专利名称：含有已改变的转录起始序列的副粘病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及副粘病毒科的含有被改变之转录起始序列的重组病毒。
背景技术：
副粘病毒具有一条作为基因组的非分节段型负链RNA。该基因组中编码了6个基因，并且通常每一个基因连接一个短序列(E-IG-S信号)。这些信号序列是高度保守的，特别是在属中和科中，在指定病毒种的基因间更是高度保守(Feldmann，H.E.等，1992，Virus Res.241-19)。
仙台病毒(SeV)，被分类为副粘病毒科中的呼吸道病毒，是一种有包膜的非分节段型负链RNA病毒，该病毒被认为是副粘病毒亚科的原型。SeV基因组的长度是15384个碱基，起始于一个短的3’前导区，接下来是编码N(核衣壳)、P(磷酸)、M(基质)、F(融合)、HN(血凝素-神经氨酸酶)和L(大)蛋白的6个基因，终止于一个短的5’尾随区。除了P蛋白以外，第二个基因还通过一种已知为共转录编辑的方法(其插入了一个原本不包含在模板中的G残基)(Park，K.H.和M.Krystal，1992，J.Virol.667033-7039；Paterson，R.G.和R.A.Lamb，1990，J.Virol.644137-4145；Thomas，S.M.等，1988，Cell，54891-902；Vidal，S等，1990，J.Virol.64239-246)并分别通过两种翻译起始(Gupta，K.C.和E.Ono，1997，Biochem.J.321811-818；Kuronati，A等，1998，Genes Cell.3111-124)而表达V和C辅助蛋白。该基因组与N蛋白紧密结合，形成一种螺旋状核糖核蛋白(RNP)复合体。该RNP，而非裸露的RNA，是转录和复制的模板(Lamb，R.A.和D.Kolakofsky，1996，副粘病毒科病毒和它们的复制.1177-1204页.在Fields Virology，第三版中.Fields，B.N.，D.M.Knipe和P.M.Howley等(编)，Raven出版社，纽约，N.Y.)。在3’端针对含有P和L蛋白的病毒聚合酶只有一个启动子(Hamaguchi，M.等，1983，Virology 128105-117)。所述聚合酶通过识别位于每一基因边界的短而保守的转录终端(E)序列和转录起始(S)序列而产生前导RNA和每一种mRNA(Glazier，K.等，1997，J.Virol.21863-871)。在E序列和S序列之间存在一个不被转录的基因间三核苷酸序列(IG)(Gupta，K.C.和D.W.Kingsbury，1984，Nucleic Acids Res.123829-3841；Luk，D.等，1987，Virology 16088-94)。由于在每一基因边界再起始转录的效率很高但不完美，所以由下游基因产生的转录物不如由上游基因产生的转录物多。因此，在被感染的细胞中每一种mRNA不是以等摩尔量合成，而是向5’端极性衰减式转录(Glazier，K.等，1997，J.Virol.21863-871；Homann，H.E.等，1990，Virology177131-140；Lamb，R.A.和D.Kolakofsky，1996，副粘病毒科病毒和它们的复制.1177-1204页.在Fields Virology，第三版中.Fields，B.N.，D.M.Knipe和P.M.Howley等(编)，Raven出版社，纽约，N.Y.)。
翻译出mRNA和积累了翻译产物后，基因组进行复制。此时，相同的病毒RNA聚合酶利用相同的RNP模板进行复制，但在一定程度上忽略了每一种mRNA的E序列和S序列并且产生了全长反基因组正义(+)RNP(Lamb，R.A.和D.Kolakofsky，1996，副粘病毒科病毒和它们的复制.1177-1204页.在Fields Virology，第三版中.Fields，B.N.，D.M.Knipe和P.M.Howley等(编)，Raven出版社，纽约，N.Y.)。聚合酶进入(+)RNP的3’端启动子以便生成基因组(-)RNP，该基因组(-)RNP作为下一轮转录和复制的模板。
在SeV基因组的6个基因之中，E序列(基因组负链中的3’-AUUCUUUUUU-5’)是完全保守的。后半部分的5个U残基被认为能使聚合酶滑动-生成poly(A)。相反，S序列略有变化，可被概括为3’-UCCCWVUUWC-5’(Gupta，K.C.和D.W.Kingsbury，1984，Nucleic Acids Res.123829-3841)。具体地，P，M和HN基因的S序列是UCCCACUUUC，N基因的S序列是UCCCAgUUUC，F基因的S序列是UCCCuaUUUC，和L基因的S序列是UCCCACUUaC。不管在分离过程，传代历史和对天然宿主如小鼠的毒力方面有何差异，迄今对所有SeV病毒株的测序都显示相同的差异，表明变异具有基因座位专一性。这些差异可能是在不受S序列变异影响的位点积累了核苷酸的结果。这些差异也可能是在病毒进化期间，在信号序列的重要位点发生了核苷酸取代，并对能调节每一个基因的表达的病毒进行选择的结果。
迄今，对多种非分节段型负链RNA病毒的模式模板系统的研究表明S序列的确对转录起始非常关键，但可在一定程度上耐受序列变异(Barr，J.N.等，1997，J.Virol.711794-1801；Barr，J.N.等，1997，J.Virol.718718-8725；Hwang，L.N.等，1998，J.Virol.721805-13；Kuo，L.等，1996，J.Virol.706143-6150；Rassa，J.C。和G.D.Parks，1998，J.Virology，247274-286；StillmanE.A.和M.A.Whitt，1998，J.Virol.725565-5572)。这些S序列中某种核苷酸取代降低了转录的起始效率，这说明基因的表达也受到病毒生活周期中天然变异的调控(Kuo，L.等，1996，J.Virol.706892-6901；Kuo，L.等，1997，J.Virol.714944-4953；Stillman E.A.和M.A.Whitt，199，J.Virol.712127-2137)。然而，在模式模板系统中，天然生活周期早期所需所有事件如初级转录可通过连续而恒定地提供反式作用蛋白而迂回而过(Nagai，Y.副粘病毒复制和致病机理.反向遗传学转化了解.Rev.Medical.Virol.9(2)83-99(1999))。在这些系统中小基因组的转录和复制是非偶联的。常被用于制备反式作用蛋白的T7聚合酶表达型痘苗病毒通过例如利用由痘苗病毒编码的加帽酶进行转录后修饰而掩饰了突变的精细效应。另外，实验全程期间的转染效率可能不同(Bukreyev，A.等，1996，J.Virol.706634-6641；He，B.等，1997，J.Virology.237249-260)。换句话说，S序列中的核苷酸取代对转录起始的影响不能在模式模板系统中精确测定。因此，为了全面地评价S序列和E序列的作用，有必要将突变引进全长病毒基因组中。
发明公开本发明的一个目的是提供副粘病毒科的病毒载体，制备所述病毒载体的方法及所述病毒载体的用途，其中所述病毒载体中的S序列已被改变从而改变了位于其下游的基因的表达。
本发明人通过利用重组DNA技术操纵SeV的基因组已成功构建了一个用于制备感染性SeV的系统。使用该系统能使负链RNA病毒在其相应的DNA基础上再生，并且通过操纵感染性病毒的多个基因来进行SeV的反向遗传(Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587；Kato，A.等，1997，J.Virol.717266-7272；Kuo，L.等，1996，J.Virol.706892-6901；Nagai，Y.1999，Rev.Medical.Virol.983-99；Kakaguchi，T.等，1997，Virology 235360-366)。本发明人尝试利用该系统阐明发现于SeV的S序列中的异质性的意义。
新合成的E序列和S序列被连接到萤火虫萤光素酶基因的上游，然后再插入N基因非编码区的下游。S序列被设计成具有与上述四个自然变异相同的序列。在构建的重组病毒中，N mRNA的转录起始于它自己的S序列并终止于所插入的报道基因(萤光素酶)中的E合成序列。对由每种不同S序列引发的报道基因的表达进行定量和比较。
所获得的结果清楚地表明F基因的天然S序列具有明显低于其它三种S序列的再起始活性。当蛋白的从头合成被阻断并且基因组复制被抑制时，只进行转录，而不进行复制。通过在这种条件下进行实验，可以证实萤光素酶基因表达减少的主要原因是F基因转录起始序列在转录水平上的减少，而不是下一步复制的结果(图4)。该实验还显示，由F基因中S序列启动的再起始活性约为其它三种S序列的四分之一。
然后用P/M/HN基因的具有较高再起始效率的S序列取代F基因的天然S序列，并检测在培养细胞、卵和小鼠中回收的病毒(SeV/mSf)的复制能力，以此评估不同S序列的再起始活性。结果，本发明人发现取代的S序列不仅提高了F基因的表达水平，而且还提高了下游基因的表达。所述提高是在转录水平上的提高(图7和9)。
