血/再灌注损伤心脏的心功能，早期应用可减小梗死区的面积，减少心 肌组织中炎症细胞的浸润，维持心肌细胞的功能，延緩心力衰竭的产生。
四
图1 AS-1对TAC (主动脉弓缩窄)术后HW/BW (心脏重量/体重)影响。 女与Sham组比，P<0.05， A与TAC组或DMSO组比，P<0.05。
图2 AS-1对TAC术后HW/BW影响。女与Sham组比，PO.05, A与TAC组或 DMSO组比，P<0.05。
图3AS-1对TAC术后小鼠室间隔舒张厚度的影响。井与Sham组比， PO.05,女与TAC组或DMSO组比，P<0.05。
图4 AS-1对TAC术后小鼠左心室舒张后壁厚度的影响。并与Sham组比， P<0.05，女与TAC组或DMSO组比，P<0.05。
图5 AS-1对TAC术后小鼠射血分数的影响。井与Sham组比，P<0.05，女与 TAC组或DMSO组比，P<0.05。
图6 AS-1对TAC术后小鼠短轴缩短率的影响。弁与Sham组比，P<0.05, ★ 与TAC组或DMSO组比，P<0.05。
图7 AS-1对TAC术后小鼠心脏外观的影响
图8 AS-1对TAC术后小鼠心肌细胞肥大和纤维化的影响。上排，HE染 色，下排，Masson染色。
图9 AS-l对TAC术后小鼠心肌组织p-P38表达水平的影响。女与Sham组比， PO.05, A与TAC组或DMSO组比，P<0.05。
图10 AS-l对TAC术后小鼠心肌组织p-ERK表达水平的影响。女与Sham组 比，PO.05, A与TAC组或DMSO组比，P<0.05。
图ll AS-l对TAC术后小鼠心肌组织p-JNK表达水平的影响。女与Sham组 比，PO.05, A与TAC组或DMSO组比，P<0.05。
图12 AS-1对TAC术后小鼠心肌组织NF-KB活性的影响
图13 AS-1对TAC术后小鼠心肌组织NF-KB活性的影响。井与Sham组比， PO.05,女与TAC组或DMSO组比，P<0.05。
图14 AS-1对肥大的心肌细胞面积的影响。
图15 AS-1对肥大的心肌细胞蛋白合成的影响。女与Control组比， PO.05, A与IL-1 组或DMSO组比，P<0.05。
图16 AS-l对肥大的心肌细胞p-P38表达水平的影响。女与Control组比， PO.05, A与IL-1 组或DMSO组比，P<0.05。图17 AS-l对肥大的心肌细胞p-ERK表达水平的影响。女与Control组比，PO.05, A与IL-1 组或DMSO组比，P<0.05。
图18 AS-l对肥大的心肌细胞p-JNK表达水平的影响。女与Control组比，PO.05, A与IL-1 组或DMSO组比，P<0.05。
图19 AS-1对肥大的心肌细胞NF-KB活性的影响。
图20 AS-1对肥大的心肌细胞NF-kB活性的影响。★与Control组比，P<0.05， A与IL-1 组或DMSO比，P<0.05。
图21 AS-1对小鼠心脏I/R (缺血/再灌注)后射血分数的影响。承与I/R组或DMSO组比，P<0.05。
图22 AS-1对小鼠心脏I/R后短轴缩短率的影响。承与I/R组或DMSO组比，
P<0.05。图23
P<0.05。图24胞。
图25
AS-1对小鼠心脏I/R后心脏梗死面积的影响。*与1/R组或DMSO组比，AS-1对I/R心肌组织中性粒细胞浸润的影响。箭头所示即为中性粒细
AS-1对I/R心肌组织中白介素la的表达水平的影响。#与Control组比，P<0.05,女与I/R组或DMSO组比，P<0.05。
图26 AS-1对I/R心肌组织中白介素lp表达水平的影响。弁与Control组比，PO.05,女与I/R组或DMSO组比，P<0.05。
图27 AS-1对I/R心肌组织中白介素6的表达水平的影响。并与Control组比，PO.05,女与I/R组或DMSO组比，P<0.05。
图28 AS-1对I/R心肌组织NF-kB活性的影响。
图29 AS-1对I/R心肌组织NF-kB活性的影响。** PO.01, *P<0.05。
五具体实施例方式
N-[2-曱基小(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)按照文献报道的方法合成，真空干燥24小时。以下面的方式配制AS-1 2g , DMSO 100ml。AS-1终浓度20mg/mL。给药前，用生理盐水稀释。
