专利名称：用于预测长期透析的尿液生物标志的制作方法
技术领域：
本发明涉及肾病预防和治疗领域。肾病治疗可以依赖长期透析的需求或期望定制。例如，可以通过监测与慢性肾病发展相关的尿液生物标志(biomarkers)确定对长期透析治疗的预测。例如，可以使用标准化的透明质酸时程(time course)确定已经患有急性肾损伤的患者是否将需要长期透析。
背景技术：
据信，慢性肾病(CKD)是发达国家面临的最大、增长最快的健康问题。单在美国， 有沈00万人患有CKD并且另有2000多万人处于增加的风险之中。CKD导致透析和心脏病， 花费数十亿美元。CKD的一个主要原因是急性肾损伤(AKI)，其自身是发病率和死亡率的独立的预测因素，且与大量增加的医疗保健花费有关，特别是如果需要透析(或相关的肾支持技术)。慢性肾病可以因多种不同因素而发展，但最显著的是遗传素质和/或急性肾损伤。肾损伤的程度还与长期死亡率逐渐增长的增加有关。患有严重的需要透析的AKI患者的最初出院后一年病死率可高达64%。此外，当前使用的肾功能/损伤标志，诸如血清肌酸酐水平，在识别肾病的长期结果方面不足。无论起始因素如何，慢性肾病有高比例的患者需要长期透析(即，例如，肾替代疗法或RRT)。该治疗昂贵、耗时且可以产生不利的副作用，包括但不限于血管狭窄和/或血栓形成。因此，开发允许对AKI患者进行早期识别和后续分层并且还预测肾功能恢复的生物标志是在本领域具有大量需求的临床工具。
发明内容
本发明涉及肾病预防和治疗领域。肾病治疗可以依赖长期透析的需求或期望定制。例如，可以通过监测与慢性肾病发展相关的尿液生物标志确定对长期透析治疗的预测。 例如，可以使用标准化的透明质酸时程确定已经患有急性肾损伤的患者是否将需要长期透析。在一种实施方式中，本发明涉及一种方法，包括a)提供；i)患者，其中所述患者表现出急性肾损伤；ii)至少两份来自所述患者的尿样；b)检测在所述尿样中持续升高的透明质酸；c)预测所述患者需要长期透析。在一种实施方式中，其中所述样品在所述严重肾损伤的替代疗法开始后的第一天和第十四天收集。在一种实施方式中，所述方法进一步包括诊断所述患者患有慢性肾病。在一种实施方式中，所述诊断发生在肾损伤后的至少六十天。在一种实施方式中，所述方法进一步包括使所述患者进入慢性肾病预防项目。
在一种实施方式中，本发明涉及一种方法，包括a)提供；i)患者，其中所述患者表现出急性肾损伤，其中所述患者处于发展为慢性肾病的风险之中；ii)至少两份来自所述患者的尿样；b)检测在所述尿样中持续升高的透明质酸；c)治疗所述患者以防止慢性肾病。在一种实施方式中，所述治疗在肾病的第14天后开始。在一种实施方式中，本发明涉及一种方法，包括a)提供；i)已经患有急性肾损伤的患者；ii)获得来自所述患者的多个尿透明质酸和肌酸酐水平，其中所述水平随时间获得；b)构建尿透明质酸水平时程，其中所述时程相对于尿肌酸酐水平标准化；并且c)预测慢性肾病发展。在一种实施方式中，其中所述预测包括长期肾替代疗法(即，例如，透析)。定义本文中使用的术语“生物标志”是指任何与慢性肾病渐进性发展有关的生物化合物。例如，生物标志可以包括透明质酸或其任何代谢物或衍生物。本文中使用的术语“预后”是指基于分析任何提供关于医学病症，包括但不限于慢性肾病或心血管疾病进展的信息的生物标志的医学结论。此类信息包括但不限于确定长期透析风险。本文中使用的术语“预测”是指一种形成预后的方法，其中经过医学培训的人分析生物标志信息。本文中使用的术语“慢性肾病”是指其中示例性症状可能包括但不限于高磷酸盐血症(即，例如，> 4. 6mg/dl)或低肾小球滤过率(即，例如，< 90ml/分钟/1. 73m2体表面)的医学病症。然而，很多CKD患者可能有正常血清磷酸盐水平伴有肾小球滤过率在3 个月或以上持续降低，或正常GFR伴有持续迹象的肾脏结构性异常。在某些情况下，诊断为慢性肾病的患者接受血液透析以维持正常血液体内稳态(即，例如，尿素或磷酸盐水平)。 可替代地，“慢性肾病”是指一种医学病症，其中患者具有i)在3个月或以上GFR < 60mi/ min/1. 73m2体表面积持续降低；或者ii)即使在不存在GFR降低的情况下在3个月或以上肾功能出现结构性或功能性异常。肾脏结构性或解剖学异常可以被定义为但不限于持续性微量白蛋白尿或蛋白尿或血尿或出现肾囊肿。本文中使用的术语“无症状的”是指未患有CKD的患者和/或受试者，其中CKD症状包括具有肾小球滤过率降低(即，例如，在约70-89ml/min/l. 73m2体表面之间)不足三个月。本文中使用的术语“肾小球滤过率”是指一种能够确定肾脏功能的量度(下文)。 一般而言，正常肾小球滤过率的范围在约120-90ml/分钟/1. 73m2体表面。当肾小球滤过率低于90ml/分钟/1. 73m2体表面时认为肾功能受损。当肾小球滤过率降至低于约30ml/分钟/1. 73m2体表面时可能肾衰竭。当肾小球滤过率降至低于约15ml/分钟/1. 73m2体表面时往往开始透析。本文中使用的术语“肾衰竭”是指在不失去电解质的情况下任何的肾脏清除废物以及浓缩尿液的能力的急性(突然)或慢性缺失。本文中使用的术语“生物样品”是指任何来自活有机体的物质。例如，样品可以来自血液作为尿液样品(as a urine sample)、血清样品、血浆样品和或全血样品。可替代地， 样品可以来自所收集的组织，例如通过活组织检查收集。此类组织样品可以包括，例如，肾组织、血管组织和/或心脏组织。生物样品还可以包括体液，包括但不限于尿液、唾液或排汗。本文中使用的术语“试剂”是指任何用于产生化学反应以检测、测量、生成等，其他物质的物质。
