抗-β-2-微球蛋白试剂及其用途的制作方法

专利名称：抗-β-2-微球蛋白试剂及其用途的制作方法
抗-β -2-微球蛋白试剂及其用途相关申请的交叉引用本PCT申请要求提交于2008年8月7日的美国临时专利申请No. 61/087，093 ；及提交于2009年3月18日的美国临时专利申请No. 61/161，298的优先权。发明背景
技术领域：
本发明总得涉及用于治疗癌的方法，及更特别涉及用抑制β 2-微球蛋白功能的试剂(例如，抗体)治疗癌的方法。
背景技术：
β 2-微球蛋白(β2_Μ)是包含119个氨基酸残基的非-糖基化的蛋白，其有99个氨基酸长的分泌型，其具有11. SKDa的分子质量。β 2-Μ由全部有核的细胞合成，及其可与主要组织相容性复合物(MHC)HLA I类抗原的α链形成三级复合物。因为β2_Μ未稳固锚定在细胞膜，其可从细胞释放，及与游离的细胞外β2-Μ蛋白交换。β 2-Μ长期被认为是贡献于宿主免疫的最重要的因子之一。随着癌细胞成为免疫-逃避，HLA I类抗原损失，使癌细胞逃逸攻击性细胞毒性T细胞，及降低细胞结合型的 β 2-Μ蛋白的稳定-状态水平。但是，已在许多液体肿瘤(例如，淋巴瘤，白血病，及多发性骨髓瘤)及实体瘤(例如，前列腺，乳腺，肾，及消化道)中报道了增加的血清或尿β2-Μ。 有时，血清β 2-Μ水平可与无关于患者的肾功能的差的预后相关。其他情况中，尿β2-Μ水平与前列腺癌患者中差的存活相关。例如，β 2-Μ蛋白表达可直接通过雄激素调节。临床样本中的β2_Μ表达水平与前列腺癌患者中的前列腺癌Gleason分值及转移性状态相关。此外，β2-Μ可为促进培养中的前列腺癌细胞生长及加速小鼠骨中的前列腺肿瘤生长的主要生长因子及细胞信号转导分子。除了人前列腺癌之外，β2-Μ是人肾癌细胞中的主要生长因子及信号转导分子。 这些结果被下列观察所支持1) β 2-Μ由人雄激素-敏感性LNCaP前列腺癌细胞响应雄激素刺激而分泌；2)作为用于评定雄激素应答的标记物，β 2-Μ可相比前列腺-特异性抗原 (PSA)(良好-建立的雄激素-应答性靶)更特异；幻血清及组织β 2-Μ水平与人前列腺癌的Gleason分值及转移性状态相关；4)在人前列腺及肾癌细胞两者中，β 2-Μ显示是有力的生长因子及信号转导分子，及这些细胞中β 2-Μ的过表达驱使它们在实验模型中归巢到骨。β2_Μ也可通过活化一些重要的信号转导分子(例如膦酸肌醇3-激酶 (PUK-Akt)，促细胞分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)，及细胞周期蛋白)来支持正常成骨细胞，大鼠及小鼠间质成纤维细胞，及癌细胞的生长。β 2-Μ可通过增加存活素及雄激素受体的表达来活化存活。此外，β 2-Μ可通过增加VEGF及神经毡蛋白(VEGF受体)的表达来促进血管发生，通过胱天蛋白酶的降低的活化及JNK信号转导活化来降低细胞死亡信号转导，及通过活化NF-κ B配体(RANKL)的受体活化子来增加骨更新。
