用于沙门菌、副溶血弧菌和大肠杆菌O₁₅₇:H₇多重荧光PCR同步检测的引物和探针序列的制作方法

专利名称：：用于沙门菌、副溶血弧菌和大肠杆菌O₁₅₇:H₇多重荧光PCR同步检测的引物和探针序列的制作方法用于沙门菌、副溶血弧菌和大肠杆菌0157:H7多重荧光PCR同步检测的引物和探针序列
技术领域：
：本发明涉及一种用于沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H7三种致病菌核苷酸片段多重荧光PCR同步检测的引物和探针序列。
背景技术：
：沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H7是重要的食源性致病菌，主要通过污染的动物源性食品如水产品等感染人类、导致食物中毒、肠伤寒、尿毒症等，严重时可导致死亡。因此，这三种致病菌备受关注，是我国乃至世界多数发达国家对进出境水产品等动物源性产品必须检验或监控的致病菌。水产品是我国出口欧美的主要农产品，多年来为我国的出口创汇作出了很大贡献。随着世界各国对食品安全的高度重视，各国对进口食品包括水产品的检测要求越来越高，往往需同时检测沙门氏菌、副溶血性弧菌等多种致病菌。然而，目前尚未有能同时检测水产品中多种致病菌的方法与相关标准。虽然关于这三种致病菌的检验有各种快速检测方法，如免疫磁株富集法、酶联免疫吸附法、自动酶联免疫荧光法、显色培养基法、DNA探针技术、PCR技术等，但由于这些方法存在这样或那样的缺点而未得到广泛推广，事实上，我国相关部门对水产品致病菌的检验基本还停留在传统的细菌分离培养上，不但费时，往往需要47天时间，还可能因操作繁杂，所用试剂多而导致漏检。2005年17月我国输美水产品就有11批次因被美国FDA检出沙门氏菌而被扣留，给企业造成了较大经济损失。因此，在水产品检验中迫切需要一种可同时检测多种致病菌的快速、简便、准确、高效、经济的检验方法。实时荧光PCR(RealTimePCR，)技术是近年发展起来的新技术，它不仅具有快速、简便、灵敏等优点，3而且由于该法采用引物和探针的"双保险"，因此特异性更强。由于实时荧光PCR不但可以检测单一的病原菌，而且能实现多种病原菌的同步检测，因此更经济更省力也更快速。故实时荧光PCR已成为检测领域越来越重要的一种检测手段。
发明内容本发明的目的是提供一种用于同步检测沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H7三种致病菌核苷酸片段的引物探针序列。引物序列包括<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>基于上述目的，木发明采用以下具体实施方案利用多通道荧光PCR仪可同时分别检测多种荧光素的特点，将检测上述三种致病菌核苷酸基因片段相应的探针分别标记不同的荧光报告基团，经过反复试验，优化多重荧光PCR反应体系和反应参数，建立了可同步检测水产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H7三种致病菌的多重荧光PCR检测方法。再根据已建立的检测方法，配制方便使用的检测试剂盒。通过采用该检测试剂盒及检测方法，便可简便快速、特异灵敏地检测水产品中上述三种致病菌。基于本发明研制的水产品致病菌多重荧光PCR检测试剂盒包括下列试剂1)DNA提取液1管，内装TE液，pH8.0;2)PCR反应液1管，内装荧光PCR反应液，包括％《酶、dNTP、含Mg2+的Buffer;3)引物探针1管，内装沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H73对引物探针。4)阳性对照模板1管,内装适当浓度的沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H7三种致病菌的DNA。5)阴性对照模板l管，内装经传统检测方法证实无沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H7污染的水产品样品增菌6h后提取的DNA。6)去离子水1管，内装无DNA酶的灭菌去离子水。基于木发明建立的多重荧光PCR检测方法，按下列步骤进行1)样品的处理与DNA模板的提取取样品25g，用3。/。NaCl缓冲蛋白胨水制成l:IO匀浆，置36'C士rC培养6h，取增菌液lmL,加入1.5mL灭菌离心管中，14000rpm离心10min，吸去上清液，加入0.8mLDNA提取液混匀，14000卬m离心10min，吸去上清液，加入50pL去离子水，震荡混匀，沸水浴10min，冰浴5min，13000rpm离心5min，取上清液为样品DNA模板，保存于fC。2)试剂配制将试剂从冰箱取出后，置室温融化，2000rpm离心10sec。根据样品数按下表计算试剂用量。试剂名称反应液.引物探针用量ML10xn8xnn=l(阴性对照)+1(阳性对照)+样品数+0.5(损耗)将计算好的试剂加入一适当体积离心管中，混匀后，2000rpm离心10sec。向每个设定反应孔加入18mIV孔。3)加样将阳性对照模板、阴性对照模板和样品DNA模板分别加入反应孔，2pL/孔。用反应膜封住反应孔，置于荧光PCR仪上检测。4)反应参数设置选择多通道检测模式，在CY5，Fam和Hex通道上打v，设置反应参数为95°C5min;95°C，10s，60°C，30s(分别检观UCY5_沙门氏菌，Fam—大肠杆菌0157:H7，Hex—副溶血性弧菌荧光信号)，4045个循环。