拌5h，然后通过添加AmberliteIR 120H+树脂进行中和，将该树脂滤除，将滤液蒸发至干。将残余物溶解在温热的DMF(lOml) 中并逐滴加入到1Pr20(150ml)中，并且将该悬浮液另外搅拌3h。将沉淀滤除，用1Pr20洗涤 (2x20ml)并干燥，从而产生4. 2g作为灰白色粉末的产物（91% )(通式3的化合物，其中 R!=Bn，-NR5R6= -NH-三氯乙酰基，01^为β型）。MS(ESP) :900. 1[M-H]。13CNMR(D20) 5:105.6，105.5，104.2，103.7(异头碳）。]\^. :134,5-135。(：。
[0262] 可以类似地从实施例21的化合物制备相同的产物。
[0263] 实施例23
[0264] 根据实施例22,从实施例19的化合物类似地制备：通式3的化合物，其中札= 4-甲基苄基，-NR5R6= -NH-三氯乙酰基，ORβ型。
[0265] 4NMR(D20) :7. 25 (dd，4Η，芳族），4· 98 (d，1Η)，4· 88 (d，1Η)，4· 8 (s)，4· 7 (d，1Η)， 4. 5 (dd，1H)，4. 44 (d，1H)，4. 18d(1H)，3. 9 (m)，3. 78 (m)，3. 6 (m)，3. 36 (s)。
[0266] 13C匪R(D20) :167. 7,141. 5, 136. 2,132. 0,131. 7,105. 7,105. 6, 104. 2,103. 7， 94. 3,84. 2,81. 1，80. 9,78. 1，77. 6,77. 5, 77. 4, 77. 1，75. 5,75. 3,74. 5,74. 1，73. 7,72. 9， 71. 3,71. 0,63. 8,63. 7,62. 9,62. 6,60. 0,51. 6,23. 0〇
[0267] 实施例24
[0268] 根据实施例22,从实施例20的化合物类似地制备：通式3的化合物，其中R1 = 4-氯苄基，_NR5R6= -NH-三氯乙酰基，ORβ型。
[0269] 虫NMR(D20) :7. 2 (m，4Η，芳族），4· 96 (d，1Η)，4· 88 (d，1Η)，4· 72 (d，1Η)，4· 62 (d， 1H)，4. 52 (m，2H)，4. 42 (m，1H)，4. 16 (d，1H)，3. 9 (m)，3. 7 (m)，3. 65 (m)，3. 58 (m)。
[0270] 13CNMR(D20) :167. 7(NHTCA羰基），137. 9,136. 2,132. 9,131. 3,105. 7,105. 6， 104·3，103·8(4χ异头碳），94.3(NHTCA(Χ13)，84·2,81·4,81·1，80·9,78·1，77·6,77·5， 77. 4, 77. 1，75. 5, 75. 3,74. 6,74. 5,73. 7, 73. 4, 72. 9,71. 3,71. 0,63. 8,63. 7,62. 8,62. 6， 60. 2,60. 0, 59. 8〇
[0271] 实施例25
[0272] 将35g的实施例22的化合物溶解在110mlMeOH和110mlΚ0Η(7. 5g)水溶液中并 将该混合物在室温搅拌1天。然后利用冰浴冷却该混合物，通过HC1气体中和并浓缩至干。 然后在室温用吡啶（150ml)和乙酸酐（150ml)将粗褐色玻璃状物（通式2的化合物，其中 R!=Bn，01^为β型，13CNMR(D20)δ:1〇7· 1，105· 7，105· 4，103· 7(异头碳））乙酰化 1 天。 将溶液浓缩，将该浆料溶解在〇12(：12中，用1MHC1溶液萃取有机相，然后用饱和NaHC03溶液 萃取有机相，用18304干燥，过滤并浓缩，从而产生43g褐色泡沫。使其经过柱色谱，从而得 到通式 4a的化合物，其中RfBr^ORAβ型）。13CNMR(CDC13)δ:101·2，100·8，100·4， 99. 2 (异头碳）。
[0273] 实施例26
[0274] 根据实施例25的去-N-酰基化步骤，从实施例23的化合物类似地制备：通式2的 化合物，其中札=4_甲基苄基，01^为β型。
