专利名称：牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种有机活性成分-糖蛋白的提取纯化方法，特别是涉及一种牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法。
背景技术：
当前海洋生物活性物质的研究是开发海洋生物资源的一个热点，海洋生物的多样性和特异性，为人类提供种类繁多，生理活性特异的海洋生物天然产物，它是药物、保健品、食品、生物材料的巨大宝库。
世界海岸国家对牡蛎养殖业都非常重视，美国是世界上牡蛎养殖最发达的国家之一，其次是日本和法国，牡蛎养殖居水产养殖的首位。为促进养殖业发展，保护环境，已投入大量资金用于牡蛎壳无污染高值开发。日本开发以牡蛎壳壳为原料，生产优良天然活性钙，用于营养型清凉饮料、医药等，每年从我国廉价进口壳粉，提制的活性钙再高值外销。美国以牡蛎钙天然有机钙作为食品、医药主要钙源；美国、德国等国科学家仿生贝壳尤其牡蛎壳研制无机生物材料。
国内目前有将牡蛎壳高温煅烧成生石灰使用；由于仍然高能耗，且使牡蛎壳中有机活性成份煅烧后损失殆尽，个别地区少量牡蛎壳被作为土壤肥料或饲料添加剂低值利用，大部分地区牡蛎壳被直接废弃为垃圾或填海废弃。据最新调查统计目前全国牡蛎329万吨(其中壳占近80％)。我国古代医学文献《本草纲目》已记叙了蚝壳的多种药用作用，如蚝壳可“化痰软坚，滋阴潜阳，镇静敛汗，固精止带……”。在民间和中药中蚝壳被用来治疗胃酸过多、消肿、治猩红热。表明此类其中含有活性成分[4][5]。现代科学分析也表明，蚝壳除含钙40％左右外，尚含生物有机成份与微量元素。据国外资料最新报道，日本研究发现，蚝壳中的钙盐能致密毛细血管、减低血管的的渗透性、调节电解质平衡，抑制神经肌肉的兴奋，因而可用来治疗胃及十二指肠溃疡、盗汗、失眠和眩晕等症。蚝壳中具有生物活性的壳聚多糖不仅能促进调整T、B淋巴细胞NK细胞等免疫细胞的功能，还能促进细胞因子如白介素、干扰素、肿瘤坏死因子。这表明牡蛎壳中存在活性药用成分。尤其有机活性成分。由此可见对牡蛎壳的药用作用国内外均有不少的研究。但迄今有关牡蛎壳中药用有机活性成分的提取纯化方法尚未见报道。因此，开展这项研究工作对研究发现牡蛎壳药用功能的活性成分、高附加值综合利用牡蛎壳是一项很有实用意义的工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种实用、可行的牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法。该方法能有效地将大而厚的牡蛎壳中的糖蛋白提取纯化，牡蛎壳中糖蛋白的分离纯化可为深入研究该新颖糖蛋白生物活性，开拓其在医药、保健品、化妆品等方面的应用，进而高附加值开发利用牡蛎壳提供实用有效的的方法。
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是本发明是一种牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法，它包括以下步骤(1)酸消解将干燥、洁净的牡蛎壳粉末以无机酸或有机酸(水溶液)在5-400C温度下基本消解至全溶态；(2)碱液处理将酸解后产物加有机碱或无机碱，调至PH值大于8，5-400C下搅拌2-25min，使酸不溶物尽量溶解后静置，过滤，得滤液；(3)糖蛋白沉淀在滤液中，缓慢搅拌下，加入沉淀剂至无沉淀产生，静置、过滤，以透析膜透析或凝胶层析纯化后，真空干燥得精制糖蛋白。
所述的无机酸或有机酸为无机酸或有机酸水溶液。
所述的无机或有机酸的浓度为0.1-1 5％。
所述的酸包括盐酸、硫酸(稀)、硝酸(稀)等无机酸，或丙酸酸、苹果酸、乳酸等有机酸。
所述的无机碱或有机碱的浓度为0.1-20％。
所述的无机碱或有机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、西佛碱等含胺基有机物等。
所述的沉淀剂为浓度1-100％的丙酮、或20-100％的乙醇、或1-20％的硫酸铵。
所述的透析膜为蛋白胶膜、或动物膜、或火棉胶膜、或超滤膜。所述的凝胶层析为琼脂糖凝胶(Sapharose)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel)、葡聚糖凝胶(Sephadex)及羧甲基-交联葡聚糖(CM-Sephadex)。
采用上述方案后，由于本发明采用酸溶液、碱溶液、沉淀剂等三种化学药品；酸性水溶液可将牡蛎壳中水不溶解性无机钙盐、有机成分消解为溶解游离态；碱性水溶液可将酸不溶物予以溶解，同时调节体系pH值为碱性；沉淀剂主要作用是使溶液中糖蛋白沉淀。因而，本发明是从大而坚厚的牡蛎壳中高效提取高纯度糖蛋白的一种简单实用的有效方法。
具体实施例方式
实施例1取一定重量牡蛎壳(鲜新为佳)，自来水冲洗干净后，凉干，粉碎(20-60目)。将干燥、洁净的牡蛎壳粉末放于耐酸反应器中，缓慢加入0.1％盐酸水溶液，控温400C反应，至牡蛎壳粉基本全溶，向其中加入0.1％氢氧化钠水溶液，至PH等于8，50C下搅拌5min，使酸不溶物尽量溶解后静置，过滤，得滤液；在滤液中，缓慢搅拌下，加入100％丙酮沉淀剂至无沉淀产生，静置、过滤，再以100％丙酮将沉淀洗涤3次，以蛋白胶膜纯化后，真空干燥得高纯糖蛋白。
实施例2取一定重量牡蛎壳(鲜新为佳)，自来水冲洗干净后，凉干，粉碎(20-60目。将干燥、洁净的牡蛎壳粉末放于耐酸反应器中，缓慢加入2％稀硝酸溶液，控温250C反应至牡蛎壳粉基本全溶，向其中加入12％氢氧化钾水溶液，至PH等于9，250C下搅拌8min，使酸不溶物尽量溶解后静置，过滤，得滤液；在滤液中，缓慢搅拌下，加入100％乙醇至无沉淀产生，静置、过滤，再以100％乙醇将沉淀洗涤3次，以火棉胶膜透析纯化后，真空干燥得糖蛋白纯品。
