用于制备含n-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-n-新四糖(lnnt)的方法
【专利说明】用于制备含N-乙酿乳糖胺的四糖乳糖-N-新四糖（LNNT) 的方法
[0001] 本申请是国际申请号PCT/DK2011/050053,国际申请日2011年2月21日，中国 申请号201180009778. 3,发明名称为"用于制备含N-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-N-新四糖 (LNNT)的方法"的专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于制备、尤其是大规模制备Galpβl_4GlcNAcpβl_3Galpβl_4Glc( LNnT)的方法，以及LNnT的中间体和新晶形（多晶型物）。
【背景技术】
[0003] 在过去数十年间，对人乳寡糖（人乳低聚糖，ΗΜ0)的制备和商业化的兴趣持续增 加。ΗΜ0的重要性直接与其独特的生物学活性如抗菌、抗病毒、免疫系统和认知发育增强活 性相关。
[0004] 四糖Galpβl-4GlcNAcpβl-3Galpβl-4Glc(乳糖-N-新四糖，LNnT，方案 1) 是存在于人乳中的寡糖之一（Kuhn等，Chem.Ber. 1962,95, 513 和 518，KobataMethods Enzymol.l972,28,262]。LNnT充当肺炎双球菌（pneumococci)的细菌受体并且发现它可 用于识别糖基转移酶的受体特异性、糖苷酶的底物特异性以及抗原决定簇的结构。此外， LNnT代表具有各种生理活性的糖脂和糖蛋白（拟红细胞糖苷酯（paragloboside)、6_唾液 基-LNnT等）中的更复杂寡糖的核心结构元件。
[0005]
[0006] 迄今，还不可能通过使用分离、生物技术和合成方法得到大量的LNnT。由于存在大 量类似寡糖，所以即使以毫克量从人乳中分离LNnT也相当困难。
[0007] LNnT的酶合成包括在半乳糖基转移酶存在下将乳糖-N-丙糖II用UDP-半乳糖 孵育[Sabesan等J.Am.Chem.Soc. 1986,108, 2068 ;EP-A-870841]或在β-D-半乳糖苷酶存 在下用乳糖孵育[Murata等Glycoconj.J. 1999，16，189;JP10-234394Α]。与固体载体结 合的合适三糖的酶促半乳糖苷化也作了详细描述[Blixt等Carbohydr.Res. 1999,319,80 ; Renaudie等ibid. 2004, 339,693]。这些复杂的酶促系统代表用于LNnT的大规模生产的非 常昂贵的方法和困难的纯化方案。
[0008] 公开的针对LNnT的总的合成程序[Zurabyan等SovietJ.Bioorg.Chem. 1978,4， 679;Paulsen等Carbohydr.Chem. 1987,169,105;Aly等ibid. 1999, 316,121]包括多个反 应步骤、保护基操作和色谱法纯化、低产率，并且仅提供毫克量的LNnT，因此它们对于大规 模制备没有提供引人注意的技术。作为拟红细胞糖苷酯的苄基类似物的1-0-苯基-LNnT 的合成也已公开[Ponpipom等TetrahedronLett. 1978, 20,1717]〇
[0009] 当从天然来源分离[Kuhn等Chem.Ber. 1962,95, 513]或通过酶方法 [EP-A-1405856]制备时，LNnT被表征为晶体物质。
[0010] 对于LNnT和用于它的中间体，仍然需要可以简化迄今为止想到的分离、纯化和制 备问题的晶体产品。
【发明内容】
[0011] 本发明的第一方面涉及一种用于制备Galpβl_4GlcNAcpβl_3Galpβl_4Glc(LN ηΤ)的方法，所述方法包括以下步骤：
[0012] a)使由通式5表征的供体
[0013]
[0014] 其中R4是任选取代的酰基，
[0015] _冊51?6选自-熟(32、-順-卤代酰基、苯邻二甲酰亚胺、四氯苯邻二甲酰亚胺、2,3-二 苯基马来酰亚胺和2, 3-二甲基马来酰亚胺，