[0275]4NMR(D20) :7. 3 (dd，4Η，芳族），4. 9 (d，1Η)，4. 72 (dd，1Η)，4. 5 (m)，4. 18 (d，1Η)， 3. 95 (m)，3. 8-3. 55 (m)，3. 34 (dd)。
[0276] 13C匪R(D20) :184. 1，141. 4, 136. 6,136. 1，131. 9,131. 6,131. 4, 105. 7,105. 3， 105. 2,100. 0,84. 8,81. 0,80. 9,78. 0,77. 7,77. 5,77. 4,77. 1，75. 9,75. 5,75. 2,74. 4,74. 0， 73. 6,73. 2,72. 7,72. 4,71. 2,70. 9,63. 7,63. 6,62. 5,58. 9,25. 9〇
[0277] 实施例27
[0278] 根据实施例25的去-N-酰基化步骤，从实施例24的化合物类似地制备：通式2的 化合物，其中Ri=4-氯苄基，01^为β型。
[0279] 虫NMR(D20) :7. 4(s，4H，芳族），4· 9(m，2H)，4· 75(m)，4· 52(dd，1Η)，4· 46(dd，1Η)， 4. 18 (d，1H)，3. 96 (m)，3. 86 (m)，3. 7 (m)，3. 62 (m)。
[0280] 13C匪R(D20) :184. 1，137. 9, 136. 2,132. 9,132. 6,131. 3,105. 7, 105. 2,104. 0， 103. 8, 84. 6,80. 9, 80. 7,78. 1，77. 6,77. 4, 77. 1，75. 5,75. 2, 74. 4, 73. 6, 73. 4, 72. 7, 71. 2， 70. 9,63. 8,63. 6,62. 8,62. 4, 58. 6, 51. 6, 25. 9〇
[0281] 实施例28
[0282] 将140g(107. 5mmol)过乙酰化的四糖（实施例25)溶解在1. 5LMeOH中，加入 NaOMe溶液（1M)直到pH10,并将该混合物在50°C搅拌过夜。产物从该反应混合物中结 晶。允许该混合物冷却至室温，然后将其冷却，过滤，用冷的EtOH洗涤滤液，然后干燥，从而 产生69g白色粉末（通式1的化合物，其中R1=Bn，0R#β型；80% )。13CNMR(D20)δ: 105.6，105.5，105.4，103.6(异头碳）。]\^.:284-286。(：。
[0283] 实施例29
[0284] 在室温，将150g纯化的胺（通式2的化合物，札=苄基，ORβ型）加入到水 (150mL)和Me0H(200mL)的混合物中。加入一个部分的乙酸酐（20mL)。lh的搅拌后，加入 额外的10mL乙酸酐并将混合物在室温搅拌。在lh的搅拌后，加入额外的10mL乙酸酐并将 混合物在室温再搅拌2h。最后，混合物是结晶物质。加入MeOH(250mL)并将混合物放入冰 箱过夜。过滤固体，用冷的Me0H(200mL)洗涤滤饼，从而产生260g浅褐色固体。此固体在 50°C在大气压下干燥（3天），产生118g产物（通式1的化合物，R1=Bn，01^为β型）。 80g在MeOH/水中的再结晶产生具有99. 7 %纯度（根据HPLC)的72. 6g产物。
[0285] 实施例30
[0286] 根据实施例29,从实施例26的化合物类似地制备：通式1的化合物，&= 4-甲基 苄基，〇1^为β型。
[0287] 4NMR(D20) :7. 3(dd，4H)，4· 88(d，1Η)，4· 7(m)，4· 54(d，1Η)，4· 48(d，1Η)，4· 42(d， 1H)，4. 34 (d)，4. 0-3. 5 (m)，3. 34 (dd，1H)。
[0288] 13C匪R(D20) :184. 2,177. 6, 173. 7,141. 5,136. 1，131. 9,131. 4, 105. 6,105. 5， 105. 4,103. 6,93· 2,84· 7,81· 5,81· 0,80· 8,78· 0,77· 6,77· 4,77· 1，75· 5,75· 2,74· 8,74· 0， 73. 6, 72. 9,63. 7,62. 8, 58. 9, 56. 4, 25. 9, 22. 9〇
