专利名称：一种负载季铵化壳聚糖和质粒dna复合粒子的皮肤再生材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基因增强型皮肤再生材料及其制备方法，具体说涉及一种复合季 铵化壳聚糖/质粒DNA粒子的胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生材料及其制备方法。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，主要由表皮层、真皮层和皮下组织构成，同时含有丰富的 血管和神经。日常生活中由于各种原因如创伤、烧伤、溃疡、手术及先天性畸形等很容易造 成皮肤的缺损。皮肤组织虽然具有较强的再生能力，但是对于大面积的全层皮肤缺损，由于 真皮层的缺失，皮肤的再生能力明显不足。治疗全层皮肤缺损的关键是重建和再生真皮组 织，促进创面尽早封闭，避免微生物入侵等并发症。迄今为止，自体皮移植仍然是临床治疗 全层皮肤缺损最有效的方法。但是该方法面临着自体皮供应不足的缺点，如III度烧伤面积 超过30%时供皮部位就已不足。另一个常用的治疗方法就是采用人工皮肤。目前国际市场 上人工皮肤有 Apligraf、Integra、Transcyte、AlloDerm 禾口 Dermagraft 等。胶原-壳聚糖/硅橡胶皮肤再生材料是由胶原/壳聚糖多孔支架和硅橡胶薄膜组 成的双层结构材料，其中胶原/壳聚糖多孔支架可以有效诱导缺损组织处细胞的迁移、增 殖和分化，原位诱导缺损真皮组织的再生；硅橡胶薄膜则起到了临时表皮层的作用，可以有 效控制水分的挥发和防止细菌的侵入等，对创面起到了临时保护作用。该皮肤再生材料所 采用的胶原和壳聚糖是具有良好生物相容性、低免疫原性和可降解性的天然高分子材料。皮肤再生材料血管化速度是影响其再生性能、决定材料移植成活率的关键。由于 皮肤再生材料中缺乏相互连通的血管网络，难以实现与创面区血管的快速连接。在移植初 期，皮肤再生材料中的细胞所需要的营养物质主要依靠扩散作用来实现。在血供实现以前， 皮肤再生材料中细胞的增殖和分化等功能常因营养成分的缺乏而受限，甚至导致细胞调 亡，从而影响其再生速度和存活率。目前的皮肤再生产品的血管化速率较慢，植入物完全血 管化一般需要几周0 4周)的时间，增加了病人的住院时间和感染风险。因此，如何促 进皮肤再生材料的血管化速度，进而缩短创面缺血时间，提高移植存活率，是皮肤再生与修 复研究中亟待解决的关键问题。为了提高皮肤再生材料的血管化速度，采用在植入物上负载血管化因子如内皮 细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)等方法，取得了积极的效果。但由于生 长因子不稳定，容易降解，而且直接注射生长因子需要多次重复操作，带来了极大的不便。 随着基因治疗技术的发展，用表达生长因子的基因代替生长因子成为一个可行的选择。本发明结合基因治疗与再生医学的方法和技术，选择具有良好生物相容性和生物 降解性能的天然生物大分子一季胺化壳聚糖为基因载体材料，与可表达促血管生成因子的 质粒DNA复合，形成季胺化壳聚糖/DNA纳米粒子；进一步将该粒子与胶原/壳聚糖组织工 程皮肤支架复合，利用该粒子对创面细胞进行原位转染，实现促血管生成因子的可控持续 分泌，促进皮肤再生材料的血管化，最终获得具有高移植成活率和良好再生修复效果的皮肤再生材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有快速血管化，可广泛应用于创伤和烧伤等全层皮肤 缺损修复与再生的负载季铵化壳聚糖和质粒DNA复合粒子的皮肤再生材料的制备方法。本发明提供的负载季铵化壳聚糖和质粒DNA复合粒子的皮肤再生材料的制备方 法，包括如下步骤1)用磷酸盐缓冲液或三蒸水分别配制浓度为1 20mg/mL的季铵化壳聚糖溶液和 浓度为0. 1 5mg/mL的质粒DNA溶液；将季铵化壳聚糖溶液与质粒DNA溶液等比混合，震 荡均勻，静置，制得季铵化壳聚糖/质粒DNA粒子溶液；2)用质量浓度为0. 