专利名称：：一种提取食用油脂中核酸的方法
技术领域：
：本发明涉及一种提取食用油脂中核酸的方法。
背景技术：
：DNA提取技术的建立是保障PCR或相应下游实验顺利进行的关键，到目前为止，保存较好的生物材料、加工或部分深加工生物材料基本均可做到利用生物
技术领域：
熟知的DNA提取技术(普通DNA提取试剂或利用市售特殊装置如纯化柱法、磁珠法、超滤离心法等)顺利完成适用DNA的提取过程。就利用PCR等技术进行下游实验而言，许多实验室经常遇到特殊的实验材料难以提取到适用于PCR或相应下游实验的DNA的问题，食用油脂是该特殊实验材料中的一种。多年来，国内外诸多相关实验室均力图建立可重复的、稳定的食用油脂中适用于PCR或相应下游实验的DNA提取方法，但至今尚未见报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种可重复的、稳定的食用油脂中适用于PCR的DNA的提取方法。为了达到上述目的，本发明所述的提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步骤进行(1)食用油脂中极性成分的萃取采用水作为萃取剂，用离心的方法进行油液分离；(2)萃取液的浓缩全部转移萃取液于电热恒温干燥设备或其它干燥设备内，充分干燥；(3)食用油脂中DNA的粗提；(4)粗提DNA的纯化。上述步骤(1)中，在萃取过程中，必须采取离心等方法去除油水界面物质，根据下层水相浑浊程度分多次共需萃取初搾大豆油约400mL-600mL、初搾菜籽油约700mL-1000mL、初榨玉米油约700mL-1000mL、各种精练油约2000-3000mL、花生油、芝麻油等约400mL-600mL、棕榈油600mL-800mL。当待测油脂为初榨大豆油时，步骤(3)中DNA的粗提按照以下方法进行取预热至约80-90°CCTAB提取液8-10mL，分多次小心洗下表面皿上干燥的萃取物，吸取洗下的萃取物转移至15mL离心管。加入等体积的船/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7500Xg室温离心lOmin;分别小心吸取上清至另一15mL离心管，再次加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，操作同上，小心吸取上清，上清加入0.2至0.3倍体积的预冷异丙醇，充分上下倒置混匀，置0。C约20-40min后10000-12500Xg，4。C离心6min，沉淀置(TC待用；上清于27000-30OOOXg，4。C离心10min，弃取上清，沉淀加入500yL70%_80%预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27000-30000Xg，4。C离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥；上述10000-12500Xg离心所获沉淀加入约1200uL70%_80%预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27000-30000Xg，4'C离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。当待测的油脂为初搾菜籽油、玉米油、花生油、芝麻油、棕榈油、棉籽油或各种精炼油等时，步骤(3)中DNA的粗提按照以下方法进行取预热至约80-90。CCTAB提取液8-10mL，充分溶解干燥的萃取物于15mL离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7500Xg室温离心10min;上清按1/10体积加入3MNaAc，混匀，加入LA溶液，混匀，加入等体积异丙醇，混匀，-20。C静置约40min-60min后，27000-30OOOXg，4。C离心10min，弃取上清，沉淀加入500uL70%-80%预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27000-30OOOXg，4'C离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。所述步骤(4)粗提DNA的利用特制的长片段核酸富集纯化装置来进行，该长片段核酸富集纯化装置包括一个筒状主体1，在两端开口端口包覆半透膜2，在筒状主体上设有取液孔3和加样槽4，取样孔3带有胶塞5。在加样槽下方的部分筒状主体内充填有琼脂糖凝胶，而取液孔下方的部分筒状主体保持为空腔，用作注入电泳缓冲液。具体的操作方法如下(a)电泳槽加入电泳缓冲液；(b)取液孔下方的部分筒状主体的空腔加满电泳缓冲液，并盖紧取液孔胶塞；(C)将核酸富集纯化装置浸入电泳槽内电泳缓冲液中；(d)待纯化核酸与上样缓冲液(含指示染料)混匀后，加入到加样槽，并通电；(e)待指示染料条带全部进入取液孔下方缓冲液中，弃去取液孔下方的缓冲液；(f)重新注满电泳缓冲液于取液孔下方的空腔，盖紧取液孔胶塞，重新放入电泳槽中，继续通电电泳，收集取液孔下方空腔的缓冲液进行酚氯仿抽提。