抗病毒免疫的方法和组合物的制作方法

专利名称：：抗病毒免疫的方法和组合物的制作方法
技术领域：
：本发明通常涉及部分糖基化的病毒多肽，其用于产生可有效抗病毒的有效的、广泛反应性的免疫原性组合物。具体而言，本发明涉及利用单糖基化的流感病毒血凝素(HA)肽产生的疫苗，该疫苗表现出抗流感病毒的有效活性。本发明涉及包含糖蛋白的药物组合物和由其产生的疫苗，以及涉及利用去糖基化的HA多肽预防和治疗流感病毒感染的方法。
背景技术：
：在真核生物中，糖残基通常与四种不同的氨基酸残基连接。这些氨基酸残基被分成0-连接的(丝氨酸、苏氨酸和羟基赖氨酸)和N-连接的(天冬酰胺)。0-连接的糖在高尔基体或糙面内质网(ER)中由核苷酸糖合成。N-连接的糖由共同的前体合成，然后被加工。已知添加N-连接的碳水化合物链对于糖蛋白的折叠稳定、防止在内质网中降解、寡聚化、生物学活性和运输至关重要。将N-连接的寡糖添加到特定的Asn残基在调节病毒成熟蛋白的活性、稳定性或抗原性中起着重要作用(OpdenakkerG.etalFASEBJournal7,1330-13371993)。还认为N-连接的糖基化是糖蛋白的折叠、运输、细胞表面表达、分泌(Helenius,A.,MolecularBiologyoftheCell5,253-2651994)、保护免受蛋白水解降解和增加糖蛋白溶解性(Domsetal.,Virology193,545-5621993)所必需的。病毒的表面糖蛋白不仅是蛋白正确折叠所必需的，而且还作为“聚糖盾牌”提供针对中和抗体的保护。因此，强烈的宿主特异性选择通常与可能的N-连接糖基化的密码子位置相关。因此N-连接的糖基化位点在菌株和进化枝间趋向于保守。有三种主要类型的流感病毒:甲型、乙型和丙型。甲型流感病毒菌株能导致严重的疾病，并且是能导致人类流行性的唯一类型。H5N1菌株是甲型流感病毒。乙型菌株导致偶发的人类病症和小规模的爆发。丙型菌株仅很少导致人类感染，并且不会导致大规模的爆发。在甲型流感病毒中，只有H1、H2和H3亚型易于在人类之间传播。甲型流感病毒的爆发持续引起世界范围内的广泛的发病率和死亡率。仅美国，估计每年就有5%至20%的人口受到甲型流感病毒的感染，导致大约200，000人住院和36，OOO人死亡。广泛的疫苗接种策略的建立是限制流感发病率的有效措施。然而，病毒频繁的遗传漂移需要每年都要重新配制疫苗，这可能会导致疫苗中存在的病毒菌株和流通的病毒菌株之间发生错配。因此，针对流感病毒的抗病毒疗法是限制疾病严重性和传播的重要工具。自从2003年至今，高致病性H5N1流感病毒已在家禽和野生禽类中引起爆发(LiKSetal.(2004)Nature430:209-213)。自2010年2月起，这些病毒不仅感染了禽类而且还感染了超过478个人,其中286例被证实是致命的(www.who,int/csr/disease/avianinfluenza/country/casestable20100217/en/index,html)。高致病性H5N1和2009猪源性甲型流感(HlNl)病毒导致全球爆发，并引起对病毒中可能发生的其他改变会导致致命的流行性的强烈关注(GartenRJ,etal.(2009)Science325:197-201,NeumannG，etal.(2009)Nature459:931-939)。更关注流感病毒可能会获得在人之间有效传播的能力，进而成为流行性威胁。流感疫苗因而一定是任何流行性应对计划不可或缺的部分。流感病毒被划分为负链RNA病毒，且属于正粘病毒家族。甲型流感病毒由9种结构蛋白组成，并额外编码一种具有调节功能的非结构NSl蛋白。非结构NSl蛋白在生殖周期过程中大量合成，并定位在受感染细胞的胞液和细胞核中。在不同的病毒菌株混合感染细胞的过程中，病毒基因组的节段性特性允许发生遗传重组机制(基因组节段的交换)。根据展示在其表面上的不同的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)病毒蛋白，可进一步将甲型流感病毒分类成不同的亚型。甲型流感病毒亚型通过两种病毒表面糖蛋白来鉴定，即血凝素(HA或H)和神经氨酸酶(NA或N)。每种流感病毒亚型通过其H和N蛋白的组合来鉴定。有16种已知的HA亚型和9种已知的NA亚型。甲型流感病毒可以感染人、禽、猪、马和其他动物，但是野生禽类是这些病毒的天然宿主。目前只有一些甲型流感亚型(即H1N1、H1N2和H3N2)在人之间传播，但是16种H亚型和9种NA亚型的所有组合均在禽类中，尤其在野生水鸟和滨鸟中鉴定到。此外，越来越多的证据表明H5和H7流感病毒还可以弓I起人类疾病。甲型流感病毒的HA包含两段结构不同的区域，即球状头区和茎区。球状头区包含受体结合位点，其负责病毒附着于靶细胞和参与HA的血细胞凝集活性。茎区包含融合肽，其是病毒包膜和细胞内体膜之间的膜融合所必需的，并因此涉及融合活性(Wileyetal.，Ann.Rev.Biochem.，56:365-394(1987))。对了解流感感染的重要贡献来自对血凝素(HA)的研究，血凝素是与呼吸道中的特定唾液酸化的聚糖受体结合，从而允许病毒进入细胞的病毒衣壳糖蛋白(KuikenT，etal.(2006)Science312:394-397；MainesTR,etal.(2009)Science325:484-487；SkeheIJJ,WileyDC(2000)AnnRevBiochem69:531-569；vanRielD,etal.(2006)Science312:399-399)。为了跨越物种障碍和感染人群，禽类HA必须改变其受体结合偏好性，从包含a2，3(禽类)-连接的唾液酸基序的末端唾液酸化的聚糖变成包含a2，6(人类)-连接的唾液酸基序(ConnorRJ,etal.(1994)Virology205:17-23)，并且如同在1918年的流行性中(TumpeyTM,etal.(2007)Science315:655-659),该转变可能仅通过两次突变而发生。因此，了解影响流感病毒与聚糖受体结合的因素是开发控制具有流行性潜能的流感菌株在将来可发生任何转型的方法的关键。为了满足制备能诱导抗H5N1流感病毒不同菌株的有效中和抗体的候选流感疫苗的需要，基于共有H5N1血凝素(HA)序列的疫苗能诱发中和一组已用多种H5N1进化枝的HA进行假性处理的病毒体的抗体。(ChenMW,etal.(2008)ProcNatlAcadSciUSA105:13538-13543)。HA是同源三聚体跨膜蛋白，具有由球状头区和茎区组成的胞外结构域(KuikenT,etal.(2006)Science312:394-397)。两个区域均携带N-连接的寡糖(KeilW，etal.(1985)EMBOJ4:2711-2720)，该寡糖影响HA的功能特性(ChenZY,etal.(2008)Vaccine26:361-371；OhuchiR,etal.(1997)JVirol71:3719-3725)。在甲型流感病毒的不同亚型中，头区的糖基化位点有广泛的变异，而茎区的寡糖更保守，且为融合活性所需(OhuchiR，etal.(1997)JVirol71:3719-3725)。抗原肽表位附近的聚糖干扰抗体识别(SkehelJJ,etal.(1984)ProcNatlAcadSciUSA81:1779-1783)，HA的蛋白水解激活位点附近的聚糖调节切割，并影响流感病毒的感染力(DeshpandeKL,etal.(1987)ProcNatlAcadSciUSA84:36-40)。HA糖基化位点的突变缺失能影响病毒的受体结合(GuntherI，etal.(1993)VirusRes27:147-160)。糖基化位点处或附近的肽序列的改变可以改变HA的3D结构，并因此改变其受体结合特异性和亲和力。的确，来自不同H5N1亚型的HA具有不同的聚糖结合模式(StevensJ，etal.(2008)JMolBiol381:1382-1394)。在整个病毒系统中研究了Hl和H3上的糖基化位点的诱变(ChandrasekaranA,etal.(2008)NatBiotechnol26:107-113；DeomCM,etal.(1986)ProcNatlAcadSciUSA83:3771-3775)。然而，还不了解糖基化的改变如何影响受体结合特异性和亲和力，尤其对于大多数致病性H5N1HA来说。自从制备出来开始，流感疫苗必须每年都改变，因为，血凝素的非高糖基化区域或非糖基化区域一直在突变以逃避宿主的免疫系统。针对异源病原体的疫苗设计的目标是鉴定和设计有效且广泛保护性的抗原。就流感而言，过去大量的工作针对保守线性序列和区域的实验测定，但是成绩较小。导致这些失败的可信服的理由是有关这方面知识的缺乏，即在真正感染的条件下，针对抗原性测试颗粒的集中应答是用于中和病原体上的抗原的真正有效的位点。发明概述具体而言，需要可在疫苗产生过程的设计和确认中使用的交叉中和单克隆抗体，所述设计和确认维持或增强目前和将来制备的疫苗中的交叉中和表位的质量和抗原性。假设与疫苗结合的抗体反映出结构完整性和抗原潜能，可以评价交叉中和抗体，例如去糖基化的HA多肽与这种疫苗加工衍生物的结合，从而定量地评价它们的交叉中和潜能。为了使对这些通用表位的应答最大化，可以制备衍生物，以增强对这些通用表位的免疫原性。按照本发明，公开了利用这些原理的疫苗。抗原通过以下产生:从病毒糖蛋白部分地去除糖以暴露糖基化位点(其是高度保守的，并且不会突变或不会激烈突变)，同时保留足够的糖，以保持所述糖蛋白的三级结构。部分糖基化的病毒糖蛋白通过所述糖蛋白的部分去糖基化，使得特定糖基化位点保留一个、两个或三个糖单元而产生。在某些方面，可以通过在一个或多个特定糖基化位点提供去糖基化的蛋白或多肽，并使该糖基化位点连接一个、两个或三个糖来产生部分糖基化的糖蛋白。公开了包含至少一种部分糖基化的HA、NA或M2糖蛋白和药物可接受的载体的疫苗。在一些实施方案中，所述部分糖基化的HA糖蛋白选自部分糖基化的流感病毒H1、H3和H5。在一些实施方案中，所述部分糖基化的HA糖蛋白是在H5HA的第39位、第127位、第170位、第181位、第302位、第495位和第500位的一个或多个位置中的天冬酰胺残基处糖基化。