专利名称：抗生育重组质粒、基因疫苗及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物与现代农业技术领域，涉及一种抗生育基因疫苗，更具体地说，本发明涉及一种含有大鼠细胞色素P450家族26超家族A多肽1 (Cyp26al)的抗生育基因疫苗、其制备方法及用途。
背景技术：
鼠及其它小型有害哺乳动物，每年对全球的农林牧业造成严重的损失。在澳大利亚东南地区谷物产粮区的家鼠(Mus domesticus)鼠害，平均每年损失2106吨粮食。80年代，我国农牧林业鼠害普遍大发生，每年农牧区发生鼠害的面积高达数千万公顷，减少粮食 100多亿公斤，牧草损失数百亿公斤，直接经济损失上百亿元。据联合国粮农组织估计，全球所生产的粮食有10%被鼠糟踏。每年，鼠及其它小型有害哺乳动物不仅对全球的农林牧业产量造成严重损失，还传播出血热、鼠疫等对人类身体健康甚至生命造成严重威胁的疾病。 目前常用的灭鼠药剂杀伤力虽强但残毒极大，严重污染环境。此外，鼠类的繁殖力极强，即使一次灭鼠率达95%，所剩的5%也能在一至两年内恢复到原有水平，使得人类要不断提高鼠药毒性，年复一年地投药，形成“灭-长-灭”的恶性循环，造成大面积的残毒污染。因此，既能长期有效地控制鼠害，又能维持生态平衡，降低环境污染，成为人类在鼠害控制研究过程中追求的目标。随着基因重组技术及基因载体传递系统的迅速发展，90年代初基因免疫技术问世。技术的核心是将编码抗原的核酸序列组装到含有必要表达调控元件的真核表达载体中构建基因疫苗，然后直接接种到动物机体中，重组的基因疫苗可以利用宿主体内的酶系合成外源基因编码的蛋白，从而诱导宿主机体对该外源蛋白产生特异性的免疫应答，从而达到免疫目的。许多动物模型和人体实验已证明核基因疫苗既可激活体液免疫，又能激活细胞免疫，基因疫苗与传统灭活疫苗、减毒疫苗相比具有免疫效果好、安全性较高、持久性、同种异株的交叉免疫保护作用、制备简便、成本低廉、便于贮藏和运输等许多全新的潜在优势。近十年来，基因疫苗在防治疾病、控制动物繁殖等许多方面的基础研究有重大突破。核酸疫苗的开发和应用的研究引起了世界各国的高度重视，许多企业相继投入巨资使之产品化。Cyp26al(retinoic acid hydroxylase)又称 P450RA1，是细胞色素 P450 (CYP)家族成员，即细胞色素P450家族26超家族A多肽1，尽管CYP26与细胞色素P450家族的成员具有相似的结构，但它与细胞色素P450家族的任何成员都不具有同源性，因此被认为是细胞色素P450的基因家族的一个新成员。White等1996年首次从斑马鱼中克隆得到该细胞色素P450家族的新成员P450RA1，其cDNA最初被称作CYP26，后被命名Cyp26al。之后，研究人员相继从人、小鼠和鸡的肝脏等器官组织中克隆到Cyp26al。RNA印迹分析表明，Cyp26al mRNA在肝脏、十二指肠、结肠、胎盘和脑部有表达。研究发现Cyp26al能将视黄酸(RA)选择性的转化为RA的极性代谢物(4-0H-，18-0H-,4-oxo-RA)。RA是维生素A的主要活性代谢物，能氧化维生素A转变为具有生物活性的4-氧视黄醇，Cyp26al通过调节RA水平进而控制类维生素A信号。有报道指出，类维生素A信号在胚胎发育中起了重要作用。给动物喂饲缺乏维生素A的饲料，胚胎发育出现异常，胚胎接受过多的类维生素A信号亦会破坏胚胎的正常发育。还有资料报道，小鼠妊娠期间过多的摄取RA可能导致胚胎发育不良，畸形的类型和程度与剂量相关，而且Cyp26al功能缺失能引起小鼠胚胎死亡。
发明内容
本发明人采用抑制消减杂交技术(SSH)，筛选大鼠植入前后子宫差异表达基因，通过RT-PCR和Northern blotting实验证实Cyp26al基因胚胎植入前后为差异表达基因。 用RACE方法首次克隆了 SD大鼠子宫Cyp26al基因的cDNA全长，并登录GenBank (登录号 DQ317305)。该基因与真核表达载体构建出基因疫苗后免疫雌性小鼠，显示Cyp26al基因疫苗具有明显的抗生育作用。因此，本发明的目的在于，提供一种用于哺乳动物抗生育基因疫苗的重组质粒及包括该重组质粒的基因疫苗。本发明的另一个目的在于，提供上述重组质粒及基因疫苗的制备方法及用途。本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种用于哺乳动物抗生育基因疫苗的重组质粒，其由Cyp26al基因的cDNA片段和真核表达载体组成，真核表达载体优选为PCR 3. 1。优选地，所述Cyp26al基因的cDNA片段源自Spreqne-Dawley大鼠子宫，其碱基序列优选如SEQ ID NO. 1所示。