专利名称：竹笋壳提取物新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然植物提取及应用领域。
背景技术：
竹笋，别名笋，为多年生常绿草本植物，食用部分为初生、嫩肥短壮的芽。竹原产中国， 类型众多，适应性强，分布极广，据统计全世界共计有30个属550种，盛产于热带、亚热带 和温带地区。我国优良的笋用主要竹种有长江中下游的毛竹(Phyllostachys pubescen Mazel)、早竹(P. Praecox CD. Chu et C. S. Chao)和珠江流域、福建及台湾等地的麻竹 (Sinocal薩s latiflorus McClure)和绿竹(S. oldhami McClure)等。竹原产热带、亚 热带，喜温怕冷，主要分布在年降雨量为1000 2000mm的地区。
对竹笋的生物活性及化学成分的研究一直是竹笋研究的一个主要方面，至今为止人们采 用多种方法对不同品种竹笋进行了较为全面和系统的分析，发现其营养价值丰富，其不同的 成分可能还有很多潜在的药理学活性。营养和化学成分分析结果表明竹笋水分是竹等的主要 成份之一,其平均含量达90. 86% ，与其他茎类蔬菜相似。竹笋的蛋白质平均含量为2. 65% ，其 变幅在1.49%-4.04%之间，为含蛋白质较高的可食用植物之一。此外，竹勢的脂肪含量较少， 平均含量为0. 49% ，但竹笋中脂肪的含量比常见可食用植物为高。总搪含量低于一般可食用植 物，平均含量为2. 5%，但其中可溶糖类化合物所占比例较高，达60%以上。而粗纤维含量较低， 其平均含量仅有0. 68% 。竹笋的无机元素中含磷较为丰富,平均含量达60毫克/100克鲜異中， 铁、钙含量相对较低。
中国人以笋入肴，历史悠久。早在《诗经》中就有"其蔬伊何？唯笋即蒲"的诗句，可 见早在周代时，竹笋已和香蒲一起是人们餐桌上的美味佳肴了。食用竹箅历史悠久，曾有"素 食第一品"，"无笋不成席"之说。竹笋，即竹的嫩芽茎，古人称之为"竹肉"、"竹胎"、"竹 芽"。主要可分为冬笋、春笋、鞭笋三类。冬季藏在土中的为冬笋，色泽洁白，肉质细嫩，鲜 美无比，有"笋中皇后"之誉。春天破土而出的叫春笋，笋体肥大，美味爽口。夏秋季生长 在泥土中的嫩杈头是鞭笋，色白，质脆，味微苦而鲜。在夏秋季上市的笋，除鞭笋外，还有 广笋、黄枯等、巻笋、绿竹笋等也是桌上鲜品。
不仅如此，竹笋的食疗保健功效在我国民间也是广为流传。唐代名医孙思邈在《千金方》 中指出"竹笋性味甘寒无毒，主消渴、利水道、益气力、可久食。"明代药物学家李时珍在《本 草纲目》中认为竹笋有"化热、消痰、爽胃"之功。清代养生学家王孟英的《随息居饮食谱》中说"箅，甘凉、舒郁、降浊升清，开膈消痰，味冠素食。"竹笋还具有清胃热、肺 热、安神之功效，能改善支气管炎痰多之症，因而在食治食养中广泛应用。
现代营养学研究表明，竹笋中富含蛋白质、胡萝卜素、多种维生素及铁、磷、镁等无机 盐和有益健康的18种氨基酸。其中，赖氨酸、丝氨酸、色氨酸、苏氨酸、丙氨酸等为人体所 必需。竹^中含脂肪、淀粉少，含量最多的是纤维素，纤维素在肠内可以减少人体对脂肪的
吸收，增加肠蠕动，促进粪便排出，减少与高血脂有关疾病的发病率。
竹努作为一种低脂肪、低糖、低热量的天然保健食品，具有"天然去雕饰，清水出芙蓉"
般的洁净，亦无化学、农药、灰尘的污染，满足了现代人回归自然的心理，故备受消费者的 青睐。据有关报道，常食笋菜有明显的保健疗疾作用。咳嗽多痰、胸膈不利，常吃凉拌笋有 疗效；春笋煮粥，可治胃肠有热、小便不利、大便不畅。有高血压、冠心病、动脉硬化、糖 尿病、便秘等老年性疾病的患者常吃笋菜也有辅助治疗作用。竹笋作为天然保健食品，在一
些发达国家的需求量也与日俱增。但遗憾的是，人们对竹第壳的研发与利用却很少给与关注。
周兆祥等人曾经报道杂竹笋壳含有糖类、粗纤维和总氮等营养物质，并从毛竹笋及杂竹笋壳
中确认出多种氨基酸(浙江林学院学报，8:54-59， 1991)。许丽旋等人的研究证明竹笋壳提
