一种降糖中药组合物及滴丸的制作方法

专利名称：一种降糖中药组合物及滴丸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种降糖中药组合物及其滴丸。
背景技术：
糖尿病(Diabetes mellitus)是一种常见的内分泌代谢性疾病，是由于体内胰岛素缺乏或不能正常发挥生理作用引起糖代谢紊乱，继而导致蛋白质、脂肪、水、电解质等多种物质代谢紊乱的一种综合病证，以高血糖为主要特征。该病常伴随多种慢性并发症，造成多器官、多系统的广泛损伤，具有较高的致残率。根据文献报道，全球糖尿病患者数量已超过1.5亿人，而中国现有糖尿病者总量已接近4000万人，其中90％为非胰岛素依赖型糖尿病(II型)。
糖尿病的危害不仅仅在于疾病本身也就是内分泌异常的影响，最严重的在于糖尿病所带来的并发症，如心血管系统疾病，肝肾损害以及周围神经病变等等，它已成为继心血管疾病和癌症以后第三大病因。
糖尿病治疗方面西医上主要采用手术治疗和降糖药物治疗两种方法。近年来应用中药及其制剂防治糖尿病的研究取得不少新的进展，尤其是中药能够克服化学合成药在降血糖的同时产生副作用或诱发并发症的事实，倍受医药界和广大患者的重视。因此，研究中药降血糖作用机理，开发速效、高效、长效、低毒的降血糖中药新药，对于防治糖尿病及其并发症具有重要的社会价值和经济效益。

发明内容
本发明目的是提供一种用于治疗糖尿病的降糖中药组合物、提取物及其滴丸。
本发明采用的技术方案是 一种降糖中药组合物，由质量组成如下的组分组成(以干重计) 绞股蓝10～20份 栀子 5～15份 山药 10～30份 玉竹 10～30份。
所述组合物质量组成如下 绞股蓝15份 栀子 10份 山药 20份 玉竹 20份。
本发明组合物主要由绞股蓝、栀子、山药、玉竹等组成。本方中绞股蓝益气养阴，兼能生津止渴，清热，栀子清热凉血，辅以玉竹滋阴清热，山药补脾肺之气阴的作用，四者均符合中医药理论依据，遵循君臣佐使原则。中医药理论认为，糖尿病症属于阴虚热盛所致气阴两虚之症，本虚主要指肾阴亏虚，标实是指肺胃燥热。故治疗要兼顾滋阴清热，重点辨虚实，随症分型，依法立方，据方选药，灵活运用。
现代研究发现绞股蓝的主要药效成分为绞股蓝皂苷，据报道绞股蓝皂苷对神经、血液、循环、内分泌系统和消化系统等多方面疾病具有防治作用。观察绞股蓝皂苷对链脲佐菌素造型的糖尿病大鼠血糖的影响，实验发现绞股蓝皂苷能抑制血清中胆固醇、过氧化脂质的增加，有助于血糖降低。采用绞股蓝皂苷治疗自由基损伤模型大鼠，实验发现绞股蓝皂苷能抑制肝脏和血浆脂质过氧化反应，明显提高自由基损伤模型大鼠和老年大鼠的红细胞过氧化物歧化酶(SOD)的活力，具有降低氧化和杀死自由基损伤的作用。观察绞股蓝皂苷对小鼠、大鼠抗应激能力的影响，发现绞股蓝皂苷可使超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性升高，加速体内自由基的清除速度，保护细胞结构免遭破坏，同时可改善红细胞运氧功能，降低血乳酸积累，从而提高了应对缺氧的能力。
山药具有补脾养胃、补肺益肾的功效，可用于治疗脾虚久泻、慢性肠炎、慢性胃炎、肺虚咳喘、糖尿病、遗精和遗尿滞下等症。既是食用的滋补保健佳品，又是常用的药材。山药多糖是山药多糖是目前公认的山药主要活性成分。据报道，山药多糖具有降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的作用，促进糖尿病小鼠体重的恢复。其作用机制可能与增加胰岛素分泌、改善受损坏的胰岛β细胞功能及清除过多自由基等有关。此外，山药多糖还具有增强机体免疫、抗衰老、抗氧化的作用。
栀子苦、性寒，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒的作用。栀子主要化学成分有环烯醚萜类(栀子苷类)、黄酮类(栀子素类)等。从栀子中提取得到的栀子苷具有降低血糖的作用。此外，栀子苷的抗炎作用强。栀子生品的抗炎作用最强，可明显抑制巴豆油所致的小鼠耳壳炎症，降低醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性。