另一方面，本发明提供了包含上述重组质粒的菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌感受态DH5a菌株。本发明还提供了包含上述重组质粒的细胞，优选地，所述细胞选自人宫颈癌 (HeLa)细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。又一方面，本发明提供一种哺乳动物抗生育的基因疫苗，其中包含上述的重组质粒。优选地，所述基因疫苗还包含佐剂；更优选地，所述佐剂选自百分比浓度为0. 25%的普鲁卡因，每次注射佐剂用量与基因疫苗用量的体积质量配比为2(V/ μ ) 1(1/^0，具体优选佐剂用量与基因疫苗用量分别为10(^1和5(^8。还一方面，本发明提供一种制备上述重组质粒的方法，该方法采用如SEQ ID NO. 2 和SEQ ID而.3所示的碱基序列作为引物克隆所述07 26&1基因的(^嫩片段；优选地，所述方法中采用温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法克隆所述Cyp26al基因的cDNA片段。再一方面，本发明提供了上述重组质粒在制备哺乳动物抗生育基因疫苗中的用途，优选地，所述哺乳动物选自大鼠、小鼠、猴、兔和猪。本发明还提供了上述基因疫苗在哺乳动物抗生育药物中的用途，优选地，所述哺乳动物选自大鼠、小鼠、猴、兔和猪。本发明另外还提供了上述基因疫苗在预防和/或控制鼠害中的用途。综上所述，本发明克服现有技术还没有将基因疫苗应用抗生育控制鼠害的空白， 提供了一种可以明显抗生育控制鼠害的基因疫苗，该疫苗由含有编码细胞色素P450家族 26超家族A多肽1-Cyp26al蛋白的基因和筛选出的真核表达载体PCR 3. 1组成，所述编码细胞色素P450家族26超家族A多肽1-Cyp26al蛋白的基因为SD大鼠子宫的全长互补脱氧核糖核酸基因，此基因已登入基因文库(Cyp26al :DQ317305)。本发明将实验室研制的抗生育基因疫苗推向产业化，有效地控制鼠害，维持生态平衡，同时为人类控制生育提供新途径。由此可见，本发明所提供的pCR3. l_Cyp26al基因疫苗的优点在于(1)所需的免疫量较小，20 50微克即可；(2)基因疫苗能同时高效激发体液免疫和细胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更强；(3)不仅具有有效降低鼠生育的作用，而且还能明显减少新生仔鼠效果；(4)基因免疫安全、长效(免疫能力有长时间的记忆)、稳定且操作便捷。
图1为本发明实施例1中妊娠大鼠子宫总RNA电泳图。图2为本发明实施例2中由Cyp26al基因的cDNA片段和真核表达载体pCR 3. 1 构建的重组质粒谱图。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。在以下各实施例中，所涉及的提取细胞总RNA、酶切、质粒纯化、RT-RCR方法、 ELISA方法、细胞转染等分子生物学手段和技术的具体操作方法参见《精编分子生物学实验指南》F.奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社，1998。在以下各实施例中，所使用的实验动物Spreqne-Dawley大鼠、BaLb/c小鼠和昆明白(KMB)小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实施例1 克隆大鼠子宫Cyp26al的cDNA全长本实施例为大鼠子宫Cyp26al的cDNA全长克隆，具体步骤如下(1)动物组织取材选取性成熟，体重220_260g的Spreqne-Dawley雌性大鼠，在动情期与雄性大鼠(1 1)合笼交配，取妊娠D3-D6子宫，剔净系膜组织和胚胎。(2)妊娠子宫总RNA的提取及纯化采用Promega公司RNAgents⑧总RNA提取系统(Total RNA Isolation System kit)提取妊娠子宫总RNA，使用TRIzol —步法提取组织总RNA，具体操作如下1ml TRIzol与子宫组织约50_100mg加入灭菌的勻浆管中， 用灭菌剪刀剪碎组织，勻浆破碎后转入Eppendorf管，加入0. 2ml氯仿，摇动15sec，室温静置2-3min，12，000rpm离心15min(4°C )，取上清至以新的Eppendorf管，加入0. 5ml异丙醇，轻轻混勻，室温静置lOmin，12，OOOrpm离心IOmin(4°C )，弃上清，加入Iml 75% 乙醇清洗沉淀，7，500rpm离心5min(4°C )(此步重复两次)，真空自然干燥，加入无核酸酶(Nuclease-free)的水500 μ L溶解，-80°C保存。取5 μ L样品溶液进行1. 