专利名称：实时荧光定量pcr检测柯萨奇病毒a16型的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及实时荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早 期、快速诊断柯萨奇病毒A16型感染的试剂盒。通过本发明的试剂盒实现对粪便、血清、咽 拭子、脑脊液、疱疹液等样品中的柯萨奇病毒A16型的检测和定量分析。
背景技术：
柯萨奇病毒A16刑(CA丄6)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成 员，柯萨奇病毒分为A、 B两组，其中A组又分24个血清型，B组分6个血清型。各血清型引起的 临床综合病征，由于侵犯的器官不同而表现各异，重则可造成死亡，妊娠期感染可引起非麻 痹性脊髓灰质炎性病变，并致胎儿宫内感染和致畸。柯萨奇病毒A型感染儿童多见，成人感 染占21.7% (Rohinson， 1958)。临床表现除上述外，主要特点为急性发烧、皮疹。脑膜脑炎 伴有Guillain Barr6综合征和急性病毒性心肌病。
自1959年由人类肠道病毒(enterovirus, EV)导致手足口病(hand, foot and raouth disease, HFMD)报道以来，HFMD已经在全球多次暴发。在我国，1985年以前柯萨奇病毒A16 型(CA16)是该病的唯一病原，1983年天津暴发柯萨奇病毒Ai6型引起的手足口病，5 10月 发病7000余例；而近年来手足口病暴发流行的主要是肠道病毒71型(EV71)和CA16引起，流 行病学研究表明二者常常伴随流行引起手足口病暴发。CA16往往是主要的病原，常常超过感染 总人数的60%。 二者在遗传学上密切相关。
通常情况下，EV71与CA16引起的手足口病在临床症状等方面难以区别，而目前CA16的 常规诊断方法还是病毒分离培养、中和抗体检测等方法，这些方法费时、费力，均不能提供 一个快速的诊断丄具，然而与肠道病毒相关的急性症状可发展迅速，尤其是在病毒流行期间， 需要同时快速处理大量样本的，但是市面上还没有一个可用的诊断试剂盒。因此，开发早期、 快速、特异、敏感的检测试剂盒非常必要。
近年来，随着分子诊断技术的飞速发展，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术已经广泛 应用丁RNA病毒基因水平的研究，也给微生物的快速鉴定提供了可能。RT-PCR技术克服传统方 法费时、费力且无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要的缺点，己成为RNA病毒快速诊断的重要于-段。 一歩法RT-PCK只要加入RNA和特异性引物即可实现在同一反应管内连续进行 RNA—cDM—PCR反应，中途不需加入任何试剂，在处理大量样品时易于操作，有助于减少残 余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。 一步法可以得到更高的灵敏度，最低 可以达到O. lpg总RNA。
实时荧光PCR技术是二十世纪末迅速发展起来的一种核酸检测技术，TaqMan PCR技术 是实时荧光PCR的一种，与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记芡 光报告基团和淬灭基团的探针。与普通PCR相比，TaqManPCR技术具有如下优点通过对扩 增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素千扰的终点 分析方法，能够对检测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；将DNA扩增 与检测过程融合为一体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程大 大縮短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；由于采取一种封闭的检测模式，从而 减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；由于在普通PCR基础上增加了 一条可与模板互补配 对的荧光探针，进一歩提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的 检测和定量分析中，己逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
CA16是引起儿童手足口病的主要病原体之一，由于还没有成熟的用于该病毒筛査和诊断 的病毒核酸检测试剂盒，严重影响了对该种病毒的诊断和流行监控。本发明设计的试剂盒通 过对CA16核酸进行直接检测和定量研究，不仅对于了解患病程度、预测、评价治疗效果有十 分重要意义，怖且有利于儿童手足口病的预防和控制。
发明内容
本发明涉及检测粪便、血清、咽拭子、脑脊液、疱疹液等样品中的CA16病毒存在的试剂 盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断CA16病毒感染的试剂盒。
因此，本发明的目的是提供一种使用实时荧光PCR技术来定性及定量检测样品中CA16病
毒的试剂盒，特别是涉及CA16病毒的早期感染在实验室诊断中的应用。基本原理是利用一对
靶多核苷酸的特异性引物和一条靶多聚核苷酸的特异性探针，在耐热DNA聚合酶(Taq酶)、
逆转录酶(RT酶)、RNA酶抑制剂(RNasin)、高质量的脱氧核糖核苷二磷酸(dNTPs)以及Mg^
等PCR反应缓冲液中，通过市售的荧光PCR扩增仪实现耙多核苷酸的循环扩增，从而达到快
速、实时、定量检测靶多核苷酸的目的。
本发明所提供的检测样品中CA16病毒的试剂盒包括(1)分别装有RNA提取液(即
TRIZOL核酸抽提试剂)、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密
封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其特征在于PCR扩
增反应液中用于靶多核苷酸扩增的TH反向引物的序列分别是:l卜:向引物CA16-Fl: 5,-CAT GCA GCG CTT GTG CTT -3， (SEQ ID NO: 1);
CA丄6-F2: 5'-CAT GCA ACG ACT GTG CTT TC -3'(SEQ ID NO: 2); 反向引物CA16-R1: 5'-CAC ACA ATT CCC CCG TCT TAC T_3'(SEQ ID NO: 3);