本发明所述的化合物可以制成注射液，用于静脉滴注、静脉注射、腹腔注射、肌肉或皮下注射。也可制成口服的片剂、胶囊等。
实施例1 (AS-1对压力负荷诱导的心室重构保护作用观察)选用SPF级雄性C57BL/6小鼠，7至8周，随机分为4组假手术组(Sham)、手术组(TAC)、手术+溶剂对照组(DMSO)、手术+给药组(AS-l),每组6-8只。小鼠麻醉后进行人工通气，于胸部左侧第2-3肋间打开胸腔，分离主动脉弓，按统一标准缩窄主动脉弓(Transverse aortic constriction , TAC),关闭胸腔。假手术组除了不进行TAC外，其余手术程序完全与模型组相同。DMSO和AS-l组术后即经腹腔给药，每天一次，AS-l给药浓度为50mg/kg,持续给药2周后，取心肌组织进行各项分析。
1.1 小鼠心肌月巴厚指数的测定
2周后的小鼠称重，麻醉，进行二维超声心电图检测。随后处死，快速打开胸腔取出心脏，去除心房组织，按统一标准修剪心脏，用滤纸吸干水分，电子天平准确称取全心重量和左心重量。此外取其胫骨，准确测量胫骨长度。计算其全心重量/体重(HW/BW),左心室/胫骨长(LVW/TL),统计比值和心超结果。
图l、图2示TAC2周后，TAC和DMSO组HW/BW和LVW/TL明显增加，与周龄配对的Sham相比具有显著性差异，提示左心室肥厚；AS-1组HW/BW和LVW/TL与TAC或DMSO组相比则明显降低。
图3、图4、图5、图6示超声心动图结果，TAC2周后小鼠心脏IVS (室间隔厚度)和LVPW (左室后壁厚度)的回声区明显增强，EF (射血分数)、FS (短轴缩短率)明显下降，提示左心室肥厚并伴有心功能的下降；AS-1组小鼠左心室、室间隔舒张期厚度明显降低，射血分数、短轴缩短率有所升高。
1.2 病理学4企查
① 肉眼观察
图7示TAC和DMSO组小鼠心脏明显增大，AS-1组小鼠心脏与TAC组或DMSO组相比有明显减少。
② 光镜检查
对小鼠左心室心肌组织切片，行HE染色和Masson染色，观察心肌细胞肥大和纤维化的情况。
图8示TAC和DMSO组心肌细胞横径增宽，细胞间隙增大，纤维结締组织增多。AS-1組心肌细胞肥大程度及纤維化较肥大组均有所减轻。1.3 AS-1对压力负荷诱导肥厚心肌的NF-KB和MAPK表达和活性的影响
取左心室组织，提取胞浆和胞核蛋白，以胞浆蛋白分析MAPK (p-P38、JNK、 ERK)表达水平的改变，取胞核蛋白，检测NF-KB结合活性变化。
图9、图10、图11示TAC术后2周，p38、 ERKl/2的磷酸化表达水平增加，而JNK的磷酸化水平与Sham组相比没有明显变化；AS-1可抑制TAC引起的p38、ERKl/2表达水平增加，对p-JNK表达水平没有明显影响。DMSO组与TAC组相比 磷酸化蛋白水平没有显著性差异。图12、图13示TAC术后2周心肌组织NF-kb结合 活性明显增加，给予AS-1后NF-kB結合活性明显降低。
实施例2 (AS-1对肥大的原代心肌细胞作用的观察)
体外培养原代心肌细胞方法如下清洁级SD乳鼠断颈脱臼处死后，取其心 脏，剪下心尖部进行消化、离心，在含有15。/。小牛血清的DMEM培养基、37°C 5 。/oC02孵箱中培养36-48hr，观察细胞生长情况较好时，换液、分组。实验分为四 组空白(control)组；IL-1 刺激组；IL-1 刺激+DMSO组；IL-1 刺激+AS-l 组。IL-1 刺激浓度为10ng/mL, AS-1浓度为100umol/L。 2.1心肌细胞肥大程度检测
原代培养的心肌细胞刺激后24小时，用a-actinin免疫荧光染色检测心肌细胞 面积，用3H-亮氨酸掺入法(luCi/mL)检测其蛋白合成水平。这两种方法都能有 效的评估心肌细胞的肥大程度。
图14显示，IL-1 能引起心肌细胞面积的明显增加；给予AS-1后，其心肌 细胞面积减小。图15显示，IL-1 能引起心肌细胞蛋白合成水平明显增加，给予 AS-1后，蛋白合成水平下降。
2.2 AS-1对肥大的原代心肌细胞NF-kb和MAPK表达和活性的影响
原代培养的心肌细胞刺激后24小时，提取胞浆和胞核蛋白，以胞浆蛋白分 析MAPK (p-P38、 JNK、 ERK)表达水平的改变，取胞核蛋白，检测NF-KB结 合活性变化。
