专利名称：质粒pUDK-SPK1在预防或治疗组织粘连中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及质粒PUDK-SPK1在预防或治疗组织粘连中的应用。
背景技术：
外科手术后腹膜粘连或盆腔粘连仍然是临床上难以解决的困难之一，70-80%的粘连是由于外科手术造成的，术后肠粘连或盆腔粘连可造成肠梗阻、女性不孕及局部反复长期的疼痛等，严重者不得不进行二次手术。目前，术后组织粘连的预防研究中发现，抗生素、抗组织胺及皮质激素等抗炎药物，葡聚糖及组织纤溶酶原激活剂在防治术后组织粘连中有一定的作用；研究中还发现有一些能被组织分解吸收的局部屏障剂如壳聚糖也有一定的效果，但疗效并不显著。组织粘连形成具有很复杂的病理过程，一般大致的认识是腹腔或盆腔内组织或器官的浆膜(间皮层)损伤造成局部毛细血管通透性增加及炎性物渗出，因而在损伤处由于血凝块和纤维蛋白酶的渗出，使组织器官发生有机化而形成永久粘连。综上所述，预防或治疗组织粘连非常重要，如何防治手术后组织粘连目前仍是医学中的一大难题。
发明内容
本发明人发现质粒pUDK-SPKl在预防或治疗术后组织粘连中具有良好效果。因此，本发明涉及质粒pUDK-SPKl在制备用于预防或治疗术后组织粘连的药物中的用途。本发明的重组质粒中鞘氨醇激酶是人鞘氨醇激酶。进一步，本发明中的鞘氨醇激酶以携带鞘氨醇激酶基因的重组质粒形式使用。在本发明中含鞘氨醇激酶的药物可以制成注射液、涂抹液、喷雾剂或以生物可吸收性材料为载体制成贴膜等形式使用。根据本发明，本发明中所述的组织粘连是指腹腔手术后肠粘连、盆腔手术后盆腔粘连和其它组织受创后的粘连等组织粘连。本发明的药物中除鞘氨醇激酶外，根据需要还可含有本领域技术人员已知的制药中常用的药物助剂，如赋形剂、稳定剂、防腐剂、载体等。本发明还涉及一种用于防治组织粘连的方法，该方法包括将携带鞘氨醇激酶基因的重组质粒给予需防治组织粘连患者。本发明中的重组质粒是含有SPKl基因的表达质粒PUDK-SPK1，手术后局部涂抹或喷雾后，证实其具有防治手术后组织粘连的功效。应用本发明提供的方法，用携带鞘氨醇激酶基因的重组质粒pUDK-SPKl，向患者体内导入鞘氨醇激酶基因，达到预防组织粘连的目的。因此应用本发明提供的方法应用重组质粒防治组织粘连比以往的防治手段更具有先进性，疗效更明确。本发明为目前尚无有效防治手段的组织粘连的临床治疗提供的一种有效的防治手段更具有先进性，疗效更明确。下面的实施例将通过描述携带鞘氨醇激酶的重组质粒对大鼠肠粘连的预防作用来进一步阐述本发明。实施例pUDK_SPKl对术后肠粘连的预防作用观察一、质粒的构建1、质粒 pUDK-SPKl 的构建 (I)SPKl基因片段的获得将pcDNA3*-SPKl (由澳大利亚科学家 Dr Stuart M Pitson 惠赠)以 BgLII、NotI 双酶切，然后1. 2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，以Qiagene的QIAquick Gel Extraction Kit分别回收从pcDNA3*-SPKl上切下的SPK1DNA片段，分别重悬于10ulddH20。测序并进行综合分析，将获得的SPKl全长cDNA序列与Gene Bank已公布的人SPKl全长cDNA序列进行比较分析表明，我们获得的人SPKlcDNA序列与Gene Bank已公布的人SPKl全长cDNA 序列完全一致。(2)构建 pUDK 质粒构建带有卡那抗性基因、CMV启动子、多克隆位点和polyA价位信号的用于插入 SPKl基因的表达载体pUDK(4008bp)。(3)构建携带SPKl基因的载体pUDK-SPKl首先用内切酶酶切pUDK质粒，再用内切酶切pcDNA3*_SPKl质粒(由澳大利亚科学家Dr Stuart M Pitson惠赠)，回收SPKl基因片段(426bp)，上述2个片段连接并转化 DH5a感受态，鉴定重组子，保存菌种。所得质粒命名为pUDK-SPKl。SPKl的表达装置依次为 CMV 启动子、SPKlcDNA、BGH polyA 信号。用4对不同限制性内切酶对构建完成的质粒进行酶切鉴定，最终结果表明我们成功构建了表达质粒pUDK-SPKl。2.