专利名称：红树植物根际促生固氮菌(dzy-n56)及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种对红树林植物具有良好促生效果红树林根际固氮菌及 其制备生物固氮菌肥的应用。
背景技术：
红树林为自然分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落，覆盖大约60-75%热带和亚热带 海岸，对维护海湾河口的生态平衡起重要作用，是海洋生产力的重要组成部分(Holguineta1.,2001)， 被认为是具有较高生产力的生态系统。该生态系统具有较高的有机质水平(全球每年凋落物为100Tg C)，为毗连的沿岸水域和相关的生物群落生境提供有机物(Holguin et al., 2001; Lugomela and Bergman, 2002)。然而红树林生态系统的无机营养较贫乏，尤其是无机氮水平较低(Holguin et al.， 1992; Vazquez etal.,2000)，固氮生物的生物固氮被证明是红树林生态系统无机氮的主要来源(Hicks and Sylvester, 1985; Kyaruzi etal 2003)。生物固氮作为红树林生态系统和生源元素生物地球化学循环的重要环节， 对红树林生态系统及生态环境产生极大的影响。由于人类的过度开发、围海造地和都市化等行为，使全球的红树林正以惊人的速度减少，据联合 国粮农组织保守的数据估算，红树林正以每年平均减少1-2%的速度消失，其速度甚至超过了珊瑚礁 和热带森林的消失速度。在发展中国家中，消失的速度更快，而红树林的90%以上位于发展中国家。 美国红树林行动项目组负责人Aheredo (1999)认为，热带亚热带国家曾在3/4的海岸线上分布有红 树林，现在仅剩下不到一半，而且大部分红树林为严重退化的生态系统。科学家预言，如果任其发展， 在未来的近100年内，人类将彻底失去红树林(Duke， 2007)。近年来，红树林生态系统的维护和红树林植株的保育等研究成为热门研究领域，也有多个国际组 织和团体发起的旨在保护红树林的国际会议。《中国21世纪议程》(1994)优先项目计划中把红树 林恢复与重建技术纳入了议事日程。ITTO组织，2002-2006年的计划目标亦把红树林生态系统恢复列 为首要资助目标之一 (廖宝文，2005)。可见红树林湿地生态系统的恢复工作亟需我们大力开展，但 无论理论的研究还是实际恢复工作的开展都面临较大困难。红树林的恢复建设工作一直比较缓慢，这主要是由于红树林造林成活率极低(廖宝文，1999)。 墨西哥和印度等国家的科学家利用植物生长促生菌(PGPB, plant growth-promoting bacteria)对红树 林进行促生，取得了一定阶段性进展，但发现的适合红树林促生的菌种仍为少数，此类菌种依旧缺少 且多数被保密收藏。目前中国林业科学研究院热带林业研究所正与墨西哥西北生物研究中心合作，引进相关菌种对我 国主要红树植物进行接种测试和相关菌剂研究，以期解决我国滩涂地段红树林造林成活率极低的棘手 问题。然而，引进菌种在我们国家红树林中的成活率小，并且也存在外种入侵所会产生的各种隐患。
发明内容
本发明的目的是提出一株从中国热带红树林中筛选分离，具有较高的生物固氮活性的红树植物根 际促生固氮菌新种。本发明的另一目的是提出所述的红树植物根际促生固氮菌在制备生物固氮菌肥的应用。 本发明所提出的红树植物根际促生固氮菌，是从海南省三亚市的热带红树林区采集红树植物根际 沉积物样品中分离出来的固氮菌新种。其分类命名为鞘氨醇单胞菌属(印/H"go附oMos sp.) DZY-N56。 该菌于2007年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址中国武汉市武汉大学)， 保藏编号CCTCCNO: M207120。本发明所述菌种的菌学特性描述如下革兰氏阴性，杆状，不产生孢子，0.2-0.4x1.6-2.5nm，细胞单个，也有较少成对(图l-3)。氧化 酶反应阴性，接触酶阳性，好氧或兼性厌氧。在Ashby、 LB以及BUG培养基上生长良好。耐盐性较 好，可以在盐分为5%的培养液中正常生长。在Ashby培养基上经过10d左右培养可以长为直径l-2cm 左右，胡萝卜色、圆形、边缘整齐表面较为干燥的凸起菌落。乙炔还原法(ARA)表明该菌可以利用 N2作为氮源，具有较高的生物固氮活性，纯培养条件下，其固氮活性20-74umolC2H2h"mg"鲜重。从菌株(印/H'"go"w"os sp.) DZY-N56的纯培养物提取基因组DNA，运用固氮基因特定的引物 PolF/PolR (参考Poly et al., 2001)进行PCR扩增，扩增到较理想的目的条带，证明该菌株具有生物 固氮基因(图4)，其序列如SEQ2所示。