3% 5%的乙酸溶液分别配制质量浓度为0. !^ ！^的胶原 溶液和质量浓度为0. 的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液滴入胶原溶液中，搅拌均勻、 真空脱泡，得到胶原-壳聚糖混合溶液，其中壳聚糖和胶原的质量比为1 9 5 5;将 胶原-壳聚糖共混液注入模具中，采用冷冻-干燥法，在_5°C _50°C温度下冷冻干燥，获 得胶原-壳聚糖三维多孔支架；将胶原-壳聚糖三维多孔支架于质量浓度为0. 05% 的戊二醛溶液中交联1 48小时，反复清洗后，再次在_5°C _50°C温度下冷冻干燥；3)将医用胶粘剂以0. 05 0. 5mg/cm2的量均勻涂覆在厚度为0. 05 0. 2mm的硅 橡胶薄膜表面，然后将步骤幻制备好的胶原-壳聚糖三维多孔支架放在涂覆胶粘剂的硅橡 胶薄膜表面上，获得胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架。4)将步骤1)的季铵化壳聚糖/质粒DNA粒子溶液逐滴加到胶原-壳聚糖/硅橡 胶双层支架上，其中质粒DNA与支架的重量比为0.5 100 10 100，室温下孵化0. 2 2小时，在-5°C _50°C温度下冷冻干燥，得到负载复合季铵化壳聚糖和质粒DNA粒子的皮 肤再生材料。上述的医用胶粘剂可以是α -氰基丙烯酸酯类胶粘剂或有机硅胶粘剂。所说的质 粒DNA可以是表达血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、酸性成纤 维细胞生长因子(aFGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的质粒DNA。本发明制备的负载季铵化壳聚糖和质粒DNA复合粒子的皮肤再生材料，其突出特 点是以可生物降解的胶原蛋白为主要原料，添加壳聚糖起促进交联、增强与耐降解作用；通 过控制冷冻干燥条件，得到具有特定微结构(孔径、孔隙率等)的多孔支架。通过改变DNA 的种类和负载量，得到具有不同血管化速度的皮肤再生支架。结果表明该支架能够有效促 进内皮细胞的迁移、增殖和分化，促进成纤维细胞的浸入，具有良好的组织相容性。猪全层 创伤缺损实验发现能够快速血管化(10天)，超薄皮片移植后能较好成活；猪全层烧伤缺损 实验发现14天即能充分血管化，超薄皮片移植后能较好成活。这种皮肤再生材料可作为组 织生长的临时支架，促进创面的血管化，肉芽组织、内皮细胞和成纤维细胞在多孔支架内的 生长。这些长入的组织或细胞会分泌出相应的细胞外基质进而分化成新的皮肤组织，促进 受损皮肤的再生。与此同时，外源性的胶原一壳聚糖多孔支架会随着新生组织的不断生长 而逐渐降解，并被机体吸收，最终得到的是与人体自身完全相似的皮肤组织。本发明选择硅橡胶薄膜作为表皮层的模拟物，因为硅橡胶具有良好的生物相容 性，高的透气性和可控透湿性能，同时具有良好的弹性和临床易操作性等。这些特点赋予了硅橡胶薄膜的隔离功能、阻止细菌侵入功能、防止水分蒸发功能等，因此可以起到临时表皮 层的作用，从而保证双层皮肤支架的实用性。本发明为创伤、烧伤等深度皮肤缺损和慢性皮肤溃疡的治疗提供了一种性能良好 的皮肤替代物，可以显著促进创面的愈合，减少瘢痕的增生，进而减轻病人的痛苦。可以广 泛应用于创伤、烧伤和外科整形等方面。本发明制备方法简单，材料来源广泛，生产效率高， 适用于产业化生产。与国外同类产品相比，本发明产品成本方面具有很大优势。
图1是季铵化壳聚糖/质粒DNA粒子的透射电镜图。图2是胶原-壳聚糖支架表面形貌的扫描电镜图。图3是负载了季铵化壳聚糖/质粒DNA粒子的胶原-壳聚糖支架扫描电镜图。图4是内皮细胞在季铵化壳聚糖/质粒DNA粒子的胶原-壳聚糖支架上培养3天 后的扫描电镜图。图fe、5b、5c分别是负载了季铵化壳聚糖/pDNA-VEGF粒子的胶原-壳聚糖支架植 入创伤全层皮肤缺损7、10、14天后的大体观察图。图6a、6b、6c分别是负载了季铵化壳聚糖/pDNA_PDGF粒子的胶原-壳聚糖支架植 入创伤全层皮肤缺损7、10、14天后的大体H&E图。