质粒 pUDK-GFP 的构建用限制性内切酶从载体pEGFP-Nl (购自Invitrogen公司，美国)上切下EGFP (绿色荧光蛋白)基因序列，并将其克隆至载体PUDK的多克隆位点，获得携带EGFP的质粒， pUDK-SPKl用于质粒转染靶组织效率的观察。二、质粒的制备、纯化及质量控制用本领域的常规技术方法大规模发酵细菌扩增质粒，离心回收菌体，采用碱变性法提取重组质粒，层析法大规模纯化质粒，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法确定DNA的纯度和含量。获得所需的质粒用于下述实验。三、重组质粒预防肠粘连的效果观察1.肠粘连模型制备及基因转移Wistar大鼠(军事医学科学院动物实验中心提供)，体重200_250g。腹腔麻醉后暴露盲肠，并用消毒纱布擦拭至有均勻出血点为止，并即刻分别将100 μ gpUDK-GFP或 100 μ gpUDK-SPKl重组质粒局部涂擦创伤的盲肠表面。对照组涂抹同体积生理盐水。2.子宫粘连模型的构建步骤如下开腹后的大鼠将子宫角(双侧)靠近体部的Icm长区域的浆膜用新的手术刀片反复刮3次，见出现均勻密布的点状出血后，将30 μ g质粒pUDK-SPKl或100 μ gpUDK-GFP溶于50 μ 1的生理盐水中涂抹于创伤表面，对照组用50 μ 1生理盐水涂抹，以上完成后，常规关腹。
3.重组质粒转染效率观察术后于转染pUDK-SPKl重组质粒后第3天、第6天将局部盲肠间皮剥离，在荧光显微镜下观察SPKl蛋白表达。结果，第3天即可见散在或成片的绿色荧光表达，第6天同样有散在或成片的绿色荧光表达，第10天见绿色荧光已明显减弱。4.评价标准(1)肠粘连的评价标准术后 14 天，依据文献(Nair SK, Bhat IK, and Aurora AR. Role ofproteolytic enzymes in the prevention of postoperative intraperitoneal adhesions. Arch Surg 1974 ；108 =849-855.)评价标准判断粘连程度0度无粘连带1度有一条粘连带或容易分离的细粘连2度有二条粘连带或粘连带能抵抗拉力3度广泛粘连涉及邻近的肠系膜、肠管或其它腹腔内脏器4度脏器直接粘连到腹壁(2)子宫粘连的评价标准大网膜或其它组织粘连于损伤区域的面积占损伤区域的面积的百分比来计算。5.实施例的评价结果(1)肠粘连模型组的实验结果如下表
权利要求
1.质粒pUDK-SPKl在制备用于预防或治疗术后组织粘连的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述鞘氨醇激酶以携带鞘氨醇激酶的重组质粒形式使用。
3.根据权利要求2的用途，其特征在于所述的鞘氨醇激酶是人鞘氨醇激酶。
4.根据权利要求2的用途，其特征在重组质粒为pUDK-SPKl。
5.根据权利要求2的用途，其中重组质粒中鞘氨醇激酶基因受巨细胞病毒启动子调控。
6.权利要求1-5任一项中的用途，其中的药物可以制成注射液、涂抹液、喷雾剂或贴膜等形式使用。
7.权利要求1-5任一项中的用途，其中所述的组织粘连选自腹腔手术后肠粘连、盆腔手术后盆腔粘连和其它组织受创伤后粘连。
8.权利要求6、7的用途，其中所述的组织粘连选自腹腔手术后肠粘连、盆腔手术后盆腔粘连和其它组织受创伤后粘连。
全文摘要
本发明涉及生物学医学领域，具体地说是涉及鞘氨醇激酶在防治或治疗组织粘连中的应用。将人鞘氨醇激酶全长编码区cDNA插入到质粒载体(pcDNA3或pUDK或其它)中，获得携带鞘氨醇激酶基因的重组质粒。该重组质粒经局部涂抹于腹腔或盆腔手术后，可预防术后肠粘连或盆腔粘连或其它组织粘连。因此，该携带人鞘氨醇激酶基因的重组质粒在预防或治疗术后组织粘连中具有极好的应用前景。
文档编号A61P41/00GK102258792SQ20101017982
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者刘红军, 吴祖泽, 李庆芳, 杨月峰, 王 华, 王立生, 郭强 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所