在一些实践中，所述天冬酰胺残基位于第177位。公开了包括向易患流感的个体给予疫苗的方法，所述疫苗包含至少一种去糖基化的HA糖蛋白和药物可接受的载体。在一些实施方案中，所述去糖基化的HA糖蛋白选自H1、H3和H5。在一些实施方案中，所述去糖基化在糖蛋白的一个或多个糖基化位点保留单糖基化(留下I个糖)。在一些实施方案中，所述去糖基化在糖蛋白的一个或多个糖基化位点保留二糖基化(留下2个糖)。在一些实施方案中，所述去糖基化在糖蛋白的一个或多个糖基化位点保留三糖基化(留下3个糖)。在一些实施方案中，所述去糖基化在糖蛋白的至少一个糖基化位点保留单糖基化、二糖基化和三糖基化中的至少一种。本发明涉及用于引发对病毒、细菌、真菌或其他来源的病原体的免疫应答的免疫原性组合物，所述组合物包含:来自病毒、细菌、真菌或其他来源的病原体的抗原糖蛋白，其中所述糖蛋白是部分糖基化的。在一些方面中，所述病原体是病毒，且所述部分糖基化的抗原是病毒、病毒样颗粒、病毒肽、蛋白、多肽、或来自病毒的片段、或部分包含病毒蛋白序列的融合蛋白。所述病毒选自流感病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、衣原体、腺病毒科、哺乳动物腺病毒属、禽腺病毒属、疱疫病毒科、单纯疱疫病毒1、单纯疱疫病毒2、单纯疱疫病毒5、单纯疱疫病毒6、光滑病毒科、轻小病毒属、肠杆菌曬菌体MS2、allolevirus、痘病毒科、脊椎动物痘病毒亚科、副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属、软疣痘病毒属、昆虫痘病毒亚科、乳头多瘤空病毒科、多瘤病毒属、乳头多瘤空病毒属、副粘病毒科、副粘病毒属、副流感病毒1、麻疹病毒属、麻疹病毒、腮腺炎病毒属、腮腺炎病毒、肺病毒亚科、肺病毒属、偏肺病毒属、禽肺病毒属、人类偏肺病毒属、小核糖核酸病毒科、肠病毒属、鼻病毒属、肝病毒属、人类甲型肝炎病毒、心病毒属、andapthovirus>呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、质型多角体病毒属、斐济病毒属、植物呼肠孤病毒属、水稻病毒属、逆转录病毒科、B型哺乳动物逆转录病毒属、C型哺乳动物逆转录病毒属、C型鸟逆转录病毒属、D型逆转录病毒组、BLV-HTLV转录病毒属、慢病毒属、人类免疫缺陷病毒1、人类免疫缺陷病毒2、HTLV-1和HTLV-1I病毒、SARS冠状病毒属、单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒属、肝炎病毒(HCV、HAV、HBV、HDV、HEV)、刚地弓形虫病毒、梅毒螺旋体病毒、人类T淋巴细胞病毒、脑炎病毒、西尼罗病毒、登革病毒、水痘-带状疱疹病毒、麻疹、腮腺炎、风疹、泡沫病毒属、黄病毒属科、丙型肝炎病毒、肝DNA病毒科、乙型肝炎病毒、披膜病毒科、甲病毒属辛德比斯病毒、风疫病毒属、风疫病毒、弹状病毒科、水疱性病毒属、狂犬病病毒属、短暂热病毒属、质型弹状病毒属、核型弹状病毒属、沙粒病毒科、沙粒病毒属、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、伊派病毒、拉沙病毒、冠状病毒科、冠状病毒属和凸隆病毒属。病毒肽、蛋白、多肽或其片段选自流感病毒神经氨酸酶、流感病毒血凝素、人类呼吸道合胞体病毒(RSV)病毒蛋白、RSVF糖蛋白、RSVG糖蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)病毒蛋白、单纯疱疹病毒糖蛋白gB、gC、gD和gE、衣原体MOMP和PorB抗原、登革病毒的核心蛋白、基质蛋白或其他蛋白，麻疹病毒血凝素、单纯疱疹病毒2型糖蛋白gB、脊髓灰质炎病毒IVPUHIVl的包膜糖蛋白、乙型肝炎表面抗原、白喉毒素、链球菌24M表位、淋球菌菌毛蛋白、伪狂犬病病毒g50(gpD)、伪狂犬病病毒II(gpB)、伪狂犬病病毒III(gpC)、伪狂犬病病毒糖蛋白H、伪狂犬病病毒糖蛋白E、传染性胃肠炎糖蛋白195、传染性胃肠炎基质蛋白、猪轮状病毒属糖蛋白38、猪细小病毒衣壳蛋白、猪密螺旋体痢疾保护性抗原、牛病毒性腹泻糖蛋白55、新堡病病毒血凝素-神经氨酸酶、猪流感血凝素、猪流感神经氨酸酶、口蹄疫病毒、猪霍乱病毒、猪流感病毒、非洲猪瘟病毒、猪肺炎支原体、传染性牛鼻气管炎病毒、传染性牛鼻气管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G、传染性喉气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白1、拉克罗斯病毒的糖蛋白、新生犊牛腹泻病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、庞塔托鲁病毒、鼠白血病病毒、小鼠乳腺瘤病毒、乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或以上蛋白的片段或衍生物、马流感病毒或马疱疹病毒的抗原(包括甲型马流感病毒/阿拉斯加株91神经氨酸酶、甲型马流感病毒/迈阿密株63神经氨酸酶、甲型马流感病毒/肯塔基株81神经氨酸酶、马疱疹病毒I型糖蛋白B和马疱疹病毒I型糖蛋白D)、牛呼吸道合胞体病毒或牛副流感病毒的抗原、牛呼吸道合胞体病毒附着蛋白(BRSVG)、牛呼吸道合胞体病毒融合蛋白(BRSVF)、牛呼吸道合胞体病毒核壳体蛋白(BRSVN)、牛副流感病毒3型融合蛋白、牛副流感病毒3型血凝素神经氨酸酶、牛病毒腹泻病毒糖蛋白48和糖蛋白53、登革病毒糖蛋白E和人类丙型肝炎病毒的糖蛋白El或E2。在一些方面中，所述去糖基化的病毒抗原是单、二或三糖基化的流感病毒血凝素。在一些实施方案中，所述去糖基化的病毒抗原是选自流感病毒H1、H3和H5的单糖基化的血凝素。在一些实施方案中，所述单糖基化的流感病毒血凝素包含N-糖基化位点，所述N-糖基化位点包含天冬酰胺-Xaa-丝氨酸和天冬酰胺-Xaa-苏氨酸的的氨基酸序列，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。在一些方面中，在糖基化位点包含单个GlcNAc糖的单糖基化的血凝素对于HA-受体结合展现出特异性降低，但是亲和力增高。在一些实施方案中，所述去糖基化的病毒抗原是用N-乙酸匍糖胺(GlcNAc)和/或甘露糖二糖基化或三糖基化的流感病毒血凝素。在一些方面中，所述去糖基化的病毒抗原是用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)糖基化的单糖基化的流感病毒血凝素。在一些方面中，所述单糖基化的流感病毒血凝素包含含有共有H5HA序列(SEQIDN0:4)的多肽。在一些实施方案中，所述单糖基化的共有H5HA序列(SEQIDNO:4)在第39位、第170位、第181位、第302位和第495位的一个或多个天冬酰胺残基处糖基化。在其他方面中，所述单糖基化的流感病毒血凝素包含选自NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)序列(SEQIDNO:6)、共有Hl-A(SEQIDNO:8)和共有H1_C(SEQIDNO:10)序列的Hl多肽序列。在一些实施方案中，所述HA序列被修饰，以便能在合适的真核细胞中表达。在一实施方案中，所述单糖基化的流感病毒血凝素包含季节性Hl(布里斯班株)多肽。本发明还涉及包含免疫原性多肽并任选地包含佐剂的疫苗，所述免疫原性多肽包含去糖基化至单糖基化、二糖基化或三糖基化状态的病毒糖蛋白，其中所述疫苗能诱发抗呼吸病毒的免疫应答。在一些实施方案中，所述呼吸病毒是流感病毒，且病毒糖蛋白是血凝素(HA)。在一些方面中，所述流感病毒选自禽流感病毒和季节性流感病毒。在一些实施方案中，所述禽流感病毒是H5N1。在一些实施方案中，所述流感病毒是甲型流感病毒。一方面，所述病毒是呼吸道合胞体病毒(RSV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是SH(小疏水性)糖蛋白的单糖基化、二糖基化或三糖基化的RSVF(融合)，G(附着)，或其免疫原性片段。在一些实施方案中，所述单糖基化的RSVG蛋白序列(SEQIDNO:12)是在表6所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分糖基化。—方面，所述病毒是黄病毒属，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的登革病毒包膜糖蛋白M、糖蛋白E或以上蛋白的免疫原性片段。在一些实施方案中，所述单糖基化的登革病毒包膜糖蛋白E(SEQIDNO:13)是在表7所示的N-糖基化位点N67和N153中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分糖基化。一方面，所述病毒是丙型肝炎病毒，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1、糖蛋白E2或以上蛋白的免疫原性片段。在一些实施方案中，所述单糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白El(SEQIDNO:14)是在表8所示的N-糖基化位点N196、N209、N234、N305和N325中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分糖基化。一方面，其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20、跨膜糖蛋白gp41或以上蛋白的免疫原性片段。在一些实施方案中，所述单糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20(SEQIDNO:15)是在表9所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分糖基化。