本方法适用于初榨大豆油、菜籽油、玉米油，精练大豆油、菜籽油、玉米油、多种调和油，以及花生油、芝麻油、橄榄油、棉籽油、棕榈油等食用油脂的适用于PCR或相应下游实验的DNA的提取。以下将通过本具体地实施方式来对本发明进行详细的描述。图1A大豆油内源基因检测电泳图谱；图1B菜籽油内源基因检测电泳图谱图1C玉米油内源基因检测电泳图谱图1D其余多种植物油内源基因检测电泳图谱；图1E其余多种植物油内源基因检测电泳图谱图2A初榨大豆油、精炼大豆油内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)图2B初榨大豆油、精练大豆油抗除草剂基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)图2C初搾大豆油、精练大豆油NOS终止子基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)图2D初榨大豆油、精练大豆油35S启动子基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)图2E初榨菜籽油、精练菜籽油内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)图2F初榨玉米油、精练玉米油内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)图2G花生油、芝麻油、棉籽油、棕榈油、橄榄油植物内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)图3如图所示为所述的长片段核酸富集纯化装置的结构示意图具体实施例方式1.试剂(全部试剂均为生物级别或优级纯级别)1.1生物级别用水1.2CTAB裂解液:3%CTAB(w/w),1.4mmol/L氯化钠，0.2%(v/v)巯基乙醇，20咖ol/LEDTA，100mmol/LTris-HC1，pH8.01.3TE缓冲液(pH8.0):量取10mL1mol/LTris-Cl(pH8.0)和2mL0.5raol/LEDTA(pH8.0),加水定容至1000mL，分装后高压灭菌备用1.4酚氯仿异戊醇(体积比25:24:1)1.5异丙醇1.675%乙醇(v/v)1.7LA溶液1.8溴化乙锭lmg/mL1.9DNA:分子量标记物100bp-2000bp、1000-20000bp1.10琼脂糖1.1150XTAE缓冲液称取484gTris，量取114.2mL冰乙酸，200mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，溶于蒸馏水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。使用时，50倍稀释1.1210X上样缓冲液:含0.25%溴酚蓝(w/v)，0.25。/。二甲苯青FF(w/v)，30%甘油(v/v)水溶液1.13氯化镁1.14dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP1.157kDNA聚合酶1.16引物和探针引物浓度为20pmo1/L，探针浓度为20pmo1/L1.17DNA:分子量标记100bp-2000bp1.18PCR反应缓冲液1.19UNG酶2.设备和材料2.1高速冷冻离心机(最高转速18000r/min)2.2台式离心机(最高转速18000r/min)2.3微型个人离心机2.4双温水浴(37°C±1。C、65°C±1°C)2.5制冰机2.6电热恒温鼓风干燥箱或其它干燥设备2.7冰箱(2°C8°C、-20°C)2.8超纯水发生器(分子生物学级别)2.9双蒸水器2.10生物安全柜2.11高压灭菌锅2.12核酸真空干燥系统2.13核酸蛋白分析仪2.14凝胶成像分析系统2.15电泳仪2.16电泳槽2.17实时荧光定量PCR仪2.18基因扩增仪2.19PCR反应管200PL2.20超净工作台2.21微量可调移液器及配套吸头(2.5PL10PL、2叱20PL、10叱100叱、50PL200PL、100叱1000HL、500|-iL5000PL)。2.22离心管(1.5mL、2mL、15mL、50mL)。2.23表面皿(直径15cm-20cm)3.实验方法3.1食用油脂中极性成分的萃取取50mL离心管4支，每支分别加入25mL双蒸水;每支分别加入25mL油样(棕榈油需加入适量正己烷，使其在室温下呈溶解状态)，充分震荡2min(约300次)，10OOOXg室温离心5min，弃取上层油液；再次加入油样，同上震荡、离心，并弃上层油液；同上述操作反复萃取至下层水相尽量浑浊，在萃取过程中，必须采取离心等方法去除油水界面物质，根据下层水相浑浊程度分多次共需萃取初榨大豆油约400mL-600mL、初榨菜籽油约700niL-1000mL、初榨玉米油约700mL-lOOOmL、各种精练油约2000-3000mL、花生油、芝麻油等约400mL-600mL、棕榈油600mL-800mL。