取液具有一定的抑菌作用，为竹笋壳的开发利用提供了实验依据(世界竹藤通讯，4:29-31，
2006)。但至今为止对竹箅壳的抗应激及改善肝脏功能等方面的药理活性研究尚未见到任何报
道，同时对竹笋壳在预防疾病、健康机能、医药、健康食品及化妆品等应用方面也没有知识 产权上的有效的保护。
近年来随着科技的进步和生活节奏的加快，人们为了适应社会的日益强烈的竞争，需要承 受来自不同方面的种种压力，使人们常常处于一种应激环境中，因此应激负荷而引起的各种
生活习惯病也随之而来。最初提出应激概念的是加拿大医生Selye (Nature, 138, 32-33， 1936)，
Selye将物理学中表示物体受到机械力作用时材料内部产生的应激反应(stress)来形容人体 的身心疲劳状态。Selye等人在研究中发现应激原负荷能导致实验动物在生理机能上发生变 化，并认为这些变化是一种典型的应激综合反应。例如大鼠在束缚或拘束负荷时，应激反应 可表现出动物的肾上腺肥大和胸腺淋巴结退化等明显的应激综合反应。他认为应激反应是来
自各种外界刺激因素(stressor)作用时所引起的一种临床症候群，是指当机体受到外界应激源
刺激时，机体出现与刺激种类无关的全身性防御反应与适应过程。此外，拘束应激负荷模型 是经典的心理应激模型之一。这种方法通过剥夺动物活动的自由诱发最纯粹的挫折应激 (Neuropharmacology, 14: 443-452， 1996)，通过束缚实验动物的自由活动，引起动物的紧张和恐惧心理。临床上常将拘束应激负荷视为应激诱导的抑郁模型(Steriod, 65: 8-15,2000)，该模 型能够更有效的引起动物的紧张情绪，也是常用的应激性肝损伤及胃溃疡模型(药学学 报，41:631-635, 2006)。而且中医理论认为各种刺激源所引起的气机变化，主要由肝脏来调整。 在心理方面对于情绪变化，尤其在调节情志因素引起的各种变化时，肝脏起着决定性的作用。 这提示中医学的肝功能与西医学的神经一内分泌一免疫系统表示的机体内环境稳定状态密切 相关。
另外，可以说对应激负荷的机体所出现的是疲劳反应，也可归属于中医"劳倦"范畴。 长期的疲劳反应是一种亚健康状态。世界卫生组织(WHO)的一项全球性调査表明，真正健康的 人仅占5%，患有疾病的人占20%，而75%的人则处于亚健康状态。亚健康(sub—health)又称第 三状态，也称灰色状态、病前状态、亚临床期、临床前期、潜伏期等，是介于健康与疾病之 间的一种状态，临床症状轻微、但己有潜在的病理信息。其最主要的表现形式为慢性疲劳综 合症(chronic fatigue syndrome CFS)。慢性疲劳综合症是一种以长期疲劳为主要表现的全身性疾 病，是以疲劳、低热、注意力不易集中、记忆力下降、睡眠障碍和抑郁等非特异性表现为主 的综合症。
抗应激药物能减弱应激负荷对机体的作用，降低机体对应激负荷的反应性，通常有安定 止痛剂(氯丙嗪、嘧哌嗪、三氟拉嗪、氟哌啶醇)、安定剂(氯二氢甲基苯基苯并二氮杂卓酮、 溴氯苯基二氢苯并二氮杂卓酮)和镇静剂(苯纳嗪、溴化钠、盐酸地巴唑)。但这些药物多数 具有副作用而且在临床使用剂量上受到一定限制、在效果上也多局限于暂时性的缓解，而不 能从根本上达到治疗目的。为此我们在致力于寻找和开发新的抗应激，抗氧化的药物、健康 食品、食品和食品添加剂的过程中，也注意到竹笋壳及其提取物的抗应激，抗氧化作用效果 及对其应用开发。
基于上述理由，本发明是提供一种以竹笋壳及竹笋壳提取物为原料，以医药品、健康食 品及食品添加剂为使用范围的抗应激、抗氧化、抗疲劳及改善肝脏功能的活性物质。确切说， 本发明通过以提髙应激负荷下的肝脏功能等指标，提供一种以竹笋壳及竹笋壳提取物为原料， 改善机体状态、且可长期服用，安全、无毒副作用的医药品、健康食品、食品添加剂及其组 成物。此外，本发明证明竹笋壳及竹笋壳提取物所提示的药理活性可以用于减轻和治疗因应 激负荷低下起因的各种临床症状，也可作为因抗氧化作用増强体内防御力的药品、健康食品、 食品添加剂及其组成物