即，本发明人发现副粘病毒科病毒中每一基因的S序列的再起始活性不同于所述S序列。还揭示，特定基因的S序列被具有不同再起始活性的另一S序列取代，使得不仅能对紧接该序列之后的基因、而且对距该基因更远的下游基因的表达在转录水平上进行修饰，从而完成本发明。
本发明涉及副粘病毒科的病毒载体，制备这种载体的方法及这种载体的应用，所述载体中一个S序列经过改变使其下游基因的表达水平改变，更具体涉及(1)一种病毒载体DNA，其中副粘病毒科病毒的基因组上至少一个基因的转录起始(S)序列被改变使得所述基因和其下游基因在宿主中的表达水平改变，(2)根据(1)的病毒载体DNA，其中所述转录起始序列的改变包括用副粘病毒科病毒的另一个基因的转录起始序列取代所述序列，(3)根据(1)的病毒载体DNA，其中所述转录起始序列的改变包括F基因的转录起始序列被另一个基因的转录起始序列所取代，
(4)根据(3)的病毒载体DNA，其中所述另一个基因的转录起始序列包括P/M/HN基因型的转录起始序列，(5)根据(1)至(4)中任一项的病毒载体DNA，其中所述病毒载体DNA在F基因和/或HN基因中有缺陷，(6)根据(1)至(5)中任一项的病毒载体DNA，其中一个外源基因已插入所述病毒载体DNA中，(7)一种副粘病毒科的病毒载体，其在病毒颗粒中包括(1)至(6)中任一项所述病毒载体DNA的转录产物，(8)根据(7)的载体，其中所述载体是仙台病毒(SeV)载体，(9)根据(7)或(8)的载体，其中在宿主中增殖的能力比野生型病毒的提高，(10)一种制备副粘病毒科病毒载体的方法，其中所述方法包括步骤将(1)至(6)中任一项所述病毒载体DNA转入宿主中，并在所述宿主中表达病毒蛋白，和(11)根据(10)的方法，其中用于制备载体的所述副粘病毒科病毒是仙台病毒。
本文中，“副粘病毒科的病毒载体”被定义为来源于副粘病毒科病毒的载体，并且该载体能将基因转入到宿主细胞中。本发明的副粘病毒科的病毒载体可以是核糖核蛋白(RNP)或感染性病毒颗粒。此处，“感染性”被定义为病毒载体通过其细胞粘附和膜融合的能力将含在病毒颗粒中的病毒基因组转运到细胞中并使其表达的能力。
副粘病毒科的病毒载体可以具有复制能力，或可以是没有复制能力的缺陷型载体。此处，“具有复制能力”被定义为病毒载体在被该病毒载体感染的宿主细胞中复制和产生感染性病毒颗粒的能力。
本发明的副粘病毒科病毒载体能以一种可表达的方式携带外源基因。这种病毒载体能被制备成副粘病毒科的重组病毒载体。此处，“重组的”副粘病毒科病毒载体被定义为通过基因工程构建的病毒载体，或其扩增产物。例如，重组的副粘病毒科病毒载体能够由副粘病毒科的重组病毒cDNA产生。
本文中，副粘病毒科的病毒被定义为一种属于副粘病毒科的病毒，或其衍生物。本发明可应用，例如副粘病毒科的病毒如仙台病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒，牛瘟病毒，犬瘟热病毒，猴副流感病毒(SV5)，和I、II、III型人副流感病毒。本发明的病毒载体和载体DNA优选地来源于副粘病毒属的病毒或其衍生物。本发明适用的副粘病毒属的病毒包括I型副流感病毒如仙台病毒和人HA2，II型副流感病毒如猴SV5和SV41和人CA，III型副流感病毒如牛SF和人HA1，IV型副流感病毒如A亚型和B亚型，腮腺炎病毒，新城疫病毒和副粘病毒属的许多其它病毒。最优选地，本发明的病毒载体和载体DNA来源于仙台病毒。这些病毒可以是野生型株，突变株，实验室传代株，人工构建株等等。不完全病毒如DI颗粒(Willenbrink W.和Neubert W.J.，J.Virol.，1994，68，8413-8417)，合成的寡聚核苷酸等也可被用作制备本发明的病毒载体的材料。
本文中，“病毒载体DNA”指含有编码病毒载体基因组的核苷酸序列的DNA。此处的“DNA”包括单链DNA和双链DNA。
本文中，副粘病毒科病毒的“N，P，M，F，HN和L基因”分别代表编码核衣壳蛋白，磷蛋白，基质蛋白，融合蛋白，血凝素-神经氨酸酶，和大分子蛋白的那些基因。副粘病毒亚科每一种病毒的基因如下进行概述。一般情况下，N基因也可表示为“NP基因”。
呼吸道病毒属 N P/C/V M FHN - LRublavirusN P/V M FHN(SH) L麻疹病毒属N P/C/V M FH - L例如，仙台病毒每一基因在核苷酸序列库中的登记号是N基因的登记号是M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046和X17218；P基因的登记号是M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007和X17008；M基因是D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584，X53056；F基因的登记号是D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152和X02131；HN基因的登记号是D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，X56131；L基因的登记号是D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587和X58886。
本发明提供了病毒载体DNA，在该病毒载体DNA中副粘病毒科病毒基因组上的至少一种基因的S序列已被改变由此改变了所述基因和位于其下游的基因在宿主中的表达水平。通过改变S序列，本发明的病毒载体DNA不但能够改变紧接在S序列后面的基因的转录水平，而且能够改变其下游基因的转录水平。
本发明中的“转录起始(S)序列的改变”是指在副粘病毒科病毒基因组上一个基因的S序列中进行一个或多个核苷酸的取代，缺失，添加和/或插入或者用副粘病毒科病毒的另一个基因的S序列取代所述基因的S序列。
为了获得具有所需再起始活性的序列而进行的S序列的改变可以是，设计多种S序列，用如实施例1所述萤光素酶分析等方法检测再起始活性，从而选出具有所需活性的序列。S序列可采用已知的基因工程技术来进行改变。例如，如实施例3所述，采用定点诱变可以将任何目标突变引进副粘病毒科病毒基因组上的F基因的S序列中。
本发明的副粘病毒科病毒载体包括那些其中S序列被改变从而导致例如F基因的表达水平与野生型病毒相比明显提高的病毒载体。明显提高是指与野生型F基因的表达相比，表达水平提高了，例如20％或更多，优选地提高了40％或更多，更优选地2倍或更多，甚至更优选地3倍或更多。这种载体可以，例如通过用P，M，HN，N或L基因的S序列取代F基因的S序列来制备。本发明的副粘病毒科的病毒载体包括那些其中P，M，HN，N或L基因中的任何一种，或其任意组合的表达水平与野生型的表达相比明显降低的病毒载体。明显降低意味着与野生型的表达相比，表达降低了，例如20％或更多，优选地30％或更多，更优选地40％或更多，和甚至更优选地60％或更多。这种载体可以，例如通过用F基因的S序列取代P，M，HN，N和/或L基因的S序列来制备。基因的表达水平可以通过，例如mRNA(转录产物)或蛋白质(翻译产物)的检测来进行测定。基因表达水平优选地是在减小病毒复制率的影响的条件下测定。例如，基因的表达水平可如实施例1中的图3所示，在只发生一个复制循环的条件下检测，或者如图4所示，通过RNA或蛋白质的检测对初级转录进行特异性评价来测定。这些检测可以，例如按照实施例1或2中描述的方法来进行。
本发明人检测了发现于副粘病毒科病毒(仙台病毒)的4种不同S序列的再起始活性，发现它们各不相同，还发现L基因的序列(AGGGTGAAT)，P/M/HN基因的S序列(AGGGTGAAA)和N基因的S序列(AGGGTCAAA)显示较高再起始活性，而F基因的S序列(AGGGATAAA)显示较低再起始活性。因此，当需要较高再起始活性时，可以使用L基因，P/M/HN基因或N基因的S序列，而当需要较低再起始活性时，可以使用F基因的S序列。例如，用具有高再起始活性的P/M/HN基因的S序列取代F基因的S序列能导致F基因及其下游基因的转录水平提高。
改变副粘病毒科病毒基因的转录水平具有许多优点。例如，利用其中F基因的S序列被具有较高再起始活性的S序列所取代的病毒，能够提高病毒的增殖能力。另外，通过将F基因的S序列与L基因的S序列交换，预计能只提高F和HN基因的表达水平，而病毒的增殖能力不受影响。而且，对于不希望被高表达的蛋白而言，可通过将该蛋白的基因连接到再起始活性低的S序列，如F基因的S序列，的下游来限制该蛋白的表达水平。
在含有经改变具有较高转录再起始活性的S序列的病毒基因组中，由被改变的S序列的下游基因编码的mRNA的表达水平比原始野生型基因组高。因此，当所需的外源基因定位在被改变的S序列的下游时，基因产物的产率也有望被提高。因此，含有这种基因组的病毒载体有利于提高基因产物的产率。另外，含有这种基因组的病毒有利于在短时间内产生大量的病毒，以便收集重组病毒颗粒或病毒样颗粒作为药物组合物或疫苗。例如，已知在37℃下培养2天的病毒颗粒相互形成复合物并出现老化现象，同时它们的原始形态发生了改变(Kim，J.等，Virology 95523-535(1979))。在电子显微镜下对这些现象的观察表明在从头合成的病毒颗粒中核衣壳结构是紧密折叠的，但随着老化核衣壳结构展开并变得松散。当利用病毒颗粒或病毒样颗粒作为药物组合物和疫苗时，重要的是要获得同质的物质。因此，有必要在尽可能短的时间内从培养基中回收病毒。如实施例所示，本发明也可以制备滴度为野生型病毒滴度100倍的改良型病毒(图5)。