样品极性成分过低可适当增加样品量。3.2萃取液的浓縮全部转移萃取液(下层水相)分多次置一表面皿中，于电热恒温鼓风干燥箱或其它干燥设备内，充分干燥。3.3食用油脂中DNA的粗提3.3.1初榨油脂(植物油)中的DNA粗提3.3.1.1初搾大豆油中DNA的粗提取预热至约80-90°CCTAB提取液8_10mL，分多次小心洗下表面皿上干燥的萃取物，吸取洗下的萃取物转移至15mL离心管。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7500Xg室温离心10min;分别小心吸取上清至另一15mL离心管，再次加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，操作同上，小心吸取上清，上清加入0.2至0.3倍体积的预冷异丙醇，充分上下倒置混匀，置0卩约20-40min后10000-12500Xg，4。C离心6min，沉淀置0。C待用；上清于27000-30000Xg，4'C离心10min，弃取上清，沉淀加入500PL70%_80%预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27000-30OOOXg，4。C离心5rain，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥；上述10000-12500Xg离心所获沉淀加入约1200uL70%-80%预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27000-30OOOXg，4。C离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。取预热至约80-90°CTE缓冲液溶解干燥提取物，此为初榨大豆油DNA粗提物。3.3.1.2初榨菜籽油中DNA的粗提取预热至约80-9CTCCTAB提取液8-10mL，分多次洗下表面皿上干燥的萃取物，吸取洗下的萃取物转移至15mL离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s,7500Xg室温离心lOmin;上清按1/10体积加入3MNaAc，混匀，加入LA溶液，混匀，加入等体积异丙醇，混匀，-2(rC静置约40min-60min后，27000-30OOOXg，4'C离心10min，弃取上清，沉淀加入500uL70%-80%预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27000-30000Xg，4。C离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。加入适量预热至约80-9(TC的TE缓冲液充分溶解干燥提取物，此为初榨菜籽油DNA粗提物。3.3.1.3初榨玉米油中DNA的粗提同初榨菜籽油。3.3.1.4各种精练油中DNA的粗提同初榨菜籽油。3.3.1.5花生油、芝麻油、棕榈油等油脂中DNA的粗提同初搾菜籽油。3.4粗提DNA的纯化按2iiL上样缓冲液/15uL样品的比例加入IOX上样缓冲液(含指示染料)于DNA粗提物，混匀。利用特制的长片段核酸富集纯化装置，按操作说明纯化并收集纯化液。如图所示为所述的长片段核酸富集纯化装置的结构示意图。该装置包括一个透明的筒状主体l，在两端开口端口通过密封胶盖8包覆半透膜2，在筒状主体上设有取液孔3和加样槽4，取样孔3带有胶塞5。在加样槽下方的部分筒状主体内充填有琼脂糖凝胶，而取液孔下方的部分筒状主体保持为空腔，用作注入电泳缓冲液。具体的操作说明如下(a)电泳槽加入电泳缓冲液；(b)打开核酸富集纯化装置取液孔胶塞5，用一次性滴管加电泳缓冲液于取液孔内，至加满，盖紧取液孔胶塞；(c)将核酸富集纯化装置浸入电泳槽内电泳缓冲液中；(d)待纯化核酸与上样缓冲液(含指示染料)混匀后，加入到加样槽，打开电源，按10V/cm调整电压，并通电；指示染料的分子量比目标核酸的分子量稍小。(e)待指示染料条带全部进入取液孔下方缓冲液中(即或继续电泳30-60min)，从电泳槽取下富集纯化装置，打开取液孔胶塞，用另一支一次性滴管吸出取液孔内全部液体，加入少量电泳缓冲液于取液孔内，反复小心吸排冲洗后吸出；当指示染料条全部进入取液孔下方缓冲液中时，表明分子量比染料的分子量小的DNA等杂质巳从凝胶进入到取液孔下方的缓冲液中，并且由于半透膜的截留，这些杂质停留在取液孔下方的缓冲液中，弃去这部分缓冲液，则去除了分子量比目的DNA小的杂质。(f)重新注满电泳缓冲液于取液孔内，盖紧取液孔胶塞，重新放入电泳槽中，继续通电，约5-6小时(可适当延长时间)后，关闭电源；(g)打开取液孔胶塞，用另一支干净的一次性滴管吸出取液孔下方全部液体，于一支1.5mL或2mL离心管，加入少量电泳缓冲液于取液孔内，反复小心吸排冲洗后吸出并同样转移至该离心管，尽量控制总体积在1.6mL内；混匀上述(g)步骤收集的液体釆用酚/氯仿法再次抽提。