专利名称：：一种麦冬提取物及其制备方法与降糖应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及麦冬提取技术及其在制备治疗糖尿病药物中的应用。
背景技术：
：麦冬为百合科植物麦冬O;fe'o;70go"y'a;w"/c^(Thimb.)Ker-Gawl.的干燥块根，具有养阴生津、润肺清心功效。药理及临床试验研究表明，从麦冬中提取得到的粗多糖能有效的降低实验性糖尿病小鼠的血糖水平，降低n型糖尿病患者空腹血糖和餐后2h血糖水平，改善胰岛素抵抗。现有技术对麦冬粗多糖的纯化，一般是选用干燥麦冬为原料，釆用"水提醇沉"法制得其粗提物，然后用三氯甲烷—正丁醇沉淀蛋白质，最后用双氧水脱色。中间涉及的化学反应较多，步骤繁琐，存在着周期长、成本高、收率低、稳定性差等问题，严重影响制剂的品质。凝胶分离技术是利用不同分子量的物质在凝胶内运动的轨迹不同而将其分离的，具有操作简便，所需设备简单，分离效果较好，重复性高，分离条件缓和等特点，可以提高产品品质和得率、简化生产工艺、降低生产成本等。目前葡聚糖凝胶应用最广，在中药提取物特别是粗多糖提取物的除杂、纯化和分离等方面显示出广阔的应用前景。
发明内容本发明的目的在于提供一种提取麦冬的新方法及其提取物在制备降糖药物中的应用。上述发明是通过如下方式来实现的取麦冬药材，煎煮13次，每次加水520倍量，每次煎煮30120分钟，过滤，合并水煎液；浓缩至密度为1.051.35g/ml后加乙醇至含醇量为5080%(体积百分比v/v)，放置过夜后收集沉淀，沉淀用葡聚糖凝胶柱进行分离纯化，真空冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶，即麦冬提取物。所制备得到的麦冬提取物中含糖量达9098%(以果糖计)，分子量范围为500-2000。所制备得到的麦冬提取物体外能够抑制消化道内a-葡萄糖苷酶的活性。所制备得到的麦冬提取物能够降低高血糖模型大鼠的血糖。所制备得到的麦冬提取物能够降低小肠绒毛细胞对葡萄糖的吸收。所制备得到的麦冬提取物能提高脂肪细胞对葡萄糖的摄取能力。所制备得到的麦冬提取物能够保护链脲佐菌素损伤的卩胰岛细胞。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明利用葡聚糖凝胶分离技术将麦冬经水提醇沉后所得的沉淀物进行纯化，并将纯化后的物质用于制备治疗糖尿病药物。动物试验证明，本工艺制得的麦冬提取物具有显著的降血糖作用，通过体外实验进一步阐明，该提取物的降糖作用机制在于抑制消化道内(X-葡萄糖苷酶的活性、降低小肠绒毛对葡萄糖的吸收、增强脂肪细胞对葡萄糖的吸收能力，以及对胰岛细胞保护作用。具体实施例方式以下通过具体实施例和试验例对本发明作进一步说明。实施例1:取麦冬药材200克，加水煎煮提取l次，加水20倍量，煎煮2小时，水煎液浓縮至密度为1.05g/ml，加入乙醇至含醇量为80%，放置过夜，沉淀经过滤干燥后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-75柱进行纯化，水洗脱；硫酸-蒽酮法检测洗脱液，收集呈阳性反应部分，冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶，即麦冬提取物，经分析该提取物含糖量为90%(以果糖计)，分子量范围为500-2000。实施例2:取麦冬药材200克，加水煎煮提取l次，加水10倍量，煎煮2小时，水煎煮提取液浓縮至密度为1.18g/ml，加入乙醇至含醇量为50%，放置过夜，沉淀经过滤干燥后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-50柱进行纯化，水洗脱；硫酸-蒽酮法检测洗脱液，收集呈阳性反应部分，冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶，即麦冬提取物，经分析该提取物含糖量为96%(以果糖计)，分子量范围为500-2000。实施例3:取麦冬药材200克，加水煎煮提取2次，加水5倍量，煎煮2小时，合并2次水煎煮提取液，浓縮至密度为1.08g/ml，加入乙醇至含醇量为60%，放置过夜，沉淀经过滤干燥后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-35柱进行纯化，水洗脱；硫酸-蒽酮法检测洗脱液，收集呈阳性反应部分，冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶，即麦冬提取物，经分析该提取物含糖量为94%(以果糖计)，分子量范围为500-2000。