专利名称：：营养组合物在制备促进肝脏干细胞增殖药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种营养组合物的用途，尤其是一种营养组合物在制备促进肝脏干细胞增殖药物中的应用。
背景技术：
：慢性肝炎、肝纤维化与肝硬化、门脉高压症、原发性肝癌、遗传性及代谢性肝脏疾病等诸多难治性肝病是全世界共同面临的棘手问题。对于上述各种原因引发的终末期肝衰竭，原位肝移植是目前唯一有效的治疗手段。然而，由于供肝的极度短缺、手术及移植本身相关的较高死亡率、终身服用免疫抑制剂及其所带来的严重甚至致命并发症，使得肝移植在临床的广泛应用受到极大限制。随着干细胞生物学研究的不断发展，以干细胞为种子细胞的移植治疗将为终末期肝衰竭患者带来新的希望。肝脏干细胞较成熟肝脏细胞的优点在于其易于扩增培养，免疫原性弱，尤其是胚胎组织来源的肝脏干细胞，体外培养条件下易于操作，可通过体外扩增、分化和基因修饰后再进行体内移植。近年来，以供体肝脏干细胞作为载体的直接肝基因治疗是肝脏细胞移植基础与临床研究的一个热点，即通过逆转录病毒、腺病毒将目的基因体外转染至分离的供体肝脏干细胞中，再进行肝脏细胞移植，移植后的供体肝脏干细胞就可以在受体中表达目的基因。但是，在机体宏观与微观环境没有得到任何改善的条件下，其自身原有相应干细胞依然处于"休眠"的状态下，仅仅依靠外援性的干细胞输送，显然难以达到预期目的。专利申请号为200710012788.8的专利申请公开了一种"促进造血干细胞增殖与血红蛋白合成的营养组合物"。该营养组合物的原料及重量比如下核苷酸90110、精氨酸2030、赖氨酸2030、半胱氨酸1020、甘氨酸2535、组氨酸2030、卵磷脂110130、脑磷脂5070、维生素EO.40.6、维生素C57、叶酸0.020.04、维生素B20.050.07、维生素B60.070.08、维生素B120.00010.0002、铁0.51.5、锌0.50.7、锰0.40.6、枸杞多糖1416、葡萄籽提取物1416。可明显提高血中血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、白细胞(WBC)及血小板(Pit)数量；可剌激骨髓造血干细胞的增殖，使造血干细胞明显增多；明显提高细胞内线粒体数目；对肝、脾的损伤具有明显的恢复作用。该营养组合物适用于营养不良性贫血(缺铁性贫血及叶酸与维生素B12营养不良性贫血)、红细胞生成减少所致贫血以及红细胞破坏过多或丢失所致贫血。但是，该专利申请文件并没有记载该营养组合物具有促进肝脏干细胞增殖的作用。
发明内容本发明是发现了上述营养组合物具有促进肝脏干细胞增殖的作用，提供一种营养组合物在制备促进肝脏干细胞增殖药物中的应用。本发明的技术解决方案是一种营养组合物在制备促进肝脏干细胞增殖药物中的应用。本发明的营养组合物在促进造血干细胞增殖与血红蛋白合成的同时，还能为唤醒休眠的成体肝脏干细胞创造条件，进而可促进成体肝脏干细胞增殖。解决了现有原位肝移植及供体肝脏干细胞移植所存在的种种问题，具有有效、安全、简便、经济、不产生免疫排斥等优点。图1是本发明实施例肝脏干细胞流式细胞仪分析图。图2是本发明实施例肝脏干细胞流式细胞仪分析示意图。图3是本发明实施例肝脏干细胞免疫组化图。图4是本发明实施例肝脏干细胞免疫组化示意图。具体实施例方式1.建立模型、实验分组和实验流程再生障碍性贫血小鼠模型的建立本实验采用BALB/c小鼠。实验步骤第1天皮下注射乙酰苯肼100mg/kg，次日X射线2.OGy照射后，于第5天环磷酰胺80mg/kg腹腔注射，第15天重复以上步骤但不给予射线处理。以单纯等量生理盐水相应部位注射为正常对照组。实验分组根据动物药理学的药品剂量和综合实验的设计分析，分为①正常对照组；②再障模型组；③高剂量组，以1445.55mg/kg.d营养组合物对再障小鼠灌胃；中剂量组，以963.7mg/kg.d营养组合物对再障小鼠灌胃；⑤低剂量组，以674.59mg/kg.d营养组合物对再障小鼠灌胃。实验流程首先，按前述再障小鼠模型的建立方法，注射乙酰苯肼、环磷酰胺及X射线照射。