专利名称：从红豆杉枝叶中初分离10－去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法
技术领域：
本发明涉及一种红豆杉植物成分的提取方法，特别是一种从红豆杉枝叶中用大孔吸附树脂初分离10-去乙酰基巴卡亭III的方法。
背景技术：
10-去乙酰基巴卡亭III(10-DABIII)是抗癌药紫杉醇(Taxol)的同系物，也是植物体内合成紫杉醇的前体成分。现已作为人工半合成紫杉醇或多烯紫杉醇的前体原料。紫杉醇或多烯紫杉醇在临床上已应用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌等治疗，其疗效好，毒副作用小，是当今抗癌药的新秀。我国和世界上多个国家都已批准生产和临床使用，需求量日增。以往紫杉醇的主要来源于天然红豆杉的树皮，而红豆杉植物是属国家珍稀保护植物，天然红豆杉资源极为有限，国家严禁把它用作制取紫杉醇的原料，因此，紫杉醇的生产和供应由于原料缺乏远远不能满足临床治疗的需要。目前，利用大规模人工栽培红豆杉，剪取其枝叶作为原料，是解决药源紧缺的途径之一。紫杉醇和10-DABIII共存于红豆杉植物中，早期研究认为欧洲短叶红豆杉枝叶中10-DABIII含量较高，是紫杉醇含量的4倍，达到0.08％左右。申请人发现我国栽培的某些红豆杉的枝叶含有丰富的10-DABIII，因此把10-DABIII分离出来，作为半合成紫杉醇或多烯紫杉醇的原料具有重要的意义。
目前，国外文献及专利报道的从红豆杉枝叶中提取10-DABIII的方法，大多是先利用乙醇或甲醇进行提取，再用其他有机溶剂萃取，萃取液浓缩后，进行多次硅胶柱层析并重结晶。中国专利申请号02136678公开了从乙醇提取过紫杉醇的红豆杉枝叶残渣中提取10-DABIII的方法，先用乙醇提取红豆杉枝叶中的紫杉醇，其残渣中除尽乙醇，再用水提取残渣中的10-DABIII，水提取液浓缩、喷雾干燥，高压正相制备色谱分离，得到纯品10-DABIII。此外，中国专利公开号CN1473821A公开了一种提取10-DABIII的方法，红豆杉枝叶超细粉φ≤10μm用乙醇提取，浓缩后，浸膏用有机溶剂萃取，两次硅胶柱层析，水解转化，进行硅胶柱层析，重结晶等得到10-DABIII。前者虽然省去了有机溶剂萃取，但是对大量水提取液使用喷雾干燥方法进行浓缩干燥，能耗大，成本高；后者在初分离中都要用大量有机溶剂进行萃取，成本高，安全性差。
发明内容
本发明的目的就是提供一种利用可再生大孔吸附树脂，吸附分离红豆杉枝叶的含水乙醇提取液的浓缩液中的10-去乙酰基巴卡亭III，从而实现初分离10-去乙酰基巴卡亭III的方法。
本发明的目的可通过以下技术方案来实现将大孔吸附树脂放入含10-去乙酰基巴卡亭III的红豆杉枝叶的70～80％乙醇提取液的浓缩液的滤液中，摇动吸附3～5小时，或将大孔吸附树脂装填于层析柱中，让含10-去乙酰基巴卡亭III的红豆杉枝叶的70～80％乙醇提取液的浓缩液的滤液流经大孔吸附树脂，进行吸附，滤液PH值5～6，吸附后，用无水乙醇洗脱被大孔吸附树脂吸附的10-去乙酰基巴卡亭III，乙醇洗脱液浓缩后，得到含10-去乙酰基巴卡亭III的流浸膏。大孔吸附树脂是S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或D3520。红豆杉枝叶是南方红豆杉、云南红豆杉、中国红豆杉、东北红豆杉、西藏红豆杉或曼地亚红豆杉的枝叶。
本发明充分利用了红豆杉枝叶资源，既提取紫杉醇，又提取10-DABIII，提高了资源利用率，省去了液-液萃取步骤，减少了有机溶剂的使用量，降低了成本，安全性高，10-DABIII的回收率高。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明作进一步描述。
