专利名称：一种中药大青叶的质量检测方法
技术领域：
本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种中药大青叶的质量检测方法，
背景技术：
大青叶(FOLIUMISATIDIS)是十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的 干燥叶，具有清热解毒，凉血消斑之功效，用于温邪入营、高热神昏、发斑发疹、黄疸、热痢、 拃腮、喉痹、丹毒、痈肿[1]，现代药效学研究表明，大青叶具有抗菌、抗病毒、抗内毒素、免疫 增强等药理作用[2—6]，目前，对大青叶的质量控制方法主要是基于靛蓝、靛玉红等成分的定 量分析[7'8]，不足以从整体上控制大青叶的质量，作为一味临床常用中药，其真伪优劣受其 产地、采收时间以及干燥条件等诸多因素的影响，因此，有必要建立一种科学的质量检测方
法对大青叶的质量进行评价，(参考文献[l]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和
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发明内容
本发明的目的是提供一种中药大青叶的质量检测方法，该方法利用中药大青叶的 电喷雾质谱做指纹图谱，利用高效液相色谱法测定了中药大青叶中核苷和嘌呤类成分的含 量，并利用紫外-可见分光光度法测定了中药大青叶中总黄酮的含量，保证了中药大青叶 质量检测方法的科学性和质量检测的先进性。 本发明利用软电离质谱技术对中药大青叶进行检测，根据得到的中药大青叶的电
喷雾指纹图谱中特征指纹峰的个数及强度，对中药大青叶的质量进行初步评价，本发明考
虑到中药大青叶中含有多种核苷和嘌呤类成分，并且以胞苷、腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷为
主，因此本发明以这五种成分作为标准对照品，通过高效液相色谱测定，得到各标准对照品
对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测定供试样品中胞苷、腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷的含
量；本发明还考虑到中药大青叶中含有多种黄酮类成分，主要以碳苷黄酮和氧苷黄酮为主，
因此本发明利用紫外-可见分光光度法，采用芦丁作为标准对照品，硝酸铝与黄酮类化合
物形成配合物的显色原理进行测定，完成一种中药大青叶的质量检测方法， 实施本发明的技术方案如下
4
(1)供试样品溶液的制备 以大青叶为原料，称取大青叶药材饮片2-10g，加40-200mL水分别煎煮两次，每次 lh，过滤，合并滤液，加入滤液的3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓縮并干燥，得 到大青叶水提取物，将得到的大青叶水提取物加25-100mL水使溶解，加入25-100mL乙酸 乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓縮并干燥，残渣以50% (V/V)甲醇溶解并 定容至10mL摇匀，即为供试品溶液1 ;萃取后的部分加入25-100mL水饱和正丁醇分别萃 取3次，合并水饱和正丁醇萃取液，减压浓縮并干燥，残渣以60% (V/V)乙醇溶解并定容至 25mL，即为供试品溶液2，
(2)供试样品的电喷雾指纹图谱 样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到取5-10yL供试品溶液l，用甲醇稀 释至100-500 ii L，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下大气压化学电离源，正离 子电离方式，放电电流为4. 0-5. 0 ii A，气化温度350-450°C，流动注入泵进样流速3_8 y L/ min，扫描范围质荷比(m/z) 50-1000，在m/zl00-300范围内，存在m/zl20、 m/zl46、 m/zl49、 m/zl63、m/zl81、m/zl87、m/z239、m/z249、m/z263禾口 m/z279离子，
(3)核苷和嘌呤类成分含量测定 高效液相色谱实验条件如下《18色谱柱4. 6mmX250mm，5iim ;柱温20-35。C ;流 动相水和甲醇；水与甲醇体积比为90 : 10-95 : 5 ;洗脱时间15-30min ;紫外检测器检 测波长:230-280nm ;样品进样量5-20 y L ; 核苷和嘌呤类成分含量测定方法如下分别精密称取lmg的标准对照品胞苷、腺 嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加60% (V/V)乙醇定容至lOmL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10ii L进样，测得各标准 对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品 含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效 液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2 中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各 标准对照品的含量为胞苷0. 27-0. 30mg/g、腺嘌呤0. 10-0. 12mg/g、尿苷0. 54-0. 