图1显示表明在表现出急性肾损伤的患者中相对于尿肌酸酐标准化的尿透明质酸排泄的示例性数据。在严重急性肾损伤替代疗法开始后1-14天之间取得样品(S卩，DU D7和D14)。所显示的数据代表肾损伤后观天恢复或未恢复的患者(分别为似8和NM8) 的示例性数据。图2显示表明在Dl、D7和/或D14从肾损伤后观天恢复或未恢复的患者(分别为似8和殿观)中取得的尿液样品之间的绝对差异的示例性数据。图3显示表明在Dl、D7和/或D14从肾损伤后60天恢复或未恢复的患者(分别为R60和NR60)中取得的尿液样品之间的绝对差异的示例性数据。图4显示表明在Dl、D7和/或D14从肾损伤后观天恢复或未恢复的患者(分别为似8和殿观)中取得的尿液样品之间的相对差异的示例性数据。图5显示表明在Dl、D7和/或D14从肾损伤后60天恢复或未恢复的患者(分别为R60和NR60)中取得的尿液样品之间的相对差异的示例性数据。图6显示表明在HA排泄在Dl和D14之间持续升高时，肾损伤60天后在患者中预测透析的高敏感性的示例性数据。发明详述本发明涉及肾病预防和治疗领域。肾病治疗可以依赖长期透析的需求或期望定制。例如，可以通过监测与慢性肾病发展相关的尿液生物标志确定对长期透析治疗的预测。 例如，可以使用标准化的透明质酸时程确定已经患有急性肾损伤的患者是否将需要长期透析。如果致力于治疗涉及AKI和防止CKD的研究可根据长期预后来定制，那么可贯彻更有效的临床策略。换言之，被预测不能恢复肾功能的患者可以被选择性的提供侵入性治疗(aggressive treatment)。相反，具有有利预后的患者可以免于更多的侵入性治疗 (aggressiveintervention)及其潜在不良反应。I.肾损伤和/或疾病肾脏位于侧腹(脊柱两侧的上腹部背面)。它们位于腹部深处，被脊柱、下肋骨护架和背部的强健肌肉保护。该位置保护肾脏不受多种外力损伤。它们是健硕的 (well-padded)，原因是肾脏是高度血管化的器官，意味着它们具有大量的血液供给。如果发生损伤，将发生严重的出血。肾脏可以因向其供血或其排出血液的血管的损伤而受损。这可以是动脉瘤、动静脉瘘、动脉阻塞或肾静脉血栓形成的形式。出血的程度取决于损伤的位置和程度。如果在中央受损(在内部)，肾脏还可能大量出血-这是危及生命的损伤。幸运的是，多数由钝伤引起的肾损伤发生在外周，仅引起肾脏擦伤(通常是自身限制过程)。具有未诊断的肾病症一诸如血管肌脂瘤(良性肿瘤)、输尿管肾盂连接梗阻(先天性或获得性UPJ梗阻)以及其它障碍的人对肾损伤更易感，并且如果发生的话更有可能患有严重并发症。肾损伤以及出血的其它原因是医疗操作。肾活组织检查、肾盂引流管放置或其它手术可以引起动脉和静脉之间的异常连接(动静脉瘘)。这通常是一种自身限制问题，但通常需要密切观察。肾损伤还可以使泌尿道破裂，引起尿液从肾脏中漏出。每个肾每天大约过滤1700升血液，每天将液体和废物浓缩为约1升尿液。由于这一原因，肾脏在身体内比几乎任何其它器官都暴露于更多的毒性物质。因此，它们对来自毒性物质的损伤高度易感。镇痛剂肾病是最常见的对肾脏的毒性损伤类型之一。暴露于铅、 清洁制品、溶剂、燃料或其它肾毒性化学物质(那些对肾脏有毒的物质)可以损伤肾脏。身体废物，诸如尿酸(可随痛风或骨髓、淋巴结或其它障碍的治疗出现)的过度聚集也可以损伤肾脏。对药物、感染或其它障碍的免疫应答引起的炎症(肿胀刺激或出现额外的免疫细胞)也可能损伤肾脏结构，通常造成不同类型的肾小球肾炎或急性肾小管坏死(组织死亡)。自身免疫性病症也可能损伤肾脏。对肾脏的损伤可能导致具有最少症状或无症状的短期损伤。可替代地，由于出血和伴随的休克它可能是危及生命的，或者它可能导致急性肾衰竭或慢性肾衰竭。输尿管损伤(对将尿液从肾脏输送至膀胱的管道的损伤)还可以由外伤(钝性或锐性)、医疗操作并发症以及腹膜后腔内的其它疾病，诸如腹膜后纤维化(RPF)、腹膜后肉瘤或转移性淋巴结阳性癌症引起。医学疗法(诸如0B/GYN手术、前期辐射或化疗、先前的腹腔骨盆手术)增加输尿管损伤的风险。A.急性肾衰竭急性(突发性)肾衰竭是肾脏在不失去电解质的情况下消除废物和浓缩尿液的能力突然丧失。有很多可能的引起肾损伤的原因。它们包括但不限于可能随由外伤引起的极低的血压出现的血流减少、手术、严重疾病、感染性休克、出血、烧伤或脱水、急性肾小管坏死(ATN)、直接损伤肾脏的感染，诸如急性肾盂肾炎或败血症、尿路梗阻(梗阻性尿路病)、 自身免疫性肾病，诸如间质肾炎或急性肾炎综合征、引起肾脏细血管内部凝血的障碍、特发性血小板减少性血栓形成紫癜(ITTP)、输血反应、恶性高血压、硬皮病、溶血性尿毒性综合征、分娩障碍，诸如出血性胎盘分离或前置胎盘。