一种用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的方法

专利名称：一种用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的方法
技术领域：
本发明涉及蟾酥提取方法，具体涉及一种用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的方法。
背景技术：
蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(5w/o 6w/o gflrgw/za似Cantor)或黑眶蟾蜍CBw/o 附e/""o劝'c加Schneider)的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液，经加工干燥制成。其性味甘、 辛温，有毒。具有解毒、消肿、醒神、开窍、强心和抗肿瘤等功效。蟾酥含有多种化学 成分，主要分为脂溶性部分和水溶性部分。脂溶性蟾酥包括酯蟾毒配基、华蟾酥毒精和 蟾毒灵。目前提取蟾酥的方法主要是在加热条件下用有机溶剂回流提取，常用的有机溶 剂为乙醇、丙酮或石油醚，用色谱柱吸附分离，常用的色谱柱为树脂柱或硅胶柱，然后 逐步洗脱、干燥得到脂溶性蟾酥提取物，目前常规提取温度一般不大于6(TC，提取时间 较长， 一般超过l小时，虽然提取时间较长但提取率仍较低，若在提取时间较长情况下 又提高提取温度，则脂溶性蟾酥易变性；树脂柱或硅胶柱虽能分离得到脂溶性蟾酥，但 分离率不高，纯度较低，纯度较低的脂溶性蟾酥也易变性。如申请号为200610070105. X 的中国发明专利申请，就公开了用重量是干蟾皮重量9倍或10倍的80%或95%乙醇提 取卯分钟或120分钟，然后用大孔树脂柱吸附分离，用水、低浓度乙醇、高浓度乙醇 逐级洗脱，再用乙酸乙脂萃取，干燥得到脂溶性蟾酥提取物，但该提取方法的步骤复杂， 而脂溶性蟾酥的提取率较低，提取时间较长，脂溶性蟾酥变性率高，树脂分离得到的脂 溶性蟾酥纯度较低。另外申请号为00136668.8的中国发明专利申请，则公开了用微波 加热消解萃取，萃取温度为30 6(TC，萃取时间为1 10小时，萃取液经3 7小时减 压浓縮，再用射流干燥得到蟾酥提取物，该方法萃取时间也较长，萃取温度较低，萃取 率相应较低，萃取后未分离纯化，蟾酥提取物成份复杂，得到的脂溶性蟾酥更易变性。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的方法，该方法 具有萃取时间较少，提取率较高，脂溶性蟾酥变性少，能较好地分离蟾毒灵、华蟾酥毒
精和酯蟾毒配基，且分离得到的脂溶性蟾酥纯度较高等优点。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为 一种用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的 方法，包括下述步骤
1)在粉碎的蟾皮中加入浓度为55 100%的乙醇，乙醇与蟾皮(干重计)的重量比为5 10: 1，得到蟾皮乙醇液。
2) 将上述蟾皮乙醇液放入微波消解器中，用功率为400 800W的微波消解加热萃 取，萃取温度为61 95'C，萃取时间为10 50min，得到萃取液；我们通过测定确定脂 溶性蟾酥的最低变性温度为96.47'C，因此选定该萃取温度，即可以降低萃取时间， 又使脂溶性蟾酥的变性较少，突破常规，具有较好的效果。
3) 将上述萃取液用lOOOKDa超滤膜过滤后浓縮得到滤液；浓縮程度按可以在液相 色谱仪分离纯化即可。
4) 将上述滤液用液相色谱仪分离纯化，该液相色谱仪的色谱柱为ds，柱温为40 'C， 流动相为质量浓度是0.5% ， pH值是3.25土0.02，按质量比50 : 50配制的磷酸二氢钾-乙腈混合液，进样量为5(^1-10(^1，流量为20 70mL/min，蟾毒灵、华蟾酥毒精和酯蟾 毒配基的保留时间分别为7.594 min、 10.103min和10.741 min,分别收集得到蟾毒灵纯 化液、华蟾酥毒精纯化液和酯蟾毒配基纯化液；上述种纯化液可以用波长为296nm检测 确认。
5) 将上述蟾毒灵纯化液、华蟾酥毒精纯化液和酯蟾毒配基纯化液分别或合并后浓 縮干燥，得到相应的脂溶性蟾酥；即分别可以得到含较纯的蟾毒灵的脂溶性蟾酥；含较 纯的华蟾酥毒精的脂溶性蟾酥；含较纯的酯蟾毒配基的脂溶性蟾酥；含较纯的蟾毒灵、 华蟾酥毒精和酯蟾毒配基的脂溶性蟾酥。