本发明的副粘病毒科的病毒载体包括，例如具有复制能力的载体和能够自主增殖的载体。总之，野生型副粘病毒的基因组含有3’短前导区，后面是6个编码N，P，M，F，HN和L蛋白的基因，在另一端具有5’尾随区。本发明的能够自主复制的载体可以通过设计具有类似于上述基因组结构的基因组来获得。本发明的副粘病毒科的病毒载体可以具有一个与野生型病毒相比变化了的病毒基因排列顺序。
本发明的副粘病毒科的病毒载体可以在野生型病毒含有的任何基因中有缺陷。例如，在重建仙台病毒载体的情况下，认为由N，P/C和L基因编码的蛋白以反式被需要，但这些基因可以不是病毒载体的组成部分。在一个技术方案中，含有编码蛋白的基因的表达载体可以与另一个编码载体基因组的表达载体一起被共转染到宿主细胞中以便重建病毒载体。或者，可将编码病毒基因组的表达载体转染到含有编码所述蛋白的基因的宿主细胞中，由此利用由宿主细胞提供的蛋白可以重组病毒载体。只要在核酸转移过程中具有等效的或较高的活性，这些蛋白的氨基酸序列可以不同于原始病毒中蛋白的氨基酸序列，并且可以突变或被另一种病毒中同源基因的氨基酸序列所取代。
由M，F和HN基因编码的蛋白被认为是几乎所有副粘病毒科病毒进行细胞-至-细胞的增殖所必需的。然而，当副粘病毒科的病毒载体被制备成RNP时，则不需要这些蛋白。如果基因M，F和HN是含在RNP中的基因组的组成部分，当被引进宿主细胞时，则产生了这些基因的产物，并且生成了具有感染力的病毒颗粒。
可将RNP以与脂转染胺、聚阳离子脂质体等形成复合体的形式导入宿主细胞。特别是，可以使用多种转染试剂，例如DOTMA(Boehringer)，SuperFect(QIAGEN #301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Boehringer#1811169)。加入氯奎以防止在核内体中发生降解(CalosM.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80，3015)。对于复制型病毒来说，所产生的病毒可以通过再感染培养细胞，鸡胚或动物(例如哺乳动物如小鼠)来进行增殖或传代。
相反，本发明的副粘病毒科病毒载体可以是那些缺乏M，F和/或HN基因的病毒载体。这些载体可以通过外源提供缺陷基因的产物来重建。这种载体仍然能象野生型载体一样粘附到宿主细胞上并且诱导细胞融合。可是，由于引进宿主细胞的载体基因组缺乏一种上述基因所以子代病毒颗粒不具有与原始颗粒相同的感染性。因此，这些载体是较安全的只能进行一次基因转移的病毒载体。例如，从基因组上缺失的基因可以是F和/或HN基因。可以通过将编码F基因缺陷型副粘病毒科重组病毒载体的基因组(含有病毒载体DNA)的表达质粒，F蛋白的表达载体与N，P/C和L蛋白的表达载体共转染到宿主细胞中来重建F基因缺陷的病毒载体(PCT/JP00/03194和PCT/JP00/03195)。或者，可以使用其中F基因已整合到染色体上的那些宿主细胞。只要能够提供等效的或较高的基因转移活性，这些由外源提供的蛋白的氨基酸序列可不必与野生型蛋白的氨基酸序列相同，并且这些蛋白可以突变或被另一种病毒的同源蛋白取代。
本发明的副粘病毒科病毒载体的包膜蛋白可以含有不同于原始载体基因组包膜蛋白的蛋白。对这种蛋白没有限制。这些蛋白可以包括其它病毒的包膜蛋白如水疱性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)。因此，本发明的病毒载体包括一种假型病毒载体，该假型病毒载体具有一种来自不同于原始病毒的病毒的包膜蛋白。
任何需要的外源基因，无论是否编码蛋白质都能被插入到本发明的病毒载体DNA中。例如，外源基因可以编码功能性RNA如核酶或反义RNA。外源基因可含有天然或人工序列。例如，在基因治疗等过程中，可将治疗目标疾病的基因插入病毒载体DNA中。当本发明的病毒载体DNA被用于制备基因治疗载体时，需要从病毒载体DNA中删除F，HN和/或M基因以便抑制它们在宿主中的毒性。对于将外源基因引入病毒载体的DNA，例如引入仙台病毒载体的DNA这种情况，优选在病毒载体DNA的E序列和S序列之间插入含有6的倍数个核苷酸的外源基因序列(J.Virol.，Vol.67，No.8，1993，p.4822-4830)。可将外源基因插入每个病毒基因(N，P，M，F，HN或L基因)的前面和/或后面。可将E-I-S序列(转录终端序列-间插序列-转录起始序列)或其部分序列适当插入外源基因的前面或后面以便不干扰该外源基因前面或后面的基因的表达。插入的外源基因的表达可以通过添加在该外源基因5’侧(头部)的S序列的类型以及基因插入的位点和基因前面和后面的核苷酸序列来调控。例如，在SeV中，已知插入位点离N基因愈进，插入基因的表达水平愈高。
通常，插入位点愈靠近病毒基因组负链RNA的3’端(愈靠近野生型病毒基因组的基因排列中的N基因)，插入基因的表达水平将愈高。为了获得外源基因的较高表达水平，优选地将该基因插入到负链基因组3’端附近的区域如N基因的上游(负链上的3’侧翼序列)或N与P基因之间。反之，插入位点愈靠近负链RNA的5’端(愈靠近野生型病毒基因组的基因排列中的L基因)，插入基因的表达水平将愈低。为了降低外源基因的表达水平，可以将外源基因插入到负链上的5’最末端位置，即野生型病毒基因组中L基因的下游(负链上L基因的5’侧翼区)或L基因的上游(负链上L基因的3’侧翼区)。因此，可对外源基因的插入位置进行适当调节以便获得目标基因的所需表达水平或优化插入物与它周围病毒基因的组合。为了有助于外源基因的轻易插入，在插入位置可以设计一个克隆位点。例如，克隆位点可以是限制酶的识别序列。病毒载体DNA中的限制位点能被用来插入一个外源基因。克隆位点可以是一个多克隆位点，该多克隆位点含有多个限制酶的识别序列。本发明的载体DNA可以在上述插入位置以外的位置含有其它的外源基因。
含有一个外源基因的重组SeV载体可如“Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587”和”Yu，D.等，1997，Genes Cells 2457-466”中所述进行构建。
首先，制备含有所需外源基因的cDNA核苷酸序列的DNA样品。优选该DNA样品经电泳鉴定是浓度为25ng/μl或更高的一个质粒。下面，将以实施例的形式描述利用NotI位点将外源基因插入到编码病毒基因组的DNA中的例子。当NotI识别位点被包含在目的cDNA核苷酸序列中时，优选先通过定点诱变改变核苷酸序列以便删除NotI位点但不改变该cDNA编码的氨基酸序列。通过PCR由该DNA样品扩增和回收所需基因片段。为了使扩增的DNA片段两端都含有NotI位点并使一端再添加一个拷贝的SeV的E-I-S序列，制备正向合成的DNA序列和反向合成的DNA序列(反义链)作为一对含有NotI限制酶切位点序列、E-I-S序列和目的基因的部分序列的引物。
例如，为确保被NotI裂解，可将正向合成DNA序列安排为，在其5′-侧选择任意2个或多个核苷酸(优选除GCG和GCC，即NotI识别位点的起始序列以外的4个核苷酸，更优选ACTT)，在其3′-侧添加NotI识别位点“gcggccgc”，然后在其3′-侧添加任意所需的9个核苷酸或9个核苷酸加上6的倍数的核苷酸作为间隔序列，再于它们的3′侧添加含所需cDNA的起始密码子ATG的大约25个核苷酸的ORF。优选从所需cDNA选择约25个核苷酸作为正向合成DNA序列以便在其3′-端有G或C作为末端核苷酸。
在反向合成DNA序列中，在其5′-侧选择任意2个或多个核苷酸(优选除GCG和GCC，即NotI识别位点的起始序列以外的4个核苷酸，更优选ACTT)，在其3′-侧添加NotI识别位点“gcggccgc”，并进一步在3′-侧添加一种寡DNA作为插入片段以调节长度。该寡DNA应设计为能使总核苷酸数为6的倍数，其中包括NotI识别位点“gcggccgc”、cDNA的互补序列和起始于下述病毒之仙台病毒基因组的EIS核苷酸序列(所谓“六的规则”；Kolakofski，D.等，《病毒学杂志》72891-899，1998)。进一步在所插入片段的3′侧添加仙台病毒S序列的互补序列，优选为5′-CTTTCACCCT-3′；I序列、优选为5′-AAG-3′；和与E序列互补的序列，优选为5′-TTTTTCTTACTACGG-3′；而且从所需cDNA序列的终止密码子起沿其反方向选择含约25个核苷酸的序列的互补序列，调节该互补序列的长度以使G和C为其最后的核苷酸，并将此序列加至插入片段的3′-端，作为反向合成DNA的3′-端。
可应用ExTaq聚合酶(宝酒造)以常规方法进行PCR反应。优选应用Vent聚合酶(NEB)进行PCR，并用NotI酶切消化如此扩增的所需片段，然后将它插入质粒载体pBluescript的NotI位点。用测序仪确定由此获得的PCR产物的核苷酸序列，以选择具有正确序列的质粒。应用NotI从该此质粒中切出插入片段，将其克隆至携带基因组cDNA的质粒的NotI位点。或者，也可不经质粒载体pBluescript，直接将此片段插入NotI位点，而获得重组仙台病毒cDNA。