试验用材料南方红豆杉、云南红豆杉、中国红豆杉、东北红豆杉、西藏红豆杉或曼地亚红豆杉的枝叶风干后，粉碎成40～200目的粉末。
试验用试剂95％食用级乙醇，由广东丰顺光明化工厂生产，分析纯无水乙醇，由广州化学试剂二厂生产，色谱纯试剂甲醇、乙腈由进口分装。
试验用仪器900瓦超声提取器由深圳超晋超声工程有限公司生产，HPLC检测使用Waters高压液相色谱仪，色谱仪由美国Waters公司生产，高压液相色谱条件Nova-PAK C18反相柱，3.9mm×150mm粒度4μm，流动相为甲醇∶水＝43∶57，流速1ml/min，柱温35℃，检测波长227nm。大孔吸附树脂是S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或D3520，由南开大学化工厂生产。
大孔吸附树脂用下述试剂依次处理1)蒸馏水浸泡洗涤24小时，去杂至水洗液透明；2)1mol的NaoH浸泡24小时去杂；3)蒸馏水洗至中性；4)1mol的HCL浸泡24小时去杂；5)蒸馏水洗至中性；6)无水乙醇洗到洗脱液加水不产生白色混浊为止；7)蒸馏水洗至无乙醇味为止。
试验用红豆杉枝叶提取液的制备采集红豆杉枝叶风干后，粉碎成40～200目的干粉，称取42g，放入500ml标准磨口玻璃三角瓶中，加入200ml的70％乙醇，装上球形冷凝管，通入冷却水，将三角瓶装置放在900瓦的超声提取器中，在28.5℃下，超声提取30分钟，过滤，滤渣再重复提取3次，合并4次的乙醇提取液，在旋转蒸发器中，55℃水浴，-0.08Mpa的真空下，减压回收乙醇至浓缩液无醇味，水性浓缩液静置过夜，有沉淀析出，用布氏漏斗抽滤，沉淀物作为分离紫杉醇、三尖杉宁等之用。含10-DABIII的滤液计215ml供大孔吸附树脂富集分离10-DABIII之用。用HPLC检测上述滤液中的10-DABIII，其含量为0.313mg/ml，总含量为67.37mg，占红豆杉枝叶干粉重的0.16％。
实施例一在四个250ml玻璃三角瓶中，分别加入13.13ml红豆杉枝叶的70％乙醇提取液的浓缩液的滤液，滤液中含4.11mg10-DABIII，分别用蒸馏水16.87ml稀释为30ml，PH值5；再分别加入已处理好的湿基大孔吸附树脂S-8、D4020、X-5、D3520各5g，干重分别为1.25g、1.1g、1.35g、1.1g。
将上述四个试验样品瓶在20℃下放在摇床上摇动吸附4小时，摇床转速为103转/分，用普通定性滤纸在玻璃漏斗中过滤，得到已吸附了10-DABIII的大孔吸附树脂和滤液。用HPLC测定滤液中残留的10-DABIII的含量，计算出每种大孔吸附树脂的吸附量；吸附了10-DABIII的大孔吸附树脂分别装入三角瓶中，再各加入60ml无水乙醇，在室温下置于摇床上摇动洗脱1小时，用普通定性滤纸在玻璃漏斗中过滤，重复洗脱4次，合并4次洗脱液，定容为250ml，用HPLC检测其中10-DABIII的含量，计算10-DABIII的洗脱量、洗脱率和回收率，见表一。含10-DABIII的乙醇洗脱液在旋转蒸发器中，于55℃水浴，-0.08Mpa的真空减压浓缩成流浸膏，待进一步纯化之用。
吸附量＝试液中原含量-试液中残留量洗脱率＝洗脱量/吸附量×100％回收率＝洗脱量/试液中原含量×100％表一
从表一数据看出，以上4种大孔吸附树脂对红豆杉枝叶含水乙醇提取液的浓缩液的过滤液中的10-DABIII均有良好的吸附和解吸附性能。1g干树脂吸附量除X-5为2.76mg外，其余3种均在3mg以上。洗脱率均在90～97.7％之间。以上试验结果表明，用大孔吸附树脂吸附法初分离红豆杉枝叶中的10-DABIII是可行的。
