专利名称：一种牡蛎壳提取物的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种牡蛎壳提取物的制备方法及其在制备细胞增殖抑制剂、血管生成 抑制剂和抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
在海水养殖品种中，贝类由于投入成本低、单产高等特点，占海水养殖的比重高达 80%以上，成为沿海渔民增收的重要渠道。贝类养殖中以牡蛎养殖为主，但是牡蛎生产加 工过程中残留的大量牡蛎壳，除部分粉碎后作为动物饲料出售或煅烧白灰外，没有得到有 效利用和妥善处理，常被加工者直接倾倒在公路两旁、闲杂空地或废弃沟渠里，严重污染环 境，直接影响了城乡人居环境的改善和新农村的建设。牡蛎壳作为中药使用，始载于《神农本草经》，亦为历次《中华人民共和国药典》收 载，是常见海洋中药，具有重镇安神，潜阳补阴，软坚散结，收敛固涩的功效，用于惊悸失眠， 眩晕耳鸣，瘰疠痰核，癥瘕痞块等病症的治疗。中药牡蛎主要成分是碳酸钙等无机成分，所 含重量比占90%以上，此外含有不到10%的有机成分，如蛋白质、糖蛋白和多种氨基酸等。 目前对牡蛎壳中可溶性蛋白质的制备方法以及在骨科中的应用研究较多，对牡蛎壳提取物 的制备方法及其在制备细胞增殖抑制剂、血管生成抑制剂或抗肿瘤药物中的应用研究至今 未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种牡蛎壳提取物的制备方法及其在制备细胞增殖抑制剂、 血管生成抑制和抗肿瘤药物中的应用，以满足现有技术的上述需求。一种牡蛎壳提取物的制备方法，其特征在于先称取牡蛎壳粉，再按料液比为 Ig 2-20mL加入含水的醇溶液，回流提取，过滤或离心分出液体；所得液体在减压条件下 浓缩后，用有机溶剂提取，分取有机溶剂层，减压浓缩，干燥后得牡蛎壳提取物。上述的牡蛎壳提取物在制备细胞增殖抑制剂中的应用。上述的牡蛎壳提取物在制备血管生成抑制剂中的应用。上述的牡蛎壳提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明采用丽丝胺罗丹明B(SRB)法测试了制备的牡蛎壳提取物对多种肿瘤细胞 株的细胞增殖抑制作用，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测试了牡蛎壳提取物对人脐静脉内 皮细胞的细胞增殖抑制作用。实验表明，本牡蛎壳提取物可通过抑制肿瘤细胞增殖和抑制 血管生成方式，从而发挥其抗肿瘤作用。因此本发明的牡蛎壳提取物可用作细胞增殖抑制 剂、血管生成抑制剂和抗肿瘤剂。
具体实施例方式制备本发明的牡蛎壳提取物时，先称取牡蛎壳粉，按料液比为Ig 2-20mL加入含 水的醇溶液，回流提取，过滤或离心分出液体；所得液体在减压条件下浓缩后，用有机溶剂提取，分取有机溶剂层，减压浓缩，干燥后得牡蛎壳提取物。本发明中所述的醇为甲醇或乙醇，所含水的体积百分浓度为0-50%。所述的有机 溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚或丙酮。实施例1称取200g牡蛎壳粉末，置于反应容器中，加入IOOOmL 50% (体积百分浓度，下 同)含水的乙醇溶液，回流提取1. 5h，离心后分出液体；向所得药渣继续加IOOOmL的50% 含水的乙醇溶液，回流提取lh，离心后分出液体。合并上述所得2次提取液，减压浓缩至 IOOmL后，用等体积的二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷萃取液，于40°C减压浓缩蒸干，得牡 蛎壳提取物。采用丽丝胺罗丹明B(SRB)法，测试所制得的牡蛎壳提取物对肿瘤细胞的增殖 抑制活性。用人肝癌BEL-7402细胞、人宫颈癌Hela细胞和小鼠白血病P388细胞，分别 在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在32°C (P388细胞)或在37°C (BEL-7402和 Hela细胞)，通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。取对数生长期的肿瘤细胞，用新鲜的 RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2 X IO5个细胞的细胞悬液，按每孔200 μ L接种于 96孔板中，每孔加入2 μ L不同浓度的样品或空白溶液，37°C下培养24小时。继而，在4°C、 3000转/分钟离心3分钟，吸去上清液。每孔加入20%三氯醋酸50 μ L，置于4°C固定1小 时，用水冲洗5次，并空气干燥。每孔加入0.4% SRB的醋酸溶液50 μ L并在室温静置30 分钟。