具体方法为加入等体积酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7500Xg室温离心10min;分别小心吸取上清至另一1.5mL离心管，按1/10体积加入3MNaAc，混匀，加入LA溶液，混匀，加入等体积异丙醇，混匀，-20。C静置约40min-60min后，27000-30000Xg，4。C离心10rain，弃取上清，沉淀加入500yL70%-80%预冷的乙醇，充分上下倒置混匀以清洗沉淀，27000-30000Xg，4'C离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。取预热至约80-90°CTE缓冲液30-50uL充分溶解干燥提取物，此即为DNA纯化产物。3.5DNA含量的测定吸取5uLDNA纯化产物，适当稀释，选择0.D.值在0.4-0.8之间读数，计算DNA浓度，调整DNA浓度为100ng/pL，PCR待用。3.6内源基因的PCR检测经上述操作所获得的DNA必须利用普通PCR或荧光PCR实验检测到其相应的内源基因，方可确定提取到适用的DNA，并可进一步进行下游实验。3.6.1普通PCR定性检测3.6.1.1普通PCR定性检测所用引物序列及反应参数普通PCR定性检测所用引物序列及反应参数见表1表l普通PCR定性检测所用引物序列及反应参数<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>试剂反应体系中的终浓度注UNG酶在活化条件下可以降解含有dU的双链或单链DNA。在PCR扩增反应液中加入UNG酶，可以有效防止以前以dUTP代替dTTP合成的PCR扩增产物所致的遗留污染。实验室如果选择采用UNG酶作为防止污染措施，可在每次PCR反应的反应休系中以dUTP代替dTTP并加入UNG酶；否则，反应体系中不必加入UNG酶，dNTP溶液为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物。3.6.1.3PCR产物的凝胶电泳检测制备2%的琼脂糖凝胶，按常规电泳方法，以100bpLadderDNAMarker作为分子量标记，进行电泳。电泳后，利用凝胶成像仪观察特异性泳带的出现，并拍摄作成像记录。3.6.2实时荧光PCR定性检测3.6.2.1实时荧光PCR定性检测所用引物序列和探针序列实时荧光PCR定性检测所用引物序列和探针序列见表3表3实时荧光PCR所用引物和探针序列<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>试剂反应体系中的终浓度注UNG酶在活化条件下fiJ以降解含有dU的双链或单链DNA。在PCR扩增反应液中加入UNG酶，可以有效防止以前以dLlTP代替dTTP合成的PCR扩增产物所致的遗留污染。实验室如果选择采用UNG酶作为防止污染措施，可在每次PCR反应的反应体系中以dUTP代替dTTP并加入UNG酶；否则，反应体系中不必加入UNG酶，dNTP溶液为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物。3.6.2.3实时荧光PCR反应参数实时荧光PCR反应参数见表5。使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整。表5实时荧光PCR反应参数1)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注反应休系中不使用UNG酶时，反应参数仍按照表中条件。3.6.2.4仪器检测通道的选择设置PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。4结果判断4.1普通PCR结果判断参比DNA分子量标记物，根据凝胶成像仪所观察到的样品DNA的PCR产物特异性泳带的出现，确定利用本方法提取到适用于PCR的DNA。4.2荧光PCR结果判断根据常规实时荧光PCR要求，设定基线和阈值阳性参比相应内源基因扩增结果均Ct《40;试剂空白和阴性参比相应内源基因扩增结果均Ct>40或45(根据PCR时所设定的循环数而定)。样品DNA相应内源基因扩增结果Ct《40或45(根据PCR时所设定的循环数而定)，确定利用本方法提取到适用于PCR的DNA。权利要求1.一种提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步骤进行(1)食用油脂中极性成分的萃取采用水作为萃取剂分多次对食用油脂进行萃取，并用离心的方法进行油液分离；(2)萃取液的浓缩全部转移萃取液于电热恒温干燥设备或其它干燥设备内，充分干燥；(3)食用油脂中DNA的粗提；(4)粗提DNA的纯化。2.根据权利要求l所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特征在于在步骤(1)的萃取过程中，采用离心方法去除油水界面物质。3.