实施例4:取麦冬药材200克，加水煎煮提取2次，加水20倍量，煎煮0.5小时，合并2次水煎煮提取液，浓缩至密度为1.35g/ml，加入乙醇至含醇量为80%，放置过夜，沉淀经过滤干燥后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-50柱进行纯化，用水洗脱；硫酸-蒽酮法检测洗脱液，收集呈阳性反应部分，冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶，即麦冬提取物，经分析该提取物含糖量为97%(以果糖计)，分子量范围为500-2000。实施例5:取麦冬药材200克，加水煎煮提取2次，每次加水10倍量，每次煎煮l小时，合并2次水煎煮提取液，浓縮至密度为1.24g/ml，加入乙醇至含醇量为70%，放置过夜，沉淀经过滤干燥后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-75柱进行纯化,用水洗脱；硫酸-蒽酮法检测洗脱液，收集呈阳性反应部分，冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶，即麦冬提取物，经分析该提取物含糖量为92%(以果糖计)，分子量范围为500-2000。实施例6:取麦冬药材200克，加水煎煮提取3次，每次加水5倍量，每次煎煮1.5小时，合并3次水煎煮提取液，浓縮至密度为L12g/ml，加入乙醇至含醇量为50%,放置过夜，沉淀经过滤干燥后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-35柱进行纯化，用水洗脱；硫酸-蒽酮法检测洗脱液，收集呈阳性反应部分，冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶，即麦冬提取物，经分析该提取物含糖量为91%(以果糖计)，分子量范围为500-2000。实施例7:取麦冬药材200克，加水煎煮提取3次，每次加水8倍量，每次煎煮l小时，合并3次水煎煮提取液，浓縮至密度为1.27g/ml，加入乙醇至含醇量为60%，放置过夜，沉淀经过滤干燥后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-75柱进行纯化，用水洗脱；硫酸-蒽酮法检测洗脱液，收集呈阳性反应部分，冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶，即麦冬提取物，经分析该提取物含糖量为95%(以果糖计)，分子量范围为500-2000。实施例8:取麦冬药材200克，加水煎煮提取3次，每次加水20倍量，每次煎煮0.5小时，合并3次水煎煮提取液，浓縮至密度为L31g/ml，加入乙醇至含醇量为70%，放置过夜，沉淀经过滤干燥后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中，用葡聚糖SephadexG-50柱进行纯化，用水洗脱；硫酸-蒽酮法检测洗脱液，收集呈阳性反应部分，冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶，即麦冬提取物，经分析该提取物含糖量为96%(以果糖计)，分子量范围为500-2000。实施例9:麦冬提取物对cx-葡萄糖苷酶活性的体外抑制作用取67mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH6.8)6ml、3mmol/L的谷胱甘肽溶液0.2ml、0.04mg/ml的a-D-葡萄糖苷酶溶液0.3ml，37。C温孵10min后，加入0.01mol/L的吡喃葡萄糖苷(PNPG)溶液0.5ml，作用20min后，用0.1mol/LNa2C03溶液10ml终止反应，在400nm波长下测定各组样品的吸光度。麦冬提取物(见实施例2、4、7)用酸钾缓冲液配制成不同浓度的供试液。抑制率(％)=(八对照-A样品)/(A对照-A空白)><100%实验显示，240mg/ml的麦冬提取物能使a-葡萄糖苷酶活性的降低76.58%。实施例10:麦冬提取物对高血糖模型大鼠的降糖作用1)动物分组健康Wistar大鼠(SPF级)，雄性，体重180-220g(由广东省实验动物中心提供)，自由饮水进食，随机分为正常对照组和造模组，造模组按如下方法建立模型，造模成功后再将模型组动物随机分为模型对照组、阳性药物组、受试药物高、中、低剂量组，连续给药1周。