玉竹性甘，微寒，归肺、胃经，能养阴润肺，益胃生津。玉竹中含有多糖、鞣质、粘液质、强心苷等。国内也有学者研究表明玉竹水提取物对STZ诱导的糖尿病小鼠的血糖有明显的降低。潘兴瑜等经多年研究证明玉竹提取物具有抑制细胞介导的免疫应答，抑制IL-2、TNF-α炎症介子产生的作用。玉竹提取物的降糖机制与阻断胰岛β细胞自身免疫反应过程，抑制Th1型细胞介导的，包括分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ在内的自身免疫反应，激活局部Th2型反应，进而分泌IL-4、IL-10等Th2型细胞因子有关。
一种用于制备治疗糖尿病的药物的中药提取物，制备所述中药提取物的中药原料为质量比为10～20∶5～15∶10～30∶10～30的绞股蓝、栀子、山药和玉竹，所述中药提取物由水提取物和乙醇提取物组成，所述的水提取物和乙醇提取物分别按如下方法制备 (1)水提取物称取配方量的山药和玉竹，浸泡0.5～2h，加6～8倍质量(以山药和玉竹干重之和计)的水回流提取1～3次，每次1～2h，提取温度为95～100℃，过滤除去药渣，合并滤液，浓缩，加入乙醇至乙醇体积浓度为80％～90％，放置24h后，抽滤，取沉淀干燥粉碎，得到水提取物粉末； (2)乙醇提取物称取配方量的栀子和绞股蓝，浸泡0.5～2h，加8～12倍质量(以栀子和绞股蓝干重之和计)的65％乙醇回流提取1～2次，每次1～2h，过滤除去药渣，合并滤液，回收乙醇、浓缩，浓缩液过滤，取沉淀干燥粉碎，得到乙醇提取物粉末。
本发明还涉及利用所述中药组合物制得的降糖滴丸(以下称复方降糖滴丸)，所述滴丸由如下方法制得 (1)水提取物制备称取配方量的山药和玉竹，浸泡0.5～2h，加6～8倍质量的水回流提取1～3次，每次1～2h，提取温度为95～100℃，过滤除去药渣，合并滤液，浓缩，加入乙醇至乙醇体积浓度为80％～90％，放置24h后，抽滤，取沉淀干燥粉碎，得到水提取物粉末； (2)乙醇提取物制备称取配方量的栀子和绞股蓝，浸泡0.5～2h，加8～12倍质量的65％乙醇回流提取1～2次，每次1～2h，过滤除去药渣，合并滤液，回收乙醇、浓缩，浓缩液过滤，取沉淀干燥粉碎，得到乙醇提取物粉末； (3)滴丸制备取水提取物粉末和乙醇提取物粉末，加入基质搅拌混匀，70～100℃下倒入滴丸机中，滴入冷凝剂中，冷却，固化成丸，干燥，得到所述降糖滴丸。
复方降糖滴丸具有深厚的临床积淀，主要由绞股蓝、栀子、山药、玉竹等组成。方中绞股蓝益气养阴，兼能生津止渴，清热，栀子清热凉血，辅以玉竹滋阴清热，山药补脾肺之气阴的作用。以上诸药合用达到益气养阴、清热生津的功效。
所述步骤(3)中冷凝剂为甲基硅油和液体石蜡质量比0.5～5∶1的混合物。
所述步骤(3)中基质为PEGE6000，质量用量为水提取物粉末和乙醇提取物粉末总质量的8～12倍。
优选的，制备所述滴丸的中药原料为质量比为15∶10∶20∶20的绞股蓝、栀子、山药和玉竹，所述滴丸由如下方法制得 (1)水提取物制备称取配方量的山药和玉竹，浸泡1h，加6倍质量的水回流提取3次，每次2h，提取温度为100℃，过滤除去药渣，合并滤液，浓缩至相对密度为1.15，加入乙醇至乙醇体积浓度为90％，放置24h后，抽滤，取沉淀干燥粉碎，得到水提取物粉末； (2)乙醇提取物制备称取配方量的栀子和绞股蓝，浸泡1h，加10倍质量的65％乙醇回流提取2次，每次2h，过滤除去药渣，合并滤液，回收乙醇、浓缩至对密度为1.12，浓缩液过滤，取沉淀干燥粉碎，得到乙醇提取物粉末； (3)滴丸制备取水提取物粉末和乙醇提取物粉末，加入质量为粉末质量10倍的PEGE6000、搅拌混匀，100℃下倒入滴丸机中，滴入冷凝剂中，冷却，固化成丸，干燥，得到所述降糖滴丸；所述冷凝剂为甲基硅油和液体石蜡质量比2∶1的混合物。