5)结果判断(1)质控标准——阴性对照无Ct值，且无扩增曲线；——阳性对照Ct<30，且扩增曲线明显呈对数增长。——如阴性和阳性对照不能满足以上条件，则实验视为无效。(2)判定和报告——无Ct值，且无扩增曲线，判为阴性结果，可报告25g样品中未检出相应的致病菌。——Ct值〈35，且扩增曲线明显呈对数增长，判为阳性结果。——Ct值45，判为可疑，应重复试验一次，如Ct值仍-35，且扩增曲线明显呈对数增长的，则判为阳性；或延长样品增菌培养时间4h以上，再重新检测。本发明的优点1木发明提供的引物探针的检测灵敏度可达10cfo/反应体系，对样品增菌6h后，对样品的检测灵敏度可达10cfU/25g，说明其具有良好的灵敏度。2本发明提供的引物和探针对不含有目的菌的样品均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。3由于木发明采用多重荧光PCR技术，实现同步检测三种致病菌，大大减少了工作量，节省了检测试剂，降低了检测成木。4基于本发明研制的水产品致病菌多重荧光PCR检测试剂盒可方便检测使用。图1是利用本发明涉及的检测试剂盒及检测方法检测阳性和阴性样品的沙门氏菌扩增曲线图2是利用木发明涉及的检测试剂盒及检测方法检测阳性和阴性样品的副溶血性弧菌扩增曲线图3是利用本发明涉及的检测试剂盒及检测方法检测阳性和阴性样品的大肠杆菌0157:H7扩增曲线图。具体实施方式实施例检测试剂盒水产品致病菌(沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H7)多重荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒可供20份水产样品检测。具体组成如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>样品1:人为添加适当浓度的沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H7三种致病菌的虾仁。样品2:经SN标准检测证实无沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H7三种致病菌的虾仁。检测步骤应用上述试剂盒和样品进行检测。1)样品的处理与DNA模板的提取取上述虾仁25g，加入3。/。NaCl缓冲蛋白胨水225mL，制成l:IO匀浆，置36'C士rC培养6h，取增菌液lmL，加入1.5mL灭菌离心管中，14000rpm离心10min，吸去上清液，加入0.8mLDNA提取液混匀，14000rpm离心10min，吸去上清液，加入50[iL去离子水，震荡混匀，沸水浴10min，冰浴5min，13000rpm离心5min，取上清液为待测样品DNA模板。2)试剂配制将试剂从冰箱取出后，置室温融化，2000rpm离心10sec。按下表计算试剂用量。试剂名称PCR反应液.引物探针用量mL10x4.58x4.5n=l(阴性对照)+1(阳性对照)+2(样品数)+0.5(损耗)将45^LPCR反应液和36mL引物探針分別加入1.5mL离心管中，混匀后，2000rpm离心10sec，分别向设定的阳性反应孔、阴性反应孔和样品反应孔中加入18mIV孔。3)加样将阳性对照模板、阴性对照模板和样品DNA模板分别加入对应的反应孔，2pL/孔。用反应膜封住反应孔，置于多通道荧光PCR仪上检测。4)反应参数设置选择多通道检测模式，在CY5，Fam和Hex通道上打v，设置反应参数为95°C5min;95°C，10s，60°C，30s(分别检测CY5_沙门氏菌，Fam—大肠杆菌O^H7，Hex—副溶血性弧菌荧光信号)，40个循环。5)试验结果(1)质控标准—一阴性对照均无Ct值，且无扩增曲线；——阳性对照沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H7阳性对照Ct值分别为27.34，19.86，27.51，且扩增曲线明显呈对数增长。详见图1图3。阴性和阳性对照满足质控标准，实验有效，可进行结果判定。(2)判定和报告样品编号菌名ct值结果判定1沙门氏菌21.94阳性副溶血性弧菌18.72阳性大肠杆菌0157:H724.92阳性2沙门氏菌-阴性副溶血性弧菌-阴性大肠杆菌0157:H7-阴性8权利要求1.一种用于沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌O157:H7三种致病菌核苷酸片段多重荧光PCR同步检测的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括2.—种用于沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌0157:H7三种致病菌核苷酸片段多重荧光PCR同步检测的探针序列，其特征在于所述的探针序列包括<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>全文摘要一种用于沙门氏菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌O₁₅₇:H₇三种致病菌核苷酸片段多重荧光PCR同步检测的引物和探针序列。引物序列为(见图)。文档编号C12Q1/10GK101440391SQ20081002924公开日2009年5月27日申请日期2008年7月4日优先权日2008年7月4日发明者林彩华,林志雄,颖蔡,许如苏,陈其生,陈冠武申请人:中华人民共和国汕头出入境检验检疫局被以下专利引用(2),