专利名称：具有纤溶亢进的凝血病的治疗的制作方法
具有纤溶亢进的凝血病的治疗
技术领域：
本发明涉及具有纤溶亢进的凝血病的领域。更具体而言，本发明涉及治疗血友病疾病，诸如血友病A或血友病B。
背景技术：
血友病是损伤身体的控制血凝固或凝血的能力的一组遗传性遗传病症，所述凝血在血管破裂时用于停止出血。血友病A，最常见的形式，产生自因子VIII的基因突变；血友病B，也称为Christmas病，产生自因子IX的基因突变。血友病B，如血友病A，是X连锁的及占血友病病例的约12%。症状与血友病A的相同损伤之后过量的出血；及自发出血，尤其进入承重关节，软组织及粘液膜。重复的出血进入关节导致关节积血，导致常常使需要关节置换的疼痛致残关节病。软组织中的血肿可导致坏死性凝集的血组成的假肿瘤；它们可阻碍，压缩或破裂到相邻器官和可导致感染。一旦形成，血肿难以治疗，甚至用手术。压缩之后的神经恢复差，导致麻痹。如果不检测，涉及消化道，中枢神经系统，或气道/腹膜后空间的那些出血发作可导致死亡。颅内出血是血友病患者死亡的主要原因。在美国估计有100，000例先天性血友病。这些中，约20，000是血友病B的情况， 该患者的血或者完全缺乏因子IX，或血浆因子IX组分严重地缺陷。因此疾病存在改变程度的严重性，需要从每周达一年一次或两次的治疗。完全缺陷情况需要每周一次替代治疗；部分缺陷情况需要仅当出血发作发生时治疗，其可稀少至一年一次。先天性，部分缺陷情况中的出血发作通常由暂时获得的感受性而非由损伤单独导致。静脉内注射足够大量的新鲜血浆，或相当的量的新鲜血暂时校正缺陷受试者的缺陷。有益效应常常持续2或3周，尽管通过对患者的血体外测试测量的凝固缺陷呈现改善仅2或3天。该用新鲜血浆或新鲜血的治疗有效，但其具有几个严重的缺点(1)其需要大量的新鲜血浆的现成可利用性；(2)需要血浆施用的住院治疗；(3)大量的患者成为致敏于重复的血或血浆输注及最终遭遇致死的输注反应；(4)至好血浆可仅部分缓和缺乏；及(5)延长的治疗或手术是不可能的，因为需要的大量的血或血浆会导致急性和致死的水肿。改善的治疗包括用因子VIII或因子IX浓缩物静脉内替代治疗。但是，此治疗也有几个缺点(1)当治疗主要出血发作时，甚至在迅速检测和治疗之后仍保留组织损伤； (2)大量的患者成为用凝血因子难治，且发展针对凝血因子的抑制性抗体(所谓的具有抑制物的血友病)；(3)尽管改善的病毒灭活方法，仍有增加的被致死的病毒诸如HIV和丙型肝炎污染的风险(在USA，估计大于50%的血友病群，超过10，000人，自变质的血供给感染 HIV) ； (4)，在发展中国家，分离的且尤其重组体凝血因子非常昂贵，且通常不可利用。在替代治疗外治疗或预防出血是挑战，因为在血友病中出血是可归因于如下三重缺陷的复合病理生理过程(1)减少的经低组织因子浓度的外在通路的凝血酶产生，(2)减少的经固有通路的凝血酶产生的次级爆发，及(3)纤溶系统被固有通路的缺陷性下调。通常接受这样的事实，减少的凝血酶产生导致减少的凝固倾向，由此导致增加的出血风险。但是，过去的几十年的工作表明，纤溶的缺陷下调也可在血友病中起到作用。结果，血友病也可分类为具有纤溶亢进的凝血病。新近出版物通过体外显示，当在因子VIII耗竭的及补充了组织纤溶酶原活化物tPA的血浆(FVIII-DP)中形成凝块时，纤溶不充分下调，结果凝块溶解提前，从而支持此推定(Broze and Higuchi, Bloodl996,88 3815-3823 ；Mosnier et al. ； Thromb. Haemost. 2001,86 1035-1039)。此外，可显示，此“成熟前溶解”是由于凝血酶_可活化的纤溶抑制剂(TAFI)的减少的或缺乏的活化(Broze和Higuchi，1996)，且显示，在FVIII-DP 中，含有活化的TAFI的混合物增加凝块溶解时间。从而得出，稳定的TAFI可用于治疗血友病(W002/099098)。TAFI在纤溶下调中起到关键的作用，其为稳定的凝块形成所需要。也称为血浆羧肽酶原B2或羧肽酶原U的TAFI是血浆酶原，当其暴露于凝血酶-血栓调节素复合物时，在 Arg92通过蛋白水解转变为碱性羧肽酶(TAFIa或活化的TAFI)，其抑制纤溶。其通过自纤维蛋白去除C-端赖氨酸和精氨酸残基有利地衰减纤溶，所述纤维蛋白对于结合及活化纤溶酶原重要。如上所述，与凝血酶复合的血栓调节素(TM)负责TAFI活化。血栓调节素是发挥衬于血管的内皮细胞上的凝血酶受体的作用的膜蛋白。