急性肾衰竭的症状可以包括但不限于尿量减少(少尿)、排尿停止(无尿)、夜间过度排尿、踝，脚和腿肿胀、全身性肿胀、液体潴留、感觉减弱，特别是手或脚、食欲减退、口中有金属味、持续打嗝、精神状态或情绪改变、激动、困倦、嗜睡、精神错乱或混乱、昏迷、情绪改变、无法集中精力、幻觉、行动缓慢呆滞、癫痫发作、手震颤(摇动)、可能持续数日的恶心或呕吐、易擦伤、出血延长、鼻出血、血便、胁腹痛(肋骨和髋部之间)、疲劳、呼吸有气味或高血压。B.慢性肾衰竭与急性肾衰竭不同，慢性肾衰竭缓慢变重。其最常起因于任何可引起肾功能逐渐丧失的疾病。其范围可以从轻度功能障碍到严重肾衰竭。该疾病可能导致终末期肾病 (ESRD)。慢性肾衰竭通常在多年内发生，因为肾脏的内部结构是缓慢受损。在早期，可能没有症状。实际上，进展可以非常慢以至于症状直到肾功能不到正常的十分之一才出现。在美国慢性肾衰竭和ESRD在每1000人影响超过2人。糖尿病和高血压是两个最
6常见的原因，与多数病例有关。其它主要原因包括但不限于奥尔波特综合征、镇痛剂肾病、 任何类型的肾小球肾炎(最常见的原因之一)、肾结石和感染、梗阻性尿路病、多囊性肾病或反流性肾病。慢性肾衰竭造成身体内体液和废物蓄积，导致血液中氮废物(氮质血症) 累积和全身性的不健康(general ill health)。大多数身体系统受到慢性肾衰竭的影响。最初的症状可能包括但不限于疲劳、频繁打嗝、全身性的不健康感觉、全身性瘙瘁 (瘙瘁症)、头痛、恶心、呕吐或无意识的体重降低。更进一步地，晚期症状可能包括但不限于呕吐物或粪便中有血、警戒性降低，包括困倦、混乱、精神错乱或昏迷、手，脚或其它区域感觉减退、易擦伤或出血、尿排出量增加或减少、肌肉颤搐或痉挛、癫痫或皮肤内部和表面白色结晶(尿毒症霜)。慢性肾衰竭患者的细胞因子和其它炎症标志循环水平显著升高。这可能由生成增加、清除减少，或两者引起。然而，还不确定肾功能自身对尿毒症性促炎症环境贡献的程度。 在176名接近肾替代疗法开始时期的患者(年龄，52+/-1岁；GFR，6. 5+/-0. lmL/min)中报道了炎症和肾小球滤过率(GFR)之间的关系。Pecoits-Filho等人，Associations between circulating inflammatory markers and residualrenal function in CRF patients. Am J Kidney Dis. 2003Jun ；41 (6) :1212-8.例如，在禁食过夜后测量了高敏感性C-反应蛋白 (hsCRP)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-6(IL_6)、透明质素(hyaluronan)和新蝶呤的循环水平。然后根据中值GFR(6.5mL/min)将患者再细分为两组。尽管GFR(1.8到 16. 5mL/min)的范围较窄，hsCRP、透明质素和新蝶呤的水平在更低的GFRs亚组中显著更高，并且在 GFR 与 IL-6 (rho = -0. 18 ；P < 0. 05)、透明质素(rho = -0. 25 ；P < 0. 001)和新蝶呤(rho = -ο. 32 ；P < 0. 0005)之间观察到显著的负相关。在多元分析中，年龄和GFR与炎症相关，但心血管疾病和糖尿病与之无关。这些结果表明低GFR自身与炎症状态相关，提示肾消除促炎症细胞因子受损，尿毒症中细胞因子生成增加，或炎症对肾功能有不良作用。C.透析透析(即，例如，肾替代疗法)是一种当肾脏无法做到时从血液中除去毒性物质 (杂质或废物)的方法，且可以使用多种不同的方法进行。例如，腹膜透析可以通过使用腹部内的腹膜过滤废物。用特殊的有助于除去毒素的溶液充满腹部。使溶液在腹部停留一段时间然后排出。这种形式的透析可以在家中进行但必须每天进行。可替代地，可以通过使血液经体外的特殊滤器循环进行血液透析。血液连同有助于除去毒素的溶液流经滤器。透析使用特殊的方法接入血管中的血液。接入可以是暂时性的或永久性的。暂时性接入采取透析导管的形式-放置在大动脉中的可以支持可接受的血流的空心管。多数导管是在紧急状态下供短期使用。然而，被称作隧道导管的导管可以供长时间使用，常常为数周到数月。永久性接入通过手术连接静脉与动脉而建立。这允许静脉在高压接收血液，导致静脉壁变厚。该静脉可以处理反复穿刺，还提供出色的血流速度。可以用血管(动静脉瘘，或AVF)或合成的桥(动静脉接枝，或AVG)建立动脉与静脉之间的连接。血液从体内接入点转向透析机。在此，血液逆流流入被称作透析液的特殊溶液。血液的化学失调和杂质得以校正，然后血液返回体内。典型地，多数患者每周进行三期血液透析。每期持续3-4小时。透析的目的是辅助肾脏功能，包括过滤血液、除去废物、调节体液、维持电解质平衡或维持血液PH在7. 35-7. 45之间。更进一步地，透析可以替代无法正常工作的肾脏的某些功能， 否则将导致患者死亡。