[0289] 实施例31
[0290] 根据实施例29,从实施例27的化合物类似地制备：通式1的化合物，R1= 4-氯苄 基，〇1^为β型。
[0291] NMR(D20) ：7. 4(s,4H) ,4. 9(d, 1H) ,4. 72 (m) ,4. 52 (d, 1H) ,4. 8(d, 1H) ,4. 42 (d, 1H)，4. 16(d，1H)，4. 0-3. 52(m) 〇
[0292] 13C匪R(D20) :138. 9,177. 6, 138. 3,137. 9,136. 2,131. 3,105. 6, 105. 5,105. 4， 103. 7, 93. 2,86. 1，84. 7,81. 5, 81. 0,80. 8,78. 0, 77. 5,77. 4, 77. 2,77. 1，75. 5,75. 2, 74. 9， 63. 7,58. 9,57. 8,56. 4,24. 8〇
[0293] 实施例32
[0294] 将40g(50.lmmol)苄基糖苷（实施例28或29)溶解在200ml水、1. 6gPd-C中并 加入400μ1乙酸，并将该混合物在室温在H2气氛（约40bar)下搅拌2天。滤除催化剂， 用水洗涤滤饼，并将滤液逐滴加入到1. 61丙酮中，然后冷却，过滤并将收集的固体在真空 下干燥，从而产生31. 5gLNnT的白色粉末（44. 5mmol，89% )。
[0295] 实施例33
[0296] 将苄基糖苷（实施例28或29,100g)溶解在300ml水、2ml乙酸中并加入30ml MeOH，然后加入10gPd-C(5%)。在室温，将该混合物在5bar的氢气下氢化2天。将活性 炭（5g)加入到该混合物中，滤除催化剂和碳，用水（200ml)稀释滤液，将该水溶液加热至 50°C。通过加入EtOH(4L)如上所述地进行结晶。分离得到65gLNnT的白色固体。
[0297] 实施例34
[0298] 将50g苄基糖苷（实施例28或29)溶解在110mL水中并用Me0H(120mL)稀释该 溶液。加入Pd-C(2g，10%Pd)催化剂，并在60°(：在!12气氛下（5bar)氢化该混合物。在7h 后，滤除催化剂，用约20mL水：MeOH混合物（1 : 1)洗涤滤饼。
[0299] 结晶：将以上获得的溶液温热（50-55Γ)，在逐渐冷却至40°C的过程中向其中分 3-5个部分加入热的MeOH(600mL)。结晶立即开始。在加入甲醇后，将结晶混合物缓慢（3h) 冷却至室温，然后放入冰箱过夜。在玻璃滤器上过滤，用冷的MeOH洗涤固体，并在60°C在 真空干燥烘箱中干燥2天，从而产生37. 4g白色固体。HPLC纯度：100%，mp. :226-230°C。 13C-NMR(600MHz，D20 :CD30D= 3 : 2)δ:Glc(a)C-l93.2C-2 72.5C-3 72.7C-4 79.5C-5 71.3C-6 61.2,Glc(0)C-l97.2C-2 75.2C-3 75.7C-4 79.5C-5 76.1 C-6 61. 3,GalC-l104. 3C-2 71. 4C-3 83.1C-4 69. 7C-5*76. 2C-6 62. 3,GlcNAcC-l 104. 1C-2 56. 4C-3 73. 4C-4 79. 2C-5 75. 8C-6 61. 0NC0CH3 23. 3 174. 8,GalC-l 104.2C-2 72.3C-3 73.9C-4 69.9C-5*76. 6C-6 62.3 (* 可互换的分配）。
【主权项】
