专利名称：：一种猪免疫性状相关基因IFN-γ及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种猪免疫性状相关基因IFN-Y及其制备方法，以及其突变位点检测方法和在建立适用于猪免疫性状的分子标记方面的应用。技术背景近10年以来，现代育种技术使猪的生产性能(生长，胴体与肉质性状)得到了显著的改良，而对猪健康及抵抗疾病能力的遗传改良却重视不够。随着分子遗传学的飞速发展，畜禽遗传图谱的不断完善，遗传标记的不断补充，使一些与疾病抗性有关的基因或遗传标记相继被发现。采用遗传学方法从遗传本质上提高畜禽的抗性，减少疾病的发生，对于控制疾病，提高养猪效益和安全养殖具有标本兼治的重要乂§、3^-o个体免疫力是衡量动物健康的重要指标(Kn即p等，2000)，它属于数量性状，其中涉及相关基因较多，分子机制很复杂。免疫力与生产性能通常表现为表型负相关关系，这为育种工作者提出了一个大的难题，即如何在保持和提高生产性能的基础上同时提高个体免疫能力是育种工作者研究的新课题。不过，最近国外少量研究表明猪免疫能力与生产性能的关系是双向的，某种情况下即正常状态免疫能力的增强能提高猪的生长速度，饲料效率等主要生产性能，而单纯针对生产性能的选择却导致猪免疫能力下降即相关等位基因的丢失或频率的降低。但是，目前二者的相互关系仍然不是很明了，从基因组水平揭示出生产性能和免疫力的控制基因体系间的具体关系，是解决上述难题的有效途径。在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。肠毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenicf5"c力er7'c力j'sco力'，ETEC)是引起仔猪泻痢的主要病原体之一(施启顺，2001)，研究表明动物体内如果缺乏大肠杆菌K88受体或F18受体，就会对相应的血清型大肠杆菌引起的腹泻产生抗性，目前编码大肠杆菌K88受体(K88abR和K88acR)的基因已经定位在猪13号染色体上靠近转铁蛋白基因的位置(Edfors-Lilja等，1997)，a-(1，2)-海藻糖转移酶l(a(1,2)f腦syltransferase，FUT1)基因是F18受体(ECF18R)的候选基因，位于猪6号染色体上(Meijerink等，，1997)。此外，猪第7号染色体着丝粒附近的主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibilitycomplex,MHC)基因已经被证明与抗体对多种抗原的应答、细菌的噬菌作用、对螺旋旋毛虫和恶性黑素瘤的易感性等性状有相关(Peelman等，1996)，其它与抗病力有关的基因有MX1(Myxovirus(influenza)resistance1，茅占液病毒(流感)抗性因子l)、NRAMP1(Naturalresistance—associatedmacrophageprotein1，与巨噬细胞有关的天然抗性蛋白1)，IL1(Interleukins1，白细胞介素1)、PPARG(Peroxisomeproliferatoractivatedreceptorgamma，过氧化物酶体增殖激活受体Y)等基因。Rothschild实验室长期从事MHC基因单倍型与猪初生重、断奶重、生长速度、背膘厚等性状有关等性状的研究，他们认为MHC基因单倍型与上述生产性能存在相关关系(RothschildMF，1998)。猪IFN-y由单个基因编码，是一类主要由NK细胞和某些T细胞产生的细胞因子，能够增强NK细胞和T细胞介导的细胞毒性，B细胞分化，MHCI和MHCII的表达和巨噬细胞活化，具有抗病毒、抗菌、抗寄生虫和免疫增强等多种活性作用，是一种非常重要的细胞因子。干扰素强大的抗病毒和多种免疫调节功能，使得干扰素基因有可能成为猪抗病力选育的理想侯选基因。有关人类疾病与干扰素基因多态性相关分析的研究报道对今后开展猪抗病力选育的研究具一定借鉴作用如不同IFN-y基因型与日本国内肾病的易感性显著相关(Masutani等，2003);IFN-y基因存在与人肺炎易感群有关的单核苷酸标记(Lopez-Maderuelo等，2003);人对乙肝病毒的易感性与IFN-y基因表达量差异有关(Ben-Ari等，2003);Lio等(2002)、Stassen等(2002)、Lii等(2002)也报导了类似研究结果。此外，大量体内和体外试验表明，猪干扰素对生产具重大威胁的传染病病毒均具有防御和抑制作用。一系列体外试验表明用IFN-y处理感染PRRSV(繁殖与呼吸综合征病毒)的猪巨噬细胞，可抑制PRRSV增殖(Bautista等，1999);用重组interferon-y处理Marc-145细胞后，可抑制PRRSV野毒株和细胞适应性毒株增殖(Row-land,2001);猪重组IFN-y可抑制感染传染性胃肠炎冠状病毒的猪上皮细胞和肺巨噬细胞中病毒复制(Charley等，1988);猪IFN-y可抑制感染猪瘟病毒的单核细胞和肺巨噬细胞的病毒复制(Esparza等，1988)。