5 %甲醛变性琼脂糖凝胶(含0. 2 μ g/mL EB)电泳检测(具体方法参见Jian-Jun Chang, Jing-Pian Peng*YingYang,Jing-Lingffang,LiXu(2006)Study on the Anti-fertility Effects ofthe Plasmid DNA Vaccine Expressing Partial brLDH-C4. Reprod. 131 :183_192)。凝胶条带分析结果如图1所示，表明在所制备的样品中，28SrRNA的量约为18S rRNA的二倍。(3)设计特异性引物根据人、鼠Cyp26al基因序列始密码子以及终止密码子外端的高度保守序列，设计扩增全长Cyp26al基因的特异性引物(带有酶切位点)，其序列如下上游引物(SEQID NO. 2)5' -CGA AGC TT(HindIII)A TGG GGC TCC CGG CGC TGC T—3'；下游引物(SEQID NO. 3)5' -CGCTC GAG(XhoI)TCAGATATCTCCCTGGAAGTGG-3‘。(4)克隆并扩增Cyp26al基因采用温度降落逆转录_聚合酶链式扩增方法 (TDRT-PCR, Touch-down reverse transcription polymerase chainreaction)克隆扩增大鼠子宫Cyp26al基因cDNA序列，具体操作如下50yL的反应体系由IOyL的AMV/Tfl 5 X 反应缓冲液、2mM的dNTPs混合物、2mM的MgSO4U μ M的上游引物及上游引物、0. IU/μ L的 AMV逆转录酶(promega产品，购自北京泽平科技有限责任公司)、0. IU/μ L的RNasin 核酸酶抑制剂(购自Sigma公司)、2 μ g总RNA和无核酸酶的水组成，并覆盖50 μ L无核酸酶矿物油。逆转录反应在48°C反应45min，接着在95°C灭活5min，启动TD-PCR扩增反应，具体操作如下在第一个变性步骤时加入0. IUz^LWTfl DNA聚合酶(promega产品，购自北京益利精细化学品有限公司)，在降落TD-PCR扩增阶段，变性温度为94°C lmin，退火温度从开始65°C lmin,以每两个循环下降1°C的速度降至55°C lmin，延伸温度为68°C 1. 5min ； 最后在以退火温度58°C继续扩增15个循环，再于72°C延伸lOmin。(5)回收纯化Cyp26al cDNA 利用Wizard PCR Pr印s. DNA树脂纯化体系试剂盒(promega产品，购自北京益利精细化学品有限公司)回收纯化TDRT-PCR方法扩增的Cyp26al基因cDNA片段。本发明克隆出大鼠子宫Cyp26al的全长基因，其序列如SEQ ID N0.1所示，其 GeneBank 登录号为 DQ317305。实施例2 构建包含Cyp26al的重组质粒本实施例为本发明包含Cyp26al的重组质粒的构建，是将Cyp26al全长cDNA片段重组到PCR 3. 1真核表达质粒(Irwitrogen产品，购自北京中原领先科技有限公司)中， 具体的质粒图谱见图2，构建成的重组质粒即抗生育的PCR3. l_Cyp26al基因疫苗，具体操作如下将实施例1纯化回收后扩增的PCR产物Cyp26al cDNA片段，连入pMD18_T载体 (Takara产品，购自北京六合通经贸有限公司)并转化DH5ci感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)。挑取阳性克隆摇菌，测序鉴定正确后，小提质粒PMD18-T-Cyp26al (采用小提质粒试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司，具体操作方法参见试剂盒说明书)。用Hind ΙΙΙ/Xba I在37°C双酶切pMD18-T_Cyp26al和pCR3. 1，产物纯化回收采用 Qia28704胶回收试剂盒(购自北京北方仪涛商贸有限公司，具体操作方法参见试剂盒说明书)后，将Cyp26al片段与pCR3. 1在DNA连接酶(promega产品，购自北京益利精细化学品有限公司)作用下连接得到PCR3. 1-Cyp26al。经酶切及测序鉴定正确后，按照Qiagen大提质粒试剂盒操作步骤大量提取PCR3. l_Cyp26al，并利用紫外分光光度计(美国Beckman，型号DU530)定量。实施例3 :pCR3. l_Cyp26al基因疫苗的体外表达鉴定本实施例为对实施例2所构建的pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗，进行外源Cyp26al基因体外瞬时表达和表达含量的鉴定，分为Cyp26al基因的体外mRNA表达和外源Cyp26al体