图7分别是负载了季铵化壳聚糖/pDNA-PDGF粒子的胶原-壳聚糖支架植入创伤 全层皮肤缺损10天后超薄皮片移植42天后的H&E图。图fe、8b、8c分别是负载了季铵化壳聚糖/pDNA-aFGF粒子的胶原-壳聚糖支架植 入烧伤全层皮肤缺损7、14、21天后的大体观察图。图9a、9b、9c分别是季铵化壳聚糖/pDNA_bFGF粒子的胶原-壳聚糖支架植入烧伤 全层皮肤缺损7、14、21天后的H&E图。图10分别是负载了季铵化壳聚糖/pDNA-bFGF粒子的胶原-壳聚糖支架植入创伤 全层皮肤缺损14天后超薄皮片移植98天后的H&E图。
具体实施例方式将季铵化的壳聚糖溶解在磷酸盐缓冲液中，配制成20mg/mL的季铵化壳聚糖溶 液，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌；将pDNA-VEGF溶解在磷酸盐缓冲液中配成5mg/mL的溶液； 将pDNA-VEGF溶液与季铵化壳聚糖溶液等比混合，剧烈震荡混合均勻，静置，制备得到季铵 化壳聚糖/pDNA-VEGF复合粒子溶液。TEM观察粒子的粒径和形貌结果如图1所示。用质量 浓度为5%的乙酸溶液将壳聚糖和胶原均配制成质量浓度为的溶液，壳聚糖和胶原的 质量比为1 9，将胶原-壳聚糖共混液注入模具中，-50°C冷冻冻干得到胶原-壳聚糖三 维多孔支架，经1 %戊二醛交联Ih后用三蒸水多次洗涤，-50°C冷冻冻干，其微观结构如图2 所示，孔径在100 200 μ m，孔隙率大于90%。将生物相容性良好的α -氰基丙烯酸辛酯 以0. 05mg/cm2的量均勻涂覆在厚度为0. 05mm的硅橡胶薄膜表面，然后将制备好的胶原-壳 聚糖三维多孔支架放在涂覆α -氰基丙烯酸辛酯的硅橡胶薄膜表面上，获得胶原-壳聚 糖/硅橡胶双层支架，紫外辐照池灭菌。把季铵化壳聚糖/pDNA-VEGF复合粒子负载到胶 原-壳聚糖支架上，用SEM观察如图3所示，季铵化壳聚糖/pDNA-VEGF复合粒子通过物理 吸附或静电作用粘附在胶原-壳聚糖支架的孔壁上。将胶原-壳聚糖支架紫外辐照池灭菌，然后把季铵化壳聚糖/pDNA-VEGF复合粒子滴加到灭菌后的支架上，室温下孵化2小时， pDNA-VEGF与支架的重量比为10 100，在负载季铵化壳聚糖/pDNA-VEGF粒子支架上种植 内皮细胞，以添加了 20%胎牛血清、100单位/毫升青霉素和100单位/毫升的链霉素的 RPMI1640培养基培养3天后，用中性福尔马林固定，梯度脱水、超临界干燥后SEM观察，如 图4所示。内皮细胞可以在负载季铵化壳聚糖/pDNA-VEGF复合粒子的支架上较好地粘附 并保持其形态。将季铵化壳聚糖/pDNA-VEGF复合粒子负载到灭菌后的胶原-壳聚糖/硅 橡胶双层支架上得到负载季铵化壳聚糖和质粒DNA复合粒子的皮肤再生材料。在巴马小型 猪背上制备全层创伤缺损创面，移植负载季铵化壳聚糖/pDNA-VEGF复合粒子的皮肤再生 支架。图fe、5b、5c分别是负载了季铵化壳聚糖/pDNA-VEGF复合粒子的胶原-壳聚糖/硅 橡胶支架植入创伤全层皮肤缺损7、10、14天后的大体观察图。从图中可以看出7天的时候 支架还有剩余，创面红润，10天的时候支架几乎全部降解，14天支架完全降解，肉芽组织颜 色很红，说明血管较丰富。实施例2将季铵化的壳聚糖溶解在磷酸盐缓冲液中，配制成lmg/mL的季铵化壳聚糖溶液， 经0. 22 μ m滤膜过滤除菌；将pDNA-PDGF溶解在磷酸盐缓冲液中配成0. lmg/mL的溶液；将 pDNA-PDGF溶液与季铵化壳聚糖溶液等比混合，剧烈震荡混合均勻，静置，制备得到季铵化 壳聚糖/pDNA-PDGF复合粒子溶液。用质量浓度为0. 3 %的乙酸溶液将壳聚糖和胶原均配 制成质量浓度为0.1%的溶液，壳聚糖和胶原的质量比为5 5，将胶原-壳聚糖共混液注 入模具中，_5°C冷冻冻干得到胶原-壳聚糖三维多孔支架，经0. 戊二醛交联4 后用三 蒸水多次洗涤，_5°C冷冻冻干。将生物相容性良好的α-氰基丙烯酸辛酯以0.5mg/cm2的 量均勻涂覆在厚度为0. 