凝血酶是凝血级联中的中心酶，其将纤维蛋白原转变为纤维蛋白，基质凝块形成。起初，局部损伤导致小量的凝血酶从其无活性前体凝血酶原产生。进而，凝血酶活化血小板，且其次，某些凝血因子包括因子V和VIII。 后来的作用产生所谓的凝血酶爆发，大量活化的额外的凝血酶原分子，其最终导致稳定的凝块形成。但是，当结合到血栓调节素时，凝血酶活性趋势性变化凝血酶-血栓调节素复合物的主要特征是其活化蛋白C的能力，其然后通过蛋白水解地灭活必要的辅因子因子Va和因子 VIIIa 下调凝血级联(Esmon et al.，Ann. N. Y. Acad. Sci. (1991)，614 :30_43)，由此提供抗凝活性。凝血酶_血栓调节素复合物也能活化凝血酶_可活化的纤溶抑制剂(TAFI)， 其然后拮抗纤溶(见以上)。成熟人TM由559个残基的单多肽链组成，及由具有下列位置(SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3给出的氨基酸位置)的5个结构域组成氨基末端"凝集素-样"结构域，包含6 个表皮生长因子(EGF)-样重复子的"6EGF-样重复结构域"，0-糖基化结构域，跨膜结构域和细胞质结构域
权利要求
1.血栓调节素类似物用于生产治疗具有纤溶亢进的凝血病的药物的用途，其中所述 TM类似物特征在于以治疗有效剂量呈现抗纤维蛋白溶解效应。
2.权利要求1的用途，其中所述血栓调节素类似物呈现一个或更多下列特征(i)与凝血酶的结合亲和力相比兔肺血栓调节素降低，和/或与凝血酶的结合亲和力具有大于0. 2nM的kD值；和/或(ii)相比TM类似物TMeM388L的辅因子活性减小的辅因子活性，(iii)相比TM类似物TMeM388L增加的TAFI活化活性与辅因子活性比。
3.权利要求1或2的用途，其中具有纤溶亢进的凝血病选自下列疾病血友病A，血友病B，血友病C，von Willebrandt病(vWD)，获得性von Willebrandt病，因子X缺乏，副血友病，凝血因子I，II，V或VII的遗传性病症，循环抗凝剂所致的出血性病症或获得性凝血缺乏。
4.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物用于治疗选自下列的一种或更多种出血事件颅内或其他CNS出血，关节、微毛细管、肌肉、消化道、呼吸道、腹膜后空间或软组织出血。
5.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物在出血发作时施用。
6.权利要求1 3中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物在增加的出血风险，例如手术或拔牙之前施用。
7.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物施用给用血/血浆输注或凝血因子取代治疗难治的患者。
8.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物以多剂量施用，优选在跨不到1周至4周的整个时期每天，每两天或每3天，每4天，每5天，每6天或每7天一次， 更优选作为慢性施用。
9.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物作为肠胃外应用给予， 可优选作为静脉内或皮下应用给予。
10.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物是可溶性TM类似物。
11.权利要求10的用途，其中所述血栓调节素类似物是人可溶性TM类似物。
12.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物包含选自下列的至少一种结构域EGF3，EGF4，EGF5，EGF6，优选包含片段EGF3 EGF6和更优选包含EGF结构域 1 6。
13.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物由EGF结构域EGFl EGF6组成，且更优选由EGF结构域EGF3 EGF6组成。
14.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物具有对应于成熟血栓调节素的氨基酸序列(SEQ ID NO :1或SEQ IDNO :3所示)的氨基酸序列，且包括一种或更多种以下修饰(a)去除氨基酸1 3(b)M388L(c)R456G(d)H457Q(e)S474A，及以 P490 终止。