抗-β 2-M mAbs可通过特异性地靶向β 2_Μ_介导的下游多效信号转导通路来用作治疗性抗体。例如，抗-β 2-M mAbs可在前列腺及肾癌中调节Pi:3K-AKT-，MAPK-，雄激素受体(Al )，及血管内皮生长因子(VEGF)-介导的存活信号转导通路。此外，抗-β2-Μ mAbs 可阻断多发性骨髓瘤及白血病中由生长因子及趋化因子活化的生长及存活信号转导通路。基于以下观察，抗-β 2-M mAbs治疗不可产生不期望的副作用(1)相比表达完整的β 2-M的对照动物，经β 2-M敲落的免疫活性小鼠(生物化学上相当于用抗-β 2-M mAbs 长期处理的小鼠)存活及体重增加。一些β 2-M敲落小鼠发展弱的自身免疫综合征，但总体 β 2-M敲落未显著影响同窝动物的生命期望。(2)抗-β2-Μ mAbs治疗不妥协生命器官中正常细胞的生长及存活地导致癌细胞生长的显著降低。用抗_β2-Μ mAbs治疗的免疫-缺陷型小鼠中观察不到急性毒性或死亡。(3)抗-β 2-M mAbs也引发直接的对无明显的针对正常细胞(例如人血细胞，免疫妥协的小鼠中移植的淋巴细胞，及培养的正常人前列腺上皮细胞及成纤维细胞)的毒性的癌细胞的细胞毒性效应。β 2-M蛋白可与I类MHC典型及非-典型蛋白形成复合物。β 2_Μ也可测定这些蛋白的细胞表面表达。恶性转化之时，MHC I类典型蛋白的表达可降低。β2-Μ作用可由非-典型MHC-样蛋白介导。目的是所述非-典型MHC-样分子，血色素沉着症基因(HFE) (图1)。血色素沉着症是可导致铁过载的常染色体隐性遗传病症。结果，其可导致肝脏硬化，糖尿病，皮肤的黑色素过多色素沉着，心力衰竭，及肝脏癌。与许多形式的此病症相关的一个显著的特征是HFE突变。β 2-M及HFE敲除小鼠及血色素沉着症患者有时具有促性腺激素低下性性腺功能减退症。这些病例中β 2-M信号转导的降低导致前列腺退行。β 2-M可与HFE相互作用及活化下游信号转导通路。几条证据支持HFE (而非1类 MHC抗原)是推定的β 2-M受体的观点。例如，⑴β 2-M可在具有不可检测水平的I类MHC 分子的前列腺癌细胞中促进生长，及活化下游信号转导。而且，如通过流式细胞术及蛋白印迹测定，前列腺癌细胞中由抗-β 2-M mAbs诱导的抑制程度可与I类MHC的细胞表面表达反相关。( 不像I类MHC复合物，其可在恶性转化中被下调，HFE表达在多种正常细胞及癌细胞中仍稳定。癌细胞与正常细胞之间的对抗-β 2-M mAbs-诱导的细胞毒性的差动灵敏度可通过相比正常细胞，癌细胞中更高水平的转铁蛋白受体I(TFRC)-转铁蛋白(TF)复合物来解释。03)抗-β2-Μ mAbs-诱导的前列腺癌细胞死亡可被铁清除剂，去铁胺衰减，提示，抗-β 2-M mAbs治疗可诱导铁过载。(4) β 2-M/HFE复合物可使用抗-β 2-M mAbs共免疫沉淀。(5)使用慢病毒HFE序列-特异性siRNAs的HFE-敲落消除抗-β 2-M mAbs体外诱导前列腺癌细胞死亡的能力，提示，抗- β 2-M mAbs-诱导的细胞死亡要求HFE。此外，β 2-M/HFE复合物已知与转铁蛋白受体相互作用，及发挥通过抑制TFRC功能的铁摄取负调节剂的作用(图1)。TFRC是多数细胞中铁摄取的主途径。TFRC结合转移 (TF)，其含铁。TFRC/TF经历内体再循环及将铁释放到细胞中。TF是TFRC的激动剂，然而 β 2-M/HFE复合物是TFRC的拮抗剂。因此，β 2-M/HFE复合物的缺乏，例如在遗传性血色素沉着症患者中，可导致增加的TFRC活性所致的铁过载。类似地，抗-β2-Μ mAbs治疗可诱导铁过载。其可通过灭活0 2-M/HFE复合物而作为TFRC的拮抗剂而导致。结果，可在前列腺癌细胞中诱导铁过载(图1)。如所期望，此效应可通过铁清除剂部分反转。重要的是， 抗-β 2-M mAbs-诱导的细胞毒性可在正常细胞中最小化，因为正常细胞表达低或不可检测水平的TFRC。