所述乙醇的浓度为84%，所述萃取温度为94.6'C，所述萃取时间为39.6min;该条
件下蟾毒灵萃取率相对较高。
所述乙醇的浓度为82%，所述萃取温度为83'C，所述萃取时间为36min;该条件下 华蟾酥毒精萃取率相对较高。
所述蟾皮为干蟾皮，所述乙醇与所述干蟾皮的重量比为8 10: 1;干蟾皮萃取时的 乙醇用量要较多，才有较好的萃取效果。
所述蟾皮为鲜蟾皮，所述乙醇与所述鲜蟾皮的重量比为5 7: 1;鲜蟾皮萃取时的
乙醇用量可以略少，也有较好的萃取效果。
将步骤5所述脂溶性蟾酥溶于水配成浓度为12mg/m啲蟾酥液，然后按体积比4 8: 1，将p-环糊精饱和溶液和所述蟾酥液混合配成混合液，搅拌混合液15 30min，在进 风温度为150 20(TC，出风温度为70 8(TC条件下，将混合液喷雾干燥，得到含有上述 各种脂溶性蟾酥的微胶囊；该微胶囊可以应用于抗肿瘤等疾病。
与现有技术相比，本发明的优点在于用乙醇为萃取溶剂，用微波消解加热萃取，用 超滤膜过滤后浓縮，用液相色谱技术分离纯化；其萃取温度突破常规，相对较高但仍控 制在最低变性温度内，萃取时间较短，少于1小时，因此萃取过程中脂溶性蟾酥变性较 少，而萃取率相对较高；液相色谱分离纯化中蟾毒灵、华蟾酥毒精和酯蟾毒配基的保留 时间分别为7.594min、 10.103min和10.741 min，可以较好地分离得到各种脂溶性蟾酥，
4且得到的蟾毒灵、华蟾酥毒精和酯蟾毒配基纯度高，，纯度可以达到99%，杂质少，因 此得到的各种脂溶性蟾酥较稳定，不易变性，本发明的脂溶性蟾酥的提取率为17%以上， 高的可以达到40%。因此本发明的方法具有萃取时间较少，提取率较高，脂溶性蟾酥变 性少，能较好地分离蟾毒灵、华蟾酥毒精和酯蟾毒配基，且分离得到的脂溶性蟾酥纯度 较高等优点。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 实施例1
一种用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的方法，将io克干蟾皮粉碎后，加入100克浓度
为55%的乙醇，然后放入微波消解器中，用功率为800W的微波消解加热萃取，萃取温 度为8(TC，萃取时间为30min，萃取完毕后用1000 KDa超滤膜过滤后浓縮得到滤液，滤 液用液相色谱仪分离纯化，该液相色谱仪的色谱柱为C18，柱温为40 °C，流动相为质 量浓度是0.5% ， pH值是3.25±0.02，按质量比50 : 50配制的磷酸二氢钾-乙腈混合液， 进样量为50pl-100nl，流量为20 70mL/min，蟾毒灵、华蟾酥毒精和酯蟾毒配基的保留 时间分别为7.594 min、 10.103min和10.741 min，分别收集得到蟾毒灵纯化液、华蟾酥 毒精纯化液和酯蟾毒配基纯化液；将蟾毒灵纯化液、华蟾酥毒精纯化液和酯蟾毒配基 纯化液分别浓縮干燥，分别可以得到含较纯的蟾毒灵的脂溶性蟾酥，含较纯的华蟾酥毒 精的脂溶性蟾酥，含较纯的酯蟾毒配基的脂溶性蟾酥，也可以将蟾毒灵纯化液、华蟾酥 毒精纯化液和酯蟾毒配基纯化液合并后浓縮干燥，含较纯的蟾毒灵、华蟾酥毒精和酯蟾 毒配基的脂溶性蟾酥，脂溶性蟾酥总提取率可以达到40.7%。 实施例2
与实施例l基本相同，所不同的只是乙醇浓度为70%，乙醇用量为90克，微波功 率为600W，萃取温度为65'C，萃取时间为50min，经检测本实施例脂溶性蟾酥的总提 取率为38.5%。
实施例3
与实施例l基本相同，所不同的只是乙醇浓度为90%，乙醇用量为80克，微波功 率为500W，萃取温度为94'C，萃取时间为10min，经检测本实施例脂溶性蟾酥的总提 取率为37.2%。
实施例4
与实施例l基本相同，所不同的只是用鲜蟾皮代替干蟾皮，乙醇浓度为95%，乙醇 用量为70克，微波功率为600W，萃取温度为65'C，萃取时间为40min，经检测本实施 例脂溶性蟾酥的总提取率为19.2%。
实施例5与实施例l基本相同，所不同的只是用鲜蟾皮代替干蟾皮，乙醇浓度为90%，乙醇 用量为60克，微波功率为600W，萃取温度为75°C，萃取时间为30min，经检测本实施 例脂溶性蟾酥的总提取率为18.1%。
实施例6
