非拔牙根管填充材料以及非拔牙的牙组织再生方法

专利名称：非拔牙根管填充材料以及非拔牙的牙组织再生方法
技术领域：
本发明涉及一种填充在非拔牙的根管中的非拔牙根管填充材料，以及使用该非拔牙根管填充材料的非拔牙的牙组织再生方法。
背景技术：
目前，牙齿缺失的原因包括牙折在内大约一半是由龋齿造成的，如果摘除牙髓则牙齿缺失的可能性剧增这一情况为人所知。牙齿的平均寿命据说现在是57岁，如果想要一生都用自己的牙齿咀嚼，则牙齿的寿命需要提高20年以上。虽然进行了 8020运动(即使到了 80岁自己的牙齿也能残留20颗以上的运动)，但是现在80岁的人牙齿的平均颗数为大约8颗，老年人残存的牙齿数量几乎没有增加，需要对龋齿治疗进行彻底改革。如果将牙髓除去(摘除牙髓)，则修复性牙本质形成能力和感染防御机制丧失，由于疼痛这一警告信号的丧失导致龋齿扩大的危险性增加。而且，在牙髓摘除治疗中没有完美无缺的方法，在进行牙髓摘除、根管填充后，可能会因填充材料从牙冠侧露出而产生根尖病灶、垂直性牙折或审美性消失、或者术后疼痛。因此，在超老龄化社会中，以避免轻易摘除牙髓、延长牙齿寿命为目标，开发出由利用了牙齿再生医疗技术的牙本质/牙髓再生所得到的新的龋齿/牙髓炎疗法非常重要。关于牙本质再生，作为细胞疗法或基因疗法，在生体外向牙髓干细胞/前体细胞内导入骨形态发生蛋白(BMP，Bone Morphogenetic Proteins，成骨因子)等蛋白质或基因，再将进行了三维培养而分化后的成牙本质细胞与其胞外基质一起自体移植到活髓切断面上，能够使大量牙本质再生(非专利文献1、2)。但是，在产生牙髓炎的情况下，除了牙本质以外还需要使牙髓组织本身再生。另一方面，牙髓组织是血管和神经极其丰富的组织。在牙髓组织中存在一种自然治愈机制，即在牙髓受到创伤时会从局部释放出趋化因子，干细胞从牙髓深部血管周围迁移到创伤部位，进行增殖、分化，产生新生血管，形成修复性牙本质。特别是，牙髓的血管系统对营养或氧的供给源、代谢产物的排泄路径、牙髓的恒常性维持很重要。而且，牙髓神经对血流、牙本质小管内溶液的液流、牙髓内压的调节具有重要的作用，对血管新生、免疫应答细胞或炎性细胞的浸润进行干预并调节炎症，有助于维持牙髓的恒常性、强化牙髓防御反应。因此，在牙本质/牙髓再生过程中，需要考虑血管和神经的相互作用以及血管新生、神经再生。侧群细胞(SP细胞)以大致各占一半的比例含有⑶31-/⑶146-SP细胞和⑶31-/CD146+SP细胞。与CD31-/CD146+SP细胞相比，CD31-/CD146-SP细胞极显著地促进血管新生、神经再生以及牙髓再生，并且显著地对基质细胞衍生因子-1 (SDF-I)的趋化因子受体即C)(CR4mRNA进行表达。从皮肤等创伤部位分泌出SDF-1，由SDF-I引起的人干细胞的迁移依赖于CXCR4的表达这一情况为人所知。CXCR4也被称为干细胞的标记物，从人脐带血分选出胚胎干细胞样
4细胞作为CXCR4+/SSEA-4+/0ct-4+(非专利文献3)。作为神经干细胞，从小鼠胎鼠脑部分选出迁移到中枢神经部位且具有显著的神经分化能力的CXCR4+/SSEA-1+细胞(非专利文献4)。据报告在人胰脏内，CXCR4阳性细胞具有多能性，能够用于对可分化成胰岛素分泌细胞的干细胞、前体细胞(非专利文献幻进行分选。另一方面，关于牙髓再生，迄今为止还有以下报告在牙根未发育完全的牙齿中，如果在拔牙并进行牙髓摘除、根管治疗后再次移植，则牙髓可再生。而且，还有以下报告即使是在根尖部发生病变的牙根未发育完全的牙齿，通过在拔牙后进行彻底的根管扩大、清创，并将血块填充至牙骨质-牙本质界，再用三氧化矿物凝聚体(Mineral TrioxideAggregate, MTA)将窝洞完全封闭，也能使牙髓样组织再生。据报告，在犬的牙根发育完全的牙齿中，如果拔牙后摘除牙髓，切断根尖部或者将根尖部扩大1. Imm以上后再进行移植，然后填充血块，则会出现牙髓样组织的再生(非专利文献6)。上述根管内牙髓再生大部分都是关于牙根未发育完全的牙齿的报告，无法证明已在根管内再生的组织是带有血管、神经的牙髓固有的组织。而且，都是先拔牙再在生体外进行根管扩大、清创，然后进行再移植并填充血块。非专利文献1 =Nakashima 和 Reddi，2003 (PMID12949568 doilO. 1038/nbt864)非专利文献2 =Nakashima 和 Akamine，2006 (PMID 16186748)非专利文献3 :KuciaM 等，2007(PMID 17136117doi :10. 1038/sj. leu. 2404470)非专禾Ij文献 4 :CortiS 等，2005 (PMID 16150803doi 10· 2478/V10042-008-0045-0)非专利文献5 =KoblasT 等，2007 (PMID :17328838)非专利文献6 :Laureys 等 2001，(PMID 11298308doi 10. 1067/mod. 2001. 113259)

发明内容
-发明所要解决的技术问题-但是，在先拔牙再在生体外进行根管扩大、清创，然后进行再移植并填充血块的方法中，有时会在牙髓腔、根管内的牙本质发生特发性牙质吸收(内部吸收)，如果该内部吸收增加则会在牙本质上发生穿孔。而且，对于临床上通常进行的将牙根已发育完全的正常智齿等再植入其它牙齿缺失部位的疗法，有可能在再植牙数年后发生由内部吸收或外部吸收引起的牙齿松动或脱落。并且，对于在牙根发育完全牙齿的情况下，摘除牙髓或治疗受感染根管的牙髓组织再生方法以及用于牙髓组织再生的根管填充材料的开发则完全没有确立。本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供一种新型独创且适当的根管填充材料以及使用该根管填充材料的牙组织再生方法。该根管填充材料对牙根发育完全的牙齿能够实现不发生内部吸收或外部吸收，不出现破牙质细胞，成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上的牙组织再生。-用以解决技术问题的技术方案-
本发明的第一观点所涉及的非拔牙根管填充材料，该非拔牙根管填充材料含有向摘除牙髓后或者在对受感染根管进行根管扩大清创后，插入非拔牙根