通过将本发明的病毒载体DNA转入宿主细胞使其表达，可制备一种病毒载体DNA，其在病毒颗粒中含有其转录产物。特别是，可将本发明的病毒载体DNA转入宿主细胞以便在该宿主细胞中表达病毒蛋白。病毒载体DNA向宿主细胞中的转移可先于或后于病毒蛋白在宿主细胞中的表达，反或者这些过程可以同时进行。通过将，例如编码病毒蛋白的表达载体转入宿主中，可使病毒蛋白在宿主细胞中表达。当使病毒载体DNA中的F，HN和/或M基因缺陷时，这种缺陷载体不会产生感染性病毒颗粒。然而，通过分别将这些缺陷基因，编码其它病毒包膜蛋白的基因等转入宿主细胞并在细胞中表达，可以形成感染性病毒颗粒。
将病毒载体DNA转移至细胞中的方法包括1)制备目标细胞可吸收的DNA沉淀物的方法；2)制备含DNA的复合体的方法，所述复合体适于被目标细胞吸收、细胞毒性不是很强并带正电荷；3)在目标细胞膜上瞬时钻孔、并使孔的宽度能让DNA分子在电脉冲下通过的方法。
在方法2)中，可应用各种转染试剂，例如DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer#1811169)等。方法1)的实例是一种应用了磷酸钙的转染方法，在此方法中，将进入细胞的DNA掺入吞噬体中，在核中也掺入足够量(Graham，F.L.和Van Der Eb，J.，1973，《病毒学》52456；Wigler，M.和Silverstein，S.，1977，《细胞》11223)。Chen和Okayama研究了转移技术的最佳方法，他们报道最佳DNA沉淀物可在下列条件下获得1)在35℃、2-4％的CO2中，将细胞与DNA一起培养15-24小时，2)应用比线性DNA具有更高沉淀物形成活性的环状DNA，和3)沉淀物混合物中DNA浓度为20-30μg/ml(Chen，C.和Okayama，H.，1987，《分子细胞生物学》72745)。方法2)适宜于瞬间转染。本领域技术人员熟知一种旧方法，在这种方法中，按照所需DNA浓度比制备DEAE-葡聚糖(Sigma #D-9885，M.W.5×105)混合物以进行转染。因为大部分复合体在内体中分解，所以可加入氯喹以提高转染效果(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。方法3)是指电穿孔法，它比方法1)和方法2)更通用，因为它没有细胞选择性。方法3)在脉冲电流延续时间、脉冲形状、电场电势(两电极间的电位差，电压)、缓冲剂的导电性、DNA浓度和细胞密度的最佳条件下是高效的。
在上述3类中，转染试剂(方法2))适宜于本发明，因为方法2)易于操作，且易于用大量细胞检查多个待检样品。优选应用Superfect转染试剂(QIAGEN，301305)或DOSPER(Boehringer 1811169)。
可以按照已知方法从cDNA重建病毒(WO97/16539；WO97/16538；Durbin A.P.等，Virol.，1997，235323-332；Whelan S.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，8388-8392；Schnell M.J.等，EMBO J.，1994，13，4195-4203；Radecke F.等，EMBO J.，1995，14，5773-5784；Lawson N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，4477-4481；Garcin D.等，EMBO J.，1995，14，6087-6094；Kato A.等，Genes Cells，1996，1，569-579；Baron M.D.和Barrett T.J.Virol.，1997，71，1265-1271；Bridgen A.和Elliott R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，15400-15404)。这些方法使得能从DNA重建副粘病毒科病毒包括副流感病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒和仙台病毒的病毒载体。
例如，在24孔到6孔的塑料培养平板或100mm直径的培养皿中通过采用极限必需培养基(MEM)将源于猴肾的LLC-MK2细胞培养到70至80％的汇合，然后，例如用表达T7聚合酶的重组疫苗病毒vTF7-3以2PFU/细胞进行感染，所述极限必需培养基含有10％的小牛血清(FCS)和抗生素(100单位/ml的青霉素G和100μg/ml的链霉素)。该病毒可以通过在有1μg/ml补骨脂素存在的条件下用紫外线照射处理20分钟而被灭活(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，838122-8126，1986；Kato A.等，GenesCells，1996，1569-579，1996)。可以适当地调节补骨脂素的加入量和紫外线的照射时间。病毒吸收1个小时后，通过利用表达反式-作用蛋白的质粒(24至0.5μg的pGEM-N，12至0.25μg的pGEM-P和24至0.5μg的pGEM-L，更有地选1μg的pGEM-N，0.5μg的pGEM-P和1μg的pGEM-L)(Kato A.等，Genes Cells，1996，1569-579，1996)与SuperFect(QIAGEN)一起进行脂转染等方法，用2-60μg，更优选地3-5μg的上述重组SeV cDNA转染细胞，其中所述反式-作用蛋白是制备全长SeV基因组所需的。将转染细胞在不含血清的MEM中培养，如果需要，所述MEM还可含有利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)各100μg/ml，更优选只含40μg/ml阿糖胞苷(AraC(Sigma)，可将试剂的浓度调节到最佳状态以减小痘苗病毒病毒的细胞毒性并提高病毒的回收率(Kato A.等，Genes Cells，1996，1569-579，1996)。转染后接着培养48至72小时后，使细胞复苏，通过反复冻融三次而裂解细胞，然后转染到LLCMK2细胞中，进行培养。细胞培养3至7天后，收集培养液。通过利用表达包膜蛋白的LLCMK2细胞进行转染，或与一种包膜表达质粒共同进行转染，可以重建包膜蛋白的编码基因缺陷而不具有复制能力的病毒载体。通过将转染细胞置于表达包膜蛋白的LLCMK2细胞上层进行培养可以扩增缺陷型病毒载体(PCT/JP00/03194和PCT/JP00/03195)。通过以“内-点稀释方法”(Kato A.等，Genes Cells，1996，1569-579，1996)测量凝血活性(HA)来测定培养上清中的病毒滴度。如此获得的病毒原液可保藏在-80℃下而不发生衰变。
用于病毒重建的宿主细胞类型没有特别的限制，只要病毒载体能在其中重建就行。例如，在SeV载体等的重建中，可以使用培养细胞如来源于猴肾的CVI细胞和LLCMK2细胞，来源于仓鼠肾的BHK细胞，来源于人的细胞等。为了大量获得SeV载体，可将从上述宿主细胞中获得的病毒载体转染到鸡胚中来扩增所述载体。病毒的鸡胚培养法是已知的(Nakanishi，等，(eds.)，1993，“Shinkei-kagaku Kenkyu-no Sentan-gijutu ProtocolIII(High Technology Protocol III of Neuroscience Research)，MolecularNeurocyte Physiology，Koseisha，Osaka，153-172页”)。具体的是，例如将受精卵放在培养箱中，在37至38℃下培养9至12天以成胚。将病毒在接种到鸡胚的绒毛尿囊腔内，并培养数天来增殖病毒。条件如培养时间可以根据所使用的重组病毒类型来变化。然后，回收含有病毒的绒毛尿囊液。按照标准方法进行SeV载体的分离和纯化(Tashiro，M.，“Virus ExperimentProtocols”，Nagai和Ishihama(eds.)，Medicalview，68-73页(1995))。
而且，本发明的病毒载体在它的包膜上还可以含有粘附分子，配体，受体或其片段以便粘附到特定细胞上。如果制备了含有嵌合蛋白的载体，使得这些蛋白位于胞外区域并使得源于病毒包膜蛋白的多肽位于胞内区域，就能够制备导向特定组织的载体。这些因子可以由病毒基因组本身来编码，或在病毒重建时通过非病毒基因组的其它基因(例如，另一表达载体或宿主细胞染色体)的表达来提供。
例如为了降低抗原性或提高RNA的转录效率或复制效率，可以对含在重组病毒载体中的病毒基因进行修饰。特别是，能改变属于复制因子的N，P/C和L基因中的至少一个基因来增强转录或复制。还可以改变HN蛋白，一种具有血凝素活性和神经氨酸酶活性的结构蛋白，以便通过减弱前者的活性来增强病毒在血液中的稳定性，并且通过改变后者的活性来调节感染力。还能改变与膜融合有关的F蛋白，以便调节融膜脂质体的融合力。并且，通过分析抗原提呈表位和细胞表面上这种可能的抗原分子如F蛋白和HN蛋白，能够产生经改造具有低抗原性的副粘病毒科病毒载体。