本发明还涉及包含流感HA多肽和药物可接受的载体的疫苗组合物，其中所述流感HA多肽被去糖基化至单糖基化状态，并且其中一旦将所述单糖基化的HA多肽引入个体，所述多肽诱导所述个体产生与流感病毒结合的抗体。在一些方面中，将单糖基化的HA多肽引入个体导致所述个体产生中和季节性流感病毒和禽流感病毒两者的抗体。在一实施方案中，所述单糖基化的流感病毒血凝素包含季节性Hl(布里斯班株)HA多肽，并且一旦将所述单糖基化的HA多肽引入个体，所述Hl(布里斯班株)HA多肽诱导所述个体产生中和NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)流感病毒的抗体。在另一施方案中，所述单糖基化的流感病毒血凝素包含NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)多肽，并且一旦将所述单糖基化的HA多肽引入个体，所述NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)多肽诱导所述个体产生中和季节性Hl(布里斯班株)HA流感病毒的抗体。在一些方面中，所述疫苗还包含佐剂，其可以选自氢氧化铝、磷酸铝、氢氧化铝和磷酸铝两者、弗氏不完全佐剂(IFA)、角鲨烯、角鲨烷、明矾和MF59。本发明涉及对哺乳动物进行抗病毒呼吸道感染免疫的方法，所述方法包括:向易受呼吸病毒感染的哺乳动物给予包含免疫原性多肽的疫苗，所述免疫原性多肽包含去糖基化至单糖基化、二糖基化或三糖基化状态的病毒糖蛋白，其中所述疫苗能诱发抗呼吸病毒的免疫应答。在一些实施方案中，所述呼吸病毒是流感病毒，且所述病毒糖蛋白是血凝素(HA)。可以通过肠胃外给药、吸入方式、鼻内给药、且有时通过预防性给药来给予所述疫苗。在一些方面中，所述疫苗引起抗流感病毒菌株的免疫应答，所述流感病毒菌株与从中选择去糖基化的病毒糖蛋白的来源流感病毒菌株不同。在一些实施方案中，所述去糖基化的病毒糖蛋白是单糖基化的流感血凝素(HA)。本发明提供了有效抗甲型流感病毒的疫苗。在一实施方案中，所述疫苗包含在功能上模拟本文所述分子的中和表位的肽或多肽。在另一实施方案中，所述疫苗有效抗包含肽或多肽的病毒抗原，所述肽或多肽在功能上模拟本文所述分子的中和表位。在一实施方案中，所述病毒抗原来自流感病毒或HIV-1或HIV-2病毒或诸如登革病毒或丙型肝炎病毒的黄病毒属。在另一实施方案中，所述疫苗是有效抗甲型流感病毒的疫苗，包含在功能上模拟本文所述分子的中和表位的肽或多肽。在一实施方案中，所述分子是抗体。在另一实施方案中，所述抗体结合HA抗原。在另一实施方案中，所述HA抗原是H5亚型。在另一实施方案中，所述HA抗原是Hl亚型。在另一实施方案中，所述抗原展示在甲型流感病毒的表面。在另一实施方案中，所述肽或多肽包含引发中和抗体的抗原决定簇。这些和其他方面从下面对优选实施方案的描述中结合下列附图变得明显，但是其中的各种改变和修改都可以的，只要不脱离本公开的新概念的实质和范围。附图简要说明以下的附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步展示本公开的某些方面，通过参考一幅或多幅这些图片并结合本文提供的具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。图1A-1C显示不同糖基化的HA的图解概述和圆二色光谱。(图1A)不同糖基化的HA的四种变体:HAfg，在HEK293E细胞中表达的具有典型复合型N-聚糖的HA(共有序列(ChenMW,etal.(2008)ProcNatlAcadSciUSA105:13538-13543)；HAds,NA处理的导致从HAfg去除唾液酸的HA-Mhm,在GnT1-HEK293S细胞中表达的具有高甘露糖型N-聚糖的HA；以及HAmg，EndoH处理的在N-糖基化位点仅具有GlcNAc的HA。(图1B)在其N-糖基化位点连接不同N-聚糖的HAfPHAdPHAhl^PHAmg的结构代表。蛋白结构用ProteinDataBankIDcode2FK0(Viet04HA)产生，颜色为灰色，并且N-连接的聚糖显示为绿色。所有的N-聚糖均通过GlyProt(Bohne-LangA,etal.(2005)NucleicAcidsRes33:W214-ff219)被模式化，并且图形由PyMOL(www.pymol.0rR)生成。(图1C)HAfg、HAds、HAhm和HAmg的圆二色性光谱显示，不同糖基化的四种HA蛋白的二级结构是相似的。图2A-2B显示不同糖基化的HA的聚糖微阵列分析。(图2A)显示HA变体HAfg、HApHAta^PHAmg的聚糖微阵列谱型。聚糖的相关连接按颜色进行分组，主要为17种a2，3唾液酸苷(黄色)或7种a2，6唾液酸苷(蓝色)。阵列上聚糖的结构显示在图2B中。用HA变体响应a2，3唾液酸苷1-15的Ka,surf值来显示HA变体HAfg、HAds,HAhm和HAmg的缔合常数。图3显示自从2000年开始，最近的HAHl、H3和H5的布里斯班株Hl，加利福尼亚株H1、H3和H5的序列比对。季节性流感HA来自A/布里斯班株/59/2007。流行性流感HA来自A/加利福尼亚株/07/2009。H5来自A/越南株/1203/2004。H3来自A/布里斯班株/10/2007。以红框显示H5HA上的N-糖基化位点。比较显示Hl和H5HA在其N-糖基化位置之间的相似性，而H3具有保守性较小的糖基化位置，且不同于Hl和H5。图4A-4F显示来自于HA聚糖相互作用的糖或修饰的结合能贡献，所述HA聚糖相互作用响应于不同糖基化的HA。这些值通过减去所示的参照聚糖(以红框突出；参见表S3)的AG值得到。(图4A)聚糖2、3、6和8-10具有与二糖聚糖I相同的主链，而仅在非还原末端的第三个糖不同。计算出AAG值以显示由于改变第三个糖而结合能的差异。(图4B)聚糖10-12和15具有与二糖聚糖8相同的主链，但是由于线性延长糖结构上或增加分支糖而不同。(图4C)聚糖4和5具有与三糖聚糖3相同的主链，但是在非还原末端第三位的分支海藻糖或硫酸盐基团上不同。(图4D)聚糖6和7在聚糖7的非还原末端第三位的硫酸盐基团上不同。(图4E)聚糖13和14是a2，3二天线唾液酸苷，但是在内部糖的改变上不同。(图4F)聚糖16和17和a2，6唾液酸苷(第21-27号)对HA表现出很少的结合或不结合图5A-显示HAfg和HAmg作为疫苗的比较。(图5A)用ELISA分析来自HAfg和HAmg的抗血清与各种HA之间的结合。与HAfg抗血清相比，HAmg抗血清表现出更好地对H5(越南株1194/2004和CHA5)的结合。此外，HAmg抗血清还与Hl(加利福尼亚株07/2009和WSN)结合。(图5B)用HAfg和HAmg抗血清对H5N1(NIBRG-14)病毒的微量中和。与HAfg抗血清相t匕，HAmg抗血清表现出更好的对MDCK细胞抗流感病毒感染的中和活性(P<0.0001)。(图5C)对H5N1病毒致死剂量激发的疫苗保护。用HA蛋白疫苗HAfg、HAmg和对照PBS的两次注射免疫BALB/c小鼠。免疫的小鼠用致死剂量的H5N1(NIBRG-14)病毒通过鼻内激发。激发后，记录存活持续14天。(图5D)通过ELISA进行的来自HAmg的兔抗血清与不同HA的结合。抗HAmg的兔抗血清表现出与H5(CHA5和越南株/1194)的强烈结合。此外，还观察到与H5(安徽株和ID5/2005)和Hl(新喀里多尼亚株/1999)的相互作用。图6A-6C显示H5HA蛋白的构建、纯化和凝胶过滤色谱分析。(图6A)将编码具有改变切割位点的HA的胞外域的DNA克隆进哺乳动物表达载体，pTT(DuroCherY，etal.(2002)NucleicAcidsRes30:E9)中，从而允许从HEK293细胞培养物有效分泌HA蛋白。HA的原始蛋白酶切割位点被突变成PQRERG，以避免HAO加工成HAl和HA2。为了稳定HA蛋白的三聚体构象，将噬菌体三聚片段“折叠子(foldon)”序列工程改造进质粒构建体，并将组氨酸标签添加到COOH末端，用于纯化目的。用表达载体的瞬转进行HA蛋白的表达。(图6B)用SDS/PAGE分析纯化的HA蛋白。Mindicates标志物。泳道1:HAfg，从293E细胞纯化的HA;泳道2=HAds,通过NA消化的HAfg;泳道3=HAhm,从293S细胞纯化的HA(ReevesPJ,etal.(2002)ProcNatlAcadSciUSA99:13419-13424);泳道4=HAnig，通过EndoH消化的HAta。(图6C)通过凝胶过滤色谱法分析HA纯化的蛋白。凝胶过滤后的洗脱峰显示HAfg三聚体>200kDa(红线)，HAds三聚体>200kDa(黑线)，HAhm三聚体>200kDa(蓝线)和HAnig三聚体>180kDa(绿线)。图显示了覆盖有蛋白标志物(虚线)的HA蛋白的叠加洗脱图谱。图7A-7C显示来自不同HA蛋白的过甲基化的N-聚糖的质谱分析。来自不同HA蛋白的过甲基化的N-聚糖的MS分析。(图7A)MALD1-MS图谱显示，HEK293E所表达的HA的N-聚糖主要包含核心岩藻糖化的、二天线、三天线和四天线复合型N-聚糖结构，这解释了所检测到的主峰并列于表SI。分配基于组成，仅有有限的几个进一步通过MS/MS分析来证实。不同程度的唾液酸化是主要特征。(图7B)用NA处理，指定为唾液酸化N-聚糖的所有的信号(例如m/z2605、3054、3503、3864、4226)都不再能检测到，伴随非唾液酸化的三天线和四天线结构(m/z2693,3142)的信号强度增加，这与唾液酸的完全去除完全相符。(图7C)来源于GnTIn缺陷型HEK293S菌株所表达的HA的N-聚糖的MALD1-MS图谱显著性地显示出，对应于m/z1579处的Man5GlcNAc2的信号，伴随糖基化途径中不完全平衡的高甘露糖型N-聚糖(m/z1783至2396；Hex6HexNAc2-Hex9HexNAc2)的最小峰。图8A-8D显示对HA变体的MALD1-T0F分析。