发明内容
具体实施例方式
本发明可以通过以下实施例进行详细说明，但并不仅仅局限于以下实施例。
实施例一、竹笋壳提取物的制备
准确称取干燥竹笋壳0. 50kg，使用粉碎机微粉碎后回收细粉化的竹笋壳，添加8倍量的 95%乙醇，8(TC热回流提取120分钟，提取液经纱布滤过后，滤饼再用相同条件提取两次，合 并滤液，经3000rpm、 15分钟离心分离后回收上清液冷冻干燥即成。回收率约0.48-5.0%竹笋 壳的上述冷冻干燥提取物用于本发明的下列实施例。
实施例二、竹笋壳提取物对拘束应激负荷小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性的改善作用
血浆丙氨酸氨基转移酶的活性是肝细胞损伤程度的一个特征性指标。至今为止的研究证 明应激反应会引起大量的自由基和细胞介素产生，例如应激负荷通过活化肝脏中的巨噬细 胞，继而激活各种细胞因子，引发炎症反应。此外，在这一反应过程中也可诱导淋巴细胞、 巨噬细胞的细胞毒作用，通过肝细胞凋亡等多种途径损伤肝细胞。我们采用的测定原理是利 用丙氨酸氨基转移酶(ALT)在37'C及PH7.4条件下，作用于丙氨酸及a-酮戊二酸组成的底 物，生成丙酮酸及谷氨酸。反应一定时间后，加入2，4-二硝基苯肼(DNra)盐酸溶液，即终 止反应，同时DNPH与酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙。苯腙在碱性条件下呈红棕色，比色 法进行测定。具体实验中测定使用丙二醛测定试剂盒(南京建成)，反应在96孔板中进行， 使用芬兰雷博MK3酶标仪在492nm下测定吸光率。
本实验使用广东省医学实验动物中心购入的6周龄雄性昆明小鼠，饲养温度23土2'C，照 明时间12h小时/天(7: 00-19: 00)，饲养一周后用于实验。小鼠随机分为空白对照组，拘 束应激模型组，阳性药对照组(人参皂苷250mg kg—。，低剂量竹笋壳提取物组(125 mg kg—1)， 中剂量竹笋壳提取物组(250 mg kg—')及高剂量竹笋壳提取物组(500 mg kg—》等给药组，每 组7只小鼠，共分6组。对照组和拘束负荷模型组均灌胃同容积水溶液，每天1次，第4天. 模型组和竹笋壳提取物以及人参皂苷给药组小鼠灌胃30分钟后进行拘束负荷18小时，对照 组禁水禁食18小时，所有小鼠在乙醚麻醉条件下，经心脏采取血液，离心处理，用赖氏法测 定血浆丙氨酸氨基转移酶活性水平。结果表明经口给与竹笋壳提取物可以有效的改善因拘束 应激负荷起因的丙氨酸氨基转移酶水平升高(图1为竹箅壳提取物对拘束应激小鼠血浆丙氨 酸氨基转移酶的影响，"抑"表示与空白组比较P〈0.01 ， "**"表示与模型组比较p〈0.01)。
实施例三、竹箅壳提取物对拘束应激负荷小鼠血浆抗氧化能力指数(ORAC)的改善作用抗氧化能力指数(ORAC)作为一种比较系统，能够比较全面、客观的反应物质抗氧化水平 的方法，在国内外得到了越来越多的认可和广泛的应用(中国药理学通报，22: 1015-1021， 2006)。其原理为荧光素钠在485nm光激发下，发射527nm荧光，可以被MPH释放的自由基 氧化而使荧光特性消失。当抗氧化剂存在时，可与荧光素钠竞争氧化剂，减缓其荧光消退的 速度。根据这一特性，可用来测定样品氧自由基清除活性。
本实验使用广东省医学实验动物中心购入的6周龄雄性昆明小鼠，饲养温度23士2'C，照 明时间12h小时/天(7: 00-19: 00)，饲养一周后用于实验。小鼠随机分为空白对照组，拘 束应激模型组，阳性药对照组(人参皂苷250mg kg—')，低剂量竹笋壳提取物组(125mg kg—1)， 中剂量竹笋壳提取物组(250 mg*kg—》，高剂量竹笋壳提取物组(500 mg kg—')等给药组，每 组7只小鼠，共分6组。对照组和拘束负荷模型组均灌胃同容积水溶液，每天1次，第4天 模型组和竹笋壳提取物以及人参皂苷给药组小鼠灌胃30分钟后进行拘束应激18小时，对照 组禁水禁食18小时，所有小鼠在乙醚麻醉条件下，经心脏采血，参照Davalos等人方法并加 以改进测定ORAC的含量。结果表明竹笋壳提取物可有效的改善因拘束应激负荷引起的血浆 ORAC水平(图2为竹笋壳提取物对拘束应激小鼠血浆ORAC的影响，"抑"表示与空白组比较 p<0.01 ,"林"表示与模型组比较p〈O.OD。