从第7天开始，营养组合物高、中、低剂量组分别以相应剂量对再障小鼠进行灌胃，每天一次，直至第49天，拉颈处死小鼠，采样进行检测。2.实验方法2.l流式细胞仪分析将细胞用PBS缓冲液洗涤三次，离心(1000r/min，5min)收集细胞，用PBS重悬为lX106/ml的细胞悬液，分别取200ii1转移至Eppendorf管中，离心(1000r/min，5min)，弃上清，沉淀加入5%脱脂奶粉371:封闭0.5小时。PBS洗涤一次，加入1:200免抗小鼠CD90多克隆抗体，37t:孵育2小时。然后PBS洗涤一次，除去未结合的一抗。加入标记荧光素的羊抗免IgG，工作浓度l:1000，37t:避光孵育0.5小时，PBS洗涤二次(1000r/min，5min)，用流式细胞仪检测表达CD90阳性细胞数量变化，以标记抗体呈阳性的细胞百分率作为表达CD90蛋白(肝干细胞标志物)的计量标准。同时以只加标记荧光素的羊抗免IgG和不加一抗、二抗的细胞作阴性对照。2.2免疫组化(SP法)染色石蜡切片脱蜡、水化；PBS洗23次各5分钟；3%H202(80%甲醇)滴加在玻片上，室温静置10分钟；PBS洗23次各5分钟；抗原修复；PBS洗23次各5分钟；滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，滴加一抗50iil，4t:过夜。过夜后需在37"复温45分钟。PBS洗3次各5分钟；滴加二抗4050y1，室温静置，或37°C1小时；PBS洗3次各5分钟；DAB显色510分钟，在显微镜下掌握染色程度；PBS或自来水冲洗10分钟；苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；自来水冲洗1015分钟；脱水、透明、封片、镜检。2.3统计学分析所有数据均用SPSS12.0软件进行统计分析。每一项分析至少有三次结果。数值用均数±SD表示，采用t检验。P<0.05认为有显著性差异，并在统计学上有意义。3.实验结果3.1流式细胞仪检测肝干细胞肝干细胞表面标志物很多，但其敏感和特异性均不满意。CD90是一种细胞表面糖蛋白，是新近发现的特异性较强的肝干细胞表面标志物，本实验选用CD90作为标志物，用流式细胞仪检测再障小鼠肝干细胞标志物CD90的表达，结果显示，与正常对照组相比，再障模型组小鼠肝干细胞数量明显减少；营养组合物处理再障小鼠后，小鼠肝干细胞的含量随营养组合物剂量增加而增加，表明营养组合物可促进再障小鼠肝干细胞的增殖(见图1、2)，具体数值见表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>#P<0.05再障组与对照组*P<0.05营养组合物组对再障组3.2免疫组化分析肝于细胞(CD90，400倍)结果显示，与正常对照组相比，再障模型组小鼠肝干细胞数量明显减少，营养组合物处理再障小鼠后，小鼠肝干细胞的含量随营养组合物剂量增加而增加，表明营养组合物可促进再障小鼠肝干细胞的增殖(见图3、4)，具体数值见表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>#P<0.05再障组与对照组*P<0.05营养组合物组与再障组结论营养组合物能促进再生障碍性贫血小鼠肝干细胞的增殖，可在制备促肝脏干细胞增殖药物中的应用。权利要求一种营养组合物在制备促进肝脏干细胞增殖药物中的应用。全文摘要本发明公开一种营养组合物在制备促进肝脏干细胞增殖药物中的应用，所述营养组合物在促进造血干细胞增殖与血红蛋白合成的同时，还能为唤醒休眠的成体肝脏干细胞创造条件，进而可促进成体肝脏干细胞增殖。解决了现有原位肝移植及供体肝脏干细胞移植所存在的种种问题，具有有效、安全、简便、经济、不产生免疫排斥等优点。文档编号A61K33/30GK101780183SQ201010129030公开日2010年7月21日申请日期2010年3月22日优先权日2010年3月22日发明者吴文国,李恕,董锋申请人:珍奥集团股份有限公司