专利名称：一种磁光双模式分子影像探针及其制备方法
技术领域：
本发明涉及多模式分子影像探针领域，具体涉及一种含有铱磷光配合物和稀土大 环多胺多酸配合物两个功能单元的异核(Ir-Gd)金属配合物用于活体的磁共振-磷光双模 式成像。
背景技术：
分子影像学(molecular imaging)是运用影像学手段显示组织水平、细胞和亚细 胞水平的特定分子，反映活体状态下分子水平变化，对其生物学行为在影像方面进行定性 和定量研究的科学，是将分子生物学技术和现代医学影像学相结合而产生的一门新兴的边 缘学科。分子医学影像技术是显示肉眼或其他技术无法或难以认识的人体生命信息的医学 影像方法，它包括在细胞和分子层次非侵入性研究体内生物过程，这就要求设计合成化学 成像试剂，使得体内的分子活动过程可视化和计量化。目前常见的分子影像技术有X射线 断层扫描成像(CT)、超声成像(US)、光学成像(01)磁共振成像(MRI)、正电子发射断层成 像(PET)和单光子发射型计算机断层成像(SPECT)等，但是现在已发展的单一模式分子影 像技术都不是完美的，都有其缺陷，无法给临床诊断提供足够的信息，如光学成像穿透性较 差，只能深入到组织内的几毫米的氛围内，且难以量化分析；磁共振成像的灵敏性较低，正 电子发射断层扫描虽有很高的灵敏度，但分辨率太低。因此把几种模式的影像技术结合在 一起，发挥其各自优势，开发适用于化学检测和医学诊断的多模式分子影像探针吸引了广 大科研工作者的关注。M^Mi^ft (magnetic resonance imageing, MRI) ^ 1973 Lauterbur
的，目前已成为医学临床诊断上的有力工具，由于照射能量低，对人体扫描无任何副作用， 而且在影像的采集过程中可以自由选择，具有提供空间三维分辨影像的优势。它对于人体 的任何部位几乎都可以扫描，甚至可以做到只针对某组织区域显像，这个优势对于癌细胞 的早期发现和诊疗是有益的。目前，磁共振成像正逐渐取代电脑断层扫描在临床诊断上的 地位。光学分子成像(Optical Imaging)是指在基因组学、蛋白质组学和现代光学成像的 基础上发展起来的新兴研究领域。其突出特点是非侵入性地对活体内参与生理和病理过程 的分子事件进行可视化观察，是目前国际上公认的开展活体内分子事件研究的主流手段之 一，在生命科学研究领域具有重大应用前景。磁共振_光学双模式成像由于兼具了磁共振 成像分辨率高和光学成像灵敏度高的优点，目前已在发达国家已经应用于生物医学研究和 临床实践中。目前使用较多的磁共振造影剂是动力学和热力学稳定的小分子钆配合物，多 胺多酸配体将钆离子螯合，可以降低其毒性，使其能安全地运用到体内。通过在大环上进行 化学修饰可以键联上光学活性基团，而不影响大环配体与钆离子的螯合能力，可以构筑成 一类双模式探针。基于MLCT态发光的铱配合物具有较长的激发波长(MLCT吸收)，较高的 量子产率以及优良的光稳定性等特点，可以实现可见光激发，从而减少对生物体的伤害；并 且可以通过改变环金属配体的结构可以实现发射波长从蓝光到红外的调节。因此，利用时 间分辨技术，铱配合物可以在生物成像中避免细胞自发荧光的干扰，有望成为一类新型的
3生物光学探针。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水溶性好、弛豫率高和生物相容性好的分子探针用于 活体的磁共振成像和磷光成像，为活体病理研究和临床诊断提供了新的手段。本发明提出的一种磁共振-磷光双模式分子影像探针是指同时含有铱磷光配合 物和稀土大环多胺多酸配合物两个功能单元的异核(Ir-Gd)金属配合物，具体结构式为