2)大鼠模型制备正常组大鼠每天灌胃普通饮用水，高脂组大鼠每天早晚灌胃自制脂肪乳(1ml/100gBW)。连续灌胃脂肪乳2周后，动物禁食不禁水24h，空白对照组10只尾静脉注射生理盐水，其余大鼠均尾静脉注射30mg/kgBW链脲佐菌素溶液(临用前配制)。给药48h后，禁食不禁水12h，每隔3小时眼眶静脉丛取血，按照血糖测定试剂盒操作测定空腹血糖值，连续测定3次，空腹血糖值216.7mmoI/L的为造模成功大鼠。3)血糖测定末次给药后，动物禁食12h、不禁水，眼眶静脉丛取血，按照试剂盒的方法分别测定血糖值。釆用SPSS11.0统计软件，分析并比较各组血糖值及给药前后血糖值的变化情况。结果见表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注*p<0.05vs模型组**p〈0.Olvs〗莫型组Ap<0.05vs同组给药前AAp<0.01vs同组给药前实施例11:麦冬提取物对小肠刷状缘膜囊(BBMV)摄取葡萄糖的影响1)小肠刷状缘膜囊的制取家兔处死后，迅速取出胃幽门至回盲结合处之间的小肠段,放入冰冻的154mmol/LKCl中清洗lh。放入-80"C环境中进行保存。一周之后取出小肠段，剪成小碎段在200mlBuffer1(10mmol/LD-甘露醇，2mmol/LTris，pH7.1)溶液中震动lmin。过滤除去结缔组织和肌肉组织，滤液用Buffer1定容至300ml。加入0.61gMgCl2并缓慢搅拌，在4。C，3800xg下离心15min。收集上清液，在4。C，43000xg下离心30min。弃去上清液，用5mlBuffer2(100mmol/LD-甘露醇，0.1mmol/LMgS04，2mmol/LTris，pH7.4)悬浮沉淀物。4°C，43000xg下离心40min。弃去上清液，用lmlBuffer3(300mmol/LD-甘露醇，0.1mmol/LMgS04,10mmol/LTris，pH7.4)悬浮沉淀物，溶液用用带25号针头的注射器缓慢反复抽打5次，形成BBMV。之后分装放置于液氮中迅速冷冻(0.26ml/分装管)，然后放入-80'C环境中保存。2)BBMV葡萄糖摄取实验用0.44mlBuffer3重新悬浮BBMV;实验前将麦冬提取物(见实施例l、3，5)配制至相应的浓度。取50jalBBMV溶液、30^1麦冬提取物供试液和10^1radioactiveglucose溶液(2pCi/ml3H-2-GD，0.4mmol/L葡萄糖，400mmol/LNaSCN，400薩ol/L甘露醇，40mmol/LHEPES-Tris，pH7.4)，在室温条件下混合反应60s后，加入冰冻的stop-washBuffer(200mmol/LNaCl，10mmol/LHEPES-Tris，250pmol/L根皮苷)终止反应；反应液用0.45pm的硝基纤维膜过滤，则BBMV被截留在膜上；用lml冰冻的stop-washBuffer反复清洗硝基纤维膜5次后，采用闪烁计数法测定BBMV中的放射性强度。实验结果以药物组的放射性强度占空白组的百分比表示。实验结果显示，4.5mg/ml的麦冬提取物能使小肠刷状缘膜囊对葡萄糖的吸收减少39.96%。实施例12:麦冬提取物对3T3-L1脂肪细胞摄取葡萄糖的影响1)3T3-L1细胞向脂肪细胞的诱导将3T3-L1细胞用含10%小牛血清的高糖DMEM在37°C、5%C02的条件下培养,细胞状态良好时接种于24孔培养板。待细胞生长至融合2d后,加含0.5mM异丁基-3-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.5pM地塞米松(DEX)、5pM胰岛素和10%胎牛血清的高糖DMEM培养3d。换以含5pM胰岛素的10%胎牛血清高糖DMEM培养液再培养2d,随后以含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液继续培养，每隔2d换1次培养液。诱导分化8-12d的3T3-L1细胞90%以上呈脂肪细胞表型，即可用于实验。2)脂肪细胞摄取葡萄糖实验3T3-L1脂肪细胞在24孔培养板中用无糖DMEM培养基培养2h后，分为对照组(不加药)、麦冬提取物(见实施例2、7、8)组、阳性药物组(胰岛素)，加上含相应药物的无糖DMEM培养基，在37'C下培养30min。弃去培养液，用PBS清洗细胞2次。