15.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物具有包含与SEQID NO 2具有至少85%，或至少90%或95%序列同一性的序列的氨基酸序列。
16.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物在对应于天然序列的下列位置(根据SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3)的一个或更多位置具有氨基酸修饰(aa349Asp(bb355Asn(ac357Glu(ad358Tyr(ae359Gln(af361Gln(ag363Leu(ah364Asn(ai368Tyr(aj371Val(ak374Glu(al376Phe(am384His(an385Arg(ba387Gln(bb389Phe(be398Asp(bd400Asp(be402Asn(bf403Thr(bg408Glu(bh411Glu(bi413Tyr(bj414Ile(bk415Leu(bl416Asp(bm417Asp(bn420Ile(bo423Asp(bp424Ile(bq425Asp(br426Glu(ca428Glu(cb429Asp(cc(Cd(ce(Cf (Cg (ch(Ci (Cj (ck(Cl(cm (cn
17.432Phe 434Ser 436Val 438His 439Asp 440Leu 443Thr 444Phe 445Glu 456Arg 458Ile ；或者 461Asp0以上权利要求中任--项的用途，其中所述血栓调节素类似物在根据SEQ ID NO 1或SEQ ID NO :3的第376位具有苯丙氨酸的修饰，优选取代为脂肪族氨基酸，更优选取代为甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸，以及最优选取代为丙氨酸。
18.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物具有一个或更多根据 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的下列氨基酸的修饰(a)387Gln ；(b)388Met ； (b) 389Phe,其中氨基酸缺失，插入一个或更多额外的氨基酸或优选取代。
19.以上权利要求中任一项的用途，其中所述血栓调节素类似物以其氧化的形式使用， 优选用氯胺T，过氧化氢或高碘酸钠氧化。
20.权利要求19的用途，其中TM类似物中的一个或更多甲硫氨酸残基被氧化，优选第 388位的甲硫氨酸残基(根据SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3)。
21.用于筛选适于治疗具有纤溶亢进的凝血病的血栓调节素的类似物的方法，其中血栓调节素呈现一个或更多下列特征(i)减小的与凝血酶的结合亲和力， ( )减小的辅因子活性， (iii)增加的TAFI活化活性， 包括下列步骤(a)制造血栓调节素序列(SEQID NO :1或SEQ ID NO 3)的一个或更多氨基酸取代， 优选在权利要求15中列出的氨基酸位置；(b)就一个或更多下列特征，比较修饰的类似物与对照分子，可优选为兔肺TM或可溶性人TM类似物(ba)与凝血酶的结合亲和力(KD值)；(bb)辅因子活性；(be) TAFI活化活性或TAFIa势； (bd)TAFI活化活性和辅因子活性的比；(be)蛋白氧化的效应；(bf)体外测定中对及时凝块溶解的效应；或者(bg)在凝血_关联的动物模型中的效应。
22.治疗具有纤溶亢进的凝血病的方法，包含施用治疗有效量的权利要求1 20中任一项的血栓调节素类似物。
全文摘要
本发明涉及血栓调节素类似物用于生产治疗具有纤溶亢进的凝血病的药物的用途，诸如血友病病症。这些血栓调节素类似物以治疗有效剂量呈现抗纤维蛋白溶解效应。公开了新蛋白修饰以及它们的鉴定方法。
文档编号A61K38/36GK102481344SQ200980160203
公开日2012年5月30日 申请日期2009年6月12日 优先权日2009年6月12日
发明者J·H·弗雷, K-U·皮德森, M·E·纳舍姆 申请人:帕昂德国有限公司