CA16-R2: 5'-CAT AAT TCG CCC GTT TTG CT-3'(SEQ ID NO: 4) 其中JH向引物CA16-F1和CA16-F2可向5'禾口3，端方向各延伸10个碱基，反向引物CA]6-Rl 禾口CA16-R2可向5'和3，端方向各延伸10个碱基。
根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的 寡核苷酸探针CA16-P1的序列是CA16-P1 5'- CGC TTG TGC TTT CCA GTG TCG GTG -3'(SEQ ID NO: 5)和CA16-P2 5'-CGA CTA TGC TTC CCT GTC TCG GTG CA-3'(SEQ ID NO: 6)其中该寡核 苷酸探针序列可向5'和3'端方向各延伸10个碱基。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液由(a)耐热DNA聚合酶(Taq 酶)、(b)逆转录酶(RT酶)、(c) RNA酶抑制剂(RNasin)、 (d)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、 (e)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，(f)能够与双链靶多核苷酸的第二 条链结合的反向引物，(g)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基闭和 荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成。
根据本 发明的另-一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中的最佳引物浓度为 0.42pmol/L、探针浓度为0.21timol/L;
根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中的最佳镁离子浓度为 2.15mmol/L、 Taq酶最佳用量为5U/反应、RT酶最佳用量为100U/反应、RNasin最佳用量为20U,' 反应、脱氧核糖核苷三磷酸最佳浓度为0.20mmol/L。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为40°C 逆转录30min;然后94。C预变性3min;最后93。C 15s， 55°C 45s， 40个循环。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中阴性质控品为生理盐水。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中阳性质控品为含有CA16病毒多聚蛋白基因片段 的质粒，包括l X 1(A;opy/ml的强阳性质控品和l X 103 copy /ml的临界阳性质控品。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中定量参考品为含有CA16病毒多聚蛋白基闵片段 的质粒，包括4个浓度梯度lX107copy/ml、 1 X 106 copy/ml、 1 X 105 copy/ml、 lX104copy 个/ml。
本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测出CA16病毒的最低浓度为2.0X 102copy /ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。
本发明针对CA16病毒基因片段设计特异引物和探针，可检测出CA16病毒，但不能检测出非CA16病毒病原体，说明本试剂盒具有很好的特异性。
本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测粪便、血清、咽拭子、脑脊液、疱 疹液等样品中的CA16病毒；可为灵敏、快速早期诊断CA16病毒感染提供可靠的实验证据； 冋时由于能准确定量，所以可对临床用药进行有效监测。
图l显示试剂盒检测CA16 ^个阳性参考品的检测结果图，3个阳性参考品的Ct值在16-25 之间(分别为19.94、 22.01、 30.32)，扩增曲线有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳 性
图2显示阴性参考品的检测结果图，7个阴性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与基线无 交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。7个阴性参考品包括与CA16感染有相似症状的EV71、 埃可病毒、腺病毒、轮状病毒、诺沃克病毒、脊髓灰质炎病毒以及正常人的粪便样品。
图3显示试剂盒定量检测时的扩增曲线，针对模板数为101 108拷贝/ml的不同浓度梯度 的样本进行RT-PCR分析。
图4显示试剂盒定量检测时Std curve窗口下的标准曲线，绘制得到的标准曲线相关系 数达到O. 9991。
图5显示阳性质控品扩增曲线。图示扩增曲线为S型曲线，且CT值〈27，说明检测体系 进行了有效扩增。
图6显示阴性质控品扩增曲线。图示扩增曲线为不规则的折线，与荧光检测阈值线没有 交点，且曲线不呈S型，说明检测过程中没有CA]6的污染。
图7显不5个阳性标本的扩增曲线。5个标本的Ct值分别是24.35， 26.69， 27.67， 29.91， 31.07;结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。
具体实施例方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1:柯萨奇病毒A16型荧光PCR检测试剂盒及其使用
1、 制备包括下列组成成分的试剂盒RNA提取液(50ml/管)l管、PCR扩增反应液(20W /管)24管、阴性质控品(100pl/管)l管、阳性质控品(100pl/管)l管、定量参考品(50 n1/ 管)4管。
2、 标本采集、运送和保存
(1 )标本采集标本采集对象是暴发疫情出现时手足口病的临床诊断病例和病例发病所在社区(村)的临近无病例的社区(村)或托幼机构的5岁以下的儿童(作为健康对照人群)。 用于病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采