(图8A)HAfg的分子量是75186.343，(图8B)HAds是75290.023，(图SOHAhm是69314.645和(图8D)HAmg是63314.761。图9显示在HA三聚体的过甲基化N-聚糖的MALDI光谱中所观察到的主要分子离子的分配。ND表不未确定。图10显示对应于a2，3唾液酸苷1-15的HA糖基化变体的AAG。值表示AAG，kcal/mol。最左栏的项目通过前面的HA的-G值减去后面的HA的-G值得到(例如，AAG(HAfg->HAds)=AG(HAds)-AG(HAfg))。ND表示未确定。图11显示响应于HA变体的不同唾液酸苷配体的结合自由能变化差异。值表示AAG，kcal/mol。最左栏的项目通过前面的HA的AG值减去后面的HA的AG值得到(例如，AAG(1->2)=AG⑵-AG(I)。ND表示未确定。图12显示从完全糖基化、高甘露糖和单糖基化的H5HA产生的抗血清抑制越南株1203HA假型病毒转导进入HEK293细胞中的能力。高甘露糖和单糖基化的HA抗血清两者均抑制病毒进入，但是完全糖基化的HA抗血清则不会抑制。图13A-13B显示利用兔HAfg和HAnig抗血清进行血细胞凝集测定的结果。图13A显示血细胞凝集测定中完全糖基化的共有H5HA抗血清对H1、H3和H5的结果。图13B显示利用单糖基化的H5HA抗血清的结果。单糖基化的H5HA抗血清不仅对H5表现出良好的血细胞凝集抑制活性，而且对Hl也表现出良好的血细胞凝集抑制活性。H3血细胞凝集不受两种抗血清的影响。图14显示H5和Hl的蛋白结构(0.9A的均方根偏差(RMSD))彼此之间比与H3的蛋白结构(2.5A的均方根偏差RMSD))更相似。图15A-15C显示使用单糖基化的Hl(布里斯班株)HA作为抗原所产生的抗血清对NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)的抑制。图15A显示对NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)病毒凝集红细胞能力的抑制。图15B显示对NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)病毒感染MDCK细胞能力的抑制。图15C显示对BALB/c小鼠免受NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)流感病毒感染的保护。所用的抗血清是用布里斯班株HA蛋白(5iig)免疫的小鼠，并且用于激发的病毒是NIBRG-121(IOOXLD5q)。图16A-16C显示使用单糖基化的Hl(布里斯班株)HA作为抗原所产生的抗血清对WSN(HlNl)1933的抑制。图16A显示对WSN(HlNl)1933病毒凝集红细胞能力的抑制。图16B显示对WSN(HlNl)1933病毒感染MDCK细胞能力的抑制。图16C显示对BALB/c小鼠免受WSN(HlNl)1933流感病毒感染的保护。所用的抗血清是用布里斯班株HA蛋白(5yg)免疫的小鼠，并且用于激发的病毒是WSN(HlNl)1933(100XLD50)。图17A-17C显示使用单糖基化的Hl(布里斯班株)HA作为抗原所产生的抗血清对A/波多黎各/8/34(HlNl):PR8的抑制。图17A显示对PR8病毒凝集红细胞能力的抑制。图17B显示对PR8病毒感染MDCK细胞能力的抑制。图17C显示对BALB/c小鼠免受PR8流感病毒的保护。所用的抗血清是用布里斯班株HA蛋白(5iig)免疫的小鼠，并且用于激发的病毒是(IOOXLD5ci)。图18A-18B显示使用单糖基化的Hl(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株；在图中显示为加利福尼亚株/2009)HA作为抗原所产生的抗血清对WSN(HlNl)的抑制。图18A显示对WSN(HlNl)病毒凝集红细胞能力的抑制。图18B显示对WSN(HlNl)病毒感染MDCK细胞能力的抑制。图19显示对HlHA蛋白上的糖基化位点的结构比较。图20显示3型登革病毒包膜糖蛋白E二聚体的完全糖基化形式(图20A)和单糖基化形式(图20B)。模型由PDB代码2BF1产生，利用GlyProt服务器具有4个可能的复合型N-聚糖。图21显示人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白gpl20三聚体的完全糖基化形式(图21A)和单糖基化形式(图21B)。模型由PDB代码2BF1产生，每个单体具有13个可能的复合型N-聚糖。发明的详细描述在下面参照附图对本公开的实施方案的详细描述中，其中相似的参考数字表示相似的元件，并且其中以列举可实施本公开的具体实施方案的方式显示。对这些实施方案的详述足以使本领域技术人员能实施本公开，并且应当理解，可以使用其他实施方案，且只要不脱离本公开的范围，可以作出合理的、结构的、功能的和其他的改变。以下详细描述因而不应被理解为限制性含义。流感病毒的血凝素(HA)是同源三聚体跨膜蛋白，具有由球状头区和茎区组成的胞外结构域。两个区域均携带N-连接的寡糖，这些寡糖的生物合成按照N糖基化的常规途径。HA的功能特性受特定位点的糖基化影响。抗原肽表位周围的碳水化合物干扰抗体接近，并且该影响可导致流感病毒的抗原性漂移。之前对HA的研究还揭示，具有糖基化的肽序列是高度保守的，并且HA受体结合特异性由于受体结合位点附近复合聚糖链的缺失而受到影响。此外，HA的蛋白水解活性还受到切割位点附近的聚糖的调节，从而影响流感病毒的感染力。头区糖基化位点的结构和数量的广泛变异已在甲型流感病毒的不同亚型中得到显示，而茎区寡糖更保守，且为融合活性所需。所有这些发现均表明HA糖基化对其活性的重要性。病毒传播从血凝素(HA)糖蛋白和含有聚糖的唾液酸(SA)之间的重要相互作用开始，所述血凝素糖蛋白是流感病毒衣壳，所述唾液酸位于宿主细胞表面。为了阐明HA糖基化在该重要的相互作用中的作用，制备了各种确定的HA糖型，并利用合成的SA微阵列研究它们的结合亲和力和特异性。截断HA上的N-聚糖结构增加SA结合亲和力，但降低了对不同SA配体的特异性。SA配体结构中每种单糖和硫酸盐基团对HA结合能的贡献在数量上均是可分析的。发现硫酸盐基团对完全糖基化的HA的结合能增加将近100倍(2.04kcal/mol)，并且二天线的聚糖对单糖基化的HA糖型的结合能同样增加将近100倍。仅在每个糖基化位点携带一个N-连接的GlcNAc的由HA蛋白引发的抗体比完全糖基化的HA所激发的抗体对流感病毒亚型表现出更好的结合亲和力和中和活性。因此，去除病毒表面糖蛋白上的结构上非必需的聚糖对于针对流感病毒和其他人类病毒的疫苗设计来说是非常有效且常用的方法。除非另外定义，本文所用的技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员所通常理解的相同的含义。Singletonetal.,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology2nded.,J.ffiley&Sons(NewYork,N.Y.1994)为本领域技术人员提供了对本申请所用的诸多术语的通用指导。本领域技术人员应当意识到，与本文所描述的相似或等同的诸多方法和材料可用于实施本发明。确实，本发明绝非限制于所述的方法和材料。为了本发明的目的，下面定义以下术语。术语“甲型流感亚型”或“甲型流感病毒亚型”可交替使用，是指用血凝素⑶病毒表面蛋白表征的甲型流感病毒变体，并因此用H的数量来标记，诸如例如H1、H3和H5。此夕卜，亚型可进一步用神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白表征，用N的数量表示，诸如例如NI和N2。同样，亚型可以通过H和N的数量两者来表征，诸如例如H1N1、H5N1和H5N2。本术语具体包括每种亚型内的所有菌株(包括灭绝的菌株)，这些菌株通常由突变产生，并表现出不同的病原谱。这类菌株还被称为病毒亚型的各种“隔离体”，包括所有过去的、当今的和未来的隔离体。因此，在该语境下，术语“菌株”和“隔离体”可交替使用。亚型含有基于甲型流感病毒的抗原。所述抗原可以基于血凝素病毒表面蛋白，并可被称为“HA抗原”。在某些情况下，这类抗原基于特定亚型的蛋白，诸如例如Hl亚型和H5亚型，其可以分别被称为Hl抗原和H5抗原。如本公开中所用的，术语“去糖基化的”或“部分糖基化的”蛋白是指从完全糖基化状态的蛋白的聚糖结构去除一个或多个糖的蛋白，并且其中所述蛋白基本保持其天然的构象/折叠。“去糖基化的”蛋白包括部分糖基化的蛋白，其中去糖基化过程在糖蛋白上存在的一个或多个糖基化位点处保留单糖基化、二糖基化或三糖基化。“部分糖基化的”蛋白包括其中在每个糖基化位点处保留一个或多个糖的“去糖基化的”蛋白，并且每个部分糖基化位点与完全糖基化状态的糖蛋白相比包含较小的聚糖结构(包含较少的糖单元)，并且部分糖基化的蛋白基本保持其天然的构象/折叠。“部分糖基化的”蛋白通过在完全糖基化状态的糖蛋白的至少一个糖基化位点的聚糖结构处部分去糖基化来产生。“部分糖基化的”蛋白还通过在蛋白的非糖基化位点导入糖基化，使得添加的糖基化序列小于完全糖基化状态的糖蛋白该位点处的聚糖结构来产生。“部分糖基化的”蛋白还通过合成病毒糖蛋白序列或其片段，在该序列的糖基化位点处导入糖基化的氨基酸单元(例如，GlcNAc-精氨酸部分)，使得添加的聚糖结构小于完全糖基化状态的糖蛋白该位点处的聚糖结构来产生。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可交替使用，是指单链或双链RNA、DNA或混合的多聚体。多核苷酸可以包括基因组序列、基因组外序列和质粒序列，以及表达多肽或可适合表达多肽的较小的工程化基因节段。“分离的核酸”是基本上从天然伴随天然序列的其他基因组DNA序列以及蛋白或诸如核糖体或多聚酶的复合体分离的核酸。该术语包括从其天然存在的环境移出的核酸序列，并包括重组的或克隆的DNA分离体和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本纯的核酸包括核酸的分离形式。