加入含2pCi/ml3H-2-GD和O.lmmol/L2-DG的无糖DMEM培养基300^1，在37。C下作用15min。每孔加入lml冰冻的含2-DG(10mmol/L)的PBS溶液终止反应，并用此溶液清洗2次。每孔加入0.5mol/L的NaOH溶液20(^1，充分震荡使细胞破碎裂解后，再加入0.5mol/L的HCl溶液200pl中和。每孔取出300pl的细胞裂解液，利用闪烁计数法测定其中的放射强度以确定3H-2-GD的摄取量。每孔再取出100pl的细胞裂解液，测定其中蛋白质的含量，并将之作为一个参数来修正经闪烁计数法测定的3H-2-GD的摄取量。实验显示，6mg/ml的麦冬提取物能使3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取能力提高46.23%。实施例13:麦冬提取物对链脲佐菌素致NIT-L1胰岛细胞损伤的保护作用本实验用链脲佐菌素(STZ)作用于NIT-L1胰岛细胞，可引起细胞损伤。取生长良好的对数期NIT细胞接种于96孔板中，在37'C含5%C02的培养箱中培养24h后，按实验分为5组，空白组、STZ模型组(8mmol/L),麦冬提取物(见实施例1、4、6)高、中和低剂量组。加药后继续培养24h后，每培养孔分别加入20^15mg/ml的MTT溶液，4h后弃去培养基，每孔各加入DMSO150ul，492nm下测定各孔的吸光度，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(％)=(A空白-A给药)/A空白><100%实验显示，2mg/ml的麦冬提取物，能较显著地提高链脲佐菌素损伤后的NIT-L1胰岛细胞活性。实施例14:麦冬提取物口服制剂的制备普通片剂按实施例l制得的麦冬提取物200g，可压性淀粉200g，置于粉碎机中粉碎，细粉过80目筛。再加入硬脂酸镁一滑石粉8g，微粉硅胶4g，搅拌均匀后粉末直接压片，即得咀嚼片按实施例5制得的麦冬提取物200g，甘露醇100g，微晶纤维素100g，置于粉碎机中粉碎，过80目筛。再加入4g硬脂酸镁、4g微粉硅胶、4g甜橙香精粉末和40g聚维酮粉末，搅拌均匀后粉末直接压片，即得。颗粒剂先将辅料分别粉碎过100目筛，按实施例2制得的麦冬提取物200g，羧甲基淀粉钠100g，微粉硅胶150g，微粉纤维素400g混合均匀，加淀粉100g制成软材，过20目筛，烘干，过20目筛整粒，即得。口服液按实施例7制得的麦冬提取物200g，山梨酸钾0.2§，柠檬香精0.5g，加水至1L，灭菌、分装。权利要求1.一种麦冬提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤取麦冬药材，煎煮1～3次，每次加水5～20倍量，每次煎煮30～120分钟，过滤，合并水煎液；浓缩至密度为1.05～1.35g/ml后加乙醇至含醇量为体积百分比50～80％，放置过夜后收集沉淀，沉淀用葡聚糖凝胶柱进行分离纯化，真空冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶，即麦冬提取物。2.权利要求1所述制备方法得到的麦冬提取物。3.权利要求2所述麦冬提取物在制备降糖药物中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述药物的剂型为口服制剂。全文摘要本发明涉及一种麦冬提取物及其制备方法与降糖应用。取麦冬药材，煎煮1～3次，每次加水5～20倍量，每次煎煮30～120分钟，过滤，合并水煎液；浓缩至密度为1.05～1.35g/ml后加乙醇至含醇量为体积百分比50～80％，放置过夜后收集沉淀，沉淀用葡聚糖凝胶柱进行分离纯化，真空冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶，即麦冬提取物，其含糖量达到90～98％(以果糖计)，分子量范围为500-2000。经动物试验证明该麦冬提取物具有显著的降血糖作用，通过体外实验进一步阐明其作用机制，结果表明该提取物能通过抑制消化道内α-葡萄糖苷酶的活性、降低小肠绒毛对葡萄糖的吸收、以及对胰岛细胞保护作用来降低血糖，提示该提取物可以用于开发治疗II型糖尿病的药物。文档编号A61P3/10GK101559166SQ20091003976公开日2009年10月21日申请日期2009年5月26日优先权日2009年5月26日发明者丁林伟,冯国培,刘碧珊,杨翠平,梁秉中,王永刚,苏薇薇,许定舟申请人:中山大学