相反，TFRC活性可对于癌细胞生长关键，其可要求用于细胞分裂的铁的丰富的供给。因此，通过使用抗-β 2-M mAbs过-活化癌细胞中的TFRC可导致过量的铁过载及活性氧类别(ROS)产生，其可导致降低的DNA修复及导致凋亡的增加的DNA损伤(图1)。 因此，抗-β2-Μ mAbs可用于特异性地靶向癌细胞，及不靶向正常细胞。当β2-Μ_介导的多效细胞信号转导通路由抗-β2_Μ抗体(多克隆或单克隆抗体)打断时，结果可为癌细胞中，但不是正常细胞中大量细胞死亡。例如，在多发性骨髓瘤 (骨癌)中，抗-β2-Μ mAbs治疗可不影响正常细胞地导致大量人及小鼠骨髓瘤细胞死亡。 此外，抗-β 2-M抗体可经由通过例如，下调存活因子，雄激素受体(AR)，及其靶基因(例如， 前列腺特异性抗原(PSA)及存活素)消除存活信号转导来在人前列腺及肾癌细胞中、以及在小鼠中生长的建立的前列腺肿瘤中诱导凋亡。在不表达AR或PSA的细胞内，抗-β 2-Μ 抗体可导致癌细胞中的氧化应激，凋亡及下调的存活信号转导。总之，这些发现作为开发改善的癌治疗的科学基础，例如，治疗人前列腺及肾癌骨及内脏器官转移，其中癌细胞可特异性地靶向，及对于正常细胞的副作用可最小化。发明概述本发明的一方面涉及用于治疗癌的方法。根据本发明的一实施方式的方法包括 用针对β 2-Μ的试剂治疗受试者，及用辐射或化学治疗剂治疗受试者。针对β2-Μ的试剂可为抗体(多克隆或单克隆)或miRNA。本发明的另一方面涉及癌治疗用试剂盒。根据本发明的一实施方式的试剂盒包括针对β 2-Μ的试剂及化学治疗剂。针对β 2-Μ的试剂可为抗体(多克隆或单克隆)或 miRNAο本发明的其他方面及优点将从以下说明及随附的权利要求显而易见。
图1是图示本发明的一些实施方式的潜在机理的示意图。图2显示根据本发明的一实施方式治疗后对前列腺癌细胞的克隆存活的效应。图3显示根据本发明的另一实施方式治疗后对前列腺癌细胞的克隆存活的效应。图4显示根据本发明的另一实施方式治疗后对前列腺肿瘤生长的效应。图5显示根据本发明的另一实施方式治疗后对蛋白表达的效应。图6显示根据本发明的另一实施方式治疗后对微RNA表达的效应。图7显示根据本发明的一实施方式治疗后对C4_2B(KD)细胞增殖的效应。图8显示根据本发明的另一实施方式治疗后对C4_2B(KD)细胞增殖的效应。图9显示根据本发明的另一实施方式治疗后对C4_2B(KD)细胞增殖的效应。图10显示根据本发明的另一实施方式治疗后对C4_2B(KD)细胞增殖的效应。图11显示根据本发明的另一实施方式治疗后对C4_2B(KD)细胞增殖的效应。图12显示根据本发明的另一实施方式治疗后对PC-3细胞增殖的效应。图13显示根据本发明的另一实施方式治疗后对PC-3细胞增殖的效应。图14显示根据本发明的另一实施方式治疗后对PC-3细胞增殖的效应。图15显示根据本发明的另一实施方式治疗后对PC-3细胞增殖的效应。图16显示根据本发明的另一实施方式治疗后对PC-3细胞增殖的效应。图17显示根据本发明的另一实施方式治疗后对PC-3细胞增殖的效应。