与实施例l基本相同，所不同的只是用鲜蟾皮代替干蟾皮，乙醇浓度为80%，乙醇 用量为50克，微波功率为600W，萃取温度为85。C，萃取时间为50min，经检测本实施 例脂溶性蟾酥的总提取率为17.2%。
上述实施例中得到的脂溶性蟾酥，经液相色谱检测蟾毒灵的纯度可以达到99.4%， 华蟾酥毒精的纯度可以达到99.7%，酯蟾毒配基的纯度可以达到99.3%。
实施例7
将按上述实施例所得到脂溶性蟾酥60 mg配成5ml的蟾酥液，然后加入30ml的卩-环糊精饱和溶液，搅拌15 30min，在进风温度为150 200°C，出风温度为70 80°C 条件下，将混合液喷雾干燥，制成含脂溶性蟾酥的微胶囊。
权利要求
1、一种用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的方法，其特征在于包括下述步骤1)在粉碎的蟾皮中加入浓度为55～100％的乙醇，乙醇与蟾皮(干重计)的重量比为5～10∶1，得到蟾皮乙醇液；2)将上述蟾皮乙醇液放入微波消解器中，用功率为400～800W的微波消解加热萃取，萃取温度为61～95℃，萃取时间为10～50min，得到萃取液；3)将上述萃取液用1000KDa超滤膜过滤后浓缩得到滤液；4)将上述滤液用液相色谱仪分离纯化，该液相色谱仪的色谱柱为C18，柱温为40℃，流动相是质量浓度为0.5％，pH值为3.25±0.02，按质量比50∶50配制的磷酸二氢钾-乙腈混合液，进样量为50μl-100μl，流量为20～70mL/min，蟾毒灵、华蟾酥毒精和酯蟾毒配基的保留时间分别为7.594min、10.103min和10.741min，分别收集得到蟾毒灵纯化液、华蟾酥毒精纯化液和酯蟾毒配基纯化液；5)将上述蟾毒灵纯化液、华蟾酥毒精纯化液和酯蟾毒配基纯化液分别或合并后浓缩干燥，得到相应的脂溶性蟾酥。
2、 如权利要求1所述的一种用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的方法，其特征在于所述 乙醇的浓度为84%，所述萃取温度为94.6'C，所述萃取时间为39.6min。
3、 如权利要求1所述的一种用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的方法，其特征在于所述 乙醇的浓度为82%，所述萃取温度为83t:，所述萃取时间为36min。
4、 如权利要求1所述的一种用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的方法，其特征在于所述 蟾皮为干蟾皮，所述乙醇与所述干蟾皮的重量比为8 10: 1。
5、 如权利要求1所述的一种用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的方法，其特征在于所述 蟾皮为鲜蟾皮，所述乙醇与所述鲜蟾皮的重量比为5 7: 1。
6、 如权利要求1所述的用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的方法，其特征在于将步骤5) 所述脂溶性蟾酥溶于水配成浓度为12mg/ml的蟾酥液，然后按体积比4 8: 1，将p-环糊精饱和溶液和所述蟾酥液混合配成混合液，搅拌混合液15 30min，在进风温度为 150 200°C，出风温度为70 80'C条件下，将混合液喷雾干燥，得到含有脂溶性蟾酥的 微胶囊。
全文摘要
本发明公开了一种用蟾皮微波萃取脂溶性蟾酥的方法，用乙醇为萃取溶剂，用微波消解加热萃取，用超滤膜过滤后浓缩，用液相色谱技术分离纯化，其萃取温度突破常规，相对较高但仍控制在最低变性温度内，萃取时间较短，少于1小时，因此萃取过程中脂溶性蟾酥变性较少，而萃取率相对较高；液相色谱分离纯化中蟾毒灵、华蟾酥毒精和酯蟾毒配基的保留时间分别为7.594min、10.103min和10.741min，可以较好地分离得到各种脂溶性蟾酥，且得到的蟾毒灵、华蟾酥毒精和酯蟾毒配基纯度高，可以达到99％，杂质少，因此得到的各种脂溶性蟾酥较稳定，不易变性，本发明的脂溶性蟾酥的提取率为17％以上，高的可以达到40％。
文档编号A61P9/04GK101669970SQ20091015292
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月21日 优先权日2009年9月21日
发明者晔 李, 李妍妍, 苏秀榕 申请人:宁波大学