专利名称：：一种丹参水溶性提取物的制备方法
技术领域：
：本发明涉及天然植物有效成分的提取技术，尤其涉及一种丹参水溶性提取物的制备方法。
背景技术：
：中药丹参是唇形科鼠尾草属的多年生草本植物丹参SalviamiltiorrhizaBmige的干燥根及根茎，因其色红且形状似参而得名"丹参"，又称血参、紫丹参、红丹参等。丹参作为一传统中药在我国沿用已久，始载于《神农本草经》,被列为上品，《本草经疏》、《本草纲目》中都有记载。丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效，主治冠心病、心绞痛、心烦不眠、月经不调、经闭痛经等症。近年来研究发现用来治疗心血管疾病，疗效显著。动物实验表明，丹参水提物对缺血心肌具有明显的保护作用，能縮小心梗范围，加快心梗后ST段的恢复。这种保护作用除了与丹参舒张冠脉，增加缺血心肌的血供有关外，还与丹参素DS—182提高机体对缺氧的耐受力和改善缺血后的心肌代谢紊乱有关。冠脉再灌注时，心肌组织产生了大量氧自由基，它可以引起心肌细胞膜脂质过氧化反应，影响心肌细胞膜的稳定性，增加钙离子内流，造成心肌再灌注损伤和心律失常。丹参素具有清除氧自由基和"H自由基的作用并对大鼠缺血和再灌注损伤的心肌线粒体有良好的保护作用，还具有很强的抗氧化作用，可抑制再灌注时心肌细胞膜的脂质过氧化反应，从而减轻心肌膜的损伤。因此，有关丹参的研究较多且日趋深入。目前丹参水溶性成分的获取主要采用水提醇沉等传统方法得到，但所得到的提取物有效成分含量低，且药理作用不明显。传统方法在纯化丹参提取液时，有效成分之一丹参素钠会损失30%50%;而且在纯化过程中，需要对丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B三个有效成分分别纯化，增加了纯化工艺步骤，操作复杂。丹参酸B是由3分子的丹参素和1分子的咖啡酸縮合形成的，具有两个羧基，是以不同的盐的形式存在的(K+，Ca2+，Na+，NH/等复合形式)，在煎煮、浓縮过程中，少部分水解生成紫草酸和丹参素，一部分丹参素在酸性条件下变为迷迭香酸；丹酚酸A，C在溶液中可以互变等。加热提取适当时间，丹酚酸B会水解为紫草酸和丹参素，丹酚酸B的分子式如式(I)所示，丹参素钠的分子式如式(II)所示，咖啡酸的分子式如式(III)所示GOCHHa(II)fi"w—(III)
发明内容本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种制备工艺简单可控、成本低、可得到高含量丹参素钠的，且有利于大规模生产的丹参水溶性提取物的制备方法。本发明上述目的是通过如下方案予以实现的一种丹参水溶性提取物的制备方法，该方法是将丹参药材依次进行传统的水提、醇沉和纯化后，再在弱碱环境下进行热处理，最后浓縮得到所需丹参水溶性提取物。上述制备方法中，利用1分子的丹酚酸B在碱性条件下可以分解为2分子的丹参素钠，本发明人先通过现有常规的水提、醇沉和纯化操作，得到含有丹酚酸B和原儿茶醛的水溶性提取液，然后将该水溶性提取液在弱碱性的环境下进行加热处理，从而使得水溶性提取液中的部分丹酚酸B分解为丹参素钠，浓縮后即可得到含有丹酚酸B、丹参素钠和原儿茶醛这三种活性成分的丹参水溶性提取物。上述制备方法中，采用将含有丹酚酸B和原儿茶醛的水溶性提取液在弱碱性的环境里进行热处理，是因为弱碱性的环境可以使得最后的提取物纯度高，且易控制；所述弱碱性环境的热处理，其条件为pH为6.011.0的弱碱性环境，热处理为65'C10(TC的温度下，处理26小时；所述弱碱性环境的热处理，优选条件为pH为7.09.0，热处理46小时。上述制备方法具体包括如下步骤(1)取丹参药材，粉碎，过筛后加水提取；(2)将上述提取液进行醇沉处理后，过滤，浓縮醇液；(3)将上述醇液的pH调节至1.04.0，过滤去除沉淀，取上清；(4)将上清进行纯化后，分别用水和醇洗脱后，收集醇洗液，浓縮；(5)将步骤(4)制备所得浓縮液在弱碱环境下进行加热处理；(6)步骤(5)的加热处理结束后，调节体系pH至3.05.0，浓縮干燥即得丹参水溶性提取物。