专利名称：白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的基因序列及其氨基酸序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛇毒蛋白纤溶酶编码基因序列及其氨基酸序列。
背景技术：
纤溶酶是指能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶，是纤溶系统中的一个重要组份。体内凝血和纤溶两系统是相互依存紧密相联的。机体一旦产生凝血反应，也几乎同时激活了纤溶系统，使体内多余的血栓移去，并通过负反馈效应使体内纤维蛋白原的水平降低，从而避免纤维蛋白的过多凝聚。蛇毒纤溶酶的分布是十分广泛的，有报道称几乎所有的响尾蛇毒均有纤溶组分。Fuffado等曾检测了 9种矛头蝮蛇蛇毒发现均含有纤溶活性。迄今为止已从蝰科眼镜蛇科及游蛇科的多种蛇毒中获得了纯化的纤溶酶，其中分布最广，含量最丰富的是蝰科中的蝮亚科蛇毒纤溶酶，能直接降解纤维蛋白原的Aa或80链，使其即 使在凝血酶存在下也不凝固，大多数可以溶解纤维蛋白根据它优先降解纤维蛋白原Aa或
肽链分为a纤溶酶和0纤溶酶。纤溶酶一般只作用于A a或80肽链。根据纤溶酶结构特点还可分为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。目前国内临床上所使用的纤溶酶均为从动物体内提取，纯度不高，具有一定的抗原性，进入人体后，可能诱发一系列的抗原抗体反应，已有报道注射纤溶酶导致固定性药疹及重症多形红斑药疹，且不能实现静脉注射给药，使药物不能最大限度发挥作用。经过多年的临床实践，发现白眉蝮蛇蛇毒类纤溶酶有最好的疗效。然而蛇毒资源是非常有限的，如果通过基因工程来获得产品，则是一个很有前途的途径。为了今后基因工程产品的开发，对白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶进行基因序列测定是一项有意义的研究课题。为此，本发明的目的是通过测定白眉蝮蛇蛇毒类纤溶酶N端的一段氨基酸序列，根据这段序列及其它蛇种纤溶酶在结构上的同源性，设计并合成上下游寡核苷酸引物，然后从白眉蝮蛇蛇毒腺中分离有关的m RNA作为模板，经反转录获得c DNA，用PCR法扩增和克隆了纤溶酶的全基因，分析测定基因的全序列。
发明内容
本发明的目的在于提供白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的编码基因序列。本发明的另一个目的是提供白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的氨基酸序列。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案I、总 RNA 提取切下蛇头，立即取出毒腺，与液氮中速冻，置于-70°C备用，采用酸性硫氰酸月瓜 _ 酿 _ 氯仿一步法(参阅 Chomczynski P. et al. Analytical Biochemistry. 1987,162 156)抽提毒腺总RNA。2、引物设计依据，引物合成的方法根据测定的纤溶酶成熟蛋白N端的氨基酸序列，结构为VIGGDECNINEHRSL，设计了上游寡核苷酸引物，即5’ GTCATTGGAGGTGATGAATGTAACATA 3’ ；根据其它蛇种纤溶酶结构上的同源性(Arinos Magalhaes. , Beatriz Campos Brasil Da Fonsecaa, et al, 1993. Thecomplete amino acid sequence of a thrombin-like enzyme/gyroxin analogue fromvenom of the bushmaster snake(Lachesis muta muta).Eur. J. Biochem. 251,845 853.)在3’端的保守区段设计了下游寡核苷酸引物，即5’TCACGGGGGGCATGTCA 3’。引物在上海生工生物技术有限公司合成，引物见图2。3、反转录、PCR扩增和基因克隆以白眉蝮蛇毒腺总RNA为模板，下游引物为引物作反转录。反转录试剂盒购自天根生化科技有限公司，操作按其说明书进行。从前步所得c DNA为模板，以合成的上下游引物进行PCR扩增。PCR扩增出一条约700bp的DNA片段，见图3琼脂糖凝胶电泳图谱。采用 天根生化科技有限公司的胶回收试剂盒回收该PCR产物。将回收的PCR产物插入pGEM-Teasy载体(质粒载体购自Promega公司)，并转入DH 5 a大肠感受态细胞,经蓝白斑筛选和酶切鉴定，获得10个阳性克隆。