透析最常用于患有肾衰竭的患者，但其也可以在急性情况下快速除去药物或毒药。该技术在患有急性或慢性肾衰竭的人中可以救命。II.尿透明质酸生物标志在一种实施方式中，本发明涉及一种尿透明质酸(HA)生物标志以预测急性肾损伤(AKI)后肾功能的恢复。在一种实施方式中，鉴别生物标志提供患者分层以定制治疗强度从而防止不必要的长期并发症。在一种实施方式中，本发明涉及一种方法，包括在疾病过程的早期预测AKI长期预后。在一种实施方式中，当尿HA在严重急性肾损伤替代疗法开始后D1-D14之间持续升高时本方法预测长期透析。在一种实施方式中，当尿HA在严重急性肾损伤替代疗法开始后 D1-D14之间持续升高时本方法预测长期透析。在一种实施方式中，长期透析包括肾损伤后至少六十(60)天。在一种实施方式中，长期透析包括肾病诊断后至少六十(60)天。本文提供的数据是从参与一项研究不同RRT剂量对AKI存活率影响的大型多中心随机对照试验的四十三G3)名患者中收集的。在一种实施方式中，AKI存活率与尿透明质酸(HA)生物标志关联。尽管没有必要了解一项发明的机制，据信HA( S卩，例如，透明质素或透明质酸盐(hyaluronate))包括非硫酸化的糖胺聚糖，并且据信其广泛分布在结缔组织、 上皮组织和神经组织中。还据信HA是细胞外基质中的数种组分之一，且可能通过介导细胞增殖和迁移、细胞外基质合成与降解参与组织修复和重塑。例如，已经观察到片段化的HA 在组织损伤过程中蓄积，且可能通过损伤部位的多种免疫细胞刺激炎性基因表达。此外，已经注意到HA清除受损导致持久性的炎症。在一种实施方式中，生物标志预测肾功能的未恢复，其中透析依赖性超过六十 (60)天。在一种实施方式中，肾功能的未恢复包括生物标志升高至高于其起始值达至少十四(14)天。在一种实施方式中，生物标志预测由接受者操作特征(ROC)分析支持。在一种实施方式中，ROC分析提供计算，包括但不限于拟合曲线下面积和/或梯形(Wilcoxon)面积。在一种实施方式中，拟合曲线下面积=0. 9686，具有估计的标准误差=0.0518。在一种实施方式中，梯形(Wilcoxon)面积=0. 9692，具有估计的标准误差=0. 0568。参见图5。A.透明质酸透明质酸(本领域还已知为透明质酸盐和透明质素，缩写做HA)是含有直链无支链的具有N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸交替单元的多糖链的糖胺聚糖。Laurent TC, Fraser RE. Hyaluronan. FASEB J1992 ；6 :2397-2404 ；and Delpech B, Girard N, Bertrand P. Hyaluronan !fundamental principles and applications in cancer. J Intern Medl997 ;242 :41-48。其广泛存在于多种类型的生物物质中，包括细菌和动物。在人类中， 高浓度的HA见于脐带、眼玻璃体液、软骨和滑膜液。少量HA存在于CSF、淋巴、血液、血清和尿液。HA水平已经与下述疾病有关，诸如类风湿性关节炎、肝硬化和维耳姆斯肿瘤。通常 HA与非特异性肿瘤有关，但其用途至今还未被用于特别的临床肿瘤的发现、治疗和处理。已知HA在包括癌症在内的多种病理生理条件中发挥作用。例如，HA水平已经在某些动物肿瘤模型(例如，兔V2癌，Knudson等人， The role and regulation of tumor associatedhyaluronan. In :The Biology of Hyaluronan(J. ffhelan,ed. ), pp.150-169, New York,Wiley Chichister(Ciba Foundation Symposiuml43)，1989)和人类癌症(例如，肺癌，维耳姆斯肿瘤、乳腺癌等等，Knudson等人，同上)中升高。在肿瘤组织中，HA支持肿瘤细胞粘附和迁移，且还提供某些抗免疫监视保护。还观察到HA的小片段刺激血管发生，且此类片段见于膀胱癌患者的尿液和肿瘤组织。Sattar A，Kumar S，West DC. Does hyaluronanhave a role in endothelial cell proliferation of the synovium ？ SeminArthritis Rheum 1992 ；22 :37-43 ；Lokeshwar VB, Selzer MG. Differences in hyaluronic acid mediated functions and signaling inarterial，microvessel, and vein-derived human endothelial cells. J BiolChem 2000;275:27641-27649。当内切糖苷酶HA酶降解HA聚合物时产生透明质酸片段。Csoka TB, Frost GI，Stern R. Hyaluronidases intissue invasion. Invasion Metastasis 1997 ；17 :297-311 ；and 55. RodenL, Campbell P，Fraser JR，Laurent TC，Petroff H， Thompson JN. Enzymatic pathways of hyaluronan catabolism. In :Whelan J，editor. The Biology of Hyaluronan. New York :Wiley Chichister 1989 :60-86. SWAiIilffl HA试验检测膀胱癌，而无论肿瘤级别如何。