其中，所述步骤(1)中，丹参药材的水提操作为本领域技术人员进行丹参提取时候的常用技术，水提方法可以为回流或超声，水提时的加水量是丹参药材重量的612倍，提取时间为12小时。上述水提方法优选回流法，水提时的加水量优选为丹参药材重量的810倍。一般可对丹参药材进行多次水提处理，水提次数为24次，然后合并多次水提液，进行浓縮后再进行下一步的处理，浓縮至药液相对密度为1.101.50(5560。C)。上述水提次数优选23次，合并提取液进行浓縮，优选浓縮至药液相对密度为1.101.30(5560°C)。所述步骤(2)中的醇沉是本领域技术人员进行丹参提取时，常用的与水提处理进行搭配的操作。醇沉时采用任意一种本领域技术人员进行药材水提醇沉操作时所采用的醇试剂，如乙醇等；醇沉时，乙醇的加入量为水提液总体积的50%80%，优选为水提液总体积的70%75%;醇沉后进行过滤，收集醇液并浓縮该醇液，这里浓縮的作用主要是为了后期过柱纯化的需要。所述步骤(3)中，采用无机酸(任意一种本领域技术人员常用的无机酸均可实现本发明，优选盐酸)将pH调节至1.04.0，优选调节至2.03.5;所用无机酸优选浓度为1.Omol/L5.0mol/L的盐酸溶液。所述步骤(4)中，采用本领域技术人员常用的大孔树脂进行上清液的纯化，如HPD826、DlOl、NKA-2或DM130中任意一种或几种的混合物，优选HPD826或DM130。所述步骤(4)中，纯化时的上清液的上样量为0.51.0g丹参药材/g树脂，洗脱时先用水进行洗脱，水洗量为1.53BV，再用醇洗脱，醇的浓度按体积百分数计为30%70%，醇洗脱量为35BV，收集醇洗液并将醇洗液浓縮至药液相对密度为1.11.5(5560°C)。所述步骤(5)中，弱碱性是指pH为611，优选pH为7.09.0;所述加热处理为65。Cl(KrC的温度下，加热处理26小时，优选65。C10(TC的温度下，加热处理46小时。所述步骤(6)中的干燥方法为常规的冷冻干燥、真空干燥等均可实现本发明。本制备方法得制得的丹参水溶性提取物中各有效成分所占的质量百分比为丹参素钠的含量在1050%，原儿茶醛的含量在210%，迷迭香酸的含量在1030%，丹酚酸B的含量在320%。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.现有技术中对丹参药材的提取是采用先降解再纯化的操作，这样使得最终所得提取液中丹参素钠的损失达到20%50%，且各批次间差异大，而本发明的制备方法采用先纯化再碱性条件下降解的操作，有效避免了丹参素钠在制备过程中的损失，从而使得最终所得丹参水溶性提取物中丹参素钠的含量提高20%50%左右；2.现有技术中，要得到含有丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B三个成分的丹参提取物，需对这三个物质都进行纯化，而且为了兼顾三个成分的收率，也增加了纯化工艺步骤，而本发明的制备方法，只需要纯化丹酚酸B，然后利用纯化好的丹酚酸B经过碱性条件下降解得到丹参素钠，因此仅需要纯化丹酚酸B，简化了工艺流程。3.现有工艺中在分离纯化过程中丹参素钠比较容易损失，稳定性差，容易受提取条件，分离方法影响，而本发明的方法操作简单，所得的纯化物各种成分比例较稳定，主要成分可以按要求来控制条件确定比例，工艺重现性高，稳定性高，利于工业化生产；4.现有工艺中，各种成分在制备过程中会受到各制备参数的影响而变化很大，如提取过程，现有工艺的成分因提取条件(碱量，提取温度及时间)而发生很大变化，随着加碱量增加，提取时间延长，丹酚酸B及原儿茶醛含量减少，丹参素钠增加；且此提取液还要经过分离纯化步骤，丹参素钠容易损失，造成其含量变化大；本发明的制备工艺采用先纯化后碱化，避免了提取和分离过程中对丹参素钠含量的影响，且可以通过碱液条件(PH值的大小，)，加热程度(加热时间)来控制各成分之间的比例，制备参数稳定可控；5.