图18显示根据本发明的另一实施方式治疗后对PC-3细胞增殖的效应。图19显示根据本发明的另一实施方式治疗后对PC-3细胞增殖的效应。图20显示根据本发明的另一实施方式治疗后对PC-3细胞增殖的效应。图21显示根据本发明的另一实施方式治疗后对PC-3细胞增殖的效应。图22显示野生型C57BL/6小鼠，用IgG抗体处理的TRAMP小鼠及用根据本发明的另一实施方式的抗-β 2-M抗体处理的TRAMP小鼠中前列腺肿瘤的近红外成像。图23显示在野生型C57BL/6小鼠，用IgG抗体处理的TRAMP小鼠及用根据本发明的另一实施方式的抗-β 2-Μ抗体处理的TRAMP小鼠中，抗体处理对免疫活性脾脏中免疫细胞数的效应。发明详述本发明的实施方式涉及用于使用针对β 2-Μ的试剂治疗癌的方法。本发明的一些实施方式涉及用于用针对β 2-Μ的试剂与癌治疗的另一模式(例如辐射或化学治疗剂)联合治疗癌的方法。所述联合治疗中，由于通过针对β 2-Μ的试剂的癌细胞致敏，可得到协同效应，导致更有效治疗及/或更低毒性。本发明的实施方式可将应用于任意类型的癌及任意类型的抗肿瘤剂(辐射或化学治疗剂)。为清楚起见，以下说明将主要使用前列腺癌及抗肿瘤剂，例如临床中使用的辐射及一些常见的化学治疗药。但是，本领域技术人员将认同，相同方法可将应用于其他类型的癌，例如乳腺，肺，肾及骨肉瘤癌，及它们的组合；及其他类型的化学治疗剂，例如治疗性抗体，小分子药物，基于核酸的药物，及基于肽的药物。本发明的实施方式可包括抗-β 2-M mAbs与化学治疗剂组合用于治疗各种癌(包括前列腺，乳腺，肺，肾，及骨肉瘤癌，及它们的组合)的用途。可将与抗2-M抗体组合的化学治疗剂可包括，但不限于，PS-341，吉西他滨，顺钼，多柔比星，泰素帝，VP-16(依托泊苷，Etopophos ，或Vepesid )，17-AAG (17-去甲氧基格尔德霉素)等。各这些化学治疗剂的特异性活性均为本领域普通技术人员熟知。例如，泰素帝可稳定微管蛋白及，因此， 抑制有丝分裂。吉西他滨可抑制DNA延伸。多柔比星及VP-16可抑制拓扑异构酶II功能。 顺钼可通过鳌合DNA抑制DNA合成。PS-341 (硼替佐米，蛋白酶体抑制剂)可抑制NF- κ B 活化及细胞存活。17-AAG可抑制热激蛋白90(HSP90)功能。这些化学治疗剂在本文仅以说明目的使用。但是，本领域技术人员基于本发明的实施方式将认同，其他化学治疗剂也可将与抗-β 2-Μ抗体组合用于治疗各种类型的癌。抗-β 2-M mAbs致敏前列腺癌细胞于辐射-诱导的体外及体内细胞死亡。抗-β 2-M抗体(多克隆或单克隆抗体)已发现抑制肿瘤生长，及是用于各癌治疗或预防的潜在的治疗剂。例如，图2显示克隆形成测定中抗-β 2-M mAbs对前列腺癌细胞G 种攻击性雄激素-独立性前列腺癌细胞系，例如，ARCaPM，C4-2，PC-3，及DU145)的效应。此研究中，将细胞用的抗-β2-Μ mAbs处理48h。结果显示，相比其他细胞系，ARCaPM 可更抵抗抗-β 2-M mAbs治疗，然而DU145细胞相比其他细胞系更敏感。不过，抗-β2_Μ mAbs有效抵抗全部这些癌细胞。从显示于图2的结果来看，显然，抗-β 2-M mAbs有效抵抗各癌细胞。此外，发明人发现，抗-β 2-M mAbs可用于增强其他癌治疗模式的治疗性功效。例如，图3显示，抗-β 2-Μ mAbs治疗致敏ARCaPM，PC-3及C4-2攻击性前列腺癌细胞于辐射-介导的细胞杀伤。