57mg/g、鸟 苷0. 31-0. 34mg/g、腺苷0. 27-0. 30mg/g ; [OOM] (4)总黄酮含量测定 总黄酮含量测定方法精密称量20mg芦丁对照品，用60% (V/V)乙醇溶解并定容 至25mL容量瓶中，摇匀，即为芦丁标准对照品溶液，备用；用移液枪精密移取芦丁对照品溶 液0、40、80、120、160、200ii L，分别置6个25mL容量瓶中，分别加入5X (m/V)亚硝酸钠水溶 液O. 2mL，摇匀，静置6min，再分别加入10% (m/V)硝酸铝水溶液O. 2mL，摇匀，静置6min，再 分别加入4% (m/V)氢氧化钠水溶液lmL，加60X (V/V)乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min， 作为待测溶液，于490-510nm波长处测定待测溶液的吸光度，以芦丁对照品溶液的吸光度 (A)为纵坐标，对应芦丁对照品的浓度(C)为横坐标做线性回归。得到芦丁对照品的标准 工作曲线和线性回归方程，然后根据供试品溶液2的吸光度和得到的芦丁对照品的标准工 作曲线，测得供试品溶液2中总黄酮的含量。根据供试样品2的质量与原生药材质量的比 例，通过计算得到中药大青叶中总黄酮的含量以芦丁计为3. 63-3. 85mg/g，完成一种中药大 青叶的质量检测方法。
有益效果本发明利用中药大青叶的电喷雾质谱作为指纹图谱，再结合高效液相 色谱对中药大青叶中核苷和嘌呤类成分的含量测定结果以及紫外_可见分光光度法对中 药大青叶中总黄酮的含量测定结果，可以对中药大青叶的质量进行评价。
图1是供试品溶液1的APCI-MS指纹图谱，
具体实施方式
实施例1 (1)供试样品溶液的制备 以大青叶为原料，称取大青叶药材饮片2g，加40mL水分别煎煮两次，每次lh，过 滤，合并滤液，加入滤液的3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓縮并干燥，得到大 青叶水提取物，将得到的大青叶水提取物加25mL水使溶解，加入25mL乙酸乙酯分别萃取3 次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓縮并干燥，残渣以50% (V/V)甲醇溶解并定容至10mL摇 匀，即为供试品溶液1 ;萃取后的部分加入25mL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和正 丁醇萃取液，减压浓縮并干燥，残渣以60% (V/V)乙醇溶解并定容至25mL，即为供试品溶液 2， (2)供试样品的电喷雾指纹图谱 样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到取5yL供试品溶液l，用甲醇稀释至 lOOi!L，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下大气压化学电离源，正离子电离方 式，放电电流为4. 0 ii A，气化温度380°C ，流动注入泵进样流速3 ii L/min，扫描范围质荷比 (m/z)50-1000，在m/z100-300范围内，存在m/zl20、 m/zl46、 m/zl49、 m/zl63、 m/zl81、 m/ zl87、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子，
(3)核苷和嘌呤类成分含量测定 高效液相色谱实验条件如下《18色谱柱4.6mmX250mm，5iim;柱温20。C ;流动 相水和甲醇；水与甲醇体积比为90 : 10-95 : 5 ;洗脱时间20min ;紫外检测器检测波 长230nm ;样品进样量20 il L ; 核苷和嘌呤类成分含量测定方法如下分别精密称取lmg的标准对照品胞苷、腺 嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加60% (V/V)乙醇定容至lOmL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10ii L进样，测得各标准 对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品 含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效 液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2 中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各 标准对照品的含量为胞苷0. 27-0. 28mg/g、腺嘌呤0. 10-0. 11mg/g、尿苷0. 55-0. 56mg/g、鸟 苷0. 31-0. 32mg/g、腺苷0. 28-0. 29mg/g，
(4)总黄酮含量测定 总黄酮含量测定方法精密称量20mg芦丁对照品，用60% (V/V)乙醇溶解并定容 至25mL容量瓶中，摇匀，即为芦丁标准对照品溶液，备用；用移液枪精密移取芦丁对照品溶
6液0、40、80、 120、 160、200 y L，分别置6个25mL容量瓶中，分别加入5% (m/V)亚硝酸水钠溶 液O. 2mL，摇匀，静置6min，再分别加入10% (m/V)硝酸铝水溶液O. 2mL，摇匀，静置6min，再 分别加入4% (m/V)氢氧化钠水溶液lmL，加60X (V/V)乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min， 作为待测溶液，于490nm波长处测定待测溶液的吸光度，以芦丁对照品溶液的吸光度(A) 为纵坐标，对应芦丁对照品的浓度(C)为横坐标做线性回归。得到芦丁对照品的标准工作 曲线和线性回归方程，然后根据供试品溶液2的吸光度和得到的芦丁对照品的标准工作曲 线，测得供试品溶液2中总黄酮的含量。根据供试样品2的质量与原生药材质量的比例，通 过计算得到中药大青叶中总黄酮的含量以芦丁计为3.65-3. 72mg/g，完成一种中药大青叶