当然，这是指原始分离的核酸，并且不排除之后通过人工添加到该分离的核酸的基因或序列。术语“多肽”以其常规含义使用，即氨基酸序列。所述多肽并不限制于特定长度的产物。肽、寡肽和蛋白均包括在多肽的定义内，并且这类术语在本文可交替使用，除非具有指出不是这样。该术语还不是指或排除翻译后修饰的多肽，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域内已知的天然存在的和非天然存在的其他修饰。多肽可以是完整的蛋白或其子序列。本发明背景下的特定目的多肽是包含CDR并能与抗原或HIV感染的细胞结合的氨基酸子序列。“分离的多肽”是从其天然环境组分中鉴定并分离和/或回收到的多肽。在优选的实施方案中，所述分离的多肽可被纯化至(I)如通过Lowry方法所测定的大于95%重量比的多肽，并且最优选至大于99%的重量比，(2)纯化至足以通过使用旋杯式测序仪来获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)纯化至通过使用考马斯亮蓝或优选银染在还原或非还原条件下的SDS-PAGE达到的均一性。分离的多肽包括重组细胞原位的多肽，因为所述多肽的天然环境的至少一种组分不再存在。然而通常，分离的多肽将通过至少一步纯化步骤来制备。“天然序列”多核苷酸是与来自自然的多核苷酸具有相同核苷酸序列的多核苷酸。“天然序列”多肽是与来自自然(例如来自任何物种)的多肽(例如抗体)具有相同氨基酸序列的多肽。这类天然序列多核苷酸和多肽可以从自然分离得到，或可以通过重组或合成方式产生。如本文所用的术语多核苷酸“变体”是存在一个或多个取代、缺失、添加和/或插入而通常不同于本文所具体公开的多核苷酸的多核苷酸。这类变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如通过修饰本发明的一种或多种多核苷酸序列，并按本文所述和/或使用本领域内公知的多种技术中的任何一种评价所编码的多肽的一种或多种生物学活性。如本文所用的术语多肽“变体”是存在一个或多个取代、缺失、添加和/或插入而通常不同于本文所具体公开的多肽的多肽。这类变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如通过修饰本发明的一种或多种上述多肽序列，并按本文所述和/或使用本领域内公知的多种技术中的任何一种评价所述多肽的一种或多种生物学活性。修饰可以在本发明的多核苷酸和多肽结构中进行，并且仍可获得编码具有所需特性的变体或衍生多肽的功能性分子。当希望改变多肽的氨基酸序列以产生本发明多肽的等同的或甚至是改进的变体或部分时，本领域技术人员通常改变编码DNA序列的一个或多个密码子。例如，在蛋白结构中，某些氨基酸可以被其他的氨基酸取代，而不会造成其与其他多肽(例如抗原)或细胞结合能力的明显损失。由于是蛋白的结合能力和特性限定了该蛋白的生物功能活性，因此可以在蛋白序列和其基础DNA编码序列中进行某些氨基酸序列取代，并且仍能获得具有相似特性的蛋白。因而应当考虑可以在所公开的组合物的肽序列或编码所述肽的相应的DNA序列中进行各种改变，只要不会造成其生物学功能或活性的明显损失。在进行这些改变时，还应当考虑氨基酸的亲水指数。本领域内普遍理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用的生物学功能中的重要性(KyteandDoolittle，1982)。被接受的是氨基酸的相对亲水特性与得到的蛋白的二级结构有关，而该二级结构随之限定了该蛋白与诸如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等其他分子的相互作用。基于氨基酸的疏水性和电荷特性，每种氨基酸具有指定的亲水指数(KyteandDoolittle，1982)。这些值是:异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。本领域内已知，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代，而仍产生具有相似生物学活性的蛋白，即仍获得生物学功能等同的蛋白。在进行这些改变时，亲水指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，特别优选的是在±1以内的氨基酸的取代，并且更特别优选的是在±0.5以内的那些氨基酸的取代。本领域内还应当理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利第4，554，101号陈述，蛋白的最局部的平均亲水性，如通过其邻近的氨基酸的亲水性所控制，与所述蛋白的生物学特性相关。如美国专利第4，554，101号详述，已将下述亲水性值指定给氨基酸残基:精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(O)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、売氨酸(-1.8)、异売氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。应当理解，氨基酸可以被具有相似亲水性值的另一氨基酸取代，且仍获得生物学上等同的尤其是免疫学上等同的蛋白。在这类改变中，亲水性值在±2以内的氨基酸的取代是优选的，特别优选的是在±1以内的氨基酸的取代，并且更特别优选的是在±0.5以内的那些氨基酸的取代。如上文所述，氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对的相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。综合考虑了上述各种特性的示例性取代是本领域技术人员所公知的，并且包括:精氨酸与赖氨酸、谷氨酸与天冬氨酸、丝氨酸与苏氨酸、谷氨酰胺与天冬酰胺、以及缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸。多肽在蛋白的N末端可以包含信号(或前导)序列，其在翻译的同时或在翻译后指导蛋白的转移。多肽还可以与连接物或其他序列缀合，以便于多肽的合成、纯化或鉴定(例如，多聚组氨酸)，或用于增强多肽与固相支持物的结合。多肽的糖基化通常是N-连接的或0-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。“序列子”是蛋白中的三个连续氨基酸序列，其可以充当与称为N-连接的聚糖的多糖(糖)的连接位点。这是一种通过天冬酰胺(Asn)侧链的氮原子与蛋白连接的多糖。序列子是Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr,其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中这些三肽序列中的任何一种的存在会产生可能的糖基化位点。0-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见的为丝氨酸或苏氨酸，但是也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。尽管序列子Asn-X-Ser/Thr是N-连接的寡糖与糖蛋白连接所绝对必需的(MarshallRD,BiochemicalSocietySymposia40,17-261974),但是其存在并非总是导致糖基化,糖蛋白中的一些序列子可以保持非糖基化(CurlingEM,etal.,BiochemicalJournal272,333-3371990)。聚糖微阵列是研究碳水化合物-蛋白相互作用的有力工具，并为流感病毒亚分型提供新的平台(Blixt0，etal.(2004)ProcNatlAcadSciUSAlOl:17033-17038;ChandrasekaranA,etal.(2008)NatBiotechnol26:107-113；LiangPH,etal.(2007)JAmChemSoc129:11177-11184；StevensJ,etal.(2008)JMolBiol381:1382-1394)。它们模拟细胞表面的聚糖，表现出高亲和力和特异性的多价相互作用。利用该技术，对各种天然的和突变的HA的受体特异性进行表征，从而为区分流感病毒亚型提供新的平台。尽管是有力的方法，但是通过聚糖阵列分析来理解HA-聚糖相互作用由于两个问题而复杂化:第一，HA结合特异性受阵列聚糖的空间排列和组成以及所用的结合检测方法影响(SrinivasanA，etal.(2008)ProcNatlAcadSciUSA105:2800-2805)。第二，糖基化位点处或附近的肽序列的改变可以改变HA的3D结构，并因此改变受体结合特异性和亲和力。的确，来自不同H5N1亚型的HA具有不同的聚糖结合模式(StevensJ,etal.(2008)JMolBiol381:1382-1394)。在整个病毒系统中研究了Hl和H3上的糖基化位点的诱变(ChandrasekaranA,etal.(2008)NatBiotechnol26:107-113；DeomCM,etal.(1986)ProcNatlAcadSciUSA83:3771-3775)。然而，还不了解糖基化的改变如何影响受体结合特异性和亲和力，尤其对于大多数致病性H5N1HA来说。为了解决这些问题，开发出了定量聚糖微阵列谱方法，以克服传统HA结合实验的限制。之前的研究使用昆虫细胞表达的HA(ChandrasekaranA,etal.(2008)NatBiotechnol26:107-113)。但是昆虫细胞中的糖基化与哺乳动物细胞不同，明显的差异是昆虫细胞中不产生以半乳糖和唾液酸为末端的复合型N-聚糖。从人类细胞表达的HA糖基化的变体为了在人类细胞中解决如何使糖基化发生影响受体结合特异性和亲和力的改变，利用流感H5N1HA共有序列(ChenMW，etal.