经药理学试验验证，复方降糖滴丸可明显提高四氧嘧啶所引起的糖尿病小鼠模型的体重，降低血糖，疗效显著，与模型对照组相比，具有极显著性差异(P＜0.01)；且其药效接近于原有处方汤药。复方降糖滴丸可提高糖尿病性小鼠血清胰岛素水平，提示可能复方降糖滴丸能保护四氧嘧啶对小鼠胰岛β细胞的破坏有关，可在一定程度上刺激模型小鼠胰岛β细胞，促进胰岛细胞的再生而释放胰岛素。复方降糖滴丸可减少组织中的氧化产物MDA含量，提高SOD的含量，效果显著，具有极显著性差异(P＜0.01)；充分体现该处方不仅具有改善血糖的优势，更具有提高个体抗氧化，抗应激能力，综合治疗糖尿病。
小鼠急性毒性预实验结果显示，在药液最大浓度灌胃动物，没有引起小鼠任何可见的毒性反应。表明制剂无法测出LD50，改用最大给药量试验测定其单次口服急性毒性。正式实验结果发现，小鼠灌胃后部分小鼠有洗脸状，2h后观察大多小鼠均有轻度腹泻，小鼠尾尖肛门环周湿，可见有药液状液体排泄物，小鼠不时有舔尾状，分析原因可能是小鼠禁食时间太久，药液浓度以及灌胃量太大，引起短时间的胃肠道刺激反应。给药24h观察小鼠上述症状消失，状态恢复正常。
观察期间小鼠体重正常增加，行动敏捷，活动自如；眼部无异常症状；皮肤毛色光亮；大小便状态正常。从饮食曲线看，药物组和空白组小鼠饮食均有降低并最终趋向平稳，这尚不能断定是有药物引起，需要做进一步长期毒性实验。实验结束各组小鼠均无死亡。本实验条件下，综合结果表明复方降糖滴丸的安全性良好。
本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种降糖效果显著、安全性好的降糖中药组合物及其滴丸，可明显提高四氧嘧啶所引起的糖尿病小鼠模型的体重、降低血糖，可提高糖尿病性小鼠血清胰岛素水平、减少组织中的氧化产物MDA含量，提高SOD的含量，且效果显著；本发明降糖中药组合物及滴丸不仅具有改善血糖的优势，更具有提高个体抗氧化，抗应激能力，可综合治疗糖尿病。


图1为复方降糖滴丸对实验性糖尿病小鼠体重影响(n＝8)； 图2为复方降糖滴丸对实验性糖尿病小鼠血糖影响(n＝8)； 图3为复方降糖滴丸对实验性糖尿病小鼠胰岛素影响(n＝8)； 图4为复方降糖滴丸对实验性糖尿病小鼠SOD影响(n＝8)； 图5为复方降糖滴丸对实验性糖尿病小鼠MDA影响(n＝8)； 图6为复方降糖滴丸对实验性糖尿病小鼠脏器指数影响(n＝8)。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此 实施例1提取工艺研究 仪器、试剂及药材 紫外可见分光光度计日本岛津 UV-2550 电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司 S.C.101型 分析天平 北京赛多利斯天平有限公司 Sartorius-BS110S 电子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司AB135-型 旋转蒸发仪上海申生科技有限公司 R-204型 超声波清洗器 昆山市超声波仪器有限公司 KQ5200 水浴锅巩义市英峪予华仪器厂 HH-S型 高效液相色谱仪Waters 510 Series，紫外检测器(美国Waters科技有限公司)，色谱柱SinoChrom ODS-BP(4.6mm×250mm，5μm批号41021)，N2000色谱数据工作站 栀子、绞股蓝、玉竹、山药四味药材均购自浙江中医药大学中药饮片厂，经浙江中医药大学药学院宋捷民教授鉴定，栀子为茜草科植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果实，炒焦后入药，批号070717；绞股蓝为葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝(Gynostemma P.E.)的全草，批号070624；山药为薯蓣科植物薯蓣(Dioscorea opposita Thunb)的干燥根茎，批号070612；玉竹为百合科植物玉竹(Polygonatum odoratum Druce)的干燥根茎，批号070511 1山药、玉竹提取工艺考察 1.1考察指标的选择 根据文献资料，山药和玉竹药材中多糖成分是其重要的药理活性成分。为了充分发挥两味中药中多糖成分的效用，将两味药材中多糖成分共同提取。一般以多糖得率为考察指标，故将其作为多糖提取工艺的评价指标。