根据权利要求l所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特征在于在步骤(1)中，共需萃取初榨大豆油400mL-600mL、或初搾菜籽油约700raL-1000mL、或初搾玉米油约700mL-1000mL、或者花生油、芝麻油400mL-600mL、或者棕榈油600mL-800mL。4.根据权利要求l所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特征在于当待测油脂为初搾大豆油时，步骤(3)中DNA的粗提按照以下方法进行取预热至约80-90°CCTAB提取液8-10mL，分多次小心洗下表面皿上千燥的萃取物，吸取洗下的萃取物转移至15mL离心管。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7500Xg室温离心10rnin;分别小心吸取上清至另一15mL离心管，再次加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，操作同上，小心吸取上清，上清加入0.2至0.3倍体积的预冷异丙醇，充分上下倒置混匀，置(TC约20-40min后10000-12500Xg，4'C离心6min，沉淀置0。C待用；上清于27000-30OOOXg，4。C离心10min，弃取上清，沉淀加入500yL70%-80%预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27000-30000Xg，4。C离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥；上述10000-12500Xg离心所获沉淀加入约1200"L70%-80%预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27000-30OOOXg，4。C离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。5.根据权利要求1所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特征在于当待测油脂为初搾菜籽油、玉米油、花生油、芝麻油、棕榈油、棉籽油或各种精炼油等时，歩骤(3)中DNA的粗提按照以下方法进行取预热至约80-9(TCCTAB提取液8-10mL，充分溶解干燥的萃取物于15mL离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s，7500Xg室温离心10min;上清按1/10体积加入3MNaAc，混匀，加入LA溶液，混匀，加入等体积异丙醇，混匀，-20°<:静置约40min-60min后，27000-30OOOXg，4。C离心10min，弃取上清，沉淀加入500UL70%-80%预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27000-30000Xg，4。C离心5rain，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。6.根据权利要求1所述的提取食用油脂中核酸的方法，其特正在于所述步骤(4)粗提DNA的纯化利用特制的长片段核酸富集纯化装置来进行，该长片段核酸富集纯化装置包括一个筒状主体(1)，在两端开口端口包覆半透膜(2)，在筒状主体上设有取液孔(3)和加样槽(4)，取样孔(3)带有胶塞(5)，在加样槽下方的部分筒状主体内充填有琼脂糖凝胶(6)，而取液孔下方的部分筒状主体保持为空腔(7)，用作注入电泳缓冲液；所述的装置具体的操作方法如下(a)电泳槽加入电泳缓冲液；(b)取液孔下方的部分筒状主体的空腔加满电泳缓冲液，并盖紧取液孔胶塞；(C)将核酸富集纯化装置浸入电泳槽内电泳缓冲液中；(d)待纯化核酸与上样缓冲液(含指示染料)混匀后，加入到加样槽，并通电；(e)待指示染料条带全部进入取液孔下方缓冲液中，弃去取液孔下方的缓冲液；(f)重新注满电泳缓冲液于取液孔下方的空腔，盖紧取液孔胶塞，重新放入电泳槽中，继续通电电泳，收集取液孔下方空腔的缓冲液进行酚氯仿抽提。全文摘要本发明公开了一种提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步骤进行(1)食用油脂中极性成分的萃取，采用水作为萃取剂，用离心的方法进行油液分离；(2)萃取液的浓缩，全部转移萃取液于电热恒温干燥设备或其它干燥设备内，充分干燥；(3)食用油脂中DNA的粗提；(4)粗提DNA的纯化。本方法适用于初榨大豆油、菜籽油、玉米油，精炼大豆油、菜籽油、玉米油、多种调和油，以及花生油、芝麻油、橄榄油、棉籽油、棕榈油等食用油脂的适用于PCR或相应下游实验的DNA的提取。文档编号C12N15/10GK101348784SQ20081002911公开日2009年1月21日申请日期2008年6月30日优先权日2008年6月30日发明者万宇平,何方洋,李丹宁,钟国强,钟玉清,高东微申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心;北京望尔生物技术有限公司