[0016] X选自卤素、_0C( =NH)CC13、-OAc、-OBz和-SR7，其中馬选自烷基和任选取代的 苯基，
[0017] 与通式6的受体发生反应
[0018]
[0019] 其中&是通过催化氢解可去除的基团，
[0020] r2是任选取代的酰基，而
[0021] 私选自任选取代的酰基或H，
[0022] 从而产生通式4的化合物
[0023]
[0024] 其中&、R2、R3、心和-NR5R6是如上所定义的，
[0025] b)将通式4的化合物转化为通式1的化合物
[0026]
[0027] 其中札是如上所定义的，
[0028]c)使所述通式1的化合物结晶，以及
[0029] d)随后使所述通式1的化合物经过催化还原。
[0030] 本发明的第二方面提供GalpPl-4GlcNAcp0l-3Galp0l-4Glc(LNnT)的一种多 晶型物。
[0031] 本发明的第三方面涉及GalpPl-4GlcNAcp0l-3Galp0l-4Glc(LNnT)的多晶型 物，其用作药物试剂。
[0032] 本发明的第四方面提供GalpPl_4GlcNAcp0l_3Galp0l_4Glc(LNnT)的多晶型 物，其用作营养添加剂。
[0033] 本发明的第五方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含 GalpPl-4GlcNAcp0l-3Galp0l-4Glc的多晶型物。
[0034] 本发明的第六方面提供一种营养组合物，所述营养组合物包含 GalpPl-4GlcNAcp0l-3Galp0l-4Glc的多晶型物。
[0035] 本发明的第七方面涉及通式Γ的化合物
[0036]
[0037] 其中R\选自取代苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的 萘甲基。
[0038] 本发明的第八方面提供通式2'的化合物
[0039]
[0040] 其中R\选自取代苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的 萘甲基。
[0041] 本发明的第九方面涉及通式3的化合物
[0042]
[0043] 其中&选自任选取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选 取代的萘甲基，而_NR5R6选自-NH-卤代酰基，苯邻二甲酰亚胺，四氯苯邻二甲酰亚胺，2， 3-二苯基马来酰亚胺和2, 3-二甲基马来酰亚胺。
[0044] 本发明的第十方面提供通式4'的化合物
[0045]
[0046] 其中&选自任选取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任 选取代的萘甲基，并且私和R4各自独立地是任选取代的酰基，R3选自任选取代的酰基和 !1，-冊51?6选自-熟〇 2，-順-卤代酰基，四氯苯邻二甲酰亚胺，2,3-二苯基马来酰亚胺和2， 3-二甲基马来酰亚胺。
[0047] 本发明的第十一方面涉及通式4a的化合物
[0048]
[0049] 其中&选自任选取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选 取代的萘甲基。
[0050] 本发明的第十二方面提供通式5'的化合物
[0051]
[0052] 其中R4是任选取代的醜基，优选乙醜基，-NR5R6是-NH- 1?代醜基，优选-NH-二氣 乙酰基或-NH-三氟乙酰基，并且R7是任选取代的苯基，优选苯基。
[0053] 本发明的第十三方面涉及通式6'的化合物
[0054]
[0055] 其中&选自任选取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选 取代的萘甲基，私是任选取代的苯甲酰基，并且1? 3选自任选取代的酰基和H。
【附图说明】
[0056] 下文中将参考附图进一步详细地描述本发明，其中：
[0057] 图1显示根据实施例34制备的晶体LNnT的X射线粉末衍射图。