现有工艺中水提取液分离纯化时采用超滤设备来分离纯化，此工艺相对复杂，对仪器要求高；而本发明只需用大孔树脂来分离纯化，分离效果好，得膏率低，且可以重复利用，纯化成本低。具体实施例方式以下就实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何限定。实施例l本实施例的丹参水溶性提取物，其制备方法包括如下步骤(1)取丹参药材lOOg，粉碎，过10目药典筛后，加8倍(重量比)水回流提取1小时，残渣重复提取2次，合并提取液，将提取液浓縮至药液相对密度为1.2;(2)向上述浓縮后的提取液中加入95体积％乙醇对提取液进行醇沉处理，95体积％乙醇的加入量为浓縮后提取液体积的70%，过滤，滤液浓縮至药液相对密度为1.2;(3)采用lmol/L盐酸溶液将上述浓縮后的醇液的pH调节至1.0，过滤去除沉淀，取上清；(4)将上清采用HPD826型大孔树脂纯化，上样速度为lBV/h，水洗速度为2BV/h，洗L5BV，50体积呢乙醇洗3BV，70体积呢乙醇洗5BV，收集醇洗液，浓縮至药液相对密度为1.20;(5)将步骤(4)所得浓縮液在pH7.5的环境下，8CTC加热4小时；(6)调节上述加热处理后的体系pH至4.0，浓縮，真空干燥得到干粉4.52g，该干粉即为所需丹参水溶性提取物。实施例2本实施例的丹参水溶性提取物，其制备方法包括如下步骤(1)取丹参药材100g，粉碎，过20目药典筛后，加10倍(重量比)水回流提取1小时，残渣重复提取2次，合并提取液，浓縮至药液相对密度为1.20;(2)向上述浓縮后的提取液中加入95体积％乙醇对提取液进行醇沉处理，95体积％乙醇的加入量为浓縮后提取液体积的75%，过滤，滤液浓縮至药液相对密度为1.2;(3)采用5mol/L盐酸溶液将上述浓縮后的醇液的pH调节至4，过滤去除沉淀，取上清；(4)将上清采用DM130型大孔树脂纯化，上样速度为lBV/h，水洗速度为2BV/h，洗1,5BV，60体积呢乙醇洗5BV，收集乙醇洗液，浓縮至药液相对密度为1.2;(5)将步骤(4)所得浓縮液在pH9.0的环境下，95"C加热3.0小时；(6)调节上述加热处理后的体系pH至3.0，浓縮，真空干燥得到干粉4.69g，该干粉即为所需丹参水溶性提取物。实施例3丹参水溶性提取物工艺对比本实施例采用的丹参药材为市售。本实施例分对比组和实验组对比组是采用现有的丹参水溶性提取物制备技术对上述丹参药材进行处理，从而制备得到丹参水溶性提取物。实验组为采用实施例1所述制备方法对上述丹参药材进行处理，从而制备得到丹参水溶性提取物。现有技术中对丹参水溶性提取物的制备工艺，其步骤如下丹参药材粉碎过筛，取过50目药筛的药材粗粒，加入1.5质量％碳酸氢钠，加热提取2次，分别以4倍，3倍量水煎煮两次(分别为2，l小时)，过滤，合并滤液，浓縮，加入95体积％乙醇到乙醇占总体系的体积浓度为68%，静置IO小时，滤过，滤液浓缩，干燥得到丹参水溶性提取物。对比组和实验组每个组都做三个平行试验，最终所得丹参水溶性提取物，其各项指标的对比如表1所示表i对比组和实验组制备所得丹参水溶性提取物的对比<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上述表1中，*表示与公开工艺相比较有显著性差异，P<0.05。由表l可以看出，本发明方法制备所得丹参水溶性提取物中，丹参素钠和丹酚酸B的含量均高于现有技术制备所得丹参水溶性提取物。与对比组比较，本发明方法所得的提取物中，丹参素钠的含量高31.1%，丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B的d三个成分的总含量高37.0%，而且各批提取物中丹参素钠等有效成分的含量波动范围明显优于对比组(P<0.05)。实施例4大孔树脂的选择按照规定将各种型号的大孔树脂进行预处理，备用；再将丹参提取液经过前处理，制成上样液，备用。滤液经过各种型号的树脂纯化；大孔树脂型号有HPD~826、HPD-722、DM-130、HPD~600、ADS-17、DlOl、HPD~407、NKA-II和H103。