集脑脊液标木。临床标本在运输和IC存过程中要避免反复冻融，如果不能确保-20'C的条件，
应该在0 8'C运输和保存。标本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如标本编号、发病
R期和标本采集闩期。
(2)标本保存和运送
① 粪便标本
采集病人发病7 R内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5 8g/份，采集后 立即放入无菌采便管内，4'C暂存立即(12h内)送达实验室，一2(TC以下低温冷冻保藏，需 长期保存的标本存于一7(TC冰箱。
② 咽拭子标本
采集病人发病3闩内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽 后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3 5ml保存液(维持液或生 理盐水，推荐使用维持液)的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防 T燥。4'C暂存立即(12h内)送达实验室，一2(TC以下低温冷冻保藏，需K期保存的标本存 于—7(TC冰箱。
③ 血清标本
静脉采集3 5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于一20。C 以下冰箱中冷冻保存。
④ 疱疹液
同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用 消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3 5ml保存液(维持液或生 理盐水，推荐使用维持液)的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采 集标本4t:暂存立即(12h内)送达实验室，一20'C以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本 存于一7(TC冰箱。
⑤ 脑脊液标本
出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，采集时间为出现神经系统症状后3天内， 采集量为1.0 2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4。C暂存立即(12h内)送达 实验室，一2(TC以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于一7(TC冰箱。 3、检测歩骤 (1) RNA提取水样粪便、血清、脑脊液、疱疹液等液态样本各100 pl (样品不足100pl时请补加适量生
理盐水重悬)，放置于1.5ml灭菌离心管，加入200plTrizol试剂及100nl氯仿，用振荡器强力振
荡20秒后静置3分钟；
2 8。C下12，000rpm离心10min，吸取上清至另一干净的1.5ml离心管； 加入0.2ml氯仿，盖紧盖了，手动用力颠倒摇动15s (不可用振荡器)，室温孵育2 3min; 2 8°C下12000rpm离心15min后，取最上层的上清液至另-一干净的1.5ml离心管； 加入0.5ml预冷的异內醇，缓慢颠倒充分混匀后，一20'C静置15min， 2 8°C， 12000rpm
离心10min，小心弃尽上清液；
加入lml预冷的70%的冰冷乙醇，手动颠倒数次洗涤沉淀，2 8°C， 8000rpm离心5min，
小心弃尽上清液；
空气或真空干燥5 10min，加入50plDEPCH20， 55 60。C下孵育10min，手指轻轻弹打 管底，使其充分溶解，直接用于实验或-7(TC保存备用。
(2) RT—PCR检测
分别取阴性质控品、标本、阳性质控品、定量参考品品各5pl，加入PCR反应管中进行PCR 扩增。PCR循环条件是40。C逆转录30min;然后94。C预变性3min;最后93。C 15s， 55°C 45s， 40个循环。选择荧光定量PCK仪上FAM/TAMRA通道进行荧光信号检测。
(3) 结果分析
反应结束后保存检测数据文件。根据扩增曲线设置Baseline的start值、stop值以及 Threshold的Value值(start值可以在1 10、 stop值可以在5 20、 Value值可以在0. 01 0. 2范围选择)，在Analysis菜单下选择Analyze fi动分析结果。
(4) 结果判定
扩增曲线呈S形，且CT值小于37，待检样本判为CA16病毒(参见附图l); 扩增曲线不呈S形，或CT值大于37，待检样本判为CA16病毒阴性(参见附图2)。
实施例2: CA16病毒核酸定量检测试剂盒中定量参考品和质控品的配制及使用
CA16病毒核酸定量检测试剂盒中定量参考品为含有CA16病毒核酸特异序列的质粒，用于
制备标准曲线，对待检样本进行准确定量，可直接用于RT-PCR检测；质控品包括阳性质控品
和阴性质控品，用于临床试验中质量控制，操作方法同待检样本。
经一歩法或两歩法扩增后，保存检测数据文件。根据分析后图像调节分析参数使标准曲
线(Std curve )窗口下的标准曲线图达到最佳(即相关性(correlation)数值<-0.95)。
最后由仪器自动分析装置计算出未知标本的测定数值(Qty)，即标本中CA16病毒的RNA含量。其中一歩法定量参考品制备的标准曲线的扩增曲线参见附图3，其标准曲线相关信息参见附图 4;
质量控制标准要求在一次实验中同时满足以下条件——阳性质控品为阳性(参见附 图5)、阴性质控品为阴性(参见附图6)、定量参考品制备得到的标准曲线相关系数大于0.95; 否则，结果无效，需重新检测。
实施例3:应用CA16病毒荧光PCR检测试剂盒定量检测临床样品
样品来自广东省疾病预防控制中心，包括粪便、咽拭子、血清、脑脊液等样品类型；标 本RNA提取、PCR反应与结果分析参照实施例1进行。
PCR反应结束后，根据扩增曲线先调节分析参数，使标准曲线(Std curve )窗口下的 标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值〉0.97)，然后分析临床样品。临床样品的检测结果 如附图7所示5个临床阳性标本扩增曲线的Ct值分别是24.35， 26.69， 27.67， 29.91， 31.07， 结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性；参照同一次试验中线性定量参考品的 标准曲线图(如附图4所示)可以判定5个临床阳性标本的CA16病毒浓度分别为1.44X 107copy/ml、 3. 54X106 copy/ml、 1. 65X 106copy/ml、 3 . 87 X 105 copy/ml、 1.81 X105copy/ml。序列表