LokeshwarVB，Obek C，Pham HT，Wei D，Young MJ, Duncan RC.Urinaryhyaluronic acid and hyaluronidase :markers for bladder cancerdetection and evaluation of grade. J Urol 2000;163:348-356。最近报道了与标准BTA-Stat相比HA-HA酶试验监测膀胱癌复发的效力。 Lokeshwar 等人，Bladder Tumor Markers for MonitoringRecurrence and Screening Comparison of HyaluronicAcid-Hyaluronidase and BTA-Stat Tests Cancer 95 61-72(2002)。该研究提出生物化学试验诸如HA-HA酶试验可以比膀胱镜检查更早地检测到膀胱癌复发。如果此类早期检测能够提供在结果方面的临床优势，膀胱镜检查将不再是决定一种试验在监测复发方面的敏感性、特异性和准确性的终极金标准。对这种结论的有趣的必然结果将是治疗前列腺癌患者和增加前列腺特异性抗原(在前列腺根治术 (radicalprostectomy)或放射疗法后)。HA-HA酶试验可以有效辅助膀胱镜检查，从而监测膀胱癌复发。具有超过90%的敏感性和86%的准确性，HA-HA酶试验可以有效辅助用于监测膀胱癌复发的膀胱镜检查。假阳性的HA-HA酶试验意味在五个月内复发的显著危险。因此，结合生物化学试验有可能有效的监测膀胱癌复发，其可能使监视膀胱镜检查操作的数目最少降低50%。1.透明质酸测定可以通过首先收集测定前于_20°C保存的排泄的(清洁收集)尿液标本检测尿透明质酸。HA测定可基于使用生物素化蛋白聚糖Gl结构域(HA-结合)区的基于ELISA板的透明质素测定。Fosang等人Matrix，10 :306-313 (1990)。在一种实施方式中，可以使用包被了人脐带ΗΑ(25μβ/πι1)的，在磷酸盐缓冲液(PBS)+0.05%吐温20 (PBS+吐温)和生物素化的牛鼻软骨HA-结合蛋白(lyg/ml)中与尿液标本的连续稀释液温育的96-孔微量滴定板改良测定。室温温育1 后，用PBS+吐温洗涤孔。用抗生物素蛋白-生物素检测系统和ABTS 0，2'联氮-双(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)底物(Vector Laboratories, Burlingame,Calif.)对结合至这些孔的HA结合蛋白进行定量。可以通过将吸光度G05nm) 与人脐带HA浓度(ng/ml)做图制备标准曲线图。使用该标准曲线图，可以计算每个稀释度的尿液标本中的HA浓度。从几次此类测定中确定每个样品的平均HA浓度，然后相对于尿样中的肌酸酐浓度(mg/ml)标准化。
已显示上面描述的本发明的HA测定以约88%的敏感度检测膀胱癌，使用截止限(cut-off limit)约为 500ng/ml。 Lokeshwar,等人 Methods for detection and evaluation of bladder cancer United StatesPatent 6, 350, 571 (herein incorporated by reference)。尽管没有必要了解一项发明的机制，据信HA浓度的截止限可以变化，且必须考虑人口扩展(population spread) 0设定HA浓度的截止限以获得长期透析的预测因子，它可能涉及的考虑因素包括但不限于年龄、饮食、样品中的蛋白浓度、环境影响、遗传背景、水合状态、医疗史、身体健康状况、性别、体重等等。在一种实施方式中，HA测定包括将HA吸收至固相表面。尽管没有必要了解一项发明的机制，据信HA可以来自任何便利的来源，诸如人脐带。固相可以是任何常规的固相， 包括硝酸纤维素等等，优选微量滴定孔。将HA吸收至固相后，优选用常规缓冲液洗涤固相的表面。由于固相仍然在其表面留有能够与HA或其它分子结合的位点，优选在加入样品之前加入封闭物以覆盖固相上任何未吸附HA的部分。适合的封闭物的实例包括来自母牛或其它动物的Y球蛋白和白蛋白。优选牛血清白蛋白。封闭固相上的游离位点后，优选用常规缓冲液洗涤固相的表面。然后在存在从疑似患有肾损伤的人中收集的生物液体样本的情况下向包被的固体支持物中加入HA结合蛋白(HABP)，且在诸如允许HABP与包被在固体支持物上的HA和尿 HA(如果存在)结合的条件下温育。温育时间和条件可以在宽限度内变化，但约4到约16 小时的温育时间和约4°C到约37°C的温育温度是令人满意的。虽然如此，较长或较短的温育时间以及较高或较低的温育温度也是可能的。适于本发明测定使用的HABP可以从多种来源容易地纯化，诸如牛鼻软骨 (Tengblad, Biochim. Biophys. Acta, 578 :281-289,1979)、猪喉软骨(Fosang 等人，Matrix, 10 =306-313,1990)。