OOC(1)首先制备2-氯-邻菲啰啉-5-乙酰胺5-硝基邻菲啰啉。取5-氨基邻菲啰啉 放入三颈瓶中，冰浴，抽真空，氮气保护，往其中加无水THF，体积为20 100mL和无水三乙 胺，体积为0. 5 5mL，搅拌半小时后，将氯乙酰氯逐滴加入到烧瓶中，其中5-氨基邻菲啰啉 和氯乙酰氯摩尔比为2 0.2 1 ；升至室温，搅拌过夜，得棕红色悬浊液，将其转移到分液 漏斗中，向其中加入适量5% NaHC03溶液，分层，倒出上层清液，旋干得棕红色固体粗产物， 用水和乙醇洗涤多次后干燥得黄色固体。(2)其次制备2-苯基吡啶-2-氯-邻菲啰啉-5-乙酰胺铱配合物。取铱2-苯基 吡啶二氯桥化合物，2-氯-邻菲啰啉-5-乙酰胺5-硝基邻菲啰啉置于三颈烧瓶中，二者的 摩尔比为2 0.2 1，抽真空后氮气保护，往其中加入CH2C12/CH30H= 1 0.5 2混合 溶剂，体积为20 100mL，回流4 12h后冷却至室温，再向其中加入KPF6，搅拌1 4h后 旋干溶剂，所得固体柱层析，淋洗剂为甲醇/ 二氯甲烷=1 50 1，得到橙黄色粉末。(3)然后制备苯基吡啶-邻菲啰啉-1，4，7-三(叔丁酯)-1，4，7，10-四氮杂环十二 烷铱配合物取1，4，7-三(叔丁酯)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷置于三颈烧瓶中，抽真空 后鼓入氮气，重复三次，然后将2-苯基吡啶-2-氯-邻菲啰啉-5-乙酰胺铱配合物溶于干 乙腈中，体积为50 100mL，缓慢滴加到烧瓶中，其中1，4，7_三(叔丁酯)_1，4，7，10-四氮 杂环十二烷和和2-苯基吡啶-2-氯-邻菲啰啉-5-乙酰胺铱配合物的摩尔比为1 0.5 2 ；回流12 48小时后停止反应，滤去无机盐后旋干，所得固体柱层析，淋洗剂为甲醇/ 二 氯甲烷=1 200 10，得棕黄色固体。(4)最后制备目标Ir-Gd配合物取苯基吡啶-邻菲啰啉-1，4，7-三(叔丁酯)_1， 4，7，10-四氮杂环十二烷铱配合物置于三颈烧瓶中，N2气氛下加入二氯甲烷，体积为1 10mL然后向其中逐滴加入三氟乙酸，其中苯基吡啶-邻菲啰啉-1，4，7-三(叔丁酯)-1，4， 7，10-四氮杂环十二烷铱配合物与三氟乙酸的摩尔比为1 0.1 20;搅拌过夜，点板跟踪
4至反应结束，旋干溶剂和未反应的酸，得棕黄色油状物，再取Gd (N03) 3. 6H20溶于水中，体积 为0. 5 5mL，加入到油状物中，用lMNaOH将pH调至6 8左右，搅拌12 48小时，抽滤 得棕黄色固体，反相HPLC提纯后得黄色粉末。本发明对所制备的目标产物Ir-Gd配合物进行紫外可见光谱和磷光光谱测试，细 胞荧光共聚焦成像实验，细胞毒性实验，体外和活体磁共振成像实验。本发明的优点本发明提及的磁光双模式分子影像探针具有高弛豫率、优良的热 动力学稳定性、较低的毒副作用，较高的量子产率以及优良的光稳定性等特点，可以有效应 用于活细胞和活体的荧光成像和磁共振成像。
图1为Ir-Gd配合物的紫外可见光谱，图2为配合物的磷光光谱。在吸收光谱中， 250nm和265nm出有两个明显的强吸收，归属于配合物种有机配体的自旋允许的单重态跃 迁(ji — ^)，在350-500nm处的弱吸收归属为铱环金属配合物中常见的单重态和三重态 的金属-配体的电荷转移跃迁(MLCT)，其中横坐标代表吸收波长，纵坐标代表吸光度；用 405nm激发，可得到明亮的黄色磷光，对应于磷光发射光谱中在约560nm处有强的发射峰， 其中横坐标代表发射波长，纵坐标代表发射强度。图3为KB细胞在含Ir-Gd配合物的PBS缓冲溶液中室温条件下孵育30min后的 共聚焦荧光(a)，明场(b)及叠加(c)图像(Xex = 405nm)。共聚焦发光图像和明场图像 的叠加表明细胞内的发光信号主要位于胞浆区域而不是在细胞膜上，说明配合物不是对细 胞膜染色而是穿过细胞膜进入了细胞胞浆中。图4为KB细胞在含3. 3，8. 3，16. 7 iiM Ir_Gd配合物的培养基中孵育24h后细胞 的存活率，横坐标代表配合物浓度，纵坐标代表细胞存活率。细胞在含Ir-Gd配合物培养基 中孵育24小时后，细胞增殖情况没有发生明显的变化，细胞存活率均> 90%，说明该配合 物在一定范围内的细胞毒性很低。图5为Ir-Gd配合物生理盐水溶液在0. 5T磁场测量系统拟合的rl弛豫率，图6 为T1加权成像。用3. 0T磁共振成像仪系统测量后拟合所得的纵向弛豫率rl = 7. (MmM—1. s—1 ；所得的T1加权成像中随着Gd3+浓度的升高，磁共振加权成像图片逐渐变亮，这是典型 的T1造影剂的成像特征。图7为加入Ir-Gd配合物前后小鼠体内器官的磁共振加权成像图片箭头所指部 位为肝部(a)，肾部(b);从左到有依次为加入前，加入0，22，44，100min后所采集的11加权 成像(西门子3T Trio磁共振成像仪系统)。加入造影剂22min后，小鼠肝部明显变亮，肾 部也略有变亮，随着时间的增加，造影剂在体内不断代谢，到lOOmin时，小鼠肝部明显亮度 稍许减弱，而肾脏部位则有明显变亮趋势。