在制备缺陷型病毒载体的过程中，可以将缺陷不同包膜基因的两种不同病毒载体转染到同一细胞中。在这种情况下，每一种缺陷的包膜蛋白通过另一种复合物的表达来提供，这种互补作用能够产生感染性病毒颗粒，其可以复制和增殖。因此，可以同时接种互补的两种或多种本发明病毒载体，从而低成本和大规模地制备出每一种包膜缺陷型病毒载体的混合物。由于这种缺乏包膜基因的病毒具有较小的基因组，所以它们能够允许插入较长的外源基因。另外，这些在宿主细胞内不具感染性的病毒在细胞外被稀释后很难再维持共转染状态，它们因此而不能增殖且对环境的危害较小。
在将如此获得的病毒载体应用于基因治疗时，通过直接或间接(来自体内)给药该病毒载体，能够表达具有所需治疗效应的外源基因，或提供患者体内不足的内源基因。对外源基因的类型没有特别的限制，除了编码蛋白的核酸外，还可以是不编码蛋白的核酸如反义核酸或核酶。对由外源基因编码的蛋白的类型没有特别的限制，天然蛋白的实例是激素，细胞因子，生长因子，受体，酶，多肽等。这些蛋白可以是分泌型蛋白，膜蛋白，胞质蛋白，核蛋白等。合成蛋白的实例是融合蛋白如嵌合毒素，显性失活蛋白(包括可溶性受体分子或膜结合型显性失活受体)，缺失型细胞粘附分子和细胞表面分子。这些蛋白可以是那些添加了分泌信号，膜定位信号，核定位信号等的蛋白。还能够通过表达反义RNA分子或切割RNA的核酶等来抑制在肾细胞中表达的不良基因的功能。能够使用本发明的可给药型载体的基因治疗目的包括通过表达一种引起细胞死亡的基因，如对感染细胞具有细胞毒性的自杀基因(HSV tk等)所获得的癌症治疗。另一个实例是对由动脉硬化引起的冠状动脉再狭窄的预防性治疗。另外，本发明的病毒载体在那些旨在维持细胞存活的基因治疗中的应用可以包括补充如腺苷脱氨基酶基因(ADA)、囊性纤维化跨膜传导调节基因(CFTR)等基因的基因产物，所述基因已知在单基因疾病等中是缺失或缺陷的。
不论基因治疗的目的是引起细胞死亡或维持细胞存活，本发明的含有RNA作为基因组的载体可应用于广泛多种疾病，这是由于这些载体在转录和自我复制过程中不会转化成DNA，还由于这些载体不太可能掺入生殖细胞等的染色体中而影响后续代的基因。即，本发明的载体可以用于由多种基因引起的疾病如高血压、糖尿病、哮喘、局部缺血性心脏病等，对许多健康受试者的治疗和预防，如疫苗，以及疫苗接种以预防各种传染病如AIDS、疟疾，流感等。
本发明的病毒载体可以与所需可药用载体一起制成组合物。此处，“可药用载体”被定义为那些能与载体一起给药但不抑制该载体进行的基因转移的物质。例如，本发明的病毒载体可以用生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)等进行适当地稀释以制备一种组合物。如果本发明的病毒载体是在鸡胚等中进行增殖的，那么该组合物中可能含有绒毛尿囊液。并且，组合物还可能含有赋形剂(carrier)如去离子水或5％的葡萄糖水溶液。它还可能含有稳定剂、抗生素等。本发明的含病毒载体的组合物可以给药至任何哺乳动物，包括人、猴、小鼠、大鼠、兔子、羊、牛、狗等。
附图简述
图1表示质粒pSeV18c(+)的构建和萤光素酶基因向N ORF的下游区域中的插入。通过定点诱变将一种被设计成含有NotI位点的18个核苷酸的片段插入到pSeV(+)中SeV基因组3’端的1698至1699位核苷酸之间(Shioda，T.等，1983，Nucleic Acids Res.117317-7330)。所得编码带18核苷酸插入子的SeV反基因组的质粒被命名为pSeV18c(+)。采用4组带有NotI-标记的引物(ESn/NotLr，ESp/NotLr，ESf/NotLr和ESl/NotLr)，由模板质粒pHvLuc-RT4(Kato A.等，Genes to Cells，1996，1569-579，1996)PCR-扩增萤光素酶基因的ORF，从而产生含有每一种不同天然S序列的片段，该天然S序列位于萤光素酶基因的首端。这些扩增的片段用NotI消化后被引进pSeV18c(+)的相同位点。所产生的被称作pSeV(+)SnLuc、pSeV(+)SpLuc、pSeV(+)SfLuc和pSeV(+)SlLuc的质粒被用来分别回收重组的SeV/SnLuc、SeV/SpLuc、SeV/SfLuc和SeV/SlLuc。
图2表示SeV的基因构建。
图3表示SeV/SnLuc、SeV/SpLuc、SeV/SfLuc和SeV/SlLuc的萤光素酶表达。以10的moi(pfu/细胞)将所述重组病毒接种到CV1细胞中。在指定时间(小时)测定萤光素酶的活性。
图4是重组SeV的萤光素酶表达的照片和图。以100的moi(pfu/细胞)将所述重组病毒接种到CV1细胞中。细胞在有环己酰亚胺存在的条件下培养12小时。回收部分细胞以制备RNA并用萤光素酶探针进行检测(上图)。剩余的细胞在没有环己酰亚胺存在的条件下继续培养0，2和4小时以便合成蛋白并且测定萤光素酶活性(下图)。
图5表示SeV/mSf的生长动力学。在增殖周期中指定时间内测定野生型SeV和突变型SeV/mSf的滴度。空心和实心柱分别代表野生型和突变型病毒的血凝单位(HAU)。带有空心和实心框的线条分别代表每ml野生型和突变病毒的pfu。
图6的照片显示SeV/mSf的致细胞病变效应。以20的moi(pfu/细胞)在有胰蛋白酶存在(+)和没有胰蛋白酶存在(-)的条件下用所述野生型或SeV/mSf病毒感染CV1细胞。该照片是感染48小时后拍照的。
图7是表示病毒基因胞内表达的照片。用病毒的N，P，F或L基因探针在转染后的不同时间(小时)对被野生型SeV或SeV/mSf病毒感染的CV1细胞通过Northern杂交进行分析。对mRNA和基因组/反基因组RNA(vRNA)的位置进行标记。
图8是表示病毒基因胞内表达的照片。采用抗-SeV抗体在每条泳道顶部所标明的不同时间(小时)对病毒基因在CV1细胞中的胞内表达通过蛋白质印迹进行分析。
图9是表示病毒基因胞内表达的照片。在有环己酰亚胺存在的条件下以100pfu的moi用野生型SeV和SeV/mSf感染CV1细胞。接种12小时后提取RNA并通过Northern杂交进行分析。采用BAS 2000图象分析仪分析所获得的特定带。
图10的照片表示连续混合传代的野生型SeV和SeV/mSf的竞争试验。(A)检测任一病毒RNA(右)的特定引物组合(左)。(B)每次传代起始于注入剂量为104(SeV/mSf)和104(野生型SeV)pfu/卵或104(SeV/mSf)和102(野生型SeV)pfu/卵。每3天收集绒毛尿囊液，稀释到10-6并混合接种到新的受精卵中连续传10代。利用特异性引物组合通过一步RT-PCR法提取和分析病毒RNA。传代数标在每一泳道的顶部。“野生型”和“SeV/mSf”代表用针对各自序列的特异性引物组合扩增的DNA片段。
图11表示感染了野生型SeV和SeV/mSf病毒的正常BALB/c和无胸腺BALB/c(nu/nu)小鼠的体重增加量。五只小鼠鼻内接种不同剂量的病毒(每只鼠104至107pfu)。接种后每天测定小鼠重量的增加克数，一直测到14天。死亡的小鼠被标记上+。
图12表示在BALB/c和BALB/c(nu/nu)小鼠肺中的肺损伤和病毒量。每只小鼠鼻内接种104pfu的病毒。接种后的第0，1，2，3，5，7和9天将这些小鼠杀死以便评价损伤分数(上图)和测定肺内的病毒滴度(下图)。所有这些值分别对应每只小鼠。
实施本发明的最好方式本发明用以下实施例详细解释，但并非受这些实施例的限制。
实施例1 重组病毒的构建和萤光素酶分析SeV E序列的9个核苷酸在所有基因中是完全保守的。另一方面，在S序列的9个核苷酸中有微小差异。6个基因中3个(P，M和HN)的S序列是3’-UCCCACUUU-5’，而N，F和L基因的S序列分别是3’-UCCCAgUUU-5’，3’-UCCCuaUUU-5’和3’-UCCCACUUa-5’(图2)。不管传代历史，毒力和分离策略如何，这些微小差异在SeV的所有株中是完全保守的。为了分析S的这些微小差异的作用，本发明人构建了在合成的S序列调控下表达萤光素酶的4种重组SeV，分别命名为SeV/SpLuc、SeV/SnLuc、SeV/SfLuc和SeV/SlLuc。
1-1 在N ORF下游创建一个插入位点含有全长SeV反基因组的cDNA拷贝的质粒pSeV(+)(Kato A.等，Genesto Cells，1996，1569-579)被用作质粒构建的起始物质。为了插入一个具有合成的E序列和S序列的萤光素酶基因，在N基因中N ORF的下游创建一个NotI单一位点。含有NotI限制位点的18个核苷酸(5’-gagggcccgcggccgcga-3’/SEQ ID NO1)被插入到从SeV基因组3’端开始第1698和1699个核苷酸之间，如