动物体内试验结果表明，同时注射猪瘟疫苗和干扰素，可增强对猪瘟病毒的防御能力(Suradhat等，2001)。另外正因为干扰素的广谱抗病毒性，对克隆相关干扰素基因并构建一定的生物反应器成了近来国内研究的热点。如中国农业大学的任慧英等(2005)则构建了猪IFN-y真核重组表达载体IFN-y-pcDNA，用作猪繁殖与呼吸综合征基因疫苗佐剂。猪干扰素对许多重大传染病致病病毒具有效的防御功能，以及人类干扰素基因存在与疾病易感性相关的多态性，可推测猪干扰素基因存在与猪综合抗病力相关的遗传多态性，有可能在猪抗病育种研究中作为理想的侯选主效基因，但开展相关研究的前提是需要对综合抗病力指示表型性状进行筛选、确立和准确测定。迄今为止,有关猪干扰素基因的遗传多态性与综合抗病力的相关分析的研究仍未见报导，对猪免疫性状相关基因IFN-y的研究将为猪干扰素基因的遗传多态性与综合抗病力的相关分析的研究奠定基础。
发明内容本发明的目的是提供一种猪免疫性状相关基因IFN-y。本发明的另一个目的是提供所述猪免疫性状相关基因IFN-y的制备方法。本发明还有一个目的是通过对父母代及子代群体中进行IFN-y基因的SNP检测，并在有免疫及生长记录的子代群体中做关联分析，找到与对综合抗病力影响很大的分子遗传标记，提出EFN-y基因在抗性育种方面的应用。本发明通过以下技术方案实现提供一种猪免疫性状相关基因IFN-y，所述基因的序列表如SEQIDNO:l所示，全长为200bp，包括部分内含子l。所述IFN-y基因DNA序列中有1个A碱基插入或缺失突变，导致SSCP多态；所述突变位点位于序列第91位置碱基处。所述的突变位点是通过设计正反向引物，应用PCR-SSCP方法检测得到。检测91位碱基处碱基突变的正、反向引物序列分别是正向5，-ATTTTCTTTTCCTTATTATACTTGTTT-3，；反向，5，-TTTTCTCTTCCACCCTCTGTT-3，。本发明同时提供了所述猪免疫性状相关基因IFN-y的制备方法，包括以下步骤(1)根据IFN-y基因在GeneBank登录号ACCESSIONX53085和多态性位点设计引物；(2)进行PCR扩增，得到PCR产物；步骤(1)所述正反向引物的序列为正向5，-ATTTTCTTTTCCTTATTATACTTGTTT-3，，反向5，TnTCTCTTCCACCCTCTGTT-3，。步骤(2)所述PCR扩增条件为94'C预变性5min;94"C变性30s、53。C退火30s、72。C延伸30s、30个循环；72"延伸5min。PCR产物经1.0。％琼脂糖凝胶电泳检测。所述猪免疫性状相关基因IFN-y可应用于猪的分子育种方面，猪标记辅助选择中。通过对父母代及子代群体中进行IFN-y基因的SNP检测，并在有免疫及生长记录的子代群体中做关联分析，找到与对综合抗病力影响很大的分子遗传标记，提出抗性育种新策略。本发明的有益效果是本发明提供了一种猪免疫性状相关基因IFN-Y，同时检测到其碱基突变位点，本发明可应用于为猪的标记辅助育种提供新的分子标记，应用本发明有望从遗传本质上提高畜禽的抗性，减少疾病的发生，对于控制疾病，提高养猪效益和安全养殖具有标本兼治的重要意义。图1本发明的技术流程图。图2本发明中猪IFN-Y基因内含子1部分序列的扩增序列的电泳图谱图3本发明中猪IFN-Y基因测序发现的A等位基因的插入或缺失突变图4本发明中猪IFN-Y基因内含子1的PCR—SSCP的三种基因型电泳图谱具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。实施例1猪免疫性状相关基因//w-r的制备具体的实验过程描述如下1.引物设计根据IFN—y基因在GeneBank登录号ACCESSIONX53085和多态性位点设计引物，扩增片段预期DNA长度为200bp，由上海生物工程有限公司合成。PCRReactionMix购于广州东盛生物科技有限公司。正向5，-ATTTTCTnTCCTTATTATACTTGTTT-3，，反向5，-TTTTCTCTTCCACCCTCTGTT-3，。2.PCR-SSCP诊断方法建立(1)引物序列正向5，-ATTTTCTTTTCCTTATTATACTTGTTT曙3，，反向5，-TTTTCTCTTCCACCCTCTGTT-3，。该引物扩增片段长度200bp。(2)PCR扩增条件10uL的反应体系中加入DNA模板0.5uL，PCRReactionMix5uL，去离子水5uL，10mM引物前后各0.2uL，Taq酶0.1uL(2.5U/ul)。PCR反应条件为94。C预变性5min后，94"变性30s、53"退火30s、72。C延伸30s，30个循环，最后72T:延伸5min。PCR产物经1.0X琼脂糖凝胶电泳检测，见附图2，，片段大小为200bp，图中M泳道DNA分子量标记(2000bpladder)。(3)SSCP检U取3uLPCR产物，5uL上样缓冲液，混合后于100。