(2008)ProcNatlAcadSciUSA105:13538-13543)制备包含HA结合配体的广泛结构类似物的聚糖微阵列和数种确定的HA糖型，用于进行定量结合分析。CHA5的密码子用人类密码子进行表达优化。如表I所示，原始的病毒蛋白酶切割位点PQRERRRKKRG(SEQIDNO:1)被突变成PQRERG(SEQIDNO:2)，以便防止蛋白从酶促切割形成HAl和HA2。跨膜区(残基:533-555)用HA构建体的C末端处的其他残基LVPRGSP'GSGYIPEAPRDGQAYYRKDGEffYLLSTFLGHHHHHH(SEQIDNO:3)取代，其中凝血酶切割位点为斜体，噬菌体T4fibritin折叠子三聚序列用下划线表示，并且组氨酸标签为粗体(StevensJ.etal.(2006)Science312:404-410)。表1.共有H5血凝素序列以粗体显示共有H5HA的氨基酸序列:信号序列；和下划线:三聚序列和组氨酸标签MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGSHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE~50KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKAN100PANDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASSGVSSA150CPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDA200AEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILK250PNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGA300INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERGLFGAIAGF350IEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKM400NTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLD450FHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDY500PQYSEEARLKREEISGVDIRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEW550权利要求1.用于引发对病毒、细菌、真菌或其他来源的病原体的免疫应答的免疫原性组合物，所述组合物包含:来自所述病毒、细菌、真菌或其他来源的病原体的抗原糖蛋白，其中所述糖蛋白包含至少一个糖基化位点，并且其中所述抗原糖蛋白在一个或多个糖基化位点被部分糖基化。2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述病原体是病毒，而且其中所述部分糖基化的抗原是病毒、病毒肽、蛋白、多肽或来源于病毒的以上的片段。3.如权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述病毒选自流感病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、衣原体、腺病毒科、哺乳动物腺病毒属、禽腺病毒属、疱疫病毒科、单纯疱疫病毒1、单纯疱疹病毒2、单纯疱疹病毒5、单纯疱疹病毒6、光滑病毒科、轻小病毒属、肠杆菌噬菌体MS2、allolevirus、痘病毒科、脊椎动物痘病毒亚科、副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属、软抚痘病毒属、昆虫痘病毒亚科、乳头多瘤空病毒科、多瘤病毒属、乳头多瘤空病毒属、副粘病毒科、副粘病毒属、副流感病毒1、麻疹病毒属、麻疹病毒、腿腺炎病毒属、腿腺炎病毒、肺病毒亚科、肺病毒属、偏肺病毒属、禽肺病毒属、人类偏肺病毒属、小核糖核酸病毒科、肠病毒属、鼻病毒属、肝病毒属、人类甲型肝炎病毒、心病毒属、andapthovirus、呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、质型多角体病毒属、斐济病毒属、植物呼肠孤病毒属、水稻病毒属、逆转录病毒科、B型哺乳动物逆转录病毒属、C型哺乳动物逆转录病毒属、C型鸟逆转录病毒属、D型逆转录病毒组、BLV-HTLV转录病毒属、慢病毒属、人类免疫缺陷病毒1、人类免疫缺陷病毒2、泡沫病毒属、黄病毒属科、丙型肝炎病毒、黄病毒属、登革病毒、肝DNA病毒科、乙型肝炎病毒、披膜病毒科、甲病毒属辛德比斯病毒、风疹病毒属、风疹病毒、弹状病毒科、水疱性病毒属、狂犬病病毒属、短暂热病毒属、质型弹状病毒属、核型弹状病毒属、沙粒病毒科、沙粒病毒属、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、伊派病毒、拉沙病毒、冠状病毒科、冠状病毒属和凸隆病毒属。4.如权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述病毒肽、蛋白、多肽或其片段是选自以下的表面糖蛋白:流感病毒神经氨酸酶，流感病毒血凝素，流感病毒M2蛋白，人类呼吸道合胞体病毒(RSV)病毒蛋白，RSVF糖蛋白，RSVG糖蛋白，单纯疱疹病毒(HSV)病毒蛋白，单纯疱疹病毒糖蛋白gB、gC、gD和gE，衣原体MOMP和PorB抗原，登革病毒的核心蛋白、基质蛋白或其他蛋白，麻疹病毒血凝素，单纯疱疹病毒2型糖蛋白gB，脊髓灰质炎病毒IVP1，HIVI的包膜糖蛋白，乙型肝炎表面抗原，白喉毒素，链球菌24M表位，淋球菌菌毛蛋白，伪狂犬病病毒g50(gpD)，伪狂犬病病毒II(gpB)，伪狂犬病病毒III(gpC)，伪狂犬病病毒糖蛋白H，伪狂犬病病毒糖蛋白E，传染性胃肠炎糖蛋白195，传染性胃肠炎基质蛋白，猪轮状病毒属糖蛋白38，猪细小病毒衣壳蛋白，猪密螺旋体痢疾保护性抗原，牛病毒性腹泻糖蛋白55，新堡病病毒血凝素-神经氨酸酶，猪流感血凝素，猪流感神经氨酸酶，口蹄疫病毒，猪霍乱病毒，猪流感病毒，非洲猪瘟病毒，猪肺炎支原体，传染性牛鼻气管炎病毒，传染性牛鼻气管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G，传染性喉气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I，拉克罗斯病毒的糖蛋白，新生犊牛腹泻病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒，庞塔托鲁病毒，鼠白血病病毒，小鼠乳腺瘤病毒，乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物，马流感病毒或马疱疹病毒的抗原，包括甲型马流感病毒/阿拉斯加株91神经氨酸酶、甲型马流感病毒/迈阿密株63神经氨酸酶、甲型马流感病毒/肯塔基株81神经氨酸酶、马疱疹病毒I型糖蛋白B和马疱疹病毒I型糖蛋白D，牛呼吸道合胞体病毒或牛副流感病毒的抗原，牛呼吸道合胞体病毒附着蛋白(BRSVG)，牛呼吸道合胞体病毒融合蛋白(BRSVF)，牛呼吸道合胞体病毒核壳体蛋白(BRSVN)，牛副流感病毒3型融合蛋白，牛副流感病毒3型血凝素神经氨酸酶，牛病毒腹泻病毒糖蛋白48和糖蛋白53，登革病毒糖蛋白E和人类丙型肝炎病毒的糖蛋白El或E2。5.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中来自病原体的所述部分糖基化的糖蛋白是通过使用化学或酶促方法中的一种或多种进行部分去糖基化而产生的。6.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原在O-糖基化位点或N-糖基化位点被部分糖基化。7.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原包含N-糖基化位点，所述N-糖基化位点包含天冬酰胺-Xaa-丝氨酸和天冬酰胺-Xaa-苏氨酸的氨基酸序列，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。8.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)或M2蛋白，或以上的免疫原性片段。9.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原是用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和/或甘露糖糖基化的流感病毒血凝素。10.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原是选自部分糖基化的流感病毒H1、H3和H5的单糖基化的血凝素。11.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原是用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)单糖基化的流感病毒血凝素。12.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含含有Sa区的N-糖基化位点。13.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含位于第177位的天冬酰胺残基处的部分糖基化。14.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单GlcNAc糖基化的流感病毒血凝素对于HA-受体结合展现出降低的特异性和提高的亲和力。15.