将阳性重组克隆经pGEM-T easy载体克隆位点上、下游通用引物进行DNA测序，得到本发明的的白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶编码基因的DNA (mRNA)序列。使用DNAMAN软件，根据这个蛇毒纤溶酶编码基因的DNA(mRNA)序列，得出该蛇毒纤溶酶的蛋白质的一级结构(氨基酸序列)。本发明的优点在于白眉蝮蛇是我国特有的蛇种，其纤溶酶的活力及疗效远优于其他来源的纤溶酶，然而蛇毒资源有限，本发明克隆得到纤溶酶基因并测定其基因序列，为今后开发研制基因工程产品创造了良好的条件。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，并非对没发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图I白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的核苷酸和氨基酸序列。a :纤溶酶的核苷酸序列；b :纤溶酶的氨基酸序列。图2合成的寡核苷酸上游引物和下游引物。图3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。I :纤溶酶的PCR产物；2 :阴性对照；3 DL2000Markero图4几种蛇毒来源的纤溶酶的氨基酸组成。图5去糖后纤溶酶的SDS-PAGE电泳图。I :去糖后的纤溶酶；2 :蛋白标准Marker。
具体实施例方式实施例II、总 RNA 提取切下蛇头，立即取出毒腺，于液氮中速冻，置于_70°C备用。取出IOOmg毒腺组织，加Iml溶液D (含4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，p H7. 0 ;5 %十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl),0. IM P -巯基乙醇)，在组织匀浆器中充分匀浆后，将匀浆液转入IOml离心管中，再加入0. Iml 2M的乙酸钠(pH4)，Iml的水饱和酚和0. 2ml的氯仿异戊醇(49 I)混合物，充分振荡混勻后，在冰上静置15min。样品在日立冷冻离心机(Hitach Centrifuge20PR-52D)以IOOOOg于4°C离心20min，吸取上层水相，与等体积异丙醇混匀，置_20°C冷冻至少I小时。以IOOOOg离心20min收集沉淀并溶于0. 3ml溶液D，加入0. 03ml2M乙酸钠和
0.3ml异丙醇，混匀，置于_20°C冷冻I小时。以IOOOOg离心20min收集沉淀再溶于0. 3ml焦炭酸二乙酯(DEPC)处理过的H20，再加入0. 03ml乙酸钠和0. 75ml乙醇，混匀，置于_20°C冷冻I小时，以IOOOOg离心20min收集沉淀，用75%洗涤RNA沉淀，自然干燥后将RNA溶于DEPC处理过的水中，分装，置于_70°C备用。2、引物设计依据，引物合成的方法本发明根据测定的纤溶酶成熟蛋白N端的氨基酸序列，结构为VIGGDECNINEHRSL，设计上游寡核苷酸引物为5’ GTCATTGGAGGTGATGAATGTAACATA 3’ ；根据其它蛇种纤溶酶结 构上的同源性(Arinos Magalhaes. ,Beatriz Campos Brasil Da Fonsecaa, et al, 1993.The complete amino acid sequence of a thrombin-like enzyme/gyroxin analoguefrom venom of the bushmaster snake(Lachesis muta muta). Eur. J. Biochem. 251,845853.)在3’端的保守区段设计了下游寡核苷酸引物，即5’ TCACGGGGGGCATGTCA 3’。引物在上海生工生物技术有限公司合成，引物见图2。3、反转录、PCR扩增和基因克隆以白眉蝮蛇毒腺总RNA为模板，上述的下游引物为引物作反转录。反转录试剂盒购自天根生物科技有限公司，操作按其说明书进行。从前步所得c DNA为模板，以上述的上下游引物进行PCR扩增。反应的总体积为30iil，其中3iil 10XPCR缓冲液，d NTP的终浓度为0.2m M和0. 3 y I Taq DNA聚合酶(购自Takara公司)。反应条件为95°C变性5min，然后95°C变性30s，59°C退火40s，72°C延伸30s，进行40个循环；最后72°C保温lOmin。取8 反应产物经I %琼脂糖电泳检查。PCR扩增出一条700bp左右的DNA片段，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳见图3。产物用天根生化科技有限公司的胶回收试剂盒进行胶回收。