图16、图17、图18示IL-1 刺激使p38、 ERKl/2的磷酸化表达水平增加，而 JNK的磷酸化水平与Sham组相比没有明显变化；AS-1可抑制IL-1 引起的p38、 ERKl/2表达水平增加，对p-JNK表达水平没有明显影响。DMSO组与IL-l 组相 比磷酸化蛋白水平没有显著性差异。图19、图20示IL-1 刺激使NF-kB結合活性 明显增加，给予AS-1后NF-kb结合活性明显降低。
实施例3 (AS-1对急性缺血再灌注小鼠心脏的保护作用观察)
选用SPF级雄性C57BL/6小鼠，6至7周，随机分为4组假手术组(Sham)、 手术组(I/R)、手术+溶剂对照组(DMSO)、手术+给药组(AS-l),每组6-8只。小 鼠麻醉后进行人工通气，建立缺血再灌注(ischemia/reperfosion, I/R)模型，主 要步骤为于胸部左侧第3-4肋间打开胸腔，剪开心包膜，按统一标准结扎冠状动 脉左前降支阻断血流45分钟后恢复血液再灌注，关闭胸腔。于再灌注即刻腹腔给予DMSO或AS-l， AS-l给药浓度为50mg/kg。再灌注4小时后取心肌组织检测各项 指标。
3.1小鼠心肌缺血面积和心功能4全测
小鼠再灌注4小时后麻醉，行超声心动图检测其心功能情况。随后处死，快 速打开胸腔取出心脏用生理盐水经冠状动脉灌流沖洗血液，再次结扎冠状动脉左 前降支，用Evans blue灌注以了解缺血区(危险区，RA)的大小，将心脏组织切 成5-6片，用TTC复染20分钟，福尔马林固定后拍照。用软件分析计算IA/LV (梗 死区面积/左室面积)、RA/LV (危险区面积/左室面积)、IR/RA(梗死区面积/危 险区面积)，了解心肌损伤程度。
图21、图22显示给予AS-1能明显改善小鼠心脏的EF (射血分数)和FS (短轴 缩短率)。图23显示给予AS-1能明显降低IA/LV、 IR/RA比值，而对RA/LV比值没 有影响。
3.2免疫学#:测
对小鼠左心室心肌组织切片，行免疫组化;险测中性粒细胞浸润水平。 图24显示，1/R和DMSO组小鼠心脏中性粒细胞浸润明显增多，AS-1能够显著
的减少1/R心脏中性粒细胞浸润的程度。
3.3细胞因子^r测
取左心室肌组织，提取胞浆蛋白，采用ELISA法检测小鼠心脏白介素la、白 介素lp、白介素6的表达水平。
图25、图26、图27显示，1/R和DMSO组小鼠心肌组织白介素la、白介素lp、 白介素6的表达水平明显增高，而AS-l能够明显降低白介素la、白介素lp、白介 素6的表达水平。
3.2 AS-1对急性缺血-再灌注心脏NF-KB活性的影响
取左心室肌组织，提取胞核蛋白，检测NF-KB结合活性变化。 图28、图29显示，I/R和DMSO组小鼠心脏NF-KB结合水平明显增高，而AS-1能够明显降低小鼠心脏组织NF-KB。
权利要求
1. N-[2-甲基-1-(吡咯烷-1-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治心室重构和心力衰竭药中的应用。
2. N-[2-曱基-l.(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治压 力负荷诱导的心肌肥大和心室重构药中的应用。
3. N-[2-甲基-卜(吡咯烷-l-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治急 性缺血性心脏病和心脏缺血-再灌注损伤药中的应用。
全文摘要
N-[2-甲基-1-(吡咯烷-1-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治心室重构和心力衰竭药中的应用。N-[2-甲基-1-(吡咯烷-1-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治压力负荷诱导的心肌肥大和心室重构药中的应用。N-[2-甲基-1-(吡咯烷-1-碳酰基)-丙基]-3-苯基丙酰胺(AS-1)在防治急性缺血性心脏病和心脏缺血-再灌注损伤药中的应用。
文档编号A61K31/40GK101474174SQ20091002848
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者刘春样, 曹志娟, 婷 李, 李跃华, 李金恒, 胡玉龙 申请人:南京医科大学