6外蛋白表达两部分。(l)Cyp26al基因的体外mRNA表达建立人宫颈癌(HeLa)细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(购自北京协和医科大学基础所细胞中心)体外瞬时表达系统，具体操作如下PCR3. 1-Cyp26al真核表达质粒经脂质体转染，分别于24小时、48小时、72小时收集培养液，提取收集的转染HeLa细胞和CHO细胞的总RNA，采用RT-PCR方法分析Cyp^al基因的体外表达。RT-PCR方法扩增出Cyp^al cDNA条带，结果表明pCR3. 1-Cyp26al真核表达质粒在HeLa细胞和CHO细胞体外瞬时表达系统中在mRNA水平上能高效表达，mRNA水平的表达量比对照组(不含Cyp^al基因的空质粒)分别高出186%和172%.(2)外源Cyp^al体外蛋白表达采用免疫荧光的方法检测转染HeLa细胞和CHO细胞的Cyp^al蛋白的表达，具体操作如下取转染4 后的HeLa细胞和CHO细胞加入4%多聚甲醛室温固定lh，0. Triton X-IOO加0. 1 %柠檬酸三钠通透lOmin，PBS漂洗3次，然后1 % BSA室温封闭lh， 再加入1 50稀释的抗血清(免疫小鼠血清为一抗)4°C孵育过夜。PBS彻底洗净后，加入 FITC标记的羊抗鼠二抗(Jackson产品，购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，37°C孵育 lh, PBS漂洗后用20 μ g/mL碘化丙啶(PI)在4°C染色2min，PBS漂洗，防猝灭剂封片。激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司，型号LSM 510META) 488nm和564nm激发波长下观察分析。免疫荧光结果证实PCR3. 1-Cyp26al能在Hela细胞和CHO细胞体外瞬时表达系统中产生具有生物活性的Cyp26al蛋白，蛋白水平的表达量比对照组(空质粒)分别高172%和 146%。实施例4 :pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗的体内表达鉴定本实施例为对实施例2所构建的pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗，进行体内外源 Cyp26al基因表达和表达含量的鉴定，具体操作如下将BALB/C小鼠机分为3组，每组25只，实验组肌肉注射50 μ gpCR3. 1-Cyp26al基因疫苗；对照组1肌肉注射50 μ g PCR3. 1空质粒DNA ；对照组2肌肉注射100 μ L生理盐水。第3周后收集pCR3. 1-Cyp26al免疫BALB/C小鼠的肌肉、肝脏和脾脏组织，提取组织总RNA (采用常规Trizol法，Invitrogen产品，购自北京茂健联星科技有限公司，具体操作方法参见试剂盒说明书)，RT-PCR检测外源Cyp^al基因在BALB/C小鼠体内的表达情况。 检测结果表明，pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗免疫后肌肉、肝脏和脾脏组织细胞中Cyp^al在 mRNA水平上表达，mRNA水平的平均表达量比对照组(空质粒)高出286%。实施例5 =ELISA检测pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗体液免疫应答的检测本实施例为对实施例2所构建的pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗，进行ELISA检测 BALB/C小鼠体液免疫应答，具体操作如下实验分组与PCR3. I-Cyp^al基因疫苗注射方式与部位与实施例4相同。用 1 100倍稀释的正常血清(未射任何质粒)和1 100倍稀释的肌肉注射50yg PCR3. 1 空质粒DNA的血清分别作为对照，收集PCR3. 1-Cyp26al基因疫苗免疫BALB/C小鼠三周后的血清按1 100到1 6000的比例稀释，以2yg/孔的BALB/C小鼠子宫蛋白作包被抗原， 1 2000的羊抗小鼠IgG-HRP 50 μ L/孔作二抗，用酶标仪(美国Bio-Rad3550Microplate Reader)测定490nm OD值。采用ELISA方法检测体液免疫应答，检测结果显示，PCR3. I-Cyp^al基因疫苗免疫后机体能产生高滴度抗体(抗体滴度> 1 4500)。