分别按照相同的条件，经过上柱吸附，水洗，不同浓度的乙醇洗，收集醇洗液；再进行检测，比较各种树脂对丹参有效成分的吸附性能(表2)。表2各种大孔树脂对丹参水溶性成分的吸附性与筛选结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表2可以看出，各种树脂对丹参素钠的吸附能力都不理想；丹参素钠在各种树脂上都比较难被吸附，在水洗时都非常容易泄漏;而HPD"826和DM130能强吸附丹参酚酸B。综合考虑树脂的安全性及对丹参各成分的吸附性能，本发明优选HPD"826或DM-130为纯化树脂。同时，也说明采用大孔树脂纯化丹参素钠时，丹参素钠不容易富集，损耗量较大。确定丹参纯化所用的大孔树脂型号后，对大孔树脂进行优化实验；根据上样浓度对吸附性能的影响，确定本工艺上样量为0.5g丹参药材/g树脂；上样浓度为0.25g药材/ml药液；水洗量为3BV;醇洗浓度为用70%，洗脱体积为5BV;收集醇洗液，减压低温浓縮至药液相对密度为1.5。实施例5弱碱环境热处理条件的优化本实施例针对制备方法的步骤(5)，将浓縮液在弱碱环境下进行加热处理中的pH条件以及加热条件进行优化。采用实施例1的制备方法，仅仅对步骤(5)进行一系列的试验，所采用的不同pH条件、热处理时间如表3所示，各处理条件最终制备所得丹参水溶性提取物中，丹参素钠、丹酚酸B和原儿茶醛的含量也如表3所示。表3pH、加热时间对丹参提取液的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由表3可知，当pH高于7.99且加热2小时以上时，或者pH高于6.09且加热4小时以上时，得到的丹参提取物较好，其中丹参素钠原儿茶醛丹酚酸B的质量比例为2585份1050份250份；pH为7.048.98时，加热时间为4h和6h时，得到的丹参提取物最佳，其中丹参素钠原儿茶醛丹酚酸B的质量比例为3550份3550份1025份。实施例6本实施例采用实施例1制备所得丹参水溶性提取物进行动物试验。清洁级雄性SD大鼠190240g，随机分成7组，每组10只，按1.0ml/100g体重灌胃给药。本发明分为如下几个实验组(1)正常对照组给药为蒸馏水；(2)心肌缺血再灌注模型组给药为蒸馏水；(3)试验组大鼠低剂量组给药为实施例1制备所得丹参水溶性提取物，给药剂量为25mg/kg;(4)试验组大鼠中剂量组给药为实施例1制备所得丹参水溶性提取物，给药剂量为50mg/kg;(5)试验组大鼠高剂量组给药为实施例1制备所得丹参水溶性提取物，给药剂量为100mg/kg;(6)对照复方丹参滴丸组给药为复方丹参滴丸(市售)，给药剂量为72.9mg/kg;(7)对照复方丹参片组给药为复方丹参片(市售)，给药剂量为267.3mg/kg。将以上各组分别连续灌胃7天，最后一天灌胃60min后麻醉(3%戊巴比妥钠0.15ml/100g腹腔注射)并固定于手术板上。行右颈总动脉导管到颈总动脉和左心室与压力换能器相连，经放大器测量股动脉血压和左心室内压。一侧股动脉插管记录外周动脉血压。标准n导程导联与放大器相连，记录心电图，用心电R波计算心率。插气管接人工呼吸机，胸部去毛消毒，沿着锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第三或第四肋间钝性分离肌层，打开胸腔，以扩胸器扩大胸腔，剪开心包，在动脉圆锥与左心耳之间冠状动脉处结扎左冠状动脉前降支实行缺血30min再灌注120min。实验结束前取出心脏标本以PBS漂洗，去除心房及右室组织，将心脏横断面切成2mm切片，置于l呢TTC染液中染色20min(37。C)。以称重法计算梗死区重量，以梗死区重量占左室总重量的百分比表示梗死范围。表4显示模型组心肌梗塞围为14.68%,给药各组梗塞范围显著减小(与模型组比较P<0.05-0.01)。