在显示于图3的研究中，将前列腺癌细胞用抗-β 2-M mAbs (3 μ g/ml)处理48h，然后以不同剂量电离辐射治疗。然后在辐射治疗后进行克隆形成测定。结果显示，在全部攻击性前列腺癌细胞系中组合的抗-β 2-M mAbs与辐射治疗增加细胞死亡达100倍。例如， DU-145细胞，其已知相对抗辐射，致使相比其他人前列腺癌细胞更敏感于辐射(无细胞存活)。类似辐射致敏研究可通过在动物模型(例如，使用ARCaPsi肿瘤的人前列腺癌异种移植物)中体内组合辐射与抗-β 2-M mAbs来进行(见以下图4)。图4显示，相比对照治疗，用单个注射的抗-β 2-M mAbs (20 μ g/ml)与辐射的联合治疗可抑制肿瘤生长。简言之，给小鼠在两肋皮下注射ARCaPsi细胞。当肿瘤达到4mm3尺寸时，在gelform 中用IgG或抗-β2-Μ mAbs处理肿瘤。可将gelform 浸入20 μ g/ml 的抗体，及手术移植到肿瘤附近。M小时之后，将肿瘤以15Gy照射。随后每周监控肿瘤体积。肿瘤再-生长测定测量初始治疗后肿瘤达到150mm3的体积所需的时间。图4中的结果显示对照肿瘤快速再-生长(约4天)，然而经抗- β 2-MmAbs及辐射处理的肿瘤生长显著延迟(约16天)。抗-β2-Μ mAbs/辐射联合治疗在7个不同肿瘤位点阻止生长。单独用抗-β2-Μ mAbs治疗(约12天)或单独用辐射治疗(约8天)不那么有效。重要的是，抗-β2-Μ mAbs治疗不对小鼠创建毒性副作用。这些结果可显著，因为抗-β 2-M mAbs可普遍地致敏激素难治性转移性前列腺癌细胞于放射治疗。因此，抗-β 2-Μ mAbs/辐射联合治疗可代表用于治疗转移性前列腺癌的有希望的新模式。为了解抗-β2_Μ mAbs单独或组合的作用机理，研究了各蛋白表达的变化。尤其是，发现TFRC，β 2-M，及凋亡蛋白的表达改变。例如，图5显示，在模拟体内肿瘤的ARCaPsi 前列腺癌类器官(3D模型)中，TFRC表达应答抗-β 2-M mAbs，辐射，及组合的抗-β 2-Μ mAbs/辐射治疗而改变。这些研究中，ARCaPsi细胞在3D旋转壁容器中生长48h，以形成类器官。将这些类器官用抗-β2-Μ mAbs (5 μ g/ml)处理Mh，然后以4Gy辐射。在辐射后Mh 时裂解细胞，然后进行蛋白印迹分析。相比对照，在全部3种治疗中β2-Μ蛋白水平降低。 而抗-β2-Μ mAbs治疗降低TFRC水平，辐射治疗实际上增加了 TFRC水平。重要的是，用抗-β 2-M mAbs前处理阻断响应辐射的TFRC表达诱导。这些观察与TFRC的涉及一致，如图1中所示。此外，某些凋亡蛋白，例如胱天蛋白酶9及3，通过联合治疗，但不通过分离的抗-β2-Μ mAbs或辐射治疗显著增加。此结果提示，使用抗-β 2-M mAbs与辐射(及其他癌治疗模式)的联合治疗诱导肿瘤细胞凋亡。除了蛋白表达变化之外，抗-β2_Μ mAbs也上调ARCaPsi细胞中的miRNA。微 RNA(miRNA)可为基因表达的转录后调节剂。通过结合到mRNAs，这些miRNA可通过抑制 mRNAs的翻译和/或增加mRNAs的降解来影响基因表达。各miRNA可靶向几种mRNAs。MiRNA筛选可通过多次进行定量实时PCR分析来进行。使用高度敏感性多次进行的，定量实时PCR，可测试来自前列腺癌细胞系的90种诱导性miRNA。简言之，抗-β2_Μ mAbs治疗(3 μ g/ml)后可监控一组90种miRNA的表达水平变化。例如，细胞可处理Mh， 然后提取miRNA。可将RNU6B用作内部对照，因为组之间其表达水平无变化。将ARCaPE细胞用作对照，用于ARCaP细胞的上皮变体。miRNA表达水平变化可表示为倍数变化。结果显示某些miRNA的表达水平变化。如图6中所示，抗-β 2-M mAbs治疗特异性地增力miR_135b，miR-200a,及miR-200b水平。