实施例二取二份各6.1ml的制备好的红豆杉枝叶80％乙醇提取液的浓缩液的滤液，滤液中含10-DABIII 1.91mg，分别加入50ml玻璃三角瓶中，加蒸馏水8.9ml稀释为15ml，测PH值为5.2。分别称取已处理好的湿基大孔树脂AB-8、NKA-9各5g，干重分别为1.38g、1.58g；分别装入2根35cm×0.7cm的玻璃层析柱中，用蒸馏水平衡后，把已备好的二份含10-DABIII的滤液分别倒入二根层析柱中，开启柱下部活塞，使滤液缓慢流过柱中的大孔吸附树脂，重复3次，使滤液中的10-DABIII被完全吸附。用HPLC检测层析柱流出液不含10-DABIII后，流出液弃去。用无水乙醇洗脱被大孔吸附树脂吸附的10-DABIII，共接受洗脱液6份计240ml，用HPLC检测最后1份中10-DABIII，结果显示不含10-DABIII。合并乙醇洗脱液，定容至250ml，取样，进行HPLC分析。由分析结果计算大孔吸附树脂对10-DABIII的吸附量、洗脱量、洗脱率、回收率。计算方法与实施例一相同，试验结果见表二。含10-DABIII乙醇洗脱液在旋转蒸发器中，于55℃水浴，-0.08Mpa的真空减压浓缩成流浸膏。
表二
表二显示，大孔吸附树脂AB-8、NKA-9在层析柱中对红豆杉枝叶的80％乙醇提取液的浓缩液的滤液中10-DABIII的吸附和洗脱结果都比较理想。在树脂用量稍稍过量时，能够将试液中的10-DABIII完全吸附。洗脱率、回收率都在98％以上上以上两种大孔吸附树脂用于红豆杉枝叶的80％乙醇提取液的浓缩液的过滤液10-DABIII的初分离是可行的。上述试验结果也表明，摇动吸附与在层析柱中吸附二种吸附方式均能达到较好效果。
权利要求
1.一种从红豆杉枝叶中初分离10-去乙酰基巴卡亭III的方法，其特征在于将大孔吸附树脂放入含10-去乙酰基巴卡亭III的红豆杉枝叶的70～80％乙醇提取液的浓缩液的滤液中，吸附3～5小时，或将大孔吸附树脂装填于层析柱中，让含10-去乙酰基巴卡亭III的红豆杉枝叶的70～80％乙醇提取液的浓缩液的滤液流经大孔吸附树脂，进行吸附，滤液PH值5～6，吸附后，用无水乙醇洗脱被大孔吸附树脂吸附的10-去乙酰基巴卡亭III，乙醇洗脱液浓缩后，得到含10-去乙酰基巴卡亭III的流浸膏。
2.依权利要求1所述的方法，其特征在于大孔吸附树脂是S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或D3520。
3.依权利要求1所述的方法，其特征在于红豆杉枝叶是南方红豆杉、云南红豆杉、中国红豆杉、东北红豆杉、西藏红豆杉或曼地亚红豆杉的枝叶。
全文摘要
本发明公开了一种从红豆杉枝叶初分离10－去乙酰基巴卡亭III的方法，用70～80％乙醇提取红豆杉枝叶，得到水溶性浓缩液，静置后，不溶于水的紫杉醇及低极性杂质沉淀析出，10－去乙酰基巴卡亭III等较大极性的紫杉醇同系物留在水溶液中，过滤，得到固形物和水性滤液，滤液pH值5～6，用大孔吸附树脂吸附滤液中的10－去乙酰基巴卡亭III，吸附后，用无水乙醇洗脱被大孔吸附树脂吸附的10－去乙酰基巴卡亭III，乙醇洗脱液浓缩后，得到富集10－去乙酰基巴卡亭III的产物。本发明充分利用了红豆杉枝叶资源，既提取了紫杉醇，又提取了10－DABIII，提高了资源利用率，省去了液－液萃取步骤，减少了有机溶剂使用量，降低了成本，安全性高。
文档编号C07D305/14GK1660827SQ20041007755
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月27日 优先权日2004年12月27日
发明者王国亮, 张依健, 骆雪兰, 黄巧明, 谢维权, 夏惠青, 王彬力, 曾秋玲, 叶瑞英, 侯嵩生, 李志良 申请人:梅县梅雁生物工程研究所