〈110〉中山大学达安基闪股份有限公司
<120>实时荧光定呈PCR检测柯萨奇病毒A16型的试剂盒
<140>
<141>
<160> 6
<210> 1 〈211〉 18 〈212〉 DNA <213>人l:序列 <220>
<223>根据特定核昔酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 1
catgcagcgcttgtgctt
<210〉 2 <211> 20 〈212〉 ■ <213>人工序列 <220>
〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 2
catgcaacgactgtgctttc
<210> 3 〈211〉 22 <212>廳 <213〉人工序列 <220><223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 3
cacacaattcccccgtcttact
<210〉 4 <211〉 20 〈212> DNA 〈213>人l:序列 〈220〉
<223>根据特定核tr酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 4
cataattcgcccgttttgct
〈210> 5 <211> 24 <212> DNA 〈213〉人:l:序列 <220>
<223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 <400> 5
cgcttgtgctttccagtgtcggtg
<210〉 6 〈211> 26 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PC財广增的探针。 <400> 6
cgactatgcttccctgtctcggtgca
权利要求
1、一种检测样品中柯萨奇病毒A16型存在的试剂盒，该试剂盒包括(1)分别装有RNA提取液、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液由耐热DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、脱氧核糖核苷三磷酸、正向引物、反向引物，两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成，，其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别为正向引物CA16-F15’-CAT GCA GCG CTT GTG CTT-3’CA16-F25’-CAT GCA ACG ACT GTG CTT TC-3’反向引物CA16-R15’-CAC ACA ATT CCC CCG TCT TAC T-3’CA16-R25’-CAT AAT TCG CCC GTT TTG CT-3’其中正向引物CA16-F1和CA16-F2可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，反向引物CA16-R1和CA16-R2可向5’和3’端方向各延伸10个碱基。
2、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中所使用的寡核苷酸探针的序 列为CA16-Pl 5'- CGC TTG TGC TTT CCA GTG TCG GTG -3'和CA16-P2 5'-CGA CTA TGC TTC CCT GTC TCG GTG CA-3'。寡核苷酸探针CA16-P1和CA16-P2序列可各向5，和3，端方向各延伸 IO个碱基。
3、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中正向引物浓度为 0.42ymol/L、反向引物浓度为0.42umol/L、寡核苷酸探针浓度为O. 21 w mo]/L。
4、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中的耐热DNA聚合酶的浓度为 5U/反应。
5、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中的逆转录酶的浓度为100U/反应。
6、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中RNA酶抑制剂的浓度为20U/ 反应。
7、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中镁离子浓度为2.15mmol/L。
8、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中脱氧核糖核苷三磷酸的浓度 为0.20mmol/L。
9、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于用于PCR扩增的反应温度和时间为40'C逆 转录30min;然后94。C预变性3min;最后93。C 15s， 55°C 45s， 40个循环。
10、 根据权利要求l中试剂盒，其特征还在于所检测的样品可选自但不局限于粪便、血 清、咽拭子、脑脊液、疱疹液等样品。
全文摘要
本发明涉及实时荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断柯萨奇病毒A16型感染的试剂盒。本试剂盒针对柯萨奇病毒A16型特异的核苷酸序列设计引物和探针，采用一步荧光RT-PCR方法对样本进行扩增，根据扩增曲线判定样本中是否有柯萨奇病毒A16型，并利用线性定量参考品对病毒含量进行定量。通过本发明的试剂盒可实现对粪便、血清、咽拭子、脑脊液、疱疹液等样品中的柯萨奇病毒A16型的检测和定量分析。
文档编号C12Q1/68GK101597652SQ20081002859
公开日2009年12月9日 申请日期2008年6月6日 优先权日2008年6月6日
发明者何蕴韶, 荃 吴, 明 李, 钢 程, 邓中平 申请人:中山大学达安基因股份有限公司