2mm的硅橡胶薄膜表面，然后将制备好的胶原-壳聚糖三维多孔支 架放在涂覆α -氰基丙烯酸辛酯的硅橡胶薄膜表面上，获得胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支 架，紫外辐照池灭菌。将季铵化壳聚糖/pDNA-PDGF复合粒子负载到灭菌后的胶原-壳聚 糖/硅橡胶双层支架上得到负载季铵化壳聚糖和/pDNA-PDGF复合粒子的皮肤再生材料，其 中pDNA-PDGF与支架的重量比为0.5 100。在巴马小型猪背上制备全层创伤缺损创面， 移植负载季铵化壳聚糖/pDNA-PDGF复合粒子的胶原-壳聚糖/硅橡胶双层皮肤再生支架。 从H&E图中看出从7天到14天支架完全降解，炎症细胞数量减少，血管增多。移植基因活 性真皮替代物10天后的创面可以进行超薄皮片移植，移植后的全层皮肤修复效果用H&E观 察。从图7中可以看出移植42天后，可以看到束状胶原微纤的存在，真皮表皮有乳突状连 接。实施例3将季铵化的壳聚糖溶解在磷酸盐缓冲液中，配制成lOmg/mL的季铵化壳聚糖溶 液，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌；将pDNA-aFGF溶解在磷酸盐缓冲液中配成aiig/mL的溶液； 将pDNA-aFGF溶液与季铵化壳聚糖溶液等比混合，剧烈震荡混合均勻，静置，制备得到季铵 化壳聚糖/pDNA-aFGF复合粒子溶液。用质量浓度为0. 3%的乙酸溶液将壳聚糖和胶原均配 制成质量浓度为0.5%的溶液，壳聚糖和胶原的质量比为2 8，将胶原-壳聚糖共混液注 入模具中，-20°C冷冻冻干得到胶原-壳聚糖三维多孔支架，经0. 25%戊二醛交联24h后用 三蒸水多次洗涤，-20°C冷冻冻干。将生物相容性良好的有机硅胶粘剂以0. lmg/cm2的量均 勻涂覆在厚度为0. Imm的硅橡胶薄膜表面，然后将制备好的胶原-壳聚糖三维多孔支架放
6在涂覆有机硅胶粘剂的硅橡胶薄膜表面上，获得胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架，紫外辐照 2h灭菌。将季铵化壳聚糖/pDNA-aFGF复合粒子负载到灭菌后的胶原-壳聚糖/硅橡胶双 层支架上得到负载季铵化壳聚糖和/pDNA-aFGF复合粒子的皮肤再生材料，其中pDNA-aFGF 与支架的重量比为5 100。把季铵化壳聚糖/pDNA-aFGF复合粒子负载到胶原-壳聚糖 /硅橡胶支架上，在猪背部造成三度烧伤创面，24h后切痂至有出血的正常组织(脂肪或肌 肉)，然后将材料植入。图8a、8b、8c分别是负载了季铵化壳聚糖/pDNA-aFGF复合粒子的胶 原-壳聚糖/硅橡胶支架植入烧伤全层皮肤缺损7、14、21天后的大体观察图。从图中可以 看出7天的时候支架还有剩余，创面红润，14天的时候支架几乎全部降解，21天支架完全降 解，新生组织和正常组织几乎齐平。实施例4将季铵化的壳聚糖溶解在磷酸盐缓冲液中，配制成lOmg/mL的季铵化壳聚糖溶 液，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌；将pDNA-bFGF溶解在磷酸盐缓冲液中配成ang/mL的溶液；将 pDNA-bFGF溶液与季铵化壳聚糖溶液等比混合，剧烈震荡混合均勻，静置，制备得到季铵化 壳聚糖/pDNA-bFGF复合粒子溶液。用质量浓度为3%的乙酸溶液将壳聚糖和胶原均配制成 质量浓度为的溶液，壳聚糖和胶原的质量比为1 9，将胶原-壳聚糖共混液注入模具 中，-20°C冷冻冻干得到胶原-壳聚糖三维多孔支架，经0. 5%戊二醛交联24h后用三蒸水 多次洗涤，-20°C冷冻冻干。将生物相容性良好的有机硅胶粘剂以0. 2mg/cm2的量均勻涂覆 在厚度为0. Imm的硅橡胶薄膜表面，然后将制备好的胶原-壳聚糖三维多孔支架放在涂覆 有机硅胶粘剂的硅橡胶薄膜表面上，获得胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架，紫外辐照池灭 菌。