一种以1,4,7,10-四氮杂环十二烷为骨架的手性顺磁探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学生物学研宄中的高性能探针，特别是一种以1，4, 7, 10-四氮杂 环十二烷（cyclen)为骨架的手性顺磁探针。
【背景技术】
[0002] 蛋白质空间结构是其生物功能的基础。顺磁效应下的核磁共振由于其独特的性 质，近年来在生物大分子(如蛋白质、DNA、RNA等）的结构和功能研宄中发挥着越来越强大的 作用；顺磁效应能够提供其它技术手段难以获得的大分子长程结构信息；功能化的顺磁标 签则是顺磁技术中修饰蛋白质最为重要的技术手段之一。
[0003] 顺磁标签的质量对利用顺磁核磁研宄生物大分子的结构与动态学关系起着决定 性的作用。顺磁标签一般均是一些具有双功能团的小分子探针，一端用于顺磁金属离子的 螯合，另一端则用于与蛋白质连接。将顺磁标签与生物大分子连接后，利用顺磁效应可以 揭示生物大分子的作用机制和作用构象变化、小分子与大分子作用的高分辨结构(参见a 遍/?，2010，46: 101-112)，这将对有效药物先导分子进行筛选与优化起到重要 的导向作用。
[0004] 一个好的标签通常需要需要满足以下条件：1)标签连接的刚性。当标签与顺磁金 属离子结合后，若此顺磁标签和蛋白质的相对位置发生变化，会使PCS (贋接触化学位移)和 RDC (残余偶极耦合）明显降低；2)光学纯度单一，金属离子和具有多个潜在手性中心的标 签结合后，会产生对映异构体，导致出现多套NMR信号，进而使图谱变得复杂而难以解析； 3)标签与蛋白链接的稳定性。
[0005] Su 等（2006，7: 1599 - 1604.)，首先用 Ellman's 试剂 5, 5'-二硫 代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB)活化蛋白质的巯基形成二硫键，过量的DTNB通过透析除去； 之后加入等量的标签，标签中的巯基即和活化的二硫键反应生成新的二硫键，最终把多肽 标签和蛋白质连接起来(反应过程见图1)。离去的5-巯基-2-硝基苯甲酸（TNB)呈现明显 黄色，这为反应过程的检测提供了很大的便利。这种标记方法产率较高（>70%)，因为LBT多 肽标签酸性很强，与蛋白质连接之后其pi值会明显改变，所以可以通过离子交换色谱柱将 连接产物和未连接蛋白质分离。然而，二硫键不稳定，这阻碍了此类标签的广泛应用。
[0006] Prudencio 等?及/r. J，2004，10(3) : 3252 ?3260.)报道了具有两个活 性巯基的化合物L-1(见图2)，其由DTPA双酸酐和S-(2-氨乙基）甲烷硫代磺酸反应得到， 合成方法简单。此标签可以和蛋白质上距离8?10A的两个半胱氨酸残基同时反应，形成 两个二硫键，增加了标签的刚性，限制了标签相对于蛋白质的运动，避免了 PCS的平均化， 在距离顺磁金属离子4nm处仍有明显的PCS。但是由于其存在多个手性中心，与蛋白质连接 以后，滴加顺磁金属离子，会产生至少5个顺磁信号峰，致使屯- 1% HSQC谱图非常复杂。
[0007] Li等（泛挪.Cb遞w/7.，2012，48: 2704 - 2706.)首次报道了利用末端烯键与蛋 白质侧链巯基的迈克尔加成反应将化合物L-2 (见图2)定点标记到蛋白质上，加成产物含 有硫醚键，它可以在还原性环境和碱性条件下稳定存在。然而化合物L-2只有三个配位点， 镧系金属离子和其配位以后，还能结合其他配位原子。
[0008] Vlasie等（^e??及/r. 7；，2007，13(6) : 1715?1723.)报道了化合物L-3(见 图2)，它通过两个二硫键和蛋白质上的两个巯基连接，这种连接方式增加了标签的刚性，降 低了顺磁标签相对于蛋白质的运动。但是作者发现L-2和蛋白质连接以后，滴加顺磁金属 离子，HSQC中部分残基有两个顺磁信号，说明标签和顺磁金属离子配位以后，存在不止一种 构象。
[0009] leizeYs等ij. Am . Chem. Soc.，2QQ7，YZ9.. 9292 - J. Am. Chem .5bc.，2008，130: 14802 - 14812.)报道了化合物 L-4 和 L-5(见图 2)，他们在 cyclen 中 引入了两个吡啶氮氧化物，吡啶氮氧化物的引入改变了 L-4和L-5与镧系金属离子的配位 环境。它们与蛋白质连接后，1H-15N HSQC谱图中只有一套PCS，这说明L-4和L-5与镧系金 属离子配位以后只有一种构象。L-4通过两个二硫键和蛋白质连接，限制了其相对于蛋白质 的运动，所以测得的PCS和RDC值比L-4大的多。标签L-5的缺点是其自身的净电荷，因为 其与镧系金属离子配位后显+3价，在研宄蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体识别时这三个额 外的正电荷会造成一些未知的影响。