实施例四、竹笋壳提取物对拘束应激负荷小鼠肝脏一氧化氮(NO)水平的改善作用
近年来的研究证明机体在应激负荷下可以诱发NO合成亢进，由于NO在体内的作用与NO 浓度有关，当组织内NO浓度过高时，可通过其代谢产物引起组织损伤，其中最为严重的就是 引起肝脏、肾、心脑血管等部位的氧化应激状态(JPhysicoBiochem., 58:179-188， 2002)。测 定方法为取40yL的样品，加入160uL的Griess试剂(0. 1%萘乙二胺溶液与1%磺胺(5 % )磷酸溶液，使用前12h内等体积混合)后静置20分钟，550nm波长测定溶液光密度值(OD 值)，根据N0标准曲线计算N0含量(umol ，mL— N0标准曲线的制备是将不同浓度的亚硝 酸钠PBS溶液按照上述方法测定后，以亚硝酸钠为横坐标，所测0D值为纵坐标，做出[N0—卜OD 标准曲线。
本实验使用广东省医学实验动物中心购入的6周龄雄性昆明小鼠，饲养温度23土2'C，照 明时间12h小时/天(7: 00-19: 00)，饲养一周后用于实验。小鼠随机分为空白对照组，拘 束应激模型组，阳性药对照组(人参皂苷250rag kg—')，低剂量竹笋壳提取物组(125 mg kg—1)， 中剂量竹笋壳提取物组(250 mg kg-')及高剂量竹笋壳提取物组(500 mg kg—')等给药组，每 组7只小鼠，共分6组。对照组和拘束负荷模型组均灌胃同容积水溶液，每天1次，第4天 模型组和竹笋壳提取物以及人参皂苷给药组小鼠灌胃30分钟后进行拘束应激18小时，对照组禁水禁食18小时，所有小鼠在乙醚麻醉条件下，取出肝脏组织用Griess化学法测定NO的 含量。结果表明竹笋壳提取物可以有效的改善拘束应激负荷引起的肝脏NO水平(图3为竹笋 壳提取物对拘束应激小鼠小鼠肝N0的影响，"抑"表示与空白组比较p<0. 01 ， 表示 与模型组比较p<0.01 )。
实施例五、竹笋壳提取物对拘束应激起因的小鼠肝脏抗氧化能力指数(ORAC)水平降低的改善 本实验使用广东省医学实验动物中心购入的6周龄雄性昆明小鼠，饲养温度23土2'C，照 明时间12h小时/天(7: 00-19: 00)，饲养一周后用于实验。小鼠随机分为空白对照组，拘 束应激模型组，阳性药对照组(人参皂苷250mg kg,，低剂量竹笋壳提取物组(125mg kg—1)， 屮剂量竹笋壳提取物组(250 mg'kg1)，高剂量竹笋壳提取物组(500 mg kg—》等给药组，每 组7只小鼠，共分6组。对照组和拘束负荷模型组均灌胃同容积水溶液，每天l次，第4天 模型组和竹笋壳提取物以及人参皂苷给药组小鼠灌胃30分钟后进行拘束应激18小时，对照 组禁水禁食18小时，所有小鼠在乙醚麻醉条件下，取出肝脏组织，参照Davalos等人方法并 加以改进测定ORAC的含量。实验结果表明竹笋壳提取物可以有效的改善拘束应激负荷引起的 肝组织ORAC水平(图4为竹笋壳提取物对拘束应激负荷小鼠肝脏ORAC水平的影响，"將" 表示与空白组比较P〈0.01 ， 表示与模型组比较p〈0.01)。
实施例六、竹笋壳提取物体外抗氧化能力指数(ORAC)水平的测定
抗氧化能力指数(OMC)作为一种比较系统，能够比较全面、客观的反应物质抗氧化的水 平的方法，在国内外得到了越来越多的认可和广泛的应用(中国药理学通报，22:1015-1021， 2006)。其原理为荧光素钠在485nm光激发下，发射527nra荧光，可以被Mra释放的自由基 氧化而使荧光特性消失。当抗氧化剂存在时，可与荧光素钠竞争氧化剂，减缓其荧光消退的 速度。根据这一特性，可用来测定样品氧自由基清除活性。我们的实验结果表明竹笋壳提取 物在体外均能明显延缓荧光物质被活性氧自由基淬灭的速度。竹笋壳提取物体外抗氧化作用 明显，且具有一定量效关系(图5为竹笋壳提取物体外抗氧化能力指数(ORAC)的测定)。