将HABP与包被的HA和/或样品HA结合后，优选用常规缓冲液洗涤固相表面。然后确定与包被在固体支持物上的HA结合的HABP的量。优选地，HABP是生物素化的，在与抗生物素蛋白-酶缀合物以及任意产生有色产物的酶的底物温育后使结合的 HABP显影。此类检测系统不使用放射性作为指示物，多种标志(即，酶分子)为每一个结合至固体支持物上的HABP而被固定，信号(即，有色产物)通过酶的转换而被放大。然而，任何传统标志系统都可以与HABP结合使用。适合的标志系统的实例包括酶、荧光、化学发光、酶-底物、同位素标志、放射标志等等。优选地，通过抗生物素蛋白-生物素检测系统确定与包被在固体支持物上的HA结合的HABP的量。另一种有用的标志系统使用硫酸角蛋白和硫酸角蛋白反应性抗体。可以使用微量滴定板读板仪有效地测定尿HA水平，并且可以从标准曲线图外推。然后可以将与包被的HA结合的HABP的量与收集了生物液体样品的患者的膀胱癌的存在性关联。对于HA测定而言，优选使用纯化的透明质酸作为标准。上述测定中使用的HA-结合片段可以通过用20，000单位睾丸透明质酸酶(Sigma Chemical Co.，St. Louis,Mo.)于37°C消化不同的时间间隔从人脐带HA(约500mg)中分离。 生成的HA片段在kphadex G_50色谱柱(1. 5x120cm)上分离。收集IOml级分并测定糖醛酸含量(Bitterand Muir,A modified uronic acid carbazole reaction. Anal. Biochem., 4 :330-334,1962) 0将级分合并得到三份制备物，F1、F2和F3。通过Dygert法(Dygert等人，Determination of reducing sugars withimproved precision. Anal. Biochem. ,13 367-374,1965)测定每个级分中还原端的数目。由于每个HA的线性多糖或其片段含有单还原末端，从每摩尔糖醛酸的还原端数目计算每个片段的链长。还通过在HA消化过程中掺入 3H 标记的 HA (按照 Lokeshwar 等人的描述制备，Ankyrin binding domain of CD44 (GP85) is required for the expressionof hyaluronic acid-mediated adhesion function. J. Cell Biol. ,1261099-1109,1994)以及用凝胶电泳和荧光自显影分析片段来确定每个片段中低聚糖的大小范围。相应地，在本发明的一种实施方式中，可以通过定量测量来自疑似患有肾损伤和/ 或疾病的患者的生物液体样品(诸如，例如，尿样)中的HA预测长期透析。可以使用任何传统测定方法学测定HA的存在和测量，包括放射测定、三明治分析法、抑制测定等等。然而， 优选用竞争性结合测定法测量HA。更优选地，本发明的测定以与ELISA试验相同的方式工作，但不使用抗体竞争机制。在一种实施方式中，可以使用下述方法预测长期透析，包括(a)用HA包被固体支持物(solid support)(优选微量滴定孔)；(b)在允许HABP与包被在固体支持物上的HA以及样品中的HA(如果存在)结合的条件下，在存在从疑似患有肾损伤和/或疾病的人中收集的生物液体样品(诸如，尿样) 的情况下使HA结合蛋白(HABP)与包被的固体支持物接触并温育；(c)确定与包被在固体支持物上的HA结合的HABP的量，并从中确定样品中存在的 HA的量。尽管没有必要了解一项发明的机制，据信当样品中存在HA时，通过例如与标准比较测定，将与包被的HA结合的HABP较少。换言之，与包被的HA结合的HABP的量减少(即， 与对照相比)将意味着样品中存在的HA增加。在一种实施方式中，升高的尿HA预测长期透析。在一种实施方式中，该方法可以进一步包括检测与结合的HABP相关的或由其产生的信号。尽管没有必要了解一项发明的机制，据信可以使用与包被在固体支持物上的HA 结合的HABP的量从中确定样品中存在的HA的量。例如，可以使用微量滴定板读板仪测量有色产物的吸光度作为与固体支持物结合的生物素化的HABP的间接测量(例如，用抗生物素蛋白-酶缀合物和标记的底物产生有色产物)。可以通过将HA包被的孔在不存在任何 HA或含HA的样品的情况下与缓冲液单独温育来获得最大吸光度。然后可以通过将吸光度与ng/孔或O.aiil HA作图来制备标准曲线图。使用该标准曲线图可以计算每个稀释度样品中的HA浓度(ng/ml)。可以从数次此类测定中确定每个样品中的平均HA浓度。可以确定肌酸酐浓度这样可以将HA浓度标准化。在一种实施方式中，预测患者是否需要长期透析可以通过下述来自标准化尿HA 水平的计算结果确定从时程曲线图X稀释度因子/mg/ml尿蛋白外推HA (ng/ml)。例如， 低吸光度读数预示尿样中显著量的HA，其自身可能预示患者需要长期透析。2.从患者尿液中分离HA和HA片段来自正常受试者和患者的尿液标本可以被浓缩10倍并用PBS广泛透析。将约2ml每份透析的标本(约20mg蛋白)上样至以PBS平衡的kpharose 6CL-B色谱柱 (1. 5x120cm) (Pharmacia, Piscataway, N. J.)。色谱柱在 7ml/hr 的 PBS 中运行，收集 3. 5ml 级分。用上述ELISA-样测定法测定级分中的HA。由于标准的球状蛋白标志和线性多糖，