1.2正交因素水平的确定 称取1倍处方量(处方量为山药20g、玉竹20g)的药材，共九份，采用回流提取法，按照L9(34)正交试验设计进行试验。提取液过滤，浓缩，按提取溶媒的考察项下方法进行醇沉操作。选择料液比，提取时间，提取次数为考察因素，每因素各取三个水平，选用L9(34)正交表进行试验，见表1。
表1因素水平表
1.3正交试验验证 准确称取1倍处方量的药材，按正交试验最佳工艺提取，平行提取三份，提取液过滤，浓缩。按提取溶媒的考察项下方法进行醇沉，采用苯酚-硫酸法测定提取液中多糖的含量，考察工艺的合理性。
1.4正交醇沉工艺考察 准确称取处方量药材，按最佳提取工艺提取，提取液合并浓缩，按照L9(34)正交试验设计进行醇沉试验。选择浓缩比，醇沉浓度，静置时间为考察因素，每因素各取三个水平，选用L9(34)正交表进行试验，因素水平见表2。
表2因素水平表

1.5正交试验验证 准确称取1倍处方量的药材，按最佳提取工艺提取，提取液合并浓缩，按正交试验最佳工艺醇沉，平行操作三份，按照苯酚-硫酸法测定提取液中多糖的含量，考察工艺的合理性。
1.6结果与数据处理 表3多糖提取的正交试验结果L9(34)正交表
表4多糖提取的正交试验结果方差分析表 注F005(2，2)＝19 表5多糖提取的正交试验验证实验结果(n＝3) 表6多糖醇沉试验L9(34)正交表
表7多糖醇沉试验方差分析表 注F0.10(2，2)＝9 表8多糖醇沉试验验证实验结果(n＝3) 2绞股蓝、栀子提取工艺考察 2.1考察指标的选择 根据文献资料，绞股蓝中的皂苷成分和栀子苷药材中黄酮成分是重要的药理活性成分。为了充分发挥两味中药中活性成分的效用，将两味药材中共同提取，提取溶剂选择乙醇。一般绞股蓝以绞股蓝皂苷含量为考察指标，栀子以栀子苷含量为考察指标，故将绞股蓝皂苷和栀子苷作为乙醇提取工艺的评价指标。
2.2正交提取工艺考察 称取1倍处方量药材(处方量绞股蓝15g、栀子10g)，共九份，采用回流提取法，按照L9(34)正交试验设计进行试验。提取液过滤，浓缩。以栀子苷含量，绞股蓝皂苷含量为考察指标，选择提取乙醇浓度，溶媒量，提取时间，提取次数为考察因素，每因素各取三个水平，选用L9(34)正交表进行试验，因素水平见表9。
表9因素水平表
2.3正交试验验证 称取1倍处方量药材，按正交试验最佳提取工艺，平行提取三份，提取液过滤，浓缩。分别测定栀子苷含量和绞股蓝皂苷含量，考察工艺的合理性。准确吸取制得的浓缩浸膏50mL，置恒重蒸发皿中水浴蒸干，残渣105℃干燥1小时，移至干燥器中冷却30min，重复以上操作至恒重，精密称定，计算浸膏得率。
2.4绞股蓝、栀子提取工艺考察结果 表10L9(34)正交表
注(综合评分＝栀子苷含量*70％+绞股蓝皂苷含量*30％) 表11方差分析表 注F0.10(2，2)＝9 表12验证试验结果(n＝3) 提取工艺研究，经单因素和正交试验确定的山药、玉竹最佳水提工艺为药材浸泡1h，加入6倍量水回流提取3次，每次提取2h，提取温度为100℃；最佳醇沉工艺为提取液浓缩至每毫升含生药量为1g，加入95％乙醇至醇沉浓度达到90％，静置24h，过滤，干燥，即得。栀子、绞股蓝最佳醇提工艺为药材浸泡1h，加入10倍量65％乙醇提取2次，每次提取2h，过滤，合并提取液，浓缩，减压干燥，即得。
实施例2制剂成型工艺研究 1正交试验法优选滴丸成型工艺 根据以上试验，选定药物与基质的比例、PEG4000与PEG6000的比例、料温三个因素，每因素选择三个水平，采用L9(34)正交试验对滴丸成型工艺进行优选，以外观I(硬度、外形及拖尾情况)、丸重差异系数II、溶散时限III为筛选指标进行综合评分，综合评分值越小越好。因素水平见表4。
表13因素水平表