运用细菌16S rDNA全序列通用引物16SF/16SR (参考 Weisenburgetal.， 1998)进行PCR扩增，通过测序分析得到16S rDNA序列，该菌株的16SrDNA的 全序列如SEQ1所示。通过GenBank中的BLAST软件将16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列 进行比对，在数据库中没有找到完全相似的序列，表明为首次发现的新基因序列。向基因库成功递交 新基因序列得到登录号为EF202991。在GenBank数据库中选取了部分与测定的16S rDNA序列相似性较高的代表性基因序列，通过 ClustalW软件和Mega软件以Neibor-joining方法构建系统进化树(图5)，进行系统发育分析。从系 统发育树(图5)可以看出与(5^/"gowo"ossp.) DZY-N56的16SrDNA序列与鞘氨醇单胞菌 S/^/"gowo"aspa朋/(AJ575818,2)同源性最相近，为97% (Query coverage为96%)。生理生化、BIOLOG 等结果进一步显示这两种菌有明显区别(如表l)。这表明菌株(5^ >zgomo"a$sp.) DZY-N56为一株 新的固氮菌种。表1 5^/w力gowowoy/ a朋/禾口 S^/z/wgo附owoy sp. strain DZY-N56两禾中细菌指标比较(+ :表示阳性反应；-:表示阴性反应)TestDZY陽N56Pigmentation Growth at 37 °CHydrolysis of bis-pNP phosphateN-Acetyl-D-glucosamineL-rhamnoseD-fructoseSucroseD陽cellobioseL-alanineYellow ++Yellow++ + + +4L画Arabinose—+D-Galactose—+D-Maltose(+)+L-proline(+)+D-Mamiose(+)+D-trehalose(+)+L-Histidine——注S^/u"gcwo""j ; a/7"〖(AJ575818.2)的菌种性质参考Hans-Jiirgen Busse，2005文章Description of two novel species, iS/ /2/"gyww7"j "6a"' sp.nov.and *Sp/ '"go/woW(iy戸朋/ sp.nov. DZY-N56数据为BIOLOG细菌自动分析仪数据。用iS^W"gowowos sp, DZY-N56处理两种红树，木榄(5n/gw/eragy附"oWz/2a)和红海榄(及/^op/rora j(y/ora)，结果如表2所示。表2 >S^ >;go/noMav sp. DZY-N56对木榄和红海榄肝处理45天后的影响主根长度(cm)根生物量(g)叶面(cm2)地上(g)chl-achl-b总叶绿素类胡萝卜素木榄11,930.6419.012.281.250.6118.490.51对照8.010.357.521.780.820.319.680.18红海榄11.260.3145.531.371.390.7220.930.4对照10.30.5431.461.990.880.2919.10.32注表中值均为10组平行样平均值。生物量中重量指湿重；剩下重量均指干重。从表2中我们可以看出该菌对于木榄和红海榄有着良好的促生作用。和对照组相比，木榄的叶面 积有着明显的增大，提高幅度为152%;类胡萝卜素的含量也显著增加，为对照组的3.5倍。光合色素含量也有所增加，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素分别增长了 52%、 96%、和91%。对于红海榄效 果则不如木榄明显，叶面积增加了44%，光合色素中叶绿素增加了 148%。对该菌株进行生物安全性实验，土壤接种法结果表明，在室温条件下(28'C左右)，湿度60%—75% 条件下，该菌发酵液对海榄、红海榄、木榄等均无致病能力，对红树植物的生长安全无害。同时通过 用平板分离法检测供试菌株检出率、土壤原位固氮酶活性变化等指标，结果显示该菌接种后可以继续 存活，可以显著促进土壤固氮酶活性增加。实验证明，用含有该菌的菌剂接种海榄、红海榄和木榄等 红树植物可以明显促进植株生长，因此，该菌可以作为制备促进红树林植物生长的生物固氮菌肥的应 用。本发明将在以下方面产生有益效果该菌对于红树林植物的促生效果较好，可用于自然红树林生 态系统菌肥的生产工程菌，提高红树林生态系统的生产力，有望用于红树林恢复、造林的艰巨任务中。