的质量检测方法， 实施例2 (1)供试样品溶液的制备 以大青叶为原料，称取大青叶药材饮片4g，加80mL水分别煎煮两次，每次lh，过 滤，合并滤液，加入滤液的3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓縮并干燥，得到大 青叶水提取物，将得到的大青叶水提取物加50mL水使溶解，加入50mL乙酸乙酯分别萃取3 次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓縮并干燥，残渣以50% (V/V)甲醇溶解并定容至10mL摇 匀，即为供试品溶液1 ;萃取后的部分加入50mL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和正 丁醇萃取液，减压浓縮并干燥，残渣以60% (V/V)乙醇溶解并定容至25mL，即为供试品溶液 2， (2)供试样品的电喷雾指纹图谱 样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到取6yL供试品溶液l，用甲醇稀释至 150iiL，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下大气压化学电离源，正离子电离方 式，放电电流为4. 3ii A，气化温度40(TC，流动注入泵进样流速7ii L/min，扫描范围质荷比 (m/z)50-1000，在m/z100-300范围内，存在m/zl20、 m/zl46、 m/zl49、 m/zl63、 m/zl81、 m/ zl87、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子，
(3)核苷和嘌呤类成分含量测定 高效液相色谱实验条件如下《18色谱柱4.6mmX250mm，5iim;柱温30。C ;流动 相水和甲醇；水与甲醇体积比为90 : 10-90 : 10 ;洗脱时间15min ;紫外检测器检测波 长:240nm ;样品进样量:15il L ; 核苷和嘌呤类成分含量测定方法如下分别精密称取lmg的标准对照品胞苷、腺 嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加60% (V/V)乙醇定容至lOmL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10ii L进样，测得各标准 对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品 含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效 液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2 中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各 标准对照品的含量为胞苷0. 29-0. 30mg/g、腺嘌呤0. 11-0. 12mg/g、尿苷0. 56-0. 57mg/g、鸟 苷0. 32-0. 33mg/g、腺苷0. 29-0. 30mg/g，
(4)总黄酮含量测定 总黄酮含量测定方法精密称量20mg芦丁对照品，用60% (V/V)乙醇溶解并定容至25mL容量瓶中，摇匀，即为芦丁标准对照品溶液，备用；用移液枪精密移取芦丁对照品溶 液0、40、80、120、160、200ii L，分别置6个25mL容量瓶中，分别加入5X (m/V)亚硝酸水钠溶 液O. 2mL，摇匀，静置6min，再分别加入10% (m/V)硝酸铝水溶液O. 2mL，摇匀，静置6min，再 分别加入4% (m/V)氢氧化钠水溶液lmL，加60X乙醇(V/V)定容至刻度，摇匀，静置15min， 作为待测溶液，于500nm波长处测定待测溶液的吸光度，以芦丁对照品溶液的吸光度(A) 为纵坐标，对应芦丁对照品的浓度(C)为横坐标做线性回归。得到芦丁对照品的标准工作 曲线和线性回归方程，然后根据供试品溶液2的吸光度和得到的芦丁对照品的标准工作曲 线，测得供试品溶液2中总黄酮的含量。根据供试样品2的质量与原生药材质量的比例，通 过计算得到中药大青叶中总黄酮的含量以芦丁计为3. 70-3.81mg/g，完成一种中药大青叶 的质量检测方法，
实施例3
(1)供试样品溶液的制备 以大青叶为原料，称取大青叶药材饮片6g，加120mL水分别煎煮两次，每次lh，过 滤，合并滤液，加入滤液的3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓縮并干燥，得到大 青叶水提取物，将得到的大青叶水提取物加50mL水使溶解，加入50mL乙酸乙酯分别萃取3 次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓縮并干燥，残渣以50% (V/V)甲醇溶解并定容至10mL摇 匀，即为供试品溶液1 ;萃取后的部分加入50mL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和正 丁醇萃取液，减压浓縮并干燥，残渣以60% (V/V)乙醇溶解并定容至25mL，即为供试品溶液 2， (2)供试样品的电喷雾指纹图谱 样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到取8yL供试品溶液l，用甲醇稀释至 250iiL，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下大气压化学电离源，正离子电离方 式，放电电流为4. 