用醋酸水溶液清洗4次后，每孔加入150yL三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液 (10mmol/L, pH 10. 5)，利用MD公司产SPECTRA MAX Plus型酶标仪测定每孔在520nm处的 光密度(OD)值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照。取 三孔平均OD值，按公式= (0D空白对照-OD样品)/OD空白对照X 100 %计算每个浓 度下的细胞增殖抑制率(IR% )。肿瘤细胞增殖抑制实验表明，所制取的牡蛎壳提取物对小 鼠白血病P388细胞的IC5tl值为67. 3 μ g/mL ；牡蛎壳提取物在250 μ g/mL浓度下，对人宫颈 癌Hela细胞和人肝癌BEL-7402细胞的增殖抑制率分别为64. 84和77. 78%。以上实验证 实，所制取的牡蛎壳提取物对肿瘤细胞可通过抑制细胞增殖方式，从而发挥其抗肿瘤作用。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法，测试所制得的牡蛎壳提取物对血管生成的抑制活 性。用人脐静脉内皮细胞HUVEHUVEC细胞，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37°C、 通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。取对数生长期的人脐静脉内皮细胞HUVEC，计数 后埋96孔板，浓度为5000个/孔。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养孵育48h。换用 含1 %胎牛血清的RPMI-1640培养基，加药，继续孵育48h。然后每孔加入5mg/mL的MTT溶 液20 μ L，孵育4h。吸出MTT，加入150 μ L 二甲基亚砜充分溶解；酶标仪490nm处测定吸光 度。内皮细胞增殖抑制实验表明，所制取的牡蛎壳提取物在250 μ g/mL浓度下，对人脐静脉 内皮细胞HUVEC的增殖抑制率为25. 86%。以上实验证实，所制取的牡蛎壳提取物对肿瘤细 胞可通过抑制血管生成的方式，从而发挥其抗肿瘤作用。实施例2称取200g牡蛎壳粉末，置于反应容器中，用1200mL的甲醇，回流提取lh，过滤分出 液体；向所得药渣继续加入IOOOmL的甲醇，回流提取0. 5h，过滤分出液体；再次向所得药渣 加入IOOOmL的甲醇，回流提取0. 5h，过滤分出液体。合并上述所得3次提取液，于40°C减 压浓缩蒸干后，共用200mL丙酮分2次提取，合并丙酮提取液，于40°C减压浓缩蒸干，得牡蛎壳提取物。肿瘤细胞增殖抑制实验表明，所制取的牡蛎壳提取物在100μ g/mL浓度下，对小 鼠白血病P388细胞的增殖抑制率为81. 32%。
权利要求
一种牡蛎壳提取物的制备方法，其特征在于先称取牡蛎壳粉，再按料液比为1g∶2 20mL加入含水的醇溶液，回流提取，过滤或离心分出液体；所得液体在减压条件下浓缩后，用有机溶剂提取，分取有机溶剂层，减压浓缩，干燥后得牡蛎壳提取物。
2.如权利要求1所述牡蛎壳提取物的制备方法，其特征在于所述的醇为甲醇或乙醇， 所含水的体积百分浓度为0-50%。
3.如权利要求1所述牡蛎壳提取物的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为二氯甲 烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚或丙酮。
4.权利要求1所述的牡蛎壳提取物在制备细胞增殖抑制剂中的应用。
5.权利要求1所述的牡蛎壳提取物在制备血管生成抑制剂中的应用。
6.权利要求1所述的牡蛎壳提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
一种牡蛎壳提取物的制备方法，其特征在于先称取牡蛎壳粉，再按料液比为1g∶2-20mL加入含水的醇溶液，回流提取，过滤或离心分出液体；所得液体在减压条件下浓缩后，用有机溶剂提取，分取有机溶剂层，减压浓缩，干燥后得牡蛎壳提取物。本发明采用丽丝胺罗丹明B法测试了制备的牡蛎壳提取物对多种肿瘤细胞株的细胞增殖抑制作用，采用四甲基偶氮唑盐法测试了牡蛎壳提取物对人脐静脉内皮细胞的细胞增殖抑制作用。实验表明，本牡蛎壳提取物可通过抑制肿瘤细胞增殖和抑制血管生成方式，从而发挥其抗肿瘤作用。因此本发明的牡蛎壳提取物可用作细胞增殖抑制剂、血管生成抑制剂和抗肿瘤剂。
文档编号A61K35/56GK101953850SQ20101028036
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月8日 优先权日2010年9月8日
发明者刘红兵, 杨雪, 管华诗 申请人:中国海洋大学