图1所示，该位点位于N基因的5’非编码(在负义链中)区(Shioda，T.等，1983，Nucleic Acids Res.117317-7330)。为了插入，本发明人基本上按照早先的论文(Hasan，M.K.等，1997，J.Gen.Virol.782813-1820)用PCR-介导的重叠引物延伸法(Ho，S.N.等，1989，Gene 7751-59)进行定点诱变。简述为，合成了具有重叠的18核苷酸末端的2个引物(NmF；5’-gagggcccgcggccgcga1699TACGAGGCTTCAAGGTACTT1718-3’/SEQ ID NO2和NmR；5’-tcgcggccgcgggccctc1698TGATCCTAGATTCCTCCTAC1670-3’/SEQ ID NO3)，和2个外引物(OP1，5’-61CAAAGTATCCACCACCCTGAGGAGCAGGTTCCAGACCCTTTGCTTTGC105-3’/SEQ ID NO4和OP2，5’-2467TTAAGTTGGTVAGTGACTC2449-3’/SEQ ID NO5)。采用OP1/NmF引物对和OP2/NmF引物对以pSeV(+)为模板进行第一轮PCR，分别生成1.6kb和0.8kb的片段。采用OP1/OP2引物对并以纯化的1.6kb和0.8kb的片段作为模板进行第二轮PCR，生成1个带有所述18个核苷酸的2.4kb-片段。该2.4kb的片段被纯化后再用SphI和SalI进行消化。利用这些酶切割质粒pSeV(+)的SeV基因组上的610和2070位点。所得1.47kb片段利用AFLII自动DNA测序仪(Pharmacia，Uppsala)测序并用亲代pSeV(+)的相应片段取代，结果产生在N ORF下游含有唯一限制位点的pSeV18c(+)。
如亲代质粒pSeV(+)一样，重组病毒能够由如此获得的具有含Not I位点之18核苷酸插入子的质粒来重建。所产生的病毒的感染力和复制能力也与亲代pSeV(+)相似。
1-2 将由不同S序列调控的萤光素酶基因插入载体中来源于pHVlucRT4(-)(Kato A.等，Genes to Cells，1569-579，1996)的萤火虫(Photinus pyralis)萤光素酶基因用对应于四种不同S序列的以下四种引物对通过PCR进行扩增；四种正向引物(ESp；5’-TTgcggccgcGTAAGAAAACTTAGGGTGAAAGTTCACTTCACGATGGAAGACGGCAAAAACAT-3’/SEQ ID NO6，ESn；5’-TTgcggccgcGTAAGAAAAACTTAGGGTcAAAGTTCACTTCACGATGGAAGACGGCAAAAACAT-3’/SEQ ID NO7，ESf；5’-TTgcggccgcGTAAGAAAAACTTAGGGatAAAGTTCACTTCACGATGGAAGACGGCAAAAACAT-3’/SEQ ID NO8，和ES1；5’-TTgcggccgcGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAtGTTCACTTCACGATGGAAGACGGCAAAAACAT-3’/SEQ ID NO9)和一种通用反向引物(NotLr；5’-TCgcggccgcTATTACAATTTGGACTTTCCG-3’/SEQ ID NO10)。下划线部分是与保守的基因间三核苷酸有关的一套新的SeV E序列和S序列，没有下划线的小写字母代表NotI限制位点。有下划线的小写字母代表引物中的每个特有核苷酸。由ESp/NotLr，ESn/NotLr，ESf/NotLr和ESl/NotLr引物对扩增的1.7kb-片段纯化后，用NotI消化并直接引入pSeV18c(+)的NotI位点(
图1)。最终的构建体根据所使用的S序列被分别命名为pSeV(+)SpLuc，pSeV(+)SnLuc，pSeV(+)SfLuc，pSeV(+)SlLuc。
1-3 从cDNA中回收病毒主要按照前面记载的方法(Kato A.等，Genes to Cells，1569-579，1996)从cDNA中回收病毒。简述为用B.Moss博士赠送的痘苗病毒(VV)vTF7-3(Fuerst，T.R等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838122-8126)以2 PFU/细胞的moi感染6厘米直径平板中的2×106个LLCMK2细胞。然后，借助脂转染试剂DOTAP(Boehringer-Mannheim，Mannheim)，同时转染10μg亲代或突变型pSeV(+)以及编码反式作用蛋白的质粒，pGEM-N(4μg)、pGEM-P(μg)和pGEM-L(4μg)(Kato A.等，Genes to Cells，1569-579，1996)。细胞在无血清MEM中维持，所述MEM含有40μg/ml的araC(1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶)和100μg/ml的利福平以使VV的致细胞病变效应最小，从而使回收率最大。转染40小时后，收集细胞，反复冻融三次使细胞裂解并接种到10天龄的鸡胚中。接种3天后，收集绒毛尿囊液。所收获病毒的滴度如前述以血凝单位(HAU)和PFU/ml(Kato A.等，Genes to Cells，1996，1569-579)来表示。通过在稀释度为10-7的鸡胚中进行第二次增殖来除去被鸡胚绒毛尿囊液污染的含有108至109pfu/ml回收SeV的辅助病毒VV。将这种第二次传代液保存在-80℃下，用作所有实验的种子病毒。
1-4. 细胞培养和病毒感染于37℃下，在添加了10％胎牛血清的极限必需培养基(MEM)中培养猴肾衍生的细胞系LLCMK2和CV1。用得自cDNA的突变病毒以10PFU/细胞的输入(input)moi感染这些细胞的单层培养物，然后维持在无血清MEM中。得自cDNA的野生型SeV(Z株)(Kato A.等，Genes to Cells，1569-579，1996)被用作对照。
发现四种重组病毒比野生型在CV1细胞中的复制速度慢，这可能是由于容纳了长达1728个核苷酸的额外基因(Hasan，M.K.等，1997，J.Gen.Virol.782813-2820)。在所述四种重组子中，SeV/SfLuc复制得最慢。
1-5. 萤光素酶分析将重组SeV表达的萤光素酶活性相互比较。6孔板中每孔有5×105个CV1细胞，以1至300pfu/细胞的不同输入复数接种SeV，研究萤光素酶活性的表达。在一个生长周期中，于感染后(p.i.)0，6，14，20和26小时收集细胞。按照文献描述的方法，用发光计(Luminos CT-9000D，Dia-Iatron，Tokyo)经萤光素酶分析试剂盒(Promega，Madison)检测所得细胞的萤光素酶活性(Hasan，M.K.等，1997，J.Gen.Virol.782813-2820；Kato A.等，Genes to Cells，1569-579，1996)。
在所有重组子中由SeV表达的萤光素酶活性随着感染时间和感染量的增加而增加。图3表示当病毒以moi 10感染CV1细胞时，萤光素酶活性的变化。
收集这些细胞，以萤光素酶cDNA为探针如下进行Northern杂交。用TRI zol(Gibco BRL，N.Y.，从细胞中提取RNA。RNA经乙醇沉淀后，溶于甲酰胺/甲醛溶液中，然后在0.9％琼脂-甲酰胺/MOPS凝胶中电泳，并被经毛细转移到Hibond-N膜(Amersham，Buckighamshire)上。所述膜用32P-标记的探针进行检测，该探针由multi-prime标记试剂盒(Amersham，Buckighamshire)来制备。从pHvlucRT4中纯化出NarI/HincII(1270bp)片段作为萤光素酶探针(Kato A.等，Genes to Cells，1569-579，1996)。已证实萤光素酶mRNA被合成为单顺反子mRNA。
这些数据明确地表明在紧邻萤光素酶ORF之前插入的E序列和S序列能被病毒RNA聚合酶正确识别。然而，即使在相同条件下，被这四种病毒感染的细胞中的萤光素酶活性之间也有差异。在感染后26小时的时候，SeV/SlLuc获得了最高活性，SeV/SfLuc获得了最低活性(图3)。在感染后26小时的时候，SeV/SpLuc和SeV/SnLuc比SeV/SlLuc略低。可是，在感染后14和20小时的时候，没有观察到这种结果。因此，Sp，Sn和Sl的再起始能力被认为是相当的。
实施例2 重组病毒初期转录量的比较为了解实施例1所得四种重组SeV之间的表达量差异是否发生在转录水平，而不是发生在复制过程中，在有环己酰亚胺存在的条件下培养用所述重组子转染的CV1细胞，环己酰亚胺可抑制蛋白合成因而阻断需要从头合成病毒蛋白的病毒复制。在这些条件下，只能进行由病毒体结合型RNA聚合酶催化的病毒初期转录。
按照与实施例1相似的方式，用所述重组病毒以100m.o.i.转染CV1细胞，将转染的细胞在有100μg/ml环己酰亚胺(Sigma，St.Louis)存在的条件下培养12小时。按照上述方法制备转染细胞的RNA，然后以萤光素酶cDNA为探针进行Northern杂交(图4，上图)。在没有环己酰亚胺存在的条件下将另一批细胞培养0，2和4小时来合成蛋白质，并测定萤光素酶活性。