C煮沸10分钟，冰浴5分钟；用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察电泳结果，凝胶成像系统拍照。实施例2标记性状关联分析实验按照附图1所示技术路线进行实验。本实验例猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪，父母代包括17头公猪、36头母猪，子代有306头仔猪，父母代及子代全部进行了基因型检测，子代在l、17、32日龄采集抗凝血和非抗凝血，用于血常规和抗体水平检测。所分析的性状主要是免疫性状。根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析IFN-y基因SNPs位点的基因型效应及其与免疫指标的关系Y=X(3+Z"e其中Y为免疫性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；p为固定效应参数向量，包括性别效应、胎次效应、生产线别效应、候选基因的基因型效应；Z为混合模型中的随机效应的关联矩阵；y为所有随机效应参数向量，包括公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应；采用SAS(Version8.1)软件中MIXEDMODELS程序进行数据处理与统计分析。实验效果1、猪IFN-y基因不同带型基因型的验证对具单链核苷酸构象多态性的PCR扩增片段进行纯化，克隆，测序，测序结果显示其三种基因型个体的碱基序列，见附图3，箭头代表插入纯合。2、PCR-SSCP诊断方法建立用引物扩增猪基因组DNA得到了200bp特异性扩增片段，序列分析结果表明在91bp处存在1个A碱基插入或缺失突变，该基因座由两个等位基因控制，A是发生碱基插入的等位基因，B是发生碱基缺失的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型AA、AB和BB，AA、AB和BB分别代表插入纯合、缺失插入杂合和缺失纯合，见附图4。3、标记性状关联分析3.1猪IFN-Y基因内含子I多态性与免疫性状之间的关联分析对猪IFN-Y基因内含子I多态性位点基因型检测结果表明在306个个体中AA基因型有133个，AB基因型有135个，BB基因型有38个。所分析的免疫性状有蓝耳病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬抗体水平及血常规18项，分别对306头仔猪在1、17、32三个日龄进行。不同基因型之间性状显著差异的结果总结于表1。表1:IFN-Y基因内含子I多态性位点基因型与1日龄部分免疫性状的关联分析<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>承表示PO.05;林表示PO.Ol由表l可知IFN-Y基因内含子1的SNP位点对1日龄的猪瘟抗体有显著影响(p〈0.05)，而且对伪狂犬抗体有极显著影响(pO.01)，此位点与其他免疫性状没有达到显著水平，而且对17和32日龄的21项免疫性状也没有达到显著水平。对猪瘟病毒抗体、伪狂犬抗体显著影响的IFN-Y基因内含子1中SNP位点基因型的最小二乘均数见表2。表2SNPs位点(IFN-Y)基因型猪瘟抗体、伪狂犬抗体的最小二乘均数<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表2可知，BB基因型的猪瘟抗体水平显著低于AA基因型(p<0.01)和AB基因型(p<0.01)，AA基因型的猪瘟病毒抗体水平最高；而BB基因型的伪狂犬抗体水平显著高于AA基因型(pO.Ol)和AB基因型(p<0.0l0，BB基因型的伪狂犬抗体水平最高。可见，在l日龄所测的这两个性状上，对基因型的效果呈负相关的趋势。实施例3实验技术路线与猪群同实施例2。结果总结于表3。表3PCR-SSCP-IFN-Y多态性在306头长白猪中的分布<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>根据表3的基因型和基因频率的结果显示，AB基因型数最多，其基因型频率也最大，AA和AB基因型数相差不大，长白猪是A等位基因占优势；该基因的杂合度和香农指数也较高；另外，该基因的Hardy-Weinberg平衡检测结果表明，该基因多态位点在长白猪群中基本是处于一个自由交配(Hardy-Weinberg平衡)的状态(PX).05)，也就是群体的选育对该基因没有造成影响，或者说该基因对现在的选育性状没有作用。实施例4实验技术路线与猪群同实施例2。结果总结于表4。表41、17、32日龄三次抗体水平及血常规比较<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由表4可知，从检测的标准差来看，各类指标的标准误较小，各次测定的准确性较好。三次测定的抗体水平及血常规指标比较，经T检验发现除伪狂犬抗体、红细胞压积、平均HGB量、平均HGB浓度、淋巴细胞等指标没有显著变化外，其他免疫指标相差都达到显著或极显著水平。