将回收的PCR产物插入pGEM-T easy载体(质粒载体购自Promega公司)，连接体系lOiil，其中PCR产物liil，pGEM-T easy载体0. 5，T4连接酶liil，2X连接缓冲液5 yl，dd H20 2. 5iU，4°C过夜。将连接产物转入DH 5a大肠感受态细胞，经蓝白斑筛选和酶切鉴定，获得10个阳性克隆。将阳性重组克隆经pGEM-T easy载体克隆位点上、下游通用引物进行DNA测序，得到本发明的的白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶编码基因的DNA(mRNA)序列。使用DNAMAN软件，根据这个蛇毒纤溶酶编码基因的DNA(mRNA)序列，得出该蛇毒纤溶酶的一级结构(氨基酸序列)。实施例2生物活性测定I、纤溶酶活力定性测定纤维蛋白原在凝血酶的作用下转变成纤维蛋白，在试管中形成乳白色凝块，加入含纤溶酶样品，纤溶酶作用于纤维蛋白，使之转变成可溶性的小分子肽和氨基酸，凝块溶解，呈液体状态，凝块溶解所需时间与纤溶酶活性大小相关。依据中华人民共和国药典二部1995年版，略有改进，试管中加入150ul 6. 5mg/ml的Fg，再加入400ulGBSB缓冲液(明胶-巴比妥-Nacl缓冲液)和IOOul待测样品置37°C恒温水浴中，3分钟后加入3u/ml T IOOul和I. 5u/ml Pg lOOul，尽快混匀，37°C继续保温，观察试管中凝块形成之后不同时间的不同溶解程度。结果向纤维蛋白中加入提取后的纤溶酶后，纤维蛋白转变成可溶性的小分子肽和氨基酸，凝块溶解，呈液体状态，证明该蛋白酶具有纤溶酶活性，称之为蛇毒类纤溶酶。比活的定量测定纤维蛋白平板上打上直径I. 5mm的小孔，将待测样品配制成合适浓度，微量进样器取几滴在孔内，加盖，37°C 12小时后测量溶圈直径，与标准曲线对照即可得知待测样品的酶活。尿激酶标准曲线精确配制尿激酶标准浓度分别为5，10，20，40，60，80u/ml每个浓度取10ml，点在已配置好的平板上，加盖后，37°C恒温12小时后取出量取每个溶圈的互相垂直的两个直径(mm)，不同时日反复测定5次，然后求得平均值列入表中，以标准尿激酶浓度(u/ml)为横坐标，溶圈的直径乘积(_ 2)为纵坐标，做尿激酶标准曲线。作为测活的两种方法，试管法和平板法对纤溶物质均有一定的敏感性，较好的重 复性和稳定性。试管法操作简便、快速，但定量性较差，适于中间产物的活性测定。平板法敏感、定量法好于试管法，适于最终产物的活力测定。但这两种方法对于纤溶酶的活力测定都有不足之处。尿激酶是激活纤维蛋白溶酶，而我们提取出的纤溶酶是直接溶解纤维蛋白，作用机制并不完全相同。但目前国内外尚无纤溶酶标准品，以尿激酶作为标准品是较现实的方法之一。实施例3氨基酸组成测定于小试管中加一定量样品，加Iml 6mol/L HCl及一滴巯基乙醇,减压封管。在105-110°C烘箱中水解24小时，打开封管，抽出HCl气体，在氨基酸自动分析仪L-8500上测
氨基酸组成。该蛇毒纤溶酶的氨基酸组成，与同源性其他蛋白对比情况见图4。由本发明得到的蛇毒纤溶酶的氨基酸序列，其氨基酸组成与测定值一致。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方案及实验例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的编码基因序列，具有序列表中SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。
2.一种白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的氨基酸序列，具有序列表中SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.一种为克隆权利要求1、2所述的白眉蝮蛇蛇毒类纤溶酶基因而设计的人工合成寡核苷酸引物，其特征在于该引物序列如下 上游引物5 ’ GTTATTGGTGGCGATGAATGTAATATC 3， 下游引物5’ GCACGTACTGTGGGGG 3’
全文摘要
从白眉蝮蛇中分离纯化得到纤溶酶，测得该酶N端10个氨基酸的序列，据此设计上游引物；然后根据与其它蝮属蛇毒纤溶酶3’端非编码区同源性较高区域设计下游引物。从毒腺中抽提总RNA，用PCR扩增出该基因，克隆后经全序列测定表明该成熟蛋白的c DNA编码708个核苷酸，即236个氨基酸。该基因的成功克隆及基因序列测定为开发基因工程产品创造良好条件。
文档编号C12N9/68GK102719461SQ20121015299
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者宋梦薇, 张雅楠, 王云鹏, 罗云波, 许文涛, 马骉, 黄昆仑 申请人:中国农业大学, 北京赛升药业股份有限公司