这些miRNA的上调导致控制细胞周期及转移的基因(例如低氧诱导性因子-Ia (HIF-Ia)，细胞周期蛋白D2，pim2，磷脂酶Cy 1，TFRC，^Bl及的下调。注意，这些抗-β 2-M mAbs-诱导的miRNA可发挥类似于抗-β 2_M mAbs的β 2_Μ拮抗剂的作用。即，这些miRNA本身可用作对抗β2-Μ功能的试剂。miR-135b的重要性可归因于其下调癌基因及生长/转移相关的基因(例如， HIF-Ia，细胞周期蛋白D2，pim-2，及磷脂酶CyI)的能力。与此观点一致，C4-2及C4-2B 骨转移性LNCaP人前列腺癌上皮变体相比PrEC(正常人前列腺上皮细胞系)表达少100 倍的miR-135b。因此，抗-β 2-M mAbs治疗可增加miR_135b水平，其进而可降低内源性 HIF-IamRNA水平。与HIF-I α可相关于辐射抗性的发现一致，HIF-I α抑制剂(例如， miR-135b)可在C4-2细胞中响应辐射降低10倍。此外，在ARCaPM 3-D类器官中可观察到 HIF-Ia表达响应辐射增加。因此，抗-β2-Μ mAbs可通过上调miR_135b增强辐射致敏，其进而可下调HIF-I α，致使细胞敏感于辐射。此可为抗-β 2-MmAbs可与辐射协同而促进癌细胞死亡的机理之一。miR-200家族成员的表达可通过在ARCaPM前列腺癌细胞中的抗-β 2-M mAbs处理来特异性地诱导。miR-200家族成员也可靶向TFRC。miR-200家族成员的其他靶包括控制上皮至间叶转变(EMT)及转移的基因，例如^Bl，ZEB2，神经毡蛋白，及其他。如所述， 抗- β 2-MmAbs可通过增加miR-200的表达水平来抑制^Bl及^B2。EMT中E-钙粘蛋白的降低可贡献于细胞运动性及侵袭性。因为ZEBl及发挥E-钙粘蛋白的抑制剂的作用，由miR-200家族成员的观Bl及观82抑制可，因此，恢复E-钙粘蛋白。结果，EMT可被抑制，及间叶至上皮转变(MET)被促进。因此，抗-β 2-M mAbs可通过抑制EMT用于选择性地靶向前列腺癌细胞。miR-200也可下调TFRC。因此，抗-β2_Μ mAbs治疗可通过兼上调 miR-200家族及下调TFRC(其可相关于辐射抗性)致敏前列腺癌细胞于辐射。因为抗-β 2-M mAbs及辐射对TFRC的相反的效应(图5)，癌杀伤可通过基于细胞中TFRC的诱导及铁-调节的氧化还原信号转导适当调度用于抗2-M mAbs及辐射的递送来最大化。以上显示，抗-β2_Μ mAbs及辐射治疗的组合可产生增强的抗-肿瘤效应。涉及抗-β2-Μ mAb效应的机理明显不依赖于辐射或任何特定抗-癌治疗模式。因此，预计抗-β2-Μ mAbs致敏癌细胞于其他抗癌剂的能力应等同应用于与其他抗癌剂(包括化学治疗剂)的联合治疗。为显示这正确，以下描述展示使用抗2-M mAbs与其他化学治疗剂的联合治疗的协同效应的实验。特别是，使用抗_β2-Μ mAbs与化学治疗剂，以及在β2-Μ 敲落(KD)细胞中使用化学治疗剂显示协同效应。β2-Μ敲落模拟抗-β2-Μ mAbs的效应。例如，雄激素-独立性及雄激素受体-阴性人前列腺癌细胞系(PC-3)及β 2-M-敲落雄激素-独立性细胞系(C4-2B)可用于展示协同作用。例如，可将每孔6千(6，000)细胞平铺于96孔平板，其可培养于含1 % DCC-FBS (葡聚糖-包被的，炭-处理的胎牛血清)的培养基(C4-2B)或无血清T培养基( 03)，在5%0)2于371过夜。然后可将细胞用抗_ β 2-M mAbs处理48h。然后可将化学治疗剂(例如PS-341，吉西他滨，顺钼，多柔比星，泰素帝，或 17-AAG)加入培养基。处理后2到4天时，细胞生长可使用CellTiter96含水One溶液细胞增殖测定(!Iomega)根据生产商的使用说明通过MTS测定来测定。来自这些用各化学治疗剂的实验的结果显示于图7-21。