2 ii A，气化温度450°C ，流动注入泵进样流速5 y L/min，扫描范围质荷比 (m/z)50-1000，在m/z100-300范围内，存在m/zl20、 m/zl46、 m/zl49、 m/zl63、 m/zl81、 m/ zl87、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子，
(3)核苷和嘌呤类成分含量测定 高效液相色谱实验条件如下《18色谱柱4.6mmX250mm，5iim;柱温25。C ;流动 相水和甲醇；水与甲醇体积比为95 : 5-95 : 5 ;洗脱时间30min ;紫外检测器检测波长 254nm ;样品进样量10ii L ; 核苷和嘌呤类成分含量测定方法如下分别精密称取lmg的标准对照品胞苷、腺 嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加60% (V/V)乙醇定容至lOmL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、 10 y L进样，测得各标准 对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品 含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效 液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2 中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各 标准对照品的含量为胞苷0. 28-0. 29mg/g、腺嘌呤0. 10-0. 11mg/g、尿苷0. 55-0. 56mg/g、鸟 苷0. 31-0. 32mg/g、腺苷0. 27-0. 28mg/g，
(4)总黄酮含量测定
总黄酮含量测定方法精密称量20mg芦丁对照品，用60% (V/V)乙醇溶解并定容 至25mL容量瓶中，摇匀，即为芦丁标准对照品溶液，备用；用移液枪精密移取芦丁对照品溶 液0、40、80、120、160、200ii L，分别置6个25mL容量瓶中，分别加入5X (m/V)亚硝酸水钠溶 液O. 2mL，摇匀，静置6min，再分别加入10% (m/V)硝酸铝水溶液O. 2mL，摇匀，静置6min，再 分别加入4% (m/V)氢氧化钠水溶液lmL，加60X (V/V)乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min， 作为待测溶液，于500nm波长处测定待测溶液的吸光度，以芦丁对照品溶液的吸光度(A) 为纵坐标，对应芦丁对照品的浓度(C)为横坐标做线性回归。得到芦丁对照品的标准工作 曲线和线性回归方程，然后根据供试品溶液2的吸光度和得到的芦丁对照品的标准工作曲 线，测得供试品溶液2中总黄酮的含量。根据供试样品2的质量与原生药材质量的比例，通 过计算得到中药大青叶中总黄酮的含量以芦丁计为3. 77-3. 85mg/g，完成一种中药大青叶
的质量检测方法， 实施例4 (1)供试样品溶液的制备 以大青叶为原料，称取大青叶药材饮片8g，加160mL水分别煎煮两次，每次lh，过 滤，合并滤液，加入滤液的3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓縮并干燥，得到大 青叶水提取物，将得到的大青叶水提取物加100mL水使溶解，加入100mL乙酸乙酯分别萃取 3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓縮并干燥，残渣以50% (V/V)甲醇溶解并定容至10mL摇 匀，即为供试品溶液1 ;萃取后的部分加入100mL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和 正丁醇萃取液，减压浓縮并干燥，残渣以60% (V/V)乙醇溶解并定容至25mL，即为供试品溶 液2， (2)供试样品的电喷雾指纹图谱 样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到取9yL供试品溶液l，用甲醇稀释至 400iiL，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下大气压化学电离源，正离子电离方 式，放电电流为4. 1 ii A，气化温度420°C ，流动注入泵进样流速6 ii L/min，扫描范围质荷比 (m/z)50-1000，在m/z100-300范围内，存在m/zl20、 m/zl46、 m/zl49、 m/zl63、 m/zl81、 m/ zl87、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子，