[0010] Liu 等（7； ▲?? ae?. 5bc.，2012，134: 17306 - 17313.)设计合成了标签 L-6 (见图2)，它含有两个对硝基苯酚基团，对位硝基增强了苯酚的酸性，与镧系金属离子配位 后质子会离去，配合物总体显+1价，和L-5相比，明显少两个正电荷。化合物L-6和蛋白质 连接后，也是产生一套PCS。值得注意的是，当标签L-6与酵母细胞色素C突变体连接以后， 滴加镧系金属离子，谱图中大部分氨基酸残基出现两套锋，而且峰强度和化学位移值随pH 的不同发生变化。但是标签L-5连接到同一蛋白质的相同位点只有一套PCS，这是因为L-6 中对硝基苯酚的氧原子电荷密度比L-5中吡啶氮氧化物的氧原子小，这种情况导致了水分 子参与镧系金属离子的配位，但这并不是L-6有两套PCS的根本原因，因为L-6和其它蛋白 质相连时没有两套锋。真正的原因是在酵母细胞色素C突变体中，标签连接位点附近有一 个组氨酸残基，组氨酸咪唑环中的氮原子可以与参与配位的水分子形成氢键，破坏了络合 物的对称性，产生非对映异构体。pH的不同会影响氢键的变化，导致两种非对映异构体相互 转换，因此可以通过调节PH，用同一个配体得到两组不同的PCS数据。
[0011] Graham 等（沒ioco/u?收ate cAe?.，2011，22: 2118 - 2125.)在 DOTA 衍生物中引 入了手性酰胺，从而使化合物L-7 (见图2)和镧系金属离子配位后只有一种构象，由于空间 体积比较大，限制了其相对于蛋白质的运动，所以观测到比较大的PCS。
[0012] Loh 等?收ate ，2013，24: 260 - 268.)通过点击化学的方法成功 地将D0TA衍生物L-8 (见图2)定点标记到蛋白质上。具体方法是把非天然氨基酸扩叠氮 基-L-苯丙氨酸（AzF)引入到蛋白质中，Cu (I)作为催化剂，标签L-8和AzF发生环加成反 应共价连接到蛋白质ubiquitin上。和常用的二硫键连接相比，三挫环有更好的刚性和化 学稳定性，但是这个反应需要在无氧条件下进行，增大了实验的复杂性，而且催化剂Cu (I) 会导致蛋白质样品沉淀。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是针对上述技术分析和存在的问题，提供一种以1，4, 7, 10-四氮 杂环十二烷为骨架的手性顺磁探针，该顺磁探针可与蛋白质的特定位点进行选择性连接， 手性专一、构象单一，谱图只有一套峰，灵敏度高；高度化学选择性；电中性，对大分子影响 小；水溶性好、配位点多、稳定性强、齿合度高；刚性极强，对大分子固定作用好；探针与蛋 白质通过稳定的硫醚键连接，可以进行细胞内测量。
[0014] 本发明的技术方案： 一种以1，4, 7, 10-四氮杂环十二烷为骨架的手性顺磁探针，其化学名称为 1，4, 7, 10-四氮杂环十二烷-1- (2-甲基-4-苯砜基-6-亚甲基）吡啶-2, 3, 4-三（S)-丙 酸负离子-Tm3+配合物，化学分子式为C 3(lH4(lN508STm，化学结构式为：
【主权项】
1. 一种W 1，4, 7, 10-四氮杂环十二烧为骨架的手性顺磁探针，其特征在于：化学名称 为1，4, 7, 10-四氮杂环十二烧-1-(2-甲基-4-苯讽基-6-亚甲基川比晚-2, 3, 4- S (S)-丙 酸负离子-Tm3+配合物，化学分子式为C scftAOsSTm，化学结构式为：
2. -种如权利要求1所述W 1，4, 7, 10-四氮杂环十二烧为骨架的手性顺磁探针的制备 方法，其特征在于步骤如下： 1) 2, 6-二甲基化晚氮氧化物的合成 将2, 6-二甲基化晚、冰己酸、30wt%过氧化氨按体积比为15 ;80 ;25混合，保持80°C加 热揽拌回流4-1化直至原料转化完全，将所得混合液减压浓缩至S分之一后倒入冰水混合 物中，冰水混合物中2, 6-二甲基化晚与冰水混合物的用量比为15. OmL ;100g，然后用碳酸 钟固体将体系调至抑〉8,依次用二氯甲烧萃取、无水硫酸钢干燥，过滤后旋干，得到淡黄色 油状物2, 6-二甲基化晚氮氧化物； 2) 2, 6-二甲基-4-硝基化晚氮氧化物的合成 将上述2, 6