参照实施例2中所述的方法分别以PCMV4和pVAXl 二种载体构建出包含Cyp^al 的重组质粒，按照上述方法进行了免疫小鼠ELISA检测pCMV4-Cyp26al、pVAXl-Cyp26al基因疫苗体液免疫应答的检测，检测结果显示，pCMV4_Cyp^al和pVAXl-Cyp^al基因疫苗免疫后机体能产生的抗体滴度分别为1 3500和1 2800，因此，确定pCR3. I-Cyp^al基因疫苗所取得的免疫应答明显效果优于其他载体与Cyp^al基因cDNA构建的基因疫苗实施例6 :pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗的安全性评估本实施例评估实施例2所构建的pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗对免疫动物的安全性， 具体操作如下检测不同剂量QO μ g-300 μ g)PCR3. l"Cyp26al基因疫苗免疫35只BALB/C小鼠， 180天后无一只死亡；进行不同剂量PCR3. I-Cyp^al基因疫苗注射动物后的毒理性和常规生理指标的观察测定，利用组织化学方法(具体方法参见《实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术》蔡文琴、王伯沄主编，四川科学技术出版社，1994)确定注射疫苗后动物组织病理变化对脑、心、肝脏、脾脏、肺、肾、子宫和肌肉组织等相应组织器官进行冰冻切片，在显微镜(日本Nikon仪器型号Nikon 80i Microscope System ；冷CCD SPOT)下观察，没有发现动物组织有病理变化。实施例7 :pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗免疫抗生育实验本实施例为使用实施例2所构建的pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗，对不同鼠种进行免疫抗生育实验(1)免疫抗生育实验-I选取性成熟，体重220160g的Spreqne-Dawley (SD)雌性大鼠45只，雄性大鼠45 只。动物饲养于人工控制的条件下，饲养温度在25°c左右，光照周期，自由采食、饮水。45只雌性SD大鼠随机分为三组，每组15只。免疫质粒前24h注射100 μ L免疫佐剂 0. 25%普鲁卡因，注射前酒精局部消毒，接种部位腿部肌肉三点注射。对照组1 接种100 μ 1生理盐水。对照组2 接种100 μ 1 pCR3. 1空质粒(含pCR3. 1空质粒50 μ g)。实验组接种100 μ 1 PCR3. l_Cyp26al基因疫苗(含PCR3. l_Cyp26al基因疫苗 50 μ g)，上述3组间隔1周免疫一次，共接种免疫三次。经三次免疫后与雄性大鼠1 1 合笼交配，验栓阳性为妊娠第1天(验栓的具体方法参见《小鼠胚胎操作实验指南》A.纳吉等人著，科学出版社，2004)。免疫抗生育实验中，对照组1(生理盐水处理组)的生育率为93%，对照组 2(pCR3. 1处理组)的生育率为100%，实验组(PCR3. I-Cyp^al基因疫苗处理组)的生育率为35.7%。与对照组相比，实验组生育率显著降低(P <0.01)，实验组新生大鼠只数(Fl) 也显著低于对照组。具体的实验结果统计，如表1所示。表1本发明基因疫苗对SD雌性大鼠的免疫抗生育实验结果
8组别只数验栓阳性分娩生育率Fl只数(只)(只)(只)(%)对照组11514139311. 6 士 0. 65 (η= 152 )对照组215131310012.4±0.75 (η= 162 )实验组1514535.1**7. 1 士 0. 82 ( η= 36 ) **#表示差异极显著(P < 0. 01)结论pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗免疫具有降低Spreqne-Dawley雌性大鼠生育的作用，与对照组1和对照组2相比抗生育的效果显著(ρ < 0. 01)。(2)免疫抗生育实验-II选取性成熟的雌性BaLb/c小鼠75只，雄性BaLb/c小鼠75只。动物饲养于人工控制的条件下，饲养温度在25°C左右，12h:12h光照周期，自由采食、饮水。75只雌性BaLb/ c小鼠随机分为三组，每组25只。免疫质粒前24h注射100 μ L免疫佐剂0. 25%普鲁卡因， 注射前酒精局部消毒，接种部位腿部肌肉三点注射。对照组1 接种100 μ 1生理盐水。对照组2 接种100 μ 1 pCR3. 1空质粒(含pCR3. 1空质粒50 μ g)。实验组接种100 μ 1 pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗(含pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗 50 μ g)，上述3组间隔1周免疫一次，共接种免疫三次。经三次免疫后与雄性BaLb/c小鼠