如权利要求14所述的免疫原性组合物，其中所述单GlcNAc糖基化的流感病毒血凝素结合唾液酸化的HA-受体。16.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含含有共有H5HA序列(SEQIDNO:4)的多肽。17.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的共有H5HA序列(SEQIDNO:4)在第39位、第127位、第170位、第181位、第302位、第495位和第500位中的一个或多个位置的天冬酰胺残基处糖基化。18.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含选自季节性NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)序列(SEQIDN0:6)、共有Hl-A(SEQIDNO:8)和共有H1_C(SEQIDNO:10)序列的Hl多肽序列。19.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素(HA)序列选自共有H5HA序列(SEQIDNO:4)、NIBRG_121(流行性2009A(HlNl)疫苗)序列(SEQIDNO:6)、共有Hl-A(SEQIDNO:8)和共有H1_C(SEQIDNO:10)序列，其中所述HA序列经修饰从而能在合适的真核细胞中表达。20.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含季节性Hl(布里斯班株)多肽。21.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述病毒是呼吸道合胞体病毒(RSV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是SH(小疏水性)糖蛋白的单糖基化、二糖基化或三糖基化的RSVF(融合)、G(附着)或以上蛋白的免疫原性片段。22.如权利要求21所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的RSVG蛋白序列(SEQIDNO:12)是在表6所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分糖基化。23.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述病毒是黄病毒属，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的登革病毒包膜糖蛋白M、糖蛋白E或以上蛋白的免疫原性片段。24.如权利要求23所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的登革病毒包膜糖蛋白E(SEQIDNO:13)是在表7所示的N-糖基化位点N67和N153中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分糖基化。25.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述病毒是丙型肝炎病毒，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1、糖蛋白E2或以上蛋白的免疫原性片段。26.如权利要求25所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白El(SEQIDNO:14)是在表8所示的N-糖基化位点N196、N209、N234、N305和N325中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分糖基化。27.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20、跨月旲糖蛋白gp41或以上蛋白的免疫原性片段。28.如权利要求27所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20(SEQIDNO:15)是在表9所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分糖基化。29.疫苗，包含:(a)免疫原性多肽，所述免疫原性多肽包含在一个或多个糖基化位点部分糖基化至单糖基化、二糖基化或三糖基化状态的病毒表面糖蛋白或其免疫活性片段。(b)任选地，佐剂，其中所述疫苗能诱发抗病毒的免疫应答。30.如权利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是流感病毒，且所述病毒糖蛋白是血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)或M2。31.如权利要求30所述的疫苗，其中所述流感病毒选自禽流感病毒、动物流感病毒和人类流感病毒。32.如权利要求31所述的疫苗，其中所述禽流感病毒是H5N1。33.如权利要求31所述的疫苗，其中所述流感病毒是甲型流感病毒。34.如权利要求30所述的疫苗，其中一旦将单糖基化的流感HA多肽引入个体，所述多肽诱导所述个体产生与呼吸病毒结合的抗体。35.如权利要求34所述的疫苗，其中所述呼吸病毒是禽、动物和/或人类流感病毒或者RSV。36.如权利要求34所述的疫苗，其中所述部分糖基化的病毒抗原在O-糖基化或N-糖基化位点被部分糖基化。37.如权利要求34所述的疫苗，其中所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化的流感病毒HA多肽，所述单糖基化的流感病毒HA多肽包含具有天冬酰胺-Xaa-丝氨酸和天冬酰胺-Xaa-苏氨酸的氨基酸序列的部分糖基化的N-糖基化位点，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。38.如权利要求34所述的疫苗，其中所述N-糖基化位点包含单GlcNAc糖基化的流感病毒HA多肽，并且对于HA-受体结合展现出降低的特异性和提高的亲和力。39.如权利要求34所述的疫苗，其中所述单糖基化的流感HA多肽包含含有Sa区的N-糖基化位点。40.如权利要求34所述的疫苗，其中所述单糖基化的流感病毒HA多肽包含位于第177位的天冬酰胺残基处的N-糖基化位点。41.如权利要求38所述的疫苗，其中所述单GlcNAc糖基化的流感病毒血凝素与唾液酸化的HA-受体结合。42.如权利要求34所述的疫苗，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含含有共有H5HA序列(SEQIDNO:4)的多肽。43.如权利要求42所述的疫苗，其中所述单糖基化的共有H5HA序列(SEQIDNO:4)在第39位、第170位、第181位、第302位和第500位中的一个或多个位置的天冬酰胺残基处糖基化。44.如权利要求34所述的疫苗，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含选自NIBRG-12U流行性2OO9A(HlNl)疫苗菌株)序列(SEQIDNO:6)、共有Hl-A(SEQIDNO:8)和共有H1-C(SEQIDNO:10)序列的Hl多肽序列。45.如权利要求34所述的疫苗，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含季节性Hl(布里斯班株)HA多肽，而且其中一旦将所述单糖基化的HA多肽弓I入个体，所述Hl(布里斯班株)HA多肽或诱导所述个体产生能中和NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)、WSN(HlNl)1933或A/波多黎各/8/34(HlNl):PR8菌株流感病毒的抗体。46.如权利要求34所述的疫苗，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)多肽，而且其中一旦将单糖基化的HA多肽引入个体，所述NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)多肽诱导所述个体产生能中和季节性Hl(布里斯班株)HA、WSN(HlNl)1933或A/波多黎各/8/34(HlNl):PR8菌株流感病毒的抗体。47.如权利要求34所述的疫苗，其中所述个体是哺乳动物、禽、动物、猪、马或人。48.如权利要求34所述的疫苗，其中所述疫苗展现出抗一种或多种流感病毒菌株的显著的抗病毒活性。49.如权利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是呼吸道合胞体病毒(RSV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是SH(小疏水性)糖蛋白的单糖基化、二糖基化或三糖基化的RSVF(融合)、G(附着)或以上蛋白的免疫原性片段。50.如权利要求49所述的疫苗，其中所述单糖基化的RSVG蛋白序列(SEQIDNO:12)是在表6所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。51.如权利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是黄病毒属，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的登革病毒包膜糖蛋白M、糖蛋白E或以上蛋白的免疫原性片段。52.如权利要求51所述的疫苗，其中所述单糖基化的登革病毒包膜糖蛋白E(SEQIDNO:13)是在表7所示的N-糖基化位点N67和N153中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。53.