相比在正常小鼠中的效应，发现在β 2-Μ-敲落小鼠中，化学治疗剂具有显著增强的效应。例如，图7显示，相比新-对照细胞，C4-2B(KD)(i32-M-敲落PC-3)细胞更敏感于由吉西他滨诱导的生长抑制。结果显示，吉西他滨以较低剂量(10 μ M或更低)不是特别有效。但是，β 2-Μ-敲落显著增强吉西他滨的效应。类似地，图8显示，相比新-对照细胞，C4_2B(KD)细胞更敏感于由PS-341诱导的细胞生长抑制。即使PS-341以IyM或更高浓度独自有效，β 2-M-敲落仍产生显著的增强。增强不仅见于β 2-Μ-敲落小鼠，而且见于用拮抗或抑制β 2-Μ功能的试剂(例如针对β2-Μ的抗体)处理的正常小鼠。例如，图9显示，抗-β2Μ抗体(0.5，1μβ/πι1)可致敏C4-2B(KD)细胞于PS-341的细胞毒性。显示于图8及图9的结果之间的比较证实增强的确由于β 2-M功能的抑制或敲落所致。用各化学治疗剂观察到增强。例如，图10显示，C4-2B(KD)细胞相比新-对照细胞更敏感于由顺钼(例如，10 μ M)诱导的细胞生长抑制。图11显示，C4-2B(KD)细胞相比新-对照细胞更敏感于由泰素帝诱导的细胞生长抑制。此外，也用不同癌细胞观察到增强。图12及图13显示抗-β 2M抗体治疗致敏PC-3 细胞于顺钼的细胞毒性。这些结果类似于在C4-2B(KD)细胞中用顺钼的结果。为进一步确证抗-β 2-M抗体在增强其他治疗剂的效应中的一般应用，测试了其他化学治疗剂。图14及图15显示抗-β 2Μ抗体治疗致敏PC-3细胞于多柔比星的细胞毒性。 图16及图17显示抗-β 2Μ抗体治疗致敏PC-3细胞于吉西他滨的细胞毒性。图18及图19 显示抗- β 2Μ抗体治疗致敏PC-3细胞于泰素帝的细胞毒性。图20及图21显示抗- β 2Μ 抗体治疗致敏PC-3细胞于17-AAG的细胞毒性。总之，这些结果显示β 2-Μ功能抑制贡献于致敏癌细胞于癌治疗，放射治疗或化学治疗。因此，任何可阻断或降低β2-Μ功能的试剂(例如，上述抗-β2-Μ mAbs或miRNA) 可用于增强其他癌治疗模式(例如辐射或化学治疗剂(例如，PS-341，吉西他滨，顺钼，多柔比星，泰素帝，及17-AAG，等))的效应。可使用任何针对β 2-M的抗体，包括单克隆抗-β 2M抗体及多克隆抗-β 2M抗体。例如，在以上体外研究及用裸鼠实验的研究中，使用来自Santa Cruz Biotechnology 的单克隆抗- β 2M抗体(ΒΒΜ. 1)。就TRAMP小鼠研究而言，使用来自ATCC的杂交瘤产生 mAbs(BBM. 1)，将其注射给小鼠，以产生抗_ β 2_M单克隆抗体作为腹水。收集腹水，及使用 IgG纯化试剂盒纯化，及在注射之前定量。除了治疗效果之外，抗-β 2-M抗体也发现具有预防效果。在TRAMP小鼠模型中展示这些预防效果。TRAMP模型使用大鼠雄激素-依赖性前列腺碱性蛋白基因启动子驱使在前列腺上皮中猿猴病毒40 (SV40)大T及小t抗原的表达。因此，SV40抗原的表达特异于前列腺，及激素性及发育性地调节。