具体实施例方式实施例1Ir-Gd配合物的制备取化合物苯基吡啶-邻菲啰啉-1，4，7_三(叔丁酯)_1，4， 7,10-四氮杂环十二烷铱配合物74. 7mg(0. 05mmol)置于三颈烧瓶中，N2气氛下加入2mL 二 氯甲烷，然后向其中逐滴加入lmL三氟乙酸，搅拌过夜，点板跟踪至反应结束，旋干溶剂和未反应的酸，得棕黄色油状物，再取22. 55mg(0. 05mmol) Gd (N03) 3- 6H20溶于1. 5mL水中，加 入到油状物中，用1M NaOH将pH调至7左右，搅拌24小时，抽滤得棕黄色固体，反相HPLC 提纯后得黄色粉末。MS(ESI+)m/z =1237. 3([M+H]+).实施例2Ir-Gd配合物的紫外可见光谱和磷光光谱测试紫外可见和磷光光谱的测试均在 水溶液中进行，其中磷光光谱是用405nm紫外光激发，测试结果见图1和图2。实施例3Ir-Gd配合物的细胞荧光共聚焦成像实验KB细胞是由中国生物化学和细胞生物 学研究所提供。细胞是在37°C下在含有10%胎儿牛血清(FBs)的培养液(MEM)中养殖，养 殖环境在5%0)2中进行。细胞爬片24小时，细胞浓度为5X108/L。细胞成像实验共聚焦 成像是在OLYMPUS FV1000激光扫描显微镜和60倍物镜下完成。用405nm半导体激光激发 Ir-Gd配合物的磷光发射，然后收集波长为520nm到620nm之间范围的发射。在进行实验之 前，细胞要用PBS缓冲溶液清洗，然后用Ir-Gd配合物(16. 7 y M)的PBS缓冲溶液在37°C下 孵育30分钟；之后用PBS缓冲溶液进行清洗后进行细胞成像实验，实验结果见图3。实施例4Ir-Gd配合物的细胞毒性实验用MTS法对Ir_Gd配合物的细胞毒性进行评价。对 数期的KB细胞接种在96孔细胞培养板上(1 X 104个细胞/孔)，在37°C，5 % C02和95 % 空气氛下培养24h。将Ir-Gd配合物的溶液分别加入细胞中(1001117孔)，终浓度为3.3， 8. 3，16. 7 iiM，作为实验组。将含0. 2%DMS0的RPMI1640培养基加入细胞中(100uL/孔)， 作为对照组。上述细胞在37°C，5% C02和95%空气氛下分别孵育24h和48小时后，每孔 加入MTS/PMS溶液，继续孵育2h。用酶标仪测定560nm波长处的0D值(吸光度)，用630nm 作参比。按以下公式计算细胞的存活率细胞存活率(％)=(实验组吸光度值/对照组 吸光度值)X 100%，最后的实验结果由五组平行实验数据求平均值和标准偏差得到，实验 结果见图4。实施例5Ir-Gd配合物的体外磁共振成像实验将Ir-Gd配合物溶于超纯水，配成不同浓 度，然后用纽迈匪120-Analyst 0. 5T核磁共振分析仪系统，采用反转恢复(IR)脉冲序列， 测出弛豫时间和相应的磁共振加权成像，具体参数为TR/TE = 1000/60ms，选层厚度为 0. 6mm，谱宽SW = 50KHz，接收机增益RG = 3。然后根据浓度拟合出弛豫率，(1/Tl)。bsd = (l/Tl)d+rlX [CA]，其中(1/Tl)。bsd为顺磁性物质的溶剂质子的纵向弛豫速率，似！！八为纯 溶剂质子的纵向弛豫速率，rl是配合物的弛豫效率，[CA]是配合物的浓度，实验结果见图5 和图6。实施例6Ir-Gd配合物的活体磁共振成像实验选用洁净级成年昆明公鼠(约100g)作为 活体磁共振成像实验用动物模型，实验前一天，停止小鼠正常饮食；实验时，先将小鼠固定 在自制固定板上，采用西门子3T超导高磁场(西门子3T Trio磁共振成像仪系统)，膝盖 线圈，饱和恢复(SR)脉冲序列，T1WI横断面和冠状面扫描。在完成平扫后，以0. ImM/Kg的 给药剂量经鼠尾静脉注入所制备的造影剂Ir-Gd配合物，注射成功后，固定小鼠，选择不同 时间点进行扫描。MRI扫描参数SR序列，T1WI，TR = 500ms, TE = 13ms，层厚2mm，层数