1. 一种Galpβl_4GlcNAcpβl_3Galpβl_4Glc的多晶型物，其特征在于，基于使 用CuKa辐射的测量，所述多晶型物显示在20. 32±0. 20，19. 10±0. 20,7. 98±0. 20， 21.03±0. 20, 20. 95±0.20 和 5. 66±0.20 2Θ角的X射线粉末衍射反射。2. 根据权利要求1所述的Galpβl-4GlcNAcpβl-3Galpβl-4Glc的多晶型物，所述多 晶型物显示在226-230°C之间的熔点。3. 根据权利要求1和2中任一项所述的Galpβl-4GlcNAcpβl-3Galpβl-4Glc的多晶 型物，其用作药物。4. 根据权利要求1和2中任一项所述的Galpβl-4GlcNAcpβl-3Galpβl-4Glc的多晶 型物，其用作营养添加剂。5. -种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1和2中任一项定义的 Galpβl-4GlcNAcp0l-3Galp0l-4Glc的多晶型物。6. -种营养组合物，所述营养组合物包含根据权利要求1和2中任一项定义的 Galpβl-4GlcNAcp0l-3Galp0l-4Glc的多晶型物。7. -种用于从包含一种或多种CfC6醇的溶剂系统中结晶Galpβl-4GlcNAcpβl-3Ga lpi3 1-4Glc的多晶型物的方法，基于使用CuKa辐射的测量，所述多晶型物显示在 20. 32±0· 20,19. 10±0· 20,7· 98±0· 20,21· 03±0· 20,20· 95±0· 20 和 5. 66±0· 20 2Θ角 的X射线粉末衍射反射。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述溶剂系统包含水。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述溶剂系统是水/甲醇。10. 根据权利要求9所述的方法，其包括下述步骤： a) 用水 / 甲醇制备Galpβl-4GlcNAcpβl-3Galpβl-4Glc溶液， b) 将所述Galpβl-4GlcNAcpβl-3Galpβl-4Glc溶液温热到 50-60°C， c) 在逐渐冷却至35_45°C下，向所述Galpβl_4GlcNAcpβl_3Galpβl_4Glc溶液中加 入热甲醇， d) 任选地加入种晶， e) 将所得的温热悬浮液冷却至0-8C。11. 根据权利要求10所述的方法，其中步骤a)中所用的水/甲醇混合物是~1 : 1混 合物。12. 根据权利要求10所述的方法，其中步骤a)中的Galpβl-4GlcNAcpβl-3Galpβ1 -4Glc溶液具有140-180g/L的浓度。13. 根据权利要求10所述的方法，其中步骤c)中，加入的热甲醇多至起始体积的 115-250%。14. 根据权利要求10所述的方法，其中步骤a)中的水/甲醇混合物是~1 : 1混合 物，步骤a)中的Galpβl-4GlcNAcpβl-3Galpβl-4Glc溶液具有 140-180g/L的浓度，并且 在步骤c)中，加入的热甲醇多至起始体积的115-250%。
【专利摘要】本发明涉及用于尤其是大规模制备四糖乳糖-N-新四糖(LNnt，式(I))、以及合成中的中间体、LNnt的新晶形(多晶型物)、以及它们在药物或营养组合物中的用途。
【IPC分类】C07H15/18, A23L33/125, C07H13/04, C07H1/06
【公开号】CN105330705
【申请号】CN201510751641
【发明人】伊什特万·鲍伊佐, 久洛·戴卡尼, 卡罗伊·阿戈什顿, 伊格纳西奥·费格罗拉·佩雷斯, 朱莉安·布泰, 马库斯·赫德罗斯, 费伦茨·霍瓦特, 皮罗什卡·科瓦奇-彭泽什, 拉斯·克罗杰, 克里斯托夫·勒里希, 安德烈亚斯·施罗温, 扬尼斯·弗拉斯达斯, 彼得·特林卡, 拉斯洛·卡尔马尔, 伊姆雷·科瓦奇, 尚多尔·德姆科, 阿格尼斯·阿戈什顿, 克里斯蒂安·里辛格
【申请人】格礼卡姆股份公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2011年2月21日
【公告号】CN102803282A, EP2536737A1, EP2536737A4, US8993740, US20120309949, US20150239923, WO2011100980A1