TRAMP小鼠将自发发展前列腺癌。图22显示在TRAMP小鼠中响应抗-β 2-M mAbs的肿瘤成像研究。在此实验中， 使用TRAMP小鼠及它们的背景对照C57BL/6小鼠。TRAMP小鼠(n = 4)用对照IgG抗体或抗-β 2-M mAbs处理。小鼠连日用200 μ g/ml纯化的mAbs处理2个月，然后连日lmg/ml mAbs的2次注射。治疗后一周时，处死小鼠。成像研究显示，抗- β 2-M mAb治疗在TRAMP 小鼠中预防前列腺肿瘤的自发发展，表明抗-β 2-M抗体可具有预防效果。这些观察通过H/ E染色确认。
图23显示在TRAMP小鼠中响应抗-β 2-M mAbs的免疫学毒性研究。在这些小鼠脾脏中进行免疫研究。总T及B细胞数不受响应抗-β 2-M mAb治疗的影响，提示，抗-β2-Μ 治疗将不干扰宿主免疫系统。本发明的实施方式的优点可包括以下一或多个。本发明的方法可无影响正常细胞的副作用地特异性地致敏癌细胞于辐射-和/或化学治疗剂药-诱导的细胞杀伤。因此， 本发明的方法可最大化治疗功效及，同时，最小化不期望的副作用。尽管使用有限数量的实施例阐释了本发明的实施方式，本领域技术人员将认同本发明的实施方式不限于这些实施例。因为β 2-Μ涉及不特异于任何特定类型的癌的共同的机理，本领域技术人员将认同本发明的实施方式也可将应用于其他类型的癌。此外，如上所述，抗-β2-Μ mAbs可致使癌细胞更敏感于辐射和/或化学治疗剂。因此，协同效应不期望特异于任何特定化学治疗剂。换言之，如上所述的协同效应普遍，及不限于特定癌或特定化学治疗剂。因此，本发明的范围应仅由附加的权利要求限定。
权利要求
1.用于治疗癌的方法，包括用针对β-2-微球蛋白的试剂治疗受试者；及用辐射或癌治疗剂治疗受试者。
2.权利要求1的方法，其中所述针对β-2-微球蛋白的试剂是抗体。
3.权利要求2的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.权利要求2的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
5.权利要求1的方法，其中所述针对0-2-微球蛋白的试剂是时1^八。
6.权利要求5的方法，其中所述miRNA是选自下列的至少一种miR-135，miR-200a，及 miR-200bo
7.权利要求1的方法，其中所述癌是前列腺癌，乳腺癌，肺癌，肾癌，骨肉瘤癌，或它们的组合。
8.权利要求1的方法，其中化学治疗剂是选自下列的至少一种PS-341，吉西他滨，顺钼，多柔比星，泰素帝，VP-16，及17-AAG。
9.癌治疗用试剂盒，其包括针对β_2-微球蛋白的试剂；及化学治疗剂。
10.权利要求9的试剂盒，其中所述针对β-2-微球蛋白的试剂是抗体。
11.针对β-2-微球蛋白的试剂用于增强辐射或化学治疗剂的癌-治疗效果的用途。
12.权利要求11的用途，其中所述针对β-2-微球蛋白的试剂是抗体。
全文摘要
用于治疗癌的方法，包括用针对β-2-微球蛋白的试剂治疗受试者；及用辐射或癌治疗剂治疗受试者。针对β-2-微球蛋白的试剂，其包括抗-β2-M抗体及miRNA。
文档编号A61P35/00GK102223896SQ200980132038
公开日2011年10月19日 申请日期2009年8月7日 优先权日2008年8月7日
发明者H·E·赵, L·W·K·常, S·卓森, W-C·黄 申请人:埃默里大学, 西塞医疗中心