11诸如HA和HA片段具有不同的形状，用人脐带静脉HA (差不多&106D)和HA片段F1、F2和 F3校正色谱柱。ELISA-样测定法可以涉及使用生物素化的HA结合蛋白来确定尿液标本中的HA浓度。由于已发现尿HA水平(即，正常的ng数量级)受到水合状态和尿排出量的影响，因此将这些水平相对于尿肌酸酐含量标准化。B.透明质酸酶透明质酸酶(HA酶)是一种通过水解HA中的N-乙酰葡糖胺糖苷键 (N-acetylglucosaminic bonds)降角军 HA 的内切糖苷酶(endoglycosidic enzyme)。 HA被透明质酸酶的有限降解导致产生促进生成血管的具有特定长度(约3-25个二糖单位)的 HA 片段(West 等人’ Angiogenesis induced by degradation products of hyaluronic acid. Science, 228 :1324-1326,1985)。在脊椎动物中，透明质酸可以被分为两类，即在中性PH(pH最适宜5. 0)有活性的那些以及在酸性pH(pH3. 5-4. 0)有活性的那些(Roden 等人，Enzymatic pathways of hyaluronancatabolism. In :The Biology of hyaluronan, (J. Whelan, ed.), pp. 60-86, New York, Wiley Chichister (Ciba Foundation Symposium 143), 1989 ；West 等人，ibid. ；Gold，Purification and properties of hyaluronidasefrom human liver.Biochem. J.，205 :69-74,1982 ；Fraser and Laurent， Turnover and metabolism of Hyaluronan. in :Biology ofHyaluronan, (J. Whelan, ed.), pp. 41-59，New York，WileyChichister (Ciba Foundation Symposium 143),1989 ； Zhu 等人，Molecular cloning of a mammalian hyaluronidase reveals identitywith hemopexin，a serum heme—binding protein.J. Biol. Chem. ,269 :32092-32097,1994 ；Lin 等人，A hyaluronidase activity of the spermplasma membrane protein PH_20enables sperm to penetrate thecumulus layer surrounding the egg. J. Cell Biol. ,125 1157-1163,1995)。例如，睾丸透明质酸酶是中性类型而肝透明质酸酶具有酸性pH最适条件。已知HA和透明质酸酶的一致的作用在胚胎发育、血管发生、血管重塑、免疫监视以及肿瘤进展中发挥重要作用(McCormickand Zetter, Adhesive interactions in angiogenesis and metastasis. Pharmacol. Ther. , 53 :239-260,1992 ；Hobarth 等人，Topicalchemo-prophylaxis of superficial bladder cancer by mitomycin C andadjuvant hyaluronidase, Eur. Urol. ,21 :206-210,1992 ；Knudson 等人’ The role and regulation of tumor-associated hyaluronan. In :TheBiology of Hyaluronan(J. Whelan, ed. )pp. 150-169, New York, Wiley, Chichester(Ciba Foundation Symposium 143),1989 ；Lin 等人’ Urinary hyaluronic acid is a Wilms ' tumor marker. J.Ped. Surg. ,30 :304-308,1995 ；Stern 等 Α Hyaluronidase levels in urine from Wilms' tumor patients.J. Natl. Cane. Inst. ,83 :1569-1574,1991)。III.试剂盒在一种实施方式中，本发明涉及用于预测长期透析的诊断试剂盒。在一种实施方式中，该试剂盒包括HA和/或HA酶、HABP和标志或缀合于标志的HABP，以及适用于检测生物样品(即，例如，尿样)中HA和/或HA酶存在的辅助试剂。本发明涉及的检测试剂盒的实例是常规浸渍(dipstick)检查法装置。在一种实施方式中，浸渍检查法装置可以支持HA测定以预测长期透析。例如，如