评判公式[55]R＝I/Imax*100*0.4+II/IImax*100*0.3+III/IIImax*100*0.3 外观硬度由硬到软得分为1～3分；圆整度由圆整到不圆整得分为1～3分；拖尾情况由好到差得分为1～3分。溶散时限照中国药典2005年版一部附录崩解时限检察法检查，记录溶散时间，即得。丸重差异系数照中国药典2005年版一部附录滴丸剂项下重量差异检察法检查，任取滴丸20丸，分别精密称定每丸的重量，计算丸重差异系数(RSD)，即得。
2正交试验法优选滴丸成型工艺 按正交表安排实验，称取基质，加热熔融，加入中药提取物粉末，搅拌、混匀，在冰水浴条件下滴制。试验结果见表14。
表14L9(34)正交表

试验结果显示，最佳成型工艺为C1B3A1，即药物与基质比例为1∶8，液体石蜡与甲基硅油比例为1∶2，物料温度为100℃。
3验证试验 按上述最佳工艺条件，对3批样品进行滴制验证试验，并按下述具体方法检查。外观质量大小均匀，色泽一致，圆整，有硬度，无拖尾。溶散时限按中国药典2005年一部附录滴丸剂项下的方法检查。重量差异按中国药典2005年一部附录滴丸剂项下的方法检查。
结合生产实际，确定复方降糖滴丸工艺为药物∶基质＝1∶10，冷却剂为液体石蜡∶甲基硅油＝1∶2，滴制温度为100℃。
实施例3降糖滴丸制备 处方绞股蓝15g、栀子10g、山药20g、玉竹20g 方法 (1)中药提取物制备取处方量的山药、玉竹，浸泡1h后，加入6倍量(240g)水回流提取3次，每次提取2h；提取液浓缩至每毫升含生药量为1g，加入95％乙醇至乙醇体积浓度达到90％，静置24h，过滤，干燥，即得水提取物干燥粉末；取处方量的栀子、绞股蓝，浸泡1h后，加入10倍量(250g)65％乙醇提取2次，每次提取2h，过滤，合并提取液，浓缩，减压干燥，即得乙醇提取物干燥粉末；将水提取物干燥粉末和乙醇提取物干燥粉末混合，即为所述中药提取物； (2)称取基质PEGE6000，加热熔融，加入步骤(1)中药提取物粉末，搅拌、混匀，在冰水浴条件下滴制。中药提取物粉末∶基质＝1∶10，冷却剂为液体石蜡∶甲基硅油＝1∶2，滴制物料温度为100℃。滴丸成型率平均为98.83％。
实施例4复方降糖滴丸对ICR小鼠血糖、血清胰岛素、SOD，MDA、蛋白质和肝脏指数的影响 实验仪器、药物与试剂 紫外可见分光光度计日本岛津公司UV-2550 电子天平 上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂 JA-2003型 水浴锅巩义市英峪予华仪器厂HH-S型 离心机上海安亭科学仪器厂 TDL80-2B型 血糖测定仪美国Lifescan公司强步倍加型 酶标仪芬兰雷勃集团MK-3 旋涡混合器北京医用仪器厂 XW-80A型 四氧嘧啶(购自Sigma公司) 胰岛素试剂盒(品牌USCNLIFE) 超氧化物歧化酶试剂盒(南京建成生物工程研究所) 丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所) 金芪降糖片，由天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂生产，批号0703066，规格每片重0.42g，内服。中成药组成黄芪，金银花等。
复方降糖滴丸提取物(按实施例3步骤(1)方法制得)，实验时用蒸馏水配成所需浓度。原处方药物组，由山药、玉竹、绞股蓝、栀子按照实施例2处方以6倍水量回流提取3次，每次2h，提取液合并浓缩至0.8g/mL。
蛋白定量试剂盒-考马斯亮兰法(南京建成生物工程研究所)清洁级ICR小鼠70只，体重18～22g，雄性，由浙江中医药大学动物实验中心提供，普通饲料适应性喂养一周。动物饲料鼠用普通饲料，购自浙江省医学科学院。饲养条件温度为18～22℃、相对湿度50％～60％。
1实验性糖尿病小鼠模型建立 取雄性小鼠70只，体重18～22g，正常饲养一周后，随机选取10只作为正常对照组。其余小鼠自第8天后禁食不禁水12h，按100mg/kg尾静脉注射现配5％四氧嘧啶溶液，造成实验性糖尿病模型。于72h后尾静脉取血测空腹血糖值，以血糖值不低于11.1mmoL/L作为造模成功的标准，删除未造成糖尿病模型者。