[0058] 图2显示根据34和EP-A-1405856制备的晶体LNnT的X射线粉末衍射图的比较 (连续曲线：根据实施例34制备的晶体LNnT的衍射图；垂直线：取自EP-A-1405856的数 据）。
[0059] 图3显示根据实施例34制备的晶体LNnT的固态13C_NMR谱图。
【具体实施方式】
[0060] 在本说明书通篇中，术语"烷基"，单独地或与另一种原子或基团连接时，指具有 1-6个碳原子的直链或支链烃基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、1 丁基、异丁基、仲丁基、叔 丁基等。
[0061] 在本申请中，术语"芳基"指同芳香性基团如苯基或萘基。优选地，芳基指苯基。
[0062] 在本说明书中，术语"酰基"表示R-C( = 0)_，其中R可以是H、烷基或芳基，如甲 酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、新戊酰基、苯甲酰基等。所述烷基和芳基残基都可以被取代。 [0063] 对于本说明书及权利要求的目的，术语"任选取代的"指目标基团可以带有取代基 或可以是未被取代的。
[0064] 对于本说明书及权利要求的目的，术语"取代的"指目标基团被通常改变链或环的 总体化学特性的基团取代。取代基可以被用于改变分子作为整体的性质，如稳定性、可溶性 和形成晶体的能力。本领域技术人员将知道可以在给定情形下用作备选方案的具有相似大 小和电荷特性的其他合适取代基。
[0065] 更通常地，与术语"烷基"、"芳基"和"酰基"结合时，术语"任选取代的"意在表示 目标基团可以被选自以下的基团取代一次或多次，优选1-5次，更优选1-3次：烷基（仅对 芳基和芳族酰基）、羟基、烷氧基（即烷基-氧基）、羧基、氧代（形成酮或醛官能度）、烷氧 基幾基、烷基幾基、甲醜基、芳基、芳氧基幾基、芳氧基、芳基氣基、芳基幾基、氣基、单和^?烧 基氣基、氣基甲醜基、单和^烷基 _氣基幾基、烷基幾基氣基、氛基、烧醜氧基、硝基、烧硫基 和卤素（F、Cl、Br、I)。
[0066] 表述"通过催化氢化可去除的基团"指这样的基团，所述基团的C-0键在已知 用于氢解的催化量钯、阮内镍或另一种适当金属催化剂存在下通过加入氢而裂解，导致 产生0H基团。此类基团是技术人员熟知的并且被充分讨论的[例如P.G.M.Wuts和 T.W.Greene〖ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis(有机合成中的保护基团），John Wiley&Sons(2007)]。合适的基团包括苄基、二苯基甲基（二苯甲基）、1-萘甲基、2-萘甲 基或三苯基甲基（三苯甲基），它们各自可以被选自以下的一个或多个基团任选取代：烷 基、烷氧基、苯基、氣基、醜基氣基、烷基氣基、^烷基氣基、硝基、駿基、烷氧基幾基、氣基甲 酰基、N-烷基氨基甲酰基、N，N-二烷基氨基甲酰基、叠氮基、卤代烷基或卤素。优选地，如 果存在，这样的取代在芳环上。尤其优选的保护基是被选自烷基或卤素的一个或多个基团 任选取代的苄基。更优选地，保护基选自未取代的苄基、4-氯苄基和4-甲基苄基。这些尤 其优选的和更优选的保护基的优势在于：氢解的副产物只有甲苯或取代甲苯。即使在数吨 规模中，这样的副产物也可以经由蒸发和/或萃取过程容易地从水溶性寡糖产物中除去。 [0067] 结合基团_NR5R6中的-NH-卤代酰基，术语"卤代酰基"指式CnHxXy_C( = 0)-的卤 代醜基，其中整数η是1、2或3,x+y= 2n+l，前提是X<y，并且X是F、C1和Br，如二氣乙 酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、七氟丁酰基等。
[0068] 本发明代表一种适用于LNnT的大规模制备的商业方法，即典型地用制备成批的 至少lkg的LNnT，如至少5kg，或至少50kg，或甚至至少200kg，例如至少1吨的LNnT。成功 的策略是基于引入相关的允许简单且可靠的纯化方法的晶体中间体。结晶或再结晶是从污 染物分离产物并获得纯物质的最简单和廉价的方法之一。此外，在产品开发中，提供固体的 一种或多种晶体变体（多晶型物）是一个重要的因素，因为不同的晶形不同地影响化合物 的性质，例如热力学稳定性、可溶性、密度、吸湿性、电性质（如介电常数，电导率）、机械性 质（如易碎性、硬度、抗断强度、弹性）、光学性质（如颜色、透明度、折射）等。它扩大了科 学人员拥有的可用于改善产品特性的物质的技能。