(3)核苷和嘌呤类成分含量测定 核苷和嘌呤类成分含量测定方法如下分别精密称取lmg的标准对照品胞苷、腺 嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加60% (V/V)乙醇定容至lOmL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10ii L进样，测得各标准 对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品 含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效 液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2 中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各 标准对照品的含量为胞苷0. 28-0. 29mg/g、腺嘌呤0. 10-0. 11mg/g、尿苷0. 56-0. 57mg/g、鸟 苷0. 33-0. 34mg/g、腺苷0. 29-0. 30mg/g，
9[ooeo](4)总黄酮含量测定 总黄酮含量测定方法精密称量20mg芦丁对照品，用60% (V/V)乙醇溶解并定容 至25mL容量瓶中，摇匀，即为芦丁标准对照品溶液，备用；用移液枪精密移取芦丁对照品溶 液0、40、80、120、160、200ii L，分别置6个25mL容量瓶中，分别加入5X (m/V)亚硝酸水钠溶 液O. 2mL，摇匀，静置6min，再分别加入10% (m/V)硝酸铝水溶液O. 2mL，摇匀，静置6min，再 分别加入4% (m/V)氢氧化钠水溶液lmL，加60X (V/V)乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min， 作为待测溶液，于510nm波长处测定待测溶液的吸光度，以芦丁对照品溶液的吸光度(A) 为纵坐标，对应芦丁对照品的浓度(C)为横坐标做线性回归。得到芦丁对照品的标准工作 曲线和线性回归方程，然后根据供试品溶液2的吸光度和得到的芦丁对照品的标准工作曲 线，测得供试品溶液2中总黄酮的含量。根据供试样品2的质量与原生药材质量的比例，通 过计算得到中药大青叶中总黄酮的含量以芦丁计为3. 63-3. 75mg/g，完成一种中药大青叶
的质量检测方法， 实施例5 (1)供试样品溶液的制备 以大青叶为原料，称取大青叶药材饮片10g，加200mL水分别煎煮两次，每次lh，过 滤，合并滤液，加入滤液的3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓縮并干燥，得到大 青叶水提取物，将得到的大青叶水提取物加100mL水使溶解，加入100mL乙酸乙酯分别萃取 3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓縮并干燥，残渣以50% (V/V)甲醇溶解并定容至10mL摇 匀，即为供试品溶液1 ;萃取后的部分加入lOOmL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和 正丁醇萃取液，减压浓縮并干燥，残渣以60% (V/V)乙醇溶解并定容至25mL，即为供试品溶 液2， (2)供试样品的电喷雾指纹图谱 样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到取lOyL供试品溶液l，用甲醇稀释 至500 ii L，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下大气压化学电离源，正离子电离 方式，放电电流为4. 5 ii A，气化温度350°C ，流动注入泵进样流速8 y L/min，扫描范围质荷 比(m/z) 50-1000，在m/zl00-300范围内，存在m/zl20、m/zl46、m/zl49、m/zl63、m/zl81、m/ zl87、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子，
(3)核苷和嘌呤类成分含量测定 高效液相色谱实验条件如下《18色谱柱4.6mmX250mm，5iim;柱温25。C ;流动 相水和甲醇；水与甲醇体积比为95 : 5-95 : 5 ;洗脱时间30min ;紫外检测器检测波长 280nm ;样品进样量5ii L ; 核苷和嘌呤类成分含量测定方法如下分别精密称取lmg的标准对照品胞苷、腺 嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加60% (V/V)乙醇定容至lOmL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10ii L进样，测得各标准 对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品 含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效 液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2 中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各 标准对照品的含量为胞苷0. 27-0. 28mg/g、腺嘌呤0. 10-0. 11mg/g、尿苷0. 54-0. 55mg/g、鸟苷0. 31-0. 32mg/g、腺苷0. 27-0. 28mg/g， [OO71] (4)总黄酮含量测定 总黄酮含量测定方法精密称量20mg芦丁对照品，用60% (V/V)乙醇溶解并定容 至25mL容量瓶中，摇匀，即为芦丁标准对照品溶液，备用；用移液枪精密移取芦丁对照品溶 液0、40、80、120、160、200ii L，分别置6个25mL容量瓶中，分别加入5X (m/V)亚硝酸水钠溶 液O. 2mL，摇匀，静置6min，再分别加入10% (m/V)硝酸铝水溶液O. 