1 1合笼交配，验栓阳性为妊娠第1天。免疫抗生育实验结果统计免疫抗生育实验中，对照组1(生理盐水处理组)的生育率为82.6%，对照组
2(pCR3. 1处理组)的生育率为81. 8%，实验组(pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗处理组)的生育率为45.8%。与对照组相比，实验组的生育率明显降低(P <0.05)，实验组新生小鼠只数 (Fl)显著低于对照组(P < 0. 01)。具体的实验结果统计，如表2所示。表2本发明基因疫苗对BaLb/c雌性小鼠的免疫抗生育实验结果
组别只数验栓阳性分娩生育率Fl只数(只)(只)(只)(%)对照组125231982. 610.8 士 0. 41 (η= 206 )对照组225221881. 811.3 士 0. 35 (η= 204 )实验组25241145. 8*9. 7± 0. 42 (n=107 ) ****表示差异极显著(P < 0. 01)结论pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗免疫具有降低雌性BaLb/c小鼠生育的作用，与对照组1和对照组2相比抗生育的效果明显(ρ < 0. 01)。(3)免疫抗生育实验-III选取性成熟的雌性昆明白(KMB)小鼠75只，雄性昆明白小鼠75只。动物饲养于人工控制的条件下，饲养温度在25°C左右，1 : 1 光照周期，自由采食、饮水。75只雌性昆明白小鼠随机分为三组，每组25只。免疫质粒前Mh，注射100 μ L免疫佐剂0. 25%普鲁卡因，接种部位腿部肌肉三点注射。对照组1 接种100 μ 1生理盐水。对照组2 接种100 μ 1 pCR3. 1空质粒(含pCR3. 1空质粒50 μ g)。实验组接种100 μ 1 PCR3. l_Cyp26al基因疫苗(含PCR3. l_Cyp26al基因疫苗 50 μ g) ο上述3组间隔1周免疫一次，共接种免疫三次。经三次免疫后与雄性小鼠1 1 合笼交配，验栓阳性为妊娠第1天。免疫抗生育实验结果统计免疫抗生育实验中，对照组1(生理盐水处理组)的生育率为100%，对照组 2 (pCR3. 1处理组)的生育率为92%，实验组(PCR3. 1-Cyp26al基因疫苗处理)的生育率为 37.5%。与对照组相比，实验组生育率明显降低(P <0.01)，实验组新生小鼠只数(Fl)显著低于对照组(P < 0. 01)。具体的实验结果统计，如表3所示。表3本发明基因疫苗对雌性KMB雌性小鼠的免疫抗生育实验结果
组别只数 (只)验栓阳性 (只)分娩 (只)生育率 (%)Fl只数对照组12525251009. 8 ± 0. 32 (η= 246 )对照组22525239212. 1 ± 0. 56 (η= 279 )实验组2524937. 5**9. 5 ± 0. 48 (n=86 ) ****表示差异极显著(P < 0.01)结论pCR3. 1-Cyp26al基因疫苗免疫具有降低雌性昆明白(KMB)小鼠生育的作用，与对照组1和对照组2相比抗生育的效果显著(ρ < 0. 01)。
序列表
<110>中国科学院动物研究所
<120>抗生育重组质粒、基因疫苗及其制备方法和用途
<130>DIC09110031
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1766
<212>DNA
<213>SD 大鼠 Cyp^al cDNA <400>1
acgcgggggcgagggcggcggcggcaggtggcgcgggaggcttgctgcgtgccatggggc60tcccggcgctgctggccagtgctctctgcaccttcgtgctgccgctgctgctcttcctgg120cggcgctcaagctctgggacctgtactgtgtgagcagccgcgatcgcagctgcgctctcc180ccttgcccccgggtaccatgggcttcccattctttggggaaacattgcagatggtgctgc240agcggaggaagtttctgcagatgaagcgcaggaaatacggcttcatctacaagacgcatc300tgtttgggcggcccacggtgcgagtgatgggcgcggataatgtgcggcgcatcttgctgg360gggagcaccggttggtgtcagtgcactggcgctgcctctccaacctgcatgattcctcgcccttcaaccgagaggcgcttcagtgctacggtctggagcagtggctaagctgcggcgagcgcctcatgttccgcatcgccatgcgcatccgcggggaagacgagcagcagctagtggaggctctccccattgacgtgccctttagcgggctccacgcgcgcatcgaggagaacattcgggcggatgcgggctgcaaggacgcactgcagcagaggctggatatgcaggcaC 