12上所述，使用常规方法学，可以使用浸渍片(dipstick)形式的固相测定HA。在一种实施方式中，浸渍片可以被HA包被或浸透，其中可以使用浸渍片检测任何生物液体，包括但不限于尿液。
实施例实施例1人尿样中的标准化透明质酸如上所述测定人尿液中的透明质酸。通过为期两周(即，14天；D1-D14)的收集和分析尿液中的HA产生时程。提供的数据显示罹患肾损伤后二十八08)天恢复的患者和未恢复的患者(即，例如，似8=恢复的患者；和NI^S=未恢复的患者)。在十四(14)天的收集期内在第1天(D1)、第7天(D7)和第14天(D14)分析样品。参见图1。数据证明对于恢复的患者而言，在Dl透明质酸最高，在D7和D14逐渐降低。与之相比，对于未恢复的患者而言，透明质酸在同一时间期限内稳定增加。清楚地，数据表明透明质酸与肾损伤的恢复相关。实施例2人尿样中的绝对标准化透明质酸水平该实施例中的数据检测肾损伤后Dl、D7和/或D14取得的上述样品中标准化的绝对透明质酸水平之间的差异，所述样品按照实施例1从肾损伤后(past kidney injury) 二十八天(R28)和六十天(R60)表现出恢复的患者以及未恢复的患者(殿观和殿60)收集。数据表明在第1天和第7天之间，以及第1天和第14天之间，恢复的患者的标准化的透明质酸排泄明显减少(即，例如，绝对透明质酸排泄随该时间期限减少)。然而，第7 天和第14天之间的差异可以忽略不计，意味着排泄速度没有变化。与之相比，在未恢复的患者中，第1天和第7天之间的差异，以及第1天和第14天之间的差异证明标准化的透明质酸排泄明显增加(即，例如，绝对透明质酸排泄随该时间期限增加)。同样，在第7天和第 14天之间排泄速度没有变化。见图2和3。实施例3人尿样中的相对标准化透明质酸水平该实施例根据实施例2重绘制了数据以进一步说明恢复的患者以及未恢复的患者之间差异的量值。特别地，数据以百分比表示(即，D7 + D1、D14 + D1、D7 + D14或 D14 + D7)。数据表明在恢复的患者中相对透明质酸排泄在第1天到第14天之间进行性减少， 而第14天和第7天之间的相对差异几乎可忽略不计。这与上述数据的解释一致，表明透明质酸在恢复的肾损伤患者中随时间减少。与之相比，数据表明在未恢复的患者中相对透明质酸排泄在整个时间期限内保持升高。这与上述数据的解释一致，表明透明质酸在未恢复的肾损伤患者中随时间升高。见图4和5。实施例4在肾损伤后14天预测长期透析分析了按照实施例2中给出的数据并重绘图以评价真阳性和假阳性之间的关系。 特别地，在其中尿HA/肌酸酐持续升高的情况下(S卩，Dl和D14测量结果之间的差异)，存在预测患者在肾损伤后D60将进行长期透析的高度敏感性。见图6。总之，该数据表明肾损伤后D1-D14之间尿HA持续升高的患者将在D60 (且最可能在之后)进行透析。
权利要求
1.一种方法，包括a)提供；i)患者，其中所述患者表现出急性肾损伤； )至少两份来自所述患者的尿样；b)检测在所述尿样中持续升高的透明质酸；并且c)预测所述患者需要长期透析。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品在所述严重急性肾损伤替代疗法开始后的第一天和第十四天收集。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括诊断所述患者患有慢性肾病。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述诊断发生在肾损伤后的至少六十天。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述患者进入慢性肾病预防项目。
6.一种方法，包括a)提供；i)患者，其中所述患者表现出急性肾损伤，其中所述患者处于发展为慢性肾病的风险之中； )至少两份来自所述患者的尿样；b)检测在所述尿样中持续升高的透明质酸；并且c)治疗所述患者以防止慢性肾病。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述治疗在肾病后第14天开始。
8.一种方法，包括a)提供；i)患有急性肾损伤的患者； )获得来自所述患者的多个尿透明质酸和肌酸酐水平，其中所述水平随时间获得；b)建立尿透明质酸水平时程，其中所述时程对尿肌酸酐水平标准化；并且c)预测慢性肾病发展，在一种实施方式中，其中所述预测包括长期肾替代疗法。
全文摘要
本发明涉及肾病预防和治疗领域。肾病治疗可以依赖长期透析的需求或期望定制。例如，可以通过监测与慢性肾病发展相关的尿液生物标志确定对长期透析治疗的预测。例如，可以使用标准化的透明质酸时程确定患有急性肾损伤的患者是否需要长期透析。
文档编号A61M1/14GK102216776SQ200980145824
公开日2011年10月12日 申请日期2009年9月24日 优先权日2008年9月26日
发明者K·星格巴特尔, 小J·A·科勒姆 申请人:匹兹堡大学高等教育联邦体系