2mL，摇匀，静置6min，再 分别加入4% (m/V)氢氧化钠水溶液lmL，加60X (V/V)乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min， 作为待测溶液，于500nm波长处测定待测溶液的吸光度，以芦丁对照品溶液的吸光度(A) 为纵坐标，对应芦丁对照品的浓度(C)为横坐标做线性回归。得到芦丁对照品的标准工作 曲线和线性回归方程，然后根据供试品溶液2的吸光度和得到的芦丁对照品的标准工作曲 线，测得供试品溶液2中总黄酮的含量。根据供试样品2的质量与原生药材质量的比例，通 过计算得到中药大青叶中总黄酮的含量以芦丁计为3. 76-3. 84mg/g，完成一种中药大青叶 的质量检测方法。
1权利要求
一种中药大青叶的质量检测方法，其特征在于步骤和条件如下(1)供试样品溶液的制备以大青叶为原料，称取大青叶药材饮片2-10g，加40-200mL水分别煎煮两次，每次1h，过滤，合并滤液，加入滤液的3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓缩并干燥，得到大青叶水提取物，将得到的大青叶水提取物加25-100mL水使溶解，加入25-100mL乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL摇匀，即为供试品溶液1；萃取后的部分加入25-100mL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和正丁醇萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以60％(V/V)乙醇溶解并定容至25mL，即为供试品溶液2；(2)供试样品的电喷雾指纹图谱样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到取5-10μL供试品溶液1，用甲醇稀释至100-500μL，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下大气压化学电离源，正离子电离方式，放电电流为4.0-5.0μA，气化温度350-450℃，流动注入泵进样流速3-8μL/min，扫描范围质荷比(m/z)50-1000，在m/z100-300范围内，存在m/z120、m/z146、m/z149、m/z163、m/z181、m/z187、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子；(3)核苷和嘌呤类成分含量测定高效液相色谱实验条件如下C18色谱柱4.6mm×250mm，5μm；柱温20-35℃；流动相水和甲醇；水与甲醇体积比为90∶10-95∶5；洗脱时间15-30min；紫外检测器检测波长230-280nm；样品进样量5-20μL；核苷和嘌呤类成分含量测定方法如下分别精密称取1mg的标准对照品胞苷、腺嘌呤、尿苷、尿苷和腺苷，加60％(V/V)乙醇定容至10mL容量瓶中，配成标准对照品溶液；高效液相色谱测定各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10μL进样，测得各标准对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各标准对照品的含量为胞苷0.27-0.30mg/g、腺嘌呤0.10-0.12mg/g、尿苷0.54-0.57mg/g、鸟苷0.31-0.34mg/g、腺苷0.27-0.30mg/g；(4)总黄酮含量测定总黄酮含量测定方法精密称量20mg芦丁对照品，用60％(V/V)乙醇溶解并定容至25mL容量瓶中，摇匀，即为芦丁标准对照品溶液，备用；用移液枪精密移取芦丁对照品溶液0、40、80、120、160、200μL，分别置6个25mL容量瓶中，分别加入5％(m/V)亚硝酸水钠溶液0.2mL，摇匀，静置6min，再分别加入10％(m/V)硝酸铝水溶液0.2mL，摇匀，静置6min，再分别加入4％(m/V)氢氧化钠水溶液1mL，加60％(V/V)乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min，作为待测溶液，于490-510nm波长处测定待测溶液的吸光度，以芦丁对照品溶液的吸光度(A)为纵坐标，对应芦丁对照品的浓度(C)为横坐标做线性回归。得到芦丁对照品的标准工作曲线和线性回归方程，然后根据供试品溶液2的吸光度和得到的芦丁对照品的标准工作曲线，测得供试品溶液2中总黄酮的含量。根据供试样品2的质量与原生药材质量的比例，通过计算得到中药大青叶中总黄酮的含量以芦丁计为3.63-3.85mg/g，完成一种中药大青叶的质量检测方法。
全文摘要
本发明提供了一种中药大青叶的质量检测方法，经水提取，乙醇处理，乙酸乙酯和水饱和正丁醇依次萃取、浓缩、定容等样品前处理手段将中药大青叶处理后，通过电喷雾质谱得到中药大青叶的指纹图谱；利用高效液相色谱法测定中药大青叶中核苷和嘌呤类成分的含量；利用紫外-可见分光光度法测定中药大青叶中总黄酮的含量，综合其指纹图谱及含量测定数据，可以对中药大青叶的质量进行评价，该质量检测方法准确、快捷、方便、有效。
文档编号A61P31/04GK101732392SQ20091021807
公开日2010年6月16日 申请日期2009年12月21日 优先权日2009年12月21日
发明者刘志强, 刘忠英, 刘舒, 宋凤瑞, 皮子凤, 闫峻 申请人:中国科学院长春应用化学研究所