图1是竹笋壳提取物对拘束应激负荷小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性的影响(其中A、 B、 C、 D、 E、 F分别为空白组、模型组、阳性组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)
图2 是竹笋壳提取物对拘束应激负荷小鼠血浆抗氧化能力指数(ORAC)的影响(其中A、 B、 C、 D、 E、 F分别为空白组、模型组、阳性组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)图3是竹笋壳提取物对拘束应激负荷小鼠小鼠肝脏一氧化氮(NO)水平的影响(其中A、 B、 C、 D、 E、 F分别为空白组、模型组、阳性组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)
图4是竹笋壳提取物对拘束应激负荷小鼠肝脏抗氧化能力指数(ORAC)的影响(其中A、B、C、 D、 E、 F分别为空白组、模型组、阳性组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)
图5是竹笋壳提取物(^Wo。Wo她Shell Extract: BSE)体外抗氧化能力指数(ORAC)的测定。
权利要求
1、竹笋壳或竹笋壳提取物用于制备提高抗应激效果及改善因应激负荷引起的各种临床症状的药物、健康食品、食品添加剂的用途。
2、 竹笋壳或竹笋壳提取物用于制备改善身心疲劳引起的各种临床症状的药物、健康 食品、食品添加剂的用途。
3、 竹笋壳或竹笋壳提取物用于制备治疗或改善肝脏功能的药物、健康食品、食品添 加剂的用途。
4、 根据权利要求l、 2或3所述的用途，其特征在于所述的竹笋壳或竹笋壳提取物为 原料可用于改善和治疗因应激负荷导致的各种疾病，或改善因机体过氧化状态起 因的各种临床症状。且可以长期服用，安全、无毒副作用的医药品、食品添加剂、 健康食品及其组成物。
5、 根据权利要求l、 2或3所述的用途，其特征在于所述的竹笋壳或竹笋壳提取物是 经直接粉碎化、或采用热水、加压热处理、高温饱和水蒸汽处理、酶处理、或水 与低级醇类、极性溶剂的一种或二种以上的任意混合溶剂进行提取小分子化合物 或回收多糖、酯类、黄酮、维生素、挥发油及蛋白质等大分子沉淀物质。
6、 根据权利要求l、 2或3所述的用途，其特征在于所述的竹笋壳或竹笋壳提取物的 使用量为0. 001 %至100%重量比范围。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种以竹笋壳或竹笋壳提取物为原料用于抗氧化、抗应激、改善因应激负荷或身心疲劳引起的各种临床症状的药品、健康食品及食品添加剂。确切说，本发明是基于竹笋壳提取物以束缚应激(restraint stress)负荷小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血浆和肝脏抗氧化能力指数、肝脏一氧化氮水平等为指标，提供一种可以改善机体身心疲劳状态、具有改善肝脏功能、且可长期服用，安全、无毒副作用的医药品、健康食品、食品添加剂及其组成物。此外，本发明证明竹笋壳及竹笋壳提取物所提示的抗氧化作用可以用于改善及缓解因身心疲劳引起氧化应激状态时表现的各种临床症状的药品、健康食品、食品添加剂及其组成物。
文档编号A23L1/28GK101327000SQ20081002927
公开日2008年12月24日 申请日期2008年7月7日 优先权日2008年7月7日
发明者冯锦和, 林冠宇, 栗原博 申请人:东莞市竟恒流通研究所