图1、图2、图3是5^/"gomo"as sp. DZY-N56菌落、扫描、透射电镜照片；图4是印W"go/nowas sp. DZY-N56的基因组DNA以及扩增到的16S rDNA和固氮基因w;/ /的电泳照 片；图5是印WwgomoM^ sp. DZY-N56在16S rDNA系统发育树中位置。
具体实施方式
一、材料与方法1、 材料1.1 土样采集样品采自海南省三亚市红沙河沿岸红树林区木榄(份wg^ragv柳oA^)根际沉积物，样品采集 后装入灭菌的封口聚乙烯袋中，带回实验室低温保存。 1.2培养基Ashby液体培养基甘露醇10.0g，KH2PO4'H2O0.2g , MgS04'7H20 0.2g， NaCl 0.2g， CaS04 O.lg, CaCO35,0g，去离子水1000mL， pH7.0。Ashby固体培养基Ashby液体培养基+2.2%琼脂。改良DC)bereiner无氮液体培养基蔗糖10g,苹果酸5.0g, K2HP04-H20 O.lg， KH2P04'H20 0.4g， MgS04.7H20 0,2g， NaClO.lg， Na2M。04'H20 0.002g, FeC13 O.Olg，去离子水lOOOml， pH7.0。LB培养基酵母提取物5g，胰蛋白胨10g， NaC110g，琼脂1-2%，去离子水lOOOml, pH7.0。2、 方法2.1菌种分离将样品混匀后取约lg于200ml Ashby、D6bereiner或者Ashby+D6bereiner无氮液体培养基(Ashby 培养基与DObereiner培养基以1: 1比例混合)中，30'C恒温48h进行加富培养。然后将菌液分别稀 释至10—4、 10-5、 10-6三个稀释度,各稀释度的菌悬液以涂布法接种于Ashby固体培养基上，30°C 48h 培养后选择典型的单一菌落进一步纯化。 2.2菌种纯化将分离出的菌落，用接种针挑取典型的单一菌落，经涂片染色，在光学显微镜下观察菌体形态，如所 分离的菌落不纯，应做系列稀释后再次用平板涂布法分离，直至获得纯种。将纯化后的菌株接种于无 氮Ashby固体培养基和LB全培养基甘油保存。 2.3液体培养中固氮酶活力测定采用乙炔还原法测定固氮活性(参考Capone 1993),将斜面保存的纯菌株接种于10 ml液体改 良DObereiner培养基内，于30'C摇床振荡培养72 h，分别取1 ml于灭菌的5 ml小瓶中，盖上橡皮塞。 用注射器从容器中抽走5%空气，然后加入相同体积的乙炔气体。每个样品设3个重复，1个空白对 照，对照容器中不加入乙炔气体。所有样品于3(TC孵育12 h，用SQ-204气相色谱检测乙烯的生成量。 乙炔还原法(ARA)表明该菌可以利用N2作为氮源，且具有较高的生物固氮活性，纯培养条件下平 均固氮活性为20-74umolC2H2h—1 mg"鲜重。 2.4 DNA的提取与纯化方法参考东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》P409。2.5A^ /基因的扩增采用固氮细菌的niffl基因通用引物PolF/PolR (参考Poly et al., 2001)进行PCR扩增PolF: 5'-TGCGA (C/T) CC (G/C) AA (A/G) GC (C/G/T) GACTC-3'， PolR: 5'-AT (G/C) GCCATCAT(C/T) TC (A/G) CCGGA-3'。 经过多次实验后建立的适宜的反应体系和反应条件如下 PCR反应体系包括 PCR反应程序是提取的模板(未稀释)1 pl预变性95 °C 5 min上、下游引物(1 mM)各1^1变性95 °C 30 s10xPCR缓冲液5^1退火55°C 30 sMgCl2 (25 mM)4^1延伸72 °C 40 sdNTP混合液(各10mM)1H1后延伸72°C 10 min牛血清白蛋白(5mgml-l)1^1Ex-Taq酶(5Upl-l)0.4 pi无菌水34总讨.50 pi30个循环取2pl PCR反应产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的PCR产物直接交与Invitrogen生物技 术有限公司用ABI Prism 3730 XL DNA分析系统测序。得到332 bp的nifH序列。将序列直接递交 Genbank数据库，序列号为EU707338。 2.6 16SrDNA全序列的扩增DNA提取与纯化见方法见东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》P409。