3.3.3.3. C 3.3. aaactacagccagtgcagccacatcactgatccaaaaagttcgagaagagataaagagcaacaagttagacatggaaactttggaacagccccttcgattgaatcctccggttccgggagtgaacggttaccagattcccaaggggtggaacgtggcagacagcttcactaacaaggaggatccagaggacacctccaggttcagtttcataggcaaagagtttgcaaaaattcttcttagtgactggcagctgctaaatggacctcctatggacaatcttcctgcaagattcacccacttcttggactcatttgaagtgtacattgtttatttaatttctaaatgtatagtataatatt 3.3.3. 3. 3.3.aataatgaatttgtatgatt<210>2<211>28<212>DNA〈213〉人工序列<400>2cgaagcttatggggctcccggcgctgct<210>3<211>30<212>DNA〈213〉人工序列〈400>3cgctcgagtcagatatctccctggaagtgg
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1.一种用于哺乳动物抗生育基因疫苗的重组质粒，其由Cyp26al基因的CDNA片段和真核表达载体组成，真核表达载体优选为PCR 3. 1。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述Cyp26al基因的cDNA片段源自 Spreqne-Dawley大鼠子宫，其碱基序列优选如SEQ IDN0. 1所示。
3.包含权利要求1或2所述重组质粒的菌株；优选地，所述菌株为大肠杆菌感受态 DH5a菌株。
4.包含权利要求1或2所述重组质粒的细胞；优选地，所述细胞选自人宫颈癌细胞和中国仓鼠卵巢细胞。
5.一种哺乳动物抗生育基因疫苗，其中所述疫苗包含权利要求1或2所述的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的基因疫苗，其特征在于，所述疫苗还包含佐剂；优选地，所述佐剂选自百分比浓度为0. 25 %的普鲁卡因。
7.一种制备权利要求1或2所述重组质粒的方法，其特征在于，所述方法采用如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的碱基序列作为引物克隆所述Cyp26al基因的cDNA片段；优选地，该方法采用温度降落逆转录_聚合酶链式扩增方法克隆所述Cyp26al基因的cDNA片段。
8.权利要求1或2所述的重组质粒在制备哺乳动物抗生育基因疫苗中的用途；优选地，所述哺乳动物选自大鼠、小鼠、猴、兔和猪。
9.权利要求5或6所述的基因疫苗在制备哺乳动物抗生育药物中的用途；优选地，所述哺乳动物选自大鼠、小鼠、猴、兔和猪。
10.权利要求5或6所述的基因疫苗在预防和/或控制鼠害中的用途。
全文摘要
本发明提供一种抗生育重组质粒、基因疫苗及其制备方法和用途。该重组质粒由Cyp26a1基因cDNA片段和真核表达载体pCR 3.1组成。重组质粒及基因疫苗是通过提取并纯化大鼠妊娠子宫总RNA，设计特异性引物，采用温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法克隆扩增大鼠子宫Cyp26a1基因cDNA片段，并将其重组到真核表达质粒中而构建的。所制备的基因疫苗可用于哺乳动物抗生育及预防和/或控制鼠害，具有安全、长效、稳定、操作便捷的优点，比其它免疫手段免疫效力更强，所需的免疫量较小，不仅能有效降低鼠生育，而且还能明显减少新生仔鼠。
文档编号A61P15/18GK102191272SQ20101012921
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月18日 优先权日2010年3月18日
发明者夏红飞, 孙敬, 彭景楩, 杨颖 , 韩丙辰 申请人:中国科学院动物研究所