结果，在重组病毒所感染的所有细胞中，发现除去环己酰亚胺后培养的时间愈长，萤光素酶的活性愈高。然而，SeV/SfLuc感染细胞的萤光素酶表达量再次明显低于其它三种(图4，下图)。每一种被病毒感染的细胞中萤光素酶mRNA的量与萤光素酶的活性密切相关。培养4小时的萤光素酶活性用SeV/SpLuc计数标准化，因为这种类型的S序列为6种基因中3种所共有。SeV/SnLuc和SeV/SlLuc感染细胞中萤光素酶活性分别是0.86和1.19，因而与SeV/SpLuc感染细胞中的萤光素酶活性几乎相当。相反，SeV/SfLuc感染细胞中的萤光素酶活性值仅达到对照的0.24。
这些结果有力地说明了用于F基因表达的信号的再起始潜力比其它S序列低。
实施例3 含有F基因的改良型S序列的SeV突变体上述结果说明在SeV天然基因组中F基因的转录是下调的。为了对这一点进行研究，接下来本发明人构建了SeV突变体SeV/mSf，其F基因的S序列按照下述方法被P/M/HN基因的S序列所取代，将其复制与野生型的进行比较。
3-1 通过诱变改变全长SeV cDNA中的F基因的S序列按照下述方法对F基因的S序列上的两个核苷酸进行取代。首先，用BanIII切割pSeV(+)上SeV基因组中2088和5333位点，将产生的3.4kb-片段再克隆到pBluescriptKS(+)(Stratagene，La Jolla)中的相同限制位点，得pB/BanIII。然后，利用两种合成引物(mGSlF；5’-4810CTTAGGGTGAAAGTCCCTTGT4830-3’/SEQ ID NO11和mGSlR；5’-4830ACAAGGGACTTTCACCCTAAG4810-3’/SEQ ID NO12)和两种外引物(MlF，5’-3931TACCCATAGGTGTGGCCAAAT3951-3’/SEQ ID NO13和T7，5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3’/SEQ ID NO14)按照上述方法，通过PCR-介导的重叠引物延伸方法(Ho，S.N.等，1989，Gene 7751-59)进行定向诱变。加下划线的字母是产生突变的位点。采用MlF/mGSlR引物对和T7/mGSlF引物对并以pB/BanIII作为模板进行第一轮PCR，结果分别生成0.9kb-和0.6kb-片段。纯化这两种片段，采用MlF/T7引物对并以所述纯化片段为模板进行第二轮PCR，得到一种具有两个核苷酸突变的1.5kb-片段。该片段被纯化后用BanIII消化，再克隆到pSeV(+)的相同限制位点，得pSeV(+)mSf。通过核苷酸测序来证实所克隆的序列。通过与实施例1相同的方法由cDNA重建病毒。
该病毒的增殖利用CV1细胞进行检测。发现SeV/mSf比野生型SeV在CV1细胞中生长得快(图5)。在没有胰蛋白酶存在的条件下，观察到圆形细胞和脱附的细胞。在有外源胰蛋白酶存在能够蛋白水解激活F糖蛋白的条件下，观察到SeV/mSf的融合细胞数比野生型的多(图6)。
3-2 SeV/mSf基因的表达按照实施例1在感染后的不同时间通过Northern印迹法分析野生型和SeV/mSf以moi＝10感染CV1细胞后细胞中的mRNA浓度。从pGEM-N纯化出PstI/PvuI(1189bp)片段作为仙台病毒N探针。从pGEM-P纯化出792bp的SmaI/SmaI片段作为P探针。从pSeV(+)分别纯化出NdeI/NdeI(878bp)，BamHI/BamHI(902bp)，ScaI/ScaI/(1108bp)和BamHI/BamHI(1654bp)片段，作为M，F，HN和L探针。
如图7所示，与野生型感染相比，由SeV/mSf得到的F和L转录物较早就被检测出来并达到相当高的水平。在SeV/mSf感染中也较早检测出了P和N转录物，但峰值水平与野生型的相当。
为了证实病毒蛋白在感染细胞中的表达，利用抗SeV抗体进行了蛋白质印迹分析。生长在6-孔板中的CV1细胞(2×105)用野生型或SeV/mSf以10的moi感染并在感染后的不同时间收集。对所述细胞进行离心，使细胞沉淀裂解，在12.5％ SDS-PAGE上电泳(Laemli，U.K.，1970，Nature 227680-685)并用上述抗SeV兔血清进行蛋白质印迹分析(Kato，A.等，1995，J.Virology.209480-488；Kato，A.等，1996，Genes to Cells.1569-579)。结果，在整个感染期间的任何时间点，SeV/mSf感染细胞中的F0蛋白浓度明显高于野生型(图8)。在这个实验中，下游基因产物，HN和L没有得到很好的分离。
为了直接比较转录水平，在用环己酰亚胺处理被野生型SeV或SeV/mSf感染的细胞以便阻断蛋白质的从头合成后，从所述细胞中提取RNA并如上述进行Northern杂交分析。用BAS 2000图象分析仪(Fujifilm，Tokyo)分析杂交带中所含病毒基因组RNA的放射活性。还清楚地看到，在突变型SeV中F和L基因的表达水平提高了，而N和P基因的表达水平没有提高(图9)。这些结果再次强有力地表明F基因中天然S序列具有较低的再起始活性，因而下调了F和下游基因的表达。并且，还表明通过用效率高的S序列取代F基因的S序列不但可以提高F基因的转录水平还可以提高其下游基因的转录水平。可能由于SeV/mSf中L基因的表达水平提高，整个感染过程中突变型的病毒颗粒(v)RNA浓度高于野生型的(图7)。在突变型SeV感染的细胞中能够较早检测出mRNA(如图7所示)可能是由于L基因表达提高的缘故。
实施例4 野生型SeV和SeV/mSf在鸡胚中的连续混合传代尽管如图5所示在CV1细胞中一个周期内，野生型SeV比SeV/mSf复制得慢，但是仍有可能在多个周期内，F及其下游基因的转录的天然下调比人工引进的上调更有利。因此本发明人检测了在两种病毒于鸡胚中进行连续混合传代的多个周期内，野生型SeV或SeV/mSf是否能竞争胜出。
分别以104pfu/胚的剂量将SeV/mSf和野生型SeV混合接种到两个鸡胚中(104∶104接种量)，在另一个实验中为104和102pfu/胚(104∶102接种量)。接种后每3天收集绒毛尿囊液，将收集的绒毛尿囊液稀释到10-6，取0.1ml再接种到新的鸡胚中。这种再接种被连续重复10次。按照实施例1利用TRIzol/LS(Gibco BRL，N.Y.)从绒毛尿囊液中提取病毒RNA，并且利用两套特异性引物通过一步RT-PCR法扩增病毒RNA。利用特异性引物对通过RT-PCR半定量测定在绒毛尿囊液中增殖的病毒。通过设计，一种引物对只扩增具有F基因的野生型S序列(AGGGatAAAG)的片段，另外一种只扩增突变型序列(AGGGtgAAAG)的片段(
图10A)。具体是，从25μl的每种绒毛尿囊液中提取RNA，在50℃用Superscript II(Gibco BRL，N.Y.)以HvM引物(5’-4448TTTTCTCACTTGGGTTAATC4467-3’/SEQ ID NO15)反转录30分钟，并且在94℃加热2分钟进行变性。采用HvM和GS2WR(5’-4836GCACTCACAAGGGACTTTca4817-3’/SEQ ID NO16)引物经PCR扩增SeV/mSf cDNA，用HvM和GS2WR(5’-4836GCACTCACAAGGGACTTTat4817-3’/SEQ ID NO17)引物经PCR扩增野生型，方法如上所述(Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587；Kuronati，A.等，1998，Genes Cells.3111-124)。小写字母代表突变型双核苷酸。通过所述琼脂糖凝胶电泳分析相应的特异性产物。
发现在104∶104接种的情况下，通过8次传代，野生型基因组消失，在104∶102接种的情况下，通过15次传代，野生型基因组消失(
图10B)。对照实验中，每一种病毒分别进行传代并且测定基因组序列。结果表明两种病毒基因组都能稳定维持10代而在测序区域中没有发生任何核苷酸的改变。这些数据表明在多个增殖周期中，天然F基因S序列至少在鸡胚中针对SeV不具有复制优势。
实施例5 SeV/mSf在小鼠中的毒力与培养细胞或鸡胚相比，自然宿主小鼠个体中SeV毒力的展现需要高度复杂的条件。检测是否突变型SeV/mSf比野生型复制得早并在小鼠中显示出更强的毒力。
从日本的Charles-River购买无特定病原体(SPF)的、3周龄BALB/c小鼠和4周龄BALB/c(nu/nu)裸鼠并用于病毒感染实验。这些小鼠用醚轻微麻醉，用104，105，106，107或108pfu/鼠的野生型或SeV/mSf进行鼻内感染(Kiyotani，K.等，1990，Virology 17765-74)。每天分别测量它们的体重，一直测到14天。感染后0，1，3，5，7和9天，每组杀死三只小鼠并测定接种了104pfu的BALB/c和裸鼠肺中的病毒滴度。同时评价肺损伤分数(Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587)。结果如
图11所示。