614，FOV = 120謹，矩阵320X320 ；实验结果见图7。
权利要求
一种磁光双模式分子影像探针，具体来说是一种含有铱磷光配合物和稀土大环多胺多酸配合物两个功能单元的异核(Ir-Gd)金属配合物，其特征在于结构式如下FSA00000114558500011.tif
2.骤如下(1)首先制备2-氯-邻菲啰啉-5-乙酰胺5-硝基邻菲啰啉。取5-氨基邻菲啰啉放入 三颈瓶中，冰浴，抽真空，氮气保护，往其中加无水THF，体积为20 100mL和无水三乙胺，体 积为0. 5 5mL，搅拌半小时后，将氯乙酰氯逐滴加入到烧瓶中，其中5-氨基邻菲啰啉和氯 乙酰氯摩尔比为2 0.2 1，升至室温，搅拌过夜，得棕红色悬浊液，将其转移到分液漏斗 中，向其中加入适量5% NaHC03溶液，分层，倒出上层清液，旋干得棕红色固体粗产物，用水 和乙醇洗涤多次后干燥得黄色固体。(2)其次制备2-苯基吡啶-2-氯-邻菲啰啉-5-乙酰胺铱配合物。取铱2-苯基吡啶 二氯桥化合物，2-氯-邻菲啰啉-5-乙酰胺5-硝基邻菲啰啉置于三颈烧瓶中，二者的摩尔 比为2 0.2 1，抽真空后氮气保护，往其中加入CH2C12/CH30H= 1 0.5 2混合溶剂， 体积为20 100mL，回流4 12h后冷却至室温，再向其中加入KPF6，搅拌1 4h后旋干 溶剂，所得固体柱层析，淋洗剂为甲醇/ 二氯甲烷=1 50 1，得到橙黄色粉末。(3)然后制备苯基吡啶-邻菲啰啉-1，4，7-三(叔丁酯)-1，4，7，10_四氮杂环十二烷 铱配合物取1，4，7-三(叔丁酯)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷置于三颈烧瓶中，抽真空后 鼓入氮气，重复三次，然后将2-苯基吡啶-2-氯-邻菲啰啉-5-乙酰胺铱配合物溶于干乙 腈中，体积为50 100mL,缓慢滴加到烧瓶中，其中1，4，7-三(叔丁酯)-1，4，7，10-四氮杂 环十二烷和和2-苯基吡啶-2-氯-邻菲啰啉-5-乙酰胺铱配合物的摩尔比为1 0.5 2 ；回流12 48小时后停止反应，滤去无机盐后旋干，所得固体柱层析，淋洗剂为甲醇/ 二 氯甲烷=1 200 10，得棕黄色固体。(4)最后制备目标Ir-Gd配合物取苯基吡啶-邻菲啰啉-1，4，7-三(叔丁酯)_1，4， 7,10-四氮杂环十二烷铱配合物置于三颈烧瓶中，N2气氛下加入二氯甲烷，体积为1 10mL 然后向其中逐滴加入三氟乙酸，其中苯基吡啶-邻菲啰啉-1，4，7-三(叔丁酯)_1，4，7， 10-四氮杂环十二烷铱配合物与三氟乙酸的摩尔比为1 0.1 20;搅拌过夜，点板跟踪至 反应结束，旋干溶剂和未反应的酸，得棕黄色油状物，再取Gd(N03)3. 6H20溶于水中，体积为 0. 5 5mL，加入到油状物中，用lMNaOH将pH调至6 8左右，搅拌12 48小时，抽滤得 棕黄色固体，反相HPLC提纯后得黄色粉末。
3.—种如权利要求1所述的磁光双模式分子影像探针在磁共振成像和磷光成像中的 应用，其特征在于磁光双模式成像和可以用于活体成像。
全文摘要
本发明涉及多模式分子影像探针领域，具体涉及一种含有铱磷光配合物和稀土大环多胺多酸配合物两个功能单元的异核(Ir-Gd)金属配合物用于活体的磁共振-磷光双模式成像。细胞荧光共聚焦成像实验表明本发明中的Ir-Gd配合物可以穿过细胞膜进入细胞，专一性地染色细胞的细胞浆区域，且水溶性好，细胞毒性较低；体外磁共振成像数据表明Ir-Gd配合物有较高的纵向弛豫率，进一步研究发现该配合物还可以用作活体磁共振成像探针。
文档编号A61K49/00GK101822846SQ20101017094
公开日2010年9月8日 申请日期2010年5月11日 优先权日2010年5月11日
发明者杨仕平, 杨红, 钱俊杰 申请人:上海师范大学