采用细菌16SrDNA全序列通 用引物16SF/16SR (Weisenburg et al., 1998), 16SF: 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，， 16SR: 5 '-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ，，进行PCR扩增。经过多次实验后建立的适宜的反应体系和反应条件如下 PCR反应体系包括 PCR反应程序是提取的模板(未稀释)1 pi预变性95 °C 5 min上、下游引物(ImM)各1^1变性95 °C 30 slOxPCR缓冲液5 nl退火55 °C 30 sMgC12 (25 mM)4^1延伸72 °C 1 mindNTP混合液(各10mM)1 pi后延伸72°C 10 min牛血清白蛋白(5mgml-l)1 piEx-Taq酶(5Upl-l)0.4 pi无菌水34 pi总计50 pi30个循环取2pl PCR反应产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的PCR产物直接交与Invitrogen生物 技术有限公司用ABI Prism 3730 XL DNA分析系统测序。得到的16S rDNA序列。将序列直接递交 Genbank数据库，序列号为EU707337。利用DNAMAN软件对测序结果进行同源性比较，利用BLAST软件将测定得到的基因序列与GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行序列比对分析，获取相近 典型菌株的16S rDNA基因序列，然后利用BIOEDIT中的ClustalW对序列进行排列，利用Mega中 的邻接法(Neighbor-Joining)建立16S rDNA基因的系统发育树，进行系统发育分析，其中的遗传距 离用Tamura-Nei公式计算，枝长代表了分歧程度，各枝上的数字是1000次bootstrap重抽样分析的支 持百分比。2.7菌株制剂有效性试验将该菌(5^/H力gowowajsp. DZY-N56)接种到无氮Ashby液体培养基中，直至浓度为108cell/ml，待用。采用2种红树植物一木榄和红海榄进行盆栽实验。每种红树10个平行样。外加对照。塑料盆放 在露天条件下，用已准备好的菌液浸泡红树根部3-4h后栽种入塑料盆。45天后测量各个指标。对比 实验指标为植物根、叶面积、植株重量、光合色素等。实验结果如表2所示。序列表<110>中国科学院南海海洋研究所<120>红树植物根际促生固氮菌(DZY-N56)及其应用<160>2<210>1<211>1412<212>DNA<213>鞘氨醇单胞菌属(5^H'"gomowassp.) DZY-N56 <400>1TCGCCCTCGTCGTCATAGGTGGGATCACTCATGTCAAGTCGAACGAAGCCTTCGGGCTTA60GTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCCTTTGGTTCGGAATAACAGTTGGAA120ACGACTGCTAATACCGGATGATGACGAAAGTCCAAAGATTTATCGCCAGAGGATGAGCCC180GCGTAGGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTC240TGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC300AGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAA360GGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGATGATAATGACAGTACCGGGAGAATAAG420CCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAA■TTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTTAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTT540AACTCCAGAACTGCCTTTAAGACTGCATCGCTTGAATCCGGGAGAGGTGAGTGGAATTCC600GAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACT660GGACCGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGG720TAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGGACTTGGTCTTTGGGTGGCGCA780GCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAAT840TGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACC900TTACCAGCGTTTGACATGTCCGGACGACTGGCAGAGATGCCTTTCTTCCCTTCGGGGACT960GGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC1020GCAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTACCATCATTTAGTTGGGTACTCTAAAGGAACC1080GCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGCT1140GGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGCAGCAATCCCGCGAGGGTGAGCTA1200ATCTCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTTTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAA1260TCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACC1320GCCCGTCACACCATGGGAGTTGGATTCACCCGAAGGCGTTGCGCCAACCCGCAAGGGAGC1380AGGCGAACCTTTTGTGTTTTTACTTGATATCT1412<210>2<211>338 <212>DNA
<213>鞘氨醇单胞菌属(5^/H'"gomo"assp.) DZY-N56
<220>
<221>CDS
<400>2
TTGCGATCGA TCCCAAAGCG GACTCGACCC GCCTGATCTT GCACGCGAAG GCTCAGGACA 60 CCATCTTGTC GCTGGCCGCT GAAGCTGGTT CGGTGGAGGA CCTCGAACTG GAAGACGTGA 120 TGAAGGTCGG GTACCGCGAC ATCCGTTGCG TGGAATCCGG TGGCCCTGAG CCTGGGGTGG 180 GCTGCGCCGG CCGCGGCGTG ATCACTTCGA TCAACTTCCT GGAAGAAAAC GGCGCCTACG 240 AAGGCGTGGA CTATGTGTCC TACGACGTGC TGGGCGACGT GGTGTGCGGT GGCTTTGCCA 300 TGCCCATCCG TAGAACAAGC ACATGCATCT GCCCGCCC 338
权利要求
1、一种红树植物根际促生固氮菌，该菌是从热带红树林区的红树植物根际沉积物样品中筛选分离出来的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)DZY-N56，含有如SEQ1所示的16Sr DNA序列和固氮基因nifH，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM207120。
2、 根据权利要求1所述的红树植物根际促生固氮菌，其特征在于该菌所含的固氮基因wy /含有如SEQ2所示序列。
3、 权利要求1所述的红树植物根际促生固氮菌在制备促进红树林植物生长的生物固氮菌肥的应用。
全文摘要
本发明提供一种红树植物根际促生固氮菌(DZY-N56)及其应用，该菌是从热带红树林区红树植物根际沉积物样品中筛选分离出来的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)DZY-N56，含有固氮基因nifH和如SEQ1所示的16S rDNA，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM207120。该菌种具有较高的生物固氮活性，用含有该菌的菌剂接种海榄、红海榄和木榄等红树植物可以明显促进植株生长，因此可以作为制备促进红树林植物生长的生物固氮菌肥的应用。
文档编号C12R1/01GK101319198SQ20081002895
公开日2008年12月10日 申请日期2008年6月23日 优先权日2008年6月23日
发明者娟 凌, 张燕英, 斌 杨, 杨志浩, 田新鹏, 董俊德 申请人:中国科学院南海海洋研究所