当两种病毒的接种量为107pfu时，均严重地阻碍了小鼠体重的增加。在感染后的相似天数，所有小鼠不论接种哪种病毒均死亡。在106pfu时两种病毒之间有显著差异。与野生型相比，SeV/mSf对体重增加的影响更大。前者杀死了所有小鼠而后者只杀死了一只并且使剩余的小鼠体重继续增加。在105pfu的水平上，被野生型感染的所有小鼠表现出与模拟感染的小鼠近乎相当的体重增加模式，并且存活下来，而被突变型SeV/mSf感染的小鼠则不然并且一半的小鼠死亡。因此，SeV/mSf的毒力明显高于野生型。这种毒力差异通过50％致死剂量(LD50)进行定量；野生型的LD50是1.78×106pfu，突变型的LD50是7.94×104pfu(表1)。因此突变型病毒对BALB/c种的毒力比野生型高出22倍。
表1.野生型病毒和突变型病毒在正常小鼠和裸鼠中的LD50接种量 BALB/c LD50BALB/c(nu/nu) LD50野生型 1085/5aNT1075/5 3/51061/4 1.78×1062/5 3.16×1061050/5 NT1040/5 0/5SeVmS/F 1085/5 NT1075/5 5/51065/5 7.94×1045/5 7.94×1041053/5 3/51040/5 0/5a死亡的个体/被接种的个体细胞毒T淋巴细胞(CTL)以两种不同方式调控SeV的致病性。一方面它们导致去除或清除体内的病毒，另一方面通过免疫病理学过程加快疾病的进程。即，BALB/c中的实验结果表明，间接恶化可能是由于突变型SeV诱导增强的免疫应答，而不是由于突变型SeV在小鼠体内高水平复制的直接作用。因此，在试图否认致病性的加强可能是所诱导的免疫所致时，在无胸腺裸鼠中比较了野生型和突变型病毒的致病性(
图11)。每种病毒对裸鼠和其亲代正常小鼠的LD50值相当，两种病毒对裸鼠有有类似差异(表1)。这些结果说明至少在LD50基础上进行观察的过程中(14天)，CTL对野生型和突变型病毒的致病性不起主要作用。然而整个过程中，野生型和突变型病毒在裸鼠肺中维持，而在亲代小鼠中则被清除(
图12)。这些结果说明CTL和其它胸腺-依赖性应答至少在病毒病理学方面起到了部分作用。
上述结果表明，F基因的天然S序列部分地抑制了SeV的复制从而使得被感染的小鼠存活较长的时间。
工业实用性本发明提供了S序列已被改变的副粘病毒科病毒载体。在本发明所述病毒载体中，对S序列进行了改变从而使基因组上基因的转录水平高于野生型。这些病毒可用于提高病毒的增殖能力和所需外源基因的表达。这种病毒载体具有提高基因产物产生效率的优势。相反，在不良蛋白质过高表达时，通过将其编码基因连接到具有降低的再起始活性的S序列下游有可能抑制这些基因的表达水平，其中所述S序列如F基因的S序列。另外，当回收重组病毒颗粒或病毒样颗粒作为药物组合物或疫苗时，其中基因组中的S序列经改变而导致增殖能力提高的寻些病毒具有能够在短时间内产生大量病毒的优势。
序列表<110>株式会社载体研究所(DNAVEC Research Inc.)<120>含有已改变的转录起始序列的副粘病毒<130>D3-007PCT<140><141><150>JP 1999-252231<151>1999-09-06<160>17<170>PatentIn 2.0版<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的寡核苷酸序列<400>1gagggcccgc ggccgcga18<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>2gagggcccgc ggccgcgata cgaggcttca aggtactt 38<210>3<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>3tcgcggccgc gggccctctg atcctagatt cctcctac 38<210>4<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>4caaagtatcc accaccctga ggagcaggtt ccagaccctt tgctttgc 48<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>5ttaagttggt vagtgactc 19<210>6<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>6ttgcggccgc gtaagaaaaa cttagggtga aagttcactt cacgatggaa gacggcaaaa 60acat 64<210>7<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>7ttgcggccgc gtaagaaaaa cttagggtca aagttcactt cacgatggaa gacggcaaaa 60acat 64<210>8<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>8ttgcggccgc gtaagaaaaa cttagggata aagttcactt cacgatggaa gacggcaaaa 60acat 64<210>9<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>9ttgcggccgc gtaagaaaaa cttagggtga atgttcactt cacgatggaa gacggcaaaa 60acat 64<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>10tcgcggccgc tattacaatt tggactttcc g31<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>11cttagggtga aagtcccttg t 21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>12acaagggact ttcaccctaa g 21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>13tacccatagg tgtggccaaa t 21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>14taatacgact cactataggg c 21<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>15ttttctcact tgggttaatc 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>16gcactcacaa gggactttca 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>17gcactcacaa gggactttat 20
权利要求
1.一种病毒载体DNA，其中属于副粘病毒科的病毒的基因组上至少一个基因的转录起始(S)序列已被改变从而改变了所述基因及其下游基因在宿主中的表达水平。
2.如权利要求1所述的病毒载体DNA，其中所述转录起始序列的改变包括将所述序列用副粘病毒科病毒的另一基因的转录起始序列取代。
3.如权利要求1所述的病毒载体DNA，其中所述转录起始序列的改变包括将F基因的转录起始序列用另一基因的转录起始序列取代。
4.如权利要求3所述的病毒载体DNA，其中所述另一基因的转录起始序列包括P/M/HN基因型的转录起始序列。
5.如权利要求1至4中任一项所述的病毒载体DNA，其中所述病毒载体DNA的F基因和/或HN基因有缺陷。
6.如权利要求1至5中任一项所述的病毒载体DNA，其中已将一个外源基因插入所述病毒载体DNA中。
7.一种副粘病毒科的病毒载体，其在病毒颗粒中含有权利要求1至6中任一项所述病毒载体DNA的转录产物。
8.如权利要求7所述的载体，其中所述载体是一种仙台病毒(SeV)载体。
9.如权利要求7或8所述的载体，其中在宿主中增殖的能力与野生型病毒的增殖能力相比已提高。
10.一种制备副粘病毒科的病毒载体的方法，其中所述方法包括将一种权利要求1至6中的任一权利要求所述的病毒载体DNA转移到宿主中，并在所述宿主中表达病毒蛋白的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其中用于制备载体的所述副粘病毒科的病毒是仙台病毒。
全文摘要
本发明提供了副粘病毒科的病毒载体,制备所述载体的方法,及所述载体的应用,其中所述载体中的转录起始序列已被改变从而改变了位于其下游的基因的表达水平。通过测定仙台病毒所携带的每一基因的转录起始效率,表明,F基因的转录起始序列启动转录的能力明显低于其它三种转录起始序列。当野生型仙台病毒F基因的转录起始序列被显示高效率的P/M/HN基因型的转录起始序列取代时,所得仙台病毒突变体的F基因及其下游基因表现出升高的表达水平。还发现,这种突变体比野生型增殖得更快。上述载体可用于制备药物组合物和疫苗。
文档编号C12N15/86GK1367839SQ00807912
公开日2002年9月4日 申请日期2000年9月6日 优先权日1999年9月6日
发明者永井美之, 加藤笃, 长谷川护 申请人:株式会社载体研究所