实施例3取一定重量洗净/凉干/粉碎至(20-60目)的牡蛎壳(鲜新为佳)粉于耐酸反应器中，缓慢加入15％丙酸溶液，控温260C反应至牡蛎壳粉基本全溶，再向其中加入8％氨水液，至PH等于8.5，200C下搅拌2min，使酸不溶物尽量溶解后静置，过滤，得滤液；缓慢搅拌下，加入20％的硫酸铵水溶液至无沉淀产生，静置、过滤，再以100％乙醇或100％丙酮将沉淀洗涤3次，以超滤膜纯化后，真空干燥得糖蛋白纯品。
实施例4取一定重量洗净/凉干/粉碎至(20-60目)的牡蛎壳(鲜新为佳)粉于耐酸反应器中，缓慢加入12％乳酸溶液，控温180C反应至牡蛎壳粉基本全溶，再向其中加入1％西佛碱液，至PH等于8.6，380C下搅拌3min，使酸不溶物尽量溶解后静置，过滤，得滤液；缓慢搅拌下，加入13％的硫酸铵水溶液至无沉淀产生，静置、过滤，再以100％丙酮将沉淀洗涤4次，以动物膜纯化后，真空干燥得糖蛋白纯品。
实施例5取一定重量洗净/凉干/粉碎至(20-60目)的牡蛎壳(鲜新为佳)粉于耐酸反应器中，缓慢加入5％柠檬酸溶液，控温80C反应至牡蛎壳粉基本全溶，再向其中加入0.6％氢氧化钠溶液，至PH等于8.4，100C下搅拌5min，使酸不溶物尽量溶解后静置，过滤，得滤液；缓慢搅拌下，加入丙酮至无沉淀产生，静置、过滤，弃上清留沉淀，再以丙酮将沉淀洗涤3次，以尿素Tris-HCl缓冲液(pH8.5)溶解沉淀，将此溶解液加样于天然琼脂糖(Sapharose凝胶柱，以6mol/L尿素Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L，pH8.5)洗脱，由部分收集器按吸收峰分部收集；对各组份进行鉴定，收集蛋白峰，透析，浓缩，真空干燥得糖蛋白纯品。
本发明的原理牡蛎壳中共生糖蛋白经酸、碱分步作用变为游离态，经蛋白沉淀剂沉淀、过滤、洗涤得粗糖蛋白，将此粗糖蛋白经透析或凝胶层析纯化、真空干燥后得到精制糖蛋白。
权利要求
1.一种牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法，其特征在于它包括以下步骤(1)酸消解将干燥、洁净的牡蛎壳粉末以无机酸或有机酸在5-400℃温度下基本消解至全溶态；(2)碱液处理将酸解后产物加有机碱或无机碱，调至PH值大于8，5-400C下搅拌2-25min，使酸不溶物尽量溶解后静置，过滤，得滤液；(3)糖蛋白沉淀在滤液中，缓慢搅拌下，加入沉淀剂至无沉淀产生，静置、过滤，以透析膜透析或凝胶层析纯化后，真空干燥得精制糖蛋白。
2.根据权利要求1所述的牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法，其特征在于所述的无机酸或有机酸为无机酸或有机酸水溶液。
3.根据权利要求1所述的牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法，其特征在于所述的无机或有机酸的浓度为0.1-15％。
4.根据权利要求1或3所述的牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法，其特征在于所述的酸包括盐酸、硫酸(稀)、硝酸(稀)等无机酸，或丙酸酸、苹果酸、乳酸等有机酸。
5.根据权利要求1所述的牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法，其特征在于所述的无机碱或有机碱的浓度为0.1-20％。
6.根据权利要求1或5所述的牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法，其特征在于所述的无机碱或有机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、西佛碱等含胺基有机物等。
7.根据权利要求1所述的牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法，其特征在于所述的沉淀剂为浓度1-100％的丙酮、或20-100％的乙醇、或1-20％的硫酸铵。
8.据权利要求1所述的牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法，其特征在于所述的透析膜为蛋白胶膜、或动物膜、或火棉胶膜、或超滤膜。
9.据权利要求1所述的牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法，其特征在于所述的凝胶层析为琼脂糖凝胶(Sapharose)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel)、葡聚糖凝胶(Sephadex)及羧甲基-交联葡聚糖(CM-Sephadex)。
全文摘要
本发明公开了一种牡蛎壳中糖蛋白提取纯化方法，它包括酸消解、碱液处理、糖蛋白沉淀等三个步骤。本发明采用酸、碱、沉淀剂等三种成分的化学药品；酸性溶液水可将牡蛎壳中水不溶解性无机钙盐、有机成分消解为溶解游离态；碱性水溶液可将酸不溶物予以溶解，同时调节体系pH值为碱性；沉淀剂主要作用是使溶液中糖蛋白沉淀。因而，本发明是一种从大而坚厚的牡蛎壳中高效提取高纯度糖蛋白的一种简单实用的有效方法。
文档编号C07K14/435GK1660897SQ200410077580
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者马建华 申请人:集美大学