如权利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是丙型肝炎病毒，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1、糖蛋白E2或以上蛋白的免疫原性片段。54.如权利要求53所述的疫苗，其中所述单糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白El(SEQIDNO:14)是在表8所示的N-糖基化位点N196、N209、N234、N305和N325中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。55.如权利要求29所述的疫苗，其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20、跨膜糖蛋白gp41或以上蛋白的免疫原性片段。56.如权利要求55所述的疫苗，其中所述单糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20(SEQIDNO:15)是在表9所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。57.如权利要求29所述的疫苗，其中所述佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝、氢氧化铝和磷酸铝两者、弗氏不完全佐剂(IFA)、角鲨烯、明矾和MF59。58.对哺乳动物进行抗病毒感染免疫的方法，所述方法包括:向易受呼吸病毒感染的所述哺乳动物给予包含免疫原性多肽的疫苗，所述免疫原性多肽包含部分糖基化至单糖基化、二糖基化或三糖基化状态的病毒糖蛋白，或其免疫活性片段，其中所述疫苗能诱发抗所述病毒的免疫应答。59.如权利要求58所述的方法，其中所述疫苗通过肠胃外给药被给予。60.如权利要求58所述的方法，其中通过鼻内给予所述疫苗。61.如权利要求58所述的方法，其中通过吸入给予所述疫苗。62.如权利要求58所述的方法，其中通过预防性给予所述疫苗。63.如权利要求58所述的方法，其中所述疫苗诱发抗病毒或抗同一病毒的不同菌株的免疫应答，所述同一病毒的不同菌株与从中选择部分糖基化的病毒糖蛋白的来源病毒不同。64.如权利要求58所述的方法，其中所述病毒是流感病毒，且所述病毒糖蛋白是流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)或M2糖蛋白。65.如权利要求64所述的方法，其中所述部分糖基化的病毒糖蛋白是包含含有共有H5HA序列(SEQIDNO:4)的多肽的单糖基化的流感血凝素(HA)。66.如权利要求64所述的方法，其中所述部分糖基化的病毒糖蛋白是单糖基化的流感血凝素(HA)，所述单糖基化的流感血凝素包含选自NIBRG-121(流行性2009A(HlNl)疫苗菌株)序列(SEQIDNO:6)、共有Hl-A(SEQIDNO:8)和共有H1_C(SEQIDNO:10)序列的Hl多肽序列。67.如权利要求64所述的方法，其中所述疫苗诱发抗流感病毒菌株的免疫应答，所述流感病毒菌株与从中选择部分糖基化的病毒糖蛋白的来源流感病毒菌株不同。68.如权利要求67所述的方法，其中所述部分糖基化的病毒糖蛋白是单糖基化的流感血凝素(HA)。69.如权利要求67所述的方法，其中所述部分糖基化的病毒糖蛋白是单糖基化的流感神经氨酸酶(NA)或M2蛋白。70.如权利要求58所述的方法，其中所述病毒是呼吸道合胞体病毒(RSV)，所述部分糖基化的病毒抗原是SH(小疏水性)糖蛋白的单糖基化、二糖基化或三糖基化的RSVF(融合)、G(附着)或以上蛋白的免疫原性片段。71.如权利要求70所述的方法，其中所述单糖基化的RSVG蛋白序列(SEQIDNO:12)是在表6所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。72.如权利要求58所述的方法，其中所述病毒是黄病毒属，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的登革病毒包膜糖蛋白M、糖蛋白E或以上蛋白的免疫原性片段。73.如权利要求72所述的方法，其中所述单糖基化的登革病毒包膜糖蛋白E(SEQIDNO:13)是在表7所示的一个或多个N-糖基化位点N67和N153的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。74.如权利要求58所述的方法，其中所述病毒是丙型肝炎病毒，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1、糖蛋白E2或以上蛋白的免疫原性片段。75.如权利要求74所述的方法，其中所述单糖基化的丙型肝炎包膜糖蛋白E1(SEQIDNO:14)是在表8所示的N-糖基化位点N196、N209、N234、N305和N325中的一个或多个的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。76.如权利要求58所述的方法，其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，且所述部分糖基化的病毒抗原是单糖基化、二糖基化或三糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20、跨膜糖蛋白gp41或以上蛋白的免疫原性片段。77.如权利要求76所述的方法，其中所述单糖基化的HIV包膜糖蛋白gpl20(SEQIDNO:15)是在表9所示的一个或多个可能的N-糖基化位点的天冬酰胺残基处被部分去糖基化。78.制备方法，包括:提供糖基化的病毒表面糖蛋白或其免疫活性片段；以及去除与所述蛋白上的一个或多个糖基化位点结合的至少一部分聚糖，从而形成部分糖基化的蛋白，其中至少一种聚糖仍然与所述蛋白上的部分糖基化的位点结合，并且其中所述蛋白保持免疫活性构象。79.如权利要求78所述的方法，还包括:提供包含构建体的真核宿主细胞，所述构建体适于表达重组多肽或其免疫活性片段，包括病毒糖蛋白的氨基酸序列；以及从所述真核宿主分离所述糖基化的重组病毒糖蛋白多肽。80.如权利要求78所述的方法，其中所述部分糖基化的蛋白保持病毒糖蛋白在其天然状态的三级构象。81.如权利要求78所述的方法，其中使用糖苷酶、神经氨酸酶、a-1-甘露糖苷酶、内F-N聚糖酶或选择性消化N-或O-连接的糖基化位点的碳水化合物的酶去除所述一部分聚糖。82.如权利要求78所述的方法，其中使用选择性消化N-或0-连接的糖基化位点的碳水化合物的化学方法去除所述一部分聚糖。83.如权利要求79所述的方法，其中所述真核宿主选自酵母、昆虫细胞、杆状病毒、哺乳动物细胞和人细胞。84.如权利要求83所述的方法，其中所述真核宿主是HEK293E细胞。85.如权利要求78所述的方法，其中所述部分糖基化位点保留一个、两个或三个聚糖。86.如权利要求78所述的方法，其中所述病毒表面糖蛋白选自:病毒肽、蛋白、多肽或其片段，所述病毒肽、蛋白、多肽或其片段选自以下的表面糖蛋白:流感病毒神经氨酸酶，流感病毒血凝素，流感病毒M2蛋白，人类呼吸道合胞体病毒(RSV)病毒蛋白，RSVF糖蛋白，RSVG糖蛋白，单纯疱疹病毒(HSV)病毒蛋白，单纯疱疹病毒糖蛋白gB、gC、gD和gE，衣原体MOMP和PorB抗原，登革病毒的核心蛋白、基质蛋白或其他蛋白，麻疹病毒血凝素，单纯疱疹病毒2型糖蛋白gB，脊髓灰质炎病毒IVP1，HIVI的包膜糖蛋白，乙型肝炎表面抗原，白喉毒素，链球菌24M表位，淋球菌菌毛蛋白，伪狂犬病病毒g50(gpD)，伪狂犬病病毒11(gpB)，伪狂犬病病毒111(gpC)，伪狂犬病病毒糖蛋白H，伪狂犬病病毒糖蛋白E，传染性胃肠炎糖蛋白195，传染性胃肠炎基质蛋白，猪轮状病毒属糖蛋白.38，猪细小病毒衣壳蛋白，猪密螺旋体痢疾保护性抗原，牛病毒性腹泻糖蛋白55，新堡病病毒血凝素-神经氨酸酶，猪流感血凝素，猪流感神经氨酸酶，口蹄疫病毒，猪霍乱病毒，猪流感病毒，非洲猪瘟病毒，猪肺炎支原体，传染性牛鼻气管炎病毒，传染性牛鼻气管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G，传染性喉气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I，拉克罗斯病毒的糖蛋白，新生犊牛腹泻病毒，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒，庞塔托鲁病毒，鼠白血病病毒，小鼠乳腺瘤病毒，乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物，马流感病毒或马疱疹病毒的抗原，包括甲型马流感病毒/阿拉斯加株91神经氨酸酶、甲型马流感病毒/迈阿密株63神经氨酸酶、甲型马流感病毒/肯塔基株81神经氨酸酶、马疱疹病毒I型糖蛋白B和马疱疹病毒I型糖蛋白D，牛呼吸道合胞体病毒或牛副流感病毒的抗原，牛呼吸道合胞体病毒附着蛋白(BRSVG)，牛呼吸道合胞体病毒融合蛋白(BRSVF)，牛呼吸道合胞体病毒核壳体蛋白(BRSVN)，牛副流感病毒3型融合蛋白，牛副流感病毒3型血凝素神经氨酸酶，牛病毒腹泻病毒糖蛋白48和糖蛋白53，登革病毒糖蛋白E和人类丙型肝炎病毒的糖蛋白El或E2。全文摘要提供了用作抗病毒疫苗的包含部分糖基化的病毒糖蛋白的免疫原性组合物。用单糖基化、二糖基化或三糖基化病毒表面糖蛋白和多肽配制的疫苗提供了有效且广泛的抗病毒保护，即使是跨越菌株。公开了包含单糖基化的血凝素多肽的药物组合物和由其产生的疫苗以及使用它们来预防或治疗病毒感染的方法。公开了用于流感病毒HA、NA和M2、RSV蛋白F、G和SH、登革病毒糖蛋白M或E、丙型肝炎病毒糖蛋白E1或E2以及HIV糖蛋白gp120和gp41的方法和组合物。文档编号A61K39/12GK103200961SQ201080022917公开日2013年7月10日申请日期2010年3月26日优先权日2009年3月27日发明者翁启惠,马彻,王正琪,陈俊叡申请人:中央研究院