2分组与给药情况 选取造模成功的60只小鼠进行随机分为5组，每组12只，为模型对照组，阳性对照组，原处方汤剂组，复方降糖滴丸药物高、低剂量组。
复方降糖滴丸药物组分为高、低两个剂量组。按处方生药用量为65g/人/日，按65kg/人计算，即1.00g生药/kg，按人与动物体表面积比值换算成小鼠生药量，即小鼠用药剂量为6.00g/kg，以此2倍剂量为低剂量，其8倍为高剂量，临用前用蒸馏水分别配成浓度为2.4g/mL、0.6g/mL(以生药计)，按0.2mL/10g灌胃给药，1次/d。
金芪降糖片组规格0.42g/片，临床剂量8.82g(21片)/人/日，按65kg/人计算，即0.14g生药/kg，按人与动物体表面积比值换算成小鼠生药量，即小鼠用药剂量为0.8g/kg，以此为对照药剂量，用蒸馏水配置成浓度为0.4g/mL，按0.2mL/10g灌胃给药，1次/d。
原处方汤剂组按处方生药用量为130g/人/日，按65kg/人计算，即2.00g生药/kg，按人与动物体表面积比值换算成小鼠生药量，即小鼠用药剂量12.00g/kg，临用前用蒸馏水配成浓度为0.6g/mL，按0.2mL/10g灌胃给药，1次/d。
正常对照组及模型对照组灌胃等体积蒸馏水，按0.2mL/10g灌胃给药，1次/d。见表15。
表15复方降糖滴丸对糖尿病小鼠模型试验研究方案 3标本采集及处理 3.1标本采集 各组小鼠均采用灌胃给药途径，按表32所示给予相应剂量的受试物，每天1次，连续给药15天。造模成功后，每5d收集小鼠血液一次，尾静脉采血，进行血糖的测定，共测3次。动物处死前禁食不禁水，于眼眶取血，离心，用于测定胰岛素；处死动物，摘取肝脏，称重，并用肝组织匀浆测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。
3.210％肝组织匀浆的制备 3.2.1取肝脏组织用冷生理盐水冲洗，除去洗液，滤汁拭干，电子天平精确称重，放入5～10mL的小烧杯内。
3.2.2用量筒取预冷的生理盐水，生理盐水的总量是组织块的九倍，将其倒入小烧杯内，用眼科剪刀尽快剪碎组织块。
3.2.3将剪碎的组织全被倒入玻璃匀浆管中，用手动玻璃匀浆机充分研磨，使组织匀浆化。
3.2.4将匀浆液以4000r/min离心15分钟。
3.2.5取上清液，保存在-20℃冰箱中待测组织内各项指标。
4观察指标 4.1检测血糖 在试验期间，分别于给药5天，10天及15后，采用美国Lifescan公司血糖仪及配套的试纸，尾静脉取血测量血糖，并记录取血当天小鼠体重。
4.2测定血清胰岛素 小鼠于给药1 5天后，禁食12小时，眼眶取全血2mL，分离血清，转速4000r/min离心10min，取血清贮存于-20℃冰箱中，采用酶联免疫法测血清胰岛素。
4.3测定SOD，MDA 取10％肝组织匀浆，按试剂盒说明操作于550nm处采用化学比色法测定肝组织中SOD活力；于532nm处采用化学比色法按照试剂盒测定MDA含量；利用考马斯亮蓝蛋白测定法进行组织中蛋白质的测定。
4.3.1SOD测定原理 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧离子自由基(O2-)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定的吸光度低于对照管的吸光度，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。
4.3.2 MDA测定原理 过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532mn处有最大吸收峰。
4.3.3蛋白测定原理 蛋白质分子具有一NH3+基团，当棕红色的CBBZ250显色剂加入蛋白标准液或样品中时，CBBZ250染料上的阴离子与蛋白一NH3+结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算出蛋白含量。