测定值减少的有蓝耳抗体、猪瘟抗体、平均RBC体积、淋巴细胞等指标，测定值增加的有红细胞、血红蛋白、红细胞压积、血小板、RBC分布宽度等指标，其它性状均表先为先减少后增加的趋势。实施例5对猪IFN-y基因内含子I多态性位点基因型检测结果表明在306个个体中AA基因型有133个，AB基因型有135个，BB基因型有38个。所分析的免疫性状有蓝耳病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬抗体水平及血常规18项，分别对306头仔猪在1、17、32三个日龄进行。不同基因型之间性状显著差异的结果总结于表5。表5正]^-y基因内含子I多态性位点基因型与l日龄部分免疫性状的关联分析<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由表5可知IFN-Y基因内含子1的SNP位点对1日龄的猪瘟抗体有显著影响(p〈0.05)，而且对伪狂犬抗体有极显著影响(pO.01)，此位点与其他免疫性状没有达到显著水平，而且对17和32日龄的21项免疫性状也没有达到显著水平。实施例6对猪瘟病毒抗体、伪狂犬抗体显著影响的IFN-Y基因内含子1中SNP位点基因型的最小二乘均数见表6:表6SNPs位点(IFN-Y)基因型猪瘟抗体、伪狂犬抗体的最小二乘均数<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>由表6可知，BB基因型的猪瘟抗体水平显著低于AA基因型(p<0.01)和AB基因型(p<0.01)，AA基因型的猪瘟病毒抗体水平最高；而BB基因型的伪狂犬抗体水平显著高于AA基因型(pO.Ol)和AB基因型(p<0.01)，BB基因型的伪狂犬抗体水平最高。可见，在l日龄所测的这两个性状上，对基因型的效果呈负相关的趋势。SEQUENCELISTING〈110>华南农业大学〈120>—种猪免疫性状相关基因IFN-Y及其制备方法和应用<130〉<160〉1<170〉Patent.Inversion3.2<210〉1<211〉200〈212>DNA<213>人工序列<400>1attttcttttccttattatacttgtttgggacaattgaagtatcatcagcctttgttgag60ttcatttgtgatgtttcaatttaagagttaatactagaaaataagaaagctaaaataaca120tgatagtctttggctatatctaacatgatggtttttaagaatacttattgatagaaccaa180acagagggtggaagagaaaa200权利要求1.一种猪免疫性状相关基因IFN-γ，其特征在于所述基因的序列表如SEQIDNO1所示。2、根据权利要求1所述猪免疫性状相关基因EFN-Y，其特征在于所述IFN-Y基因DNA序列中有1个A碱基插入或缺失突变，导致SSCP多态；所述突变位点位于序列第91位置碱基处。3、根据权利要求2所述猪免疫性状相关基因IFN-Y，其特征在于所述的突变位点是通过设计正反向引物，应用PCR-SSCP方法检测得到。4、一种权利要求1或2所述猪免疫性状相关基因IFN-Y的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)根据IFN-Y基因在GeneBank登录号ACCESSIONX53085和多态性位点设计引物；(2)进行PCR扩增。5、根据权利要求4所述的猪免疫性状相关基因IFN-Y的制备方法，其特征在于步骤(1)所述正反向引物的序列为正向5，-AnTTCTTTTCCTTATTATACTTGTTT-3，，反向5，-TTTTCTCTTCCACCCTCTGTT-3，。6、根据权利要求4所述的猪免疫性状相关基因IFN-Y的制备方法，其特征在于步骤(2)所述PCR扩增条件为94。C预变性5min;94X:变性30s、53。C退火30s、72。C延伸30s、30个循环；72。C延伸5min。7、一种权利要求1所述猪免疫性状相关基因IFN-Y的应用，其特征在于应用于猪的分子育种方面。8、根据权利要求7所述猪免疫性状相关基因EFN-Y的应用，其特征在于应用于进行基因型与猪的部分免疫性状之间的关联分析或作为猪标记遗传辅助选择。全文摘要本发明公开了一种猪免疫性状相关基因IFN-γ，基因的序列表如SEQIDNo1所示，并检测到一个影响猪免疫性状的碱基突变位点。本发明还公开了获得上述基因的方法；本发明提供的基因以及检测到的碱基突变位点的成果可应用于为猪的标记辅助育种提供新的分子标记，应用本发明有望从遗传本质上提高畜禽的抗性，减少疾病的发生，对于控制疾病，提高养猪效益和安全养殖具有标本兼治的重要意义。文档编号C12N15/10GK101280309SQ200810028460公开日2008年10月8日申请日期2008年6月2日优先权日2008年6月2日发明者吴珍芳,孙奴奴,陈慧勇申请人:华南农业大学