[0069] 本发明在第一方面提供了用于制备GalpPl_4GlcNAcp0l_3Galp0l-4Glc的方 法，所述方法包括以下步骤：
[0070] a)使由通式5表征的供体
[0071]
[0072] _冊51?6选自-熟(32，-順-卤代酰基，苯邻二甲酰亚胺，四氯苯邻二甲酰亚胺，2,3-二 苯基马来酰亚胺和2, 3-二甲基马来酰亚胺，
[0073] X选自卤素，_0C( =NH)CC13, -OAc，-OBz和_SR7，其中馬选自烷基和任选取代的 苯基，
[0074] 与通式6的受体反应
[0075]
[0076] 其中&是通过催化氢解可去除的基团，
[0077] R2是任选取代的酰基并且
[0078] R3选自任选取代的酰基或H，
[0079] 从而产生通式4的化合物
[0080]
[0081] 其中&、R2、R3、心和_NR5R6是如上所定义的，
[0082] b)将通式4的化合物转化为通式1的化合物
[0083]
[0084] 其中札是如上所定义的，
[0085] c)使通式1的化合物结晶，以及
[0086] d)随后使通式1的化合物经过催化还原。
[0087] 关于步骤a)，根据通式4的经充分保护的LNnT衍生物在糖基化条件下在通式5的 化合物（供体）与通式6的化合物（受体）的反应中合成。
[0088] 通式6的乳糖受体与通式5的乳糖氨基供体的偶联可以在活化剂（促进剂或催化 剂）的存在下在非质子溶剂或非质子溶剂的混合物中进行以导致所需的糖基化产物。新的 糖苷间键合通过以下方式形成：用根据通式6的受体的3' -0H基团亲核取代根据通式5的 供体的离去基团X。两个参与反应的反应物中的其他官能团需要用保护基屏蔽。此外，本发 明的发明人意识到区域选择性糖基化可以在其中私是Η的通式6的受体上实现。在这样的 二羟基受体中，平伏的3'-0Η和轴向的4'-0Η的反应性是不同的：平伏的0Η基团在糖基化 条件下可以充当更强的亲核体。因此，通过仔细地选择条件如供体反应性、溶剂、温度、促进 剂性质、反应物/促进剂的添加方式等，可以推动反应以形成所需的1-3糖苷间键合而不是 1-4偶联。对于立体选择性尤其需要注意。立体化学结果可能受到诸如以下的不同因素影 响：供体C-2处是否存在参与基团，离去基团X的性质，溶剂效应，供体和受体两者上的保护 基的性质，促进剂或催化剂的性质，温度，压力，供体和受体之间的空间相互作用等。在葡糖 氨基或乳糖氨基衍生物的情况中，开发了一系列糖基化的异头活化并且其对于糖化学领域 技术人员是可用的。这些方法通过综述和手册被广泛讨论，例如Demchenko(Ed. ):Handbook ofChemicalGlycosylation(化学糖基化手册），Wiley(2008)。为了实施例，取决于X基 团，以下简要提及一些总的考虑。
[0089] 糖基卤化物（X指F、Cl、Br、I)经常被用于糖基化反应，原因在于其容易的可及性 和令人满意的反应性。典型地，对于亲核取代，异头卤化物遵循F<Cl<Br<I的反应性 次序。糖基化反应通常通过重金属离子，主要是汞或银，以及路易斯酸促进。
[0090] 糖基三氯乙酰亚胺酯（X= -oc( =NH)CC13)可以容易地通过在无机或有机碱催 化下将游离的异头0H添加到三氯乙腈来制备。在典型的糖基化反应中，催化量的路易斯酸 如三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐或bf3-醚合物促进偶联。
[0091] 糖基化反应中的糖基乙酸酯或苯甲酸酯（X表示-OAc或-0BZ)首先经历亲电子活 化，提供反应性中间体，然后用亲核0H受体处理。选择的典型活化剂是布朗斯台德酸（如 TsOH、HC104、氨基磺酸）、路易斯酸（如ZnCl2、SnCl4、三氟甲磺酸盐、BF3-醚合物、三苯甲基 高氯酸盐、A1C13、三氟甲磺酸酐）和它们的混合物。
[0092] 硫苷（X表示烷硫基或苯硫基）可以由