4.4测定肝脏指数 小鼠于给药15天后，禁食12小时，剖腹取全肝，称重，计算脏器指数。
5实验结果 表16复方降糖滴丸对实验性糖尿病小鼠体重影响(n＝8)
注*与模型对照组比较p＜0.05；**p＜0.01；Δ与阳性对照组比较p＜0.05；ΔΔp＜0.01； 表17复方降糖滴丸对实验性糖尿病小鼠血糖影响(n＝8)
注**与模型对照组比较P＜0.01 表18复方降糖滴丸对实验性糖尿病小鼠胰岛素影响(n＝8)
表19复方降糖滴丸对实验性糖尿病小鼠SOD影响(n＝8)
注**与模型对照组比较P＜0.01 表20复方降糖滴丸对实验性糖尿病小鼠MDA影响(n＝8)
注**与模型对照组比较P＜0.01 ΔΔ与阳性对照组比较P＜0.01 表21复方降糖滴丸对实验性糖尿病小鼠脏器指数影响(n＝8)
6小结 在糖尿病动物实验研究中，常需要建立相应的动物模型。目前制备动物糖尿病模型中，以化学药物或手术切除胰腺最为常见。化学药物又以四氧嘧啶(ALLoxan，ALX)为常用，ALX制备糖尿病模型的方法已经被用了60年了，是目前研究人类糖尿病较好的方法，其致动物糖尿病的作用机制之一是它在体内通过影响葡萄糖激酶的活性，减少葡萄糖载体和葡萄糖激酶信使RNA的浓度，氧化生成OH、O2-自由基，使细胞膜产生脂质过氧化产物，破坏胰岛细胞，从而使胰岛素分泌不足，导致糖尿病的发生。采用的给药方法有一次或连续腹腔注射或者静脉注射等。给药方式、注射剂量以及动物种属的不同，对受试动物胰岛β细胞的损伤不同。本发明参考相关文献，经预试验摸索，最终确定给药方式一次性尾静脉注射四氧嘧啶，注射剂量为100mg/kg体重。在给药后的第3～4天，胰岛的损害较大。本实验中，注射四氧嘧啶的动物在注射四氧嘧啶后第三天血糖测定高于正常对照组，表明糖尿病模型成功建立。该模型稳定性好，成功率高，对小鼠刺激较少。
6.1复方降糖滴丸对实验动物血糖、胰岛素的影响 高血糖是糖尿病的主要临床特征，而改善糖代谢，控制血糖至理想水平是糖尿病治疗的主要目的之一。研究结果显示，复方降糖滴丸可改善糖尿病小鼠糖代谢，具有明显的降血糖效应。
无论是I型糖尿病还是II型糖尿病，长期的高血糖水平本身也可致胰岛β细胞损害，而且高葡萄糖水平致胰岛β细胞毒性是不可逆转的。制造糖尿病模型的化学药物ALX主要损伤胰岛细胞，特别是胰岛β细胞，可引起β细胞INS分泌功能下降，INS分泌减少。而测定血清INS是检查胰岛β细胞功能的常用指标。研究结果显示，复方降糖滴丸高剂量组可减轻ALX对小鼠胰岛β细胞分泌功能的损害。
6.2复方降糖滴丸对实验动物血清脂质过氧化的影响 糖尿病患者除胰岛β细胞损伤与过氧化有关外，胰岛素抵抗和血管异常都与氧化应激有关。机体内存在的几种抗氧化物酶可以预防氧化应激。SOD是重要的抗氧化物酶之一，其主要功能是清除超氧游离基。在糖尿病中，血浆SOD的浓度与胰岛素抵抗密切联系，SOD能在血管特别是在动脉壁中高度表达并且能催化超氧阴离子O2-变成过氧化氢和氧气从而减轻脂质过氧化的损害，所以血液及组织中SOD水平是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。
MDA是脂质过氧化物反应的产物之一，血清中MDA含量可反应脂质过氧化的程度。脂质是生物膜的主要成分，当自由基与活性氧攻击生物膜时，可对生物膜易造成过氧化损化，同时产生脂质过氧化产物。生物膜的过氧化损伤会导致其通透性增加、流动性下降、膜蛋白功能异常等变化，影响和破坏生物膜正常的生理功能，从而对细胞造成损伤。研究结果显示，复方降糖滴丸对减轻糖尿病小鼠机体过氧化损伤具有显著作用，这可能也是复方降糖滴丸对保护胰岛β细胞结构和功能的重要机制之一。
权利要求
1.一种降糖中药组合物，由质量组成如下的组分组成
绞股蓝 10～20份
栀子5～15份
山药10～30份
玉竹10～30份。
2.如权利要求1所述的降糖中药组合物，其特征在于所述组合物质量组成如下