将季铵化壳聚糖/pDNA-bFGF复合粒子负载到灭菌后的胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支 架上得到负载季铵化壳聚糖和/pDNA-aFGF复合粒子的皮肤再生材料，其中pDNA-bFGF与支 架的重量比为5 100。把季铵化壳聚糖/pDNA-bFGF复合粒子负载到胶原-壳聚糖/硅 橡胶支架上，在猪背部造成三度烧伤创面，24h后切痂至有出血的正常组织(脂肪或肌肉)， 然后将材料植入。从H&E图中看出从7天到21天支架完全降解，炎症细胞数量减少，血管 增多。移植基因活性真皮替代物14天后的创面可以进行超薄皮片移植，移植后的全层皮肤 修复效果用H&E观察。从图10中可以看出移植98天，真皮组织胶原束类似正常组织，表皮 层与真皮层连接紧密，有乳头状结构存在，表皮分化较好。
权利要求
1.一种负载季铵化壳聚糖和质粒DNA复合粒子的皮肤再生材料的制备方法，包括如下 步骤1)用磷酸盐缓冲液或三蒸水分别配制浓度为1 20mg/mL的季铵化壳聚糖溶液和浓度 为0. 1 5mg/mL的质粒DNA溶液；将季铵化壳聚糖溶液与质粒DNA溶液等比混合，震荡均 勻，静置，制得季铵化壳聚糖/质粒DNA粒子溶液；2)用质量浓度为0.3% 5%的乙酸溶液分别配制质量浓度为0. 的胶原溶 液和质量浓度为0. 的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液滴入胶原溶液中，搅拌均勻、真 空脱泡，得到胶原-壳聚糖混合溶液，其中壳聚糖和胶原的质量比为1 9 5 5;将胶 原-壳聚糖共混液注入模具中，采用冷冻-干燥法，在_5°C -50°C温度下冷冻干燥，获得 胶原-壳聚糖三维多孔支架；将胶原-壳聚糖三维多孔支架于质量浓度为0. 05% 的 戊二醛溶液中交联1 48小时，反复清洗后，再次在_5°C _50°C温度下冷冻干燥；3)将医用胶粘剂以0.05 0. 5mg/cm2的量均勻涂覆在厚度为0. 05 0. 2mm的硅橡胶 薄膜表面，然后将步骤2、制备好的胶原-壳聚糖三维多孔支架放在涂覆胶粘剂的硅橡胶薄 膜表面上，获得胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架。4)将步骤1)的季铵化壳聚糖/质粒DNA粒子溶液逐滴加到胶原-壳聚糖/硅橡胶双 层支架上，其中质粒DNA与支架的重量比为0.5 100 10 100，室温下孵化0. 2 2小 时，在-5°C _50°C温度下冷冻干燥，得到负载复合季铵化壳聚糖和质粒DNA粒子的皮肤再 生材料。
2.根据权利要求1所述的负载复合季铵化壳聚糖和质粒DNA粒子的皮肤再生材料的制 备方法，其特征是所说的医用胶粘剂是α-氰基丙烯酸酯类胶粘剂或有机硅胶粘剂。
3.根据权利要求1所述的负载复合季铵化壳聚糖和质粒DNA粒子的皮肤再生材料的制 备方法，其特征是所说的质粒DNA是表达血管内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、酸 性成纤维细胞生长因子或碱性成纤维细胞生长因子的质粒DNA。
全文摘要
本发明公开了负载季铵化壳聚糖和质粒DNA复合粒子的皮肤再生材料的制备方法。该皮肤再生材料是通过将季铵化壳聚糖/质粒DNA粒子导入胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架制备而成。通过导入的季铵化壳聚糖/质粒DNA粒子在皮肤缺损创面的原位转染、表达皮肤再生修复过程的促血管生成因子，从而促进皮肤再生材料在创面上的快速血管化，诱导创面细胞的迁移、增殖和分化，实现创面快速、良好的修复。本发明所制备的皮肤再生材料具有快速的血管化性能和优异的创面修复能力，可广泛应用于创伤和烧伤等全层皮肤缺损的修复与再生，具有较好的临床应用前景。
文档编号A61L27/60GK102114272SQ20101019363
公开日2011年7月6日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者徐少骏, 毛峥伟, 郭瑞, 马列, 高长有 申请人:浙江大学