表4对心肌缺血大鼠心肌梗死范围的影响(X士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>与假手术组比较，与模型组比较，*P<0.05，**P<0,01。试验结果表明，本发明的丹参水溶性提取物对心肌缺血的大鼠心肌梗死具有明显作用，可以明显减小心肌梗死范围，25mg/Kg的丹参提取物与市售丹参类产品相比，该作用相当。权利要求1、一种丹参水溶性提取物的制备方法，其特征在于所述制备方法是将丹参药材依次进行水提、醇沉和纯化后，再在弱碱环境下进行热处理，最后浓缩得到丹参水溶性提取物。2、根据权利要求1所述丹参水溶性提取物的制备方法，其特征在于所述弱碱环境下进行热处理是指pH为6.011.0时，在65-C10(TC的温度下，处理26小时。3、根据权利要求2所述丹参水溶性提取物的制备方法，其特征在于所述弱碱环境下进行热处理是指pH为7.09.0时，在65。C100。C的温度下，处理46小时。4、根据权利要求1所述丹参水溶性提取物的制备方法，其特征在于所述制备方法的步骤如下(1)取丹参药材，粉碎，过筛后加水提取；(2)将上述提取液进行醇沉处理后，过滤，浓縮醇液；(3)将上述醇液的pH调节至1.04.0，过滤去除沉淀，取上清液；(4)通过大孔树脂对上清液进行纯化后，分别用水和醇洗脱后，收集醇洗液，浓縮；(5)将步骤(4)制备所得浓縮液在弱碱环境下进行加热处理；(6)加热处理结束后，调节体系pH至3.05.0，浓縮干燥即得丹参水溶性提取物。5、根据权利要求4所述丹参水溶性提取物的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，加水提取时加水量为丹参药材重量的612倍，提取时间为l2小时。6、根据权利要求4所述丹参水溶性提取物的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，加水提取次数为24次，将水提液合并后浓縮，浓縮至药液相对密度为1.101.50。7、根据权利要求4所述丹参水溶性提取物的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，进行醇处理时醇的加入量为水提液总体积的50%80%。8、根据权利要求4所述丹参水溶性提取物的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中，采用1.0mol/L5.0mol/L的盐酸溶液将醇液的pH调节至1.04.0。9、根据权利要求4所述丹参水溶性提取物的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中，所述大孔树脂为HPD826、D101、NKA-2或DM130中任意一种或几种的组合。10、根据权利要求4所述丹参水溶性提取物的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中，纯化时的上样量为0.51.0g丹参药材/g树脂，水洗脱量为1.53BV，醇洗脱量为35BV，收集醇洗液浓縮，至药液相对密度为1.101.50。全文摘要本发明公开一种丹参水溶性提取物的制备方法，该方法是将丹参药材依次进行传统的水提、醇沉和纯化后，再在弱碱环境下进行热处理，最后浓缩得到所需丹参水溶性提取物。本发明采用先降解再纯化的操作，只需要纯化丹酚酸B，然后利用纯化好的丹酚酸B经过碱性条件下降解得到丹参素钠，所得丹参水溶性提取物中丹参素钠的含量在10～50％，原儿茶醛的含量在2～10％，丹酚酸B的含量在3～20％。本发明只需用大孔树脂来分离纯化，分离效果好，得膏率低，且可以重复利用，纯化成本低。本发明方法操作简单，工艺重现性和可控性高，得到的丹参水溶性提取物中各成分比例较稳定，避免了提取和分离过程中丹参素钠的损失，利于工业化生产。文档编号A61K36/537GK101647858SQ200910192220公开日2010年2月17日申请日期2009年9月11日优先权日2009年9月11日发明者梁健登,贾珺璋,钱陈钦申请人:广州市和藤医药研究开发有限公司