绞股蓝 15份
栀子10份
山药20份
玉竹20份。
3.一种用于制备治疗糖尿病的药物的中药提取物，制备所述中药提取物的中药原料为质量比为10～20∶5～15∶10～30∶10～30的绞股蓝、栀子、山药和玉竹，所述中药提取物由水提取物和乙醇提取物组成，所述的水提取物和乙醇提取物分别按如下方法制备
(1)水提取物称取配方量的山药和玉竹，浸泡0.5～2h，加6～8倍质量的水回流提取1～3次，每次1～2h，提取温度为95～100℃，过滤除去药渣，合并滤液，浓缩，加入乙醇至乙醇体积浓度为80％～90％，放置24h后，抽滤，取沉淀干燥粉碎，得到水提取物粉末；
(2)乙醇提取物称取配方量的栀子和绞股蓝，浸泡0.5～2h，加8～12倍质量的65％乙醇回流提取1～2次，每次1～2h，过滤除去药渣，合并滤液，回收乙醇、浓缩，浓缩液过滤，取沉淀干燥粉碎，得到乙醇提取物粉末。
4.利用权利要求1所述中药组合物制得的降糖滴丸，所述滴丸由如下方法制得
(1)水提取物制备称取配方量的山药和玉竹，浸泡0.5～2h，加6～8倍质量的水回流提取1～3次，每次1～2h，提取温度为95～100℃，过滤除去药渣，合并滤液，浓缩，加入乙醇至乙醇体积浓度为80％～90％，放置24h后，抽滤，取沉淀干燥粉碎，得到水提取物粉末；
(2)乙醇提取物制备称取配方量的栀子和绞股蓝，浸泡0.5～2h，加8～12倍质量的65％乙醇回流提取1～2次，每次1～2h，过滤除去药渣，合并滤液，回收乙醇、浓缩，浓缩液过滤，取沉淀干燥粉碎，得到乙醇提取物粉末；
(3)滴丸制备取水提取物粉末和乙醇提取物粉末，加入基质搅拌混匀，70～100℃下倒入滴丸机中，滴入冷凝剂中，冷却，固化成丸，干燥，得到所述降糖滴丸。
5.如权利要求4所述的滴丸，其特征在于所述步骤(3)中冷凝剂为甲基硅油和液体石蜡质量比0.5～5∶1的混合物。
6.如权利要求4所述的滴丸，其特征在于所述步骤(3)中基质为PEGE6000，质量用量为水提取物粉末和乙醇提取物粉末总质量的8～12倍。
7.如权利要求4所述的滴丸，其特征在于制备所述滴丸的中药原料为质量比为15∶10∶20∶20的绞股蓝、栀子、山药和玉竹，所述滴丸由如下方法制得
(1)水提取物制备称取配方量的山药和玉竹，浸泡1h，加6倍质量的水回流提取3次，每次2h，提取温度为100℃，过滤除去药渣，合并滤液，浓缩至相对密度为1.15，加入乙醇至乙醇体积浓度为90％，放置24h后，抽滤，取沉淀干燥粉碎，得到水提取物粉末；
(2)乙醇提取物制备称取配方量的栀子和绞股蓝，浸泡1h，加10倍质量的65％乙醇回流提取2次，每次2h，过滤除去药渣，合并滤液，回收乙醇、浓缩至对密度为1.12，浓缩液过滤，取沉淀干燥粉碎，得到乙醇提取物粉末；
(3)滴丸制备取水提取物粉末和乙醇提取物粉末，加入质量为粉末质量10倍的PEGE6000、搅拌混匀，100℃下倒入滴丸机中，滴入冷凝剂中，冷却，固化成丸，干燥，得到所述降糖滴丸；所述冷凝剂为甲基硅油和液体石蜡质量比2∶1的混合物。
全文摘要
本发明提供了一种用于治疗糖尿病的降糖中药组合物、提取物及其滴丸。所述降糖中药组合物，由质量组成如下的组分组成绞股蓝10～20份，栀子5～15份，山药10～30份，玉竹10～30份。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种降糖效果显著、安全性好的降糖中药组合物及其滴丸，可明显提高四氧嘧啶所引起的糖尿病小鼠模型的体重、降低血糖，可提高糖尿病性小鼠血清胰岛素水平、减少组织中的氧化产物MDA含量，提高SOD的含量，且效果显著；本发明降糖中药组合物及滴丸不仅具有改善血糖的优势，更具有提高个体抗氧化，抗应激的能力，可综合治疗糖尿病。
文档编号A61P3/10GK101810775SQ20101014778
公开日2010年8月25日 申请日期2010年4月15日 优先权日2010年4月15日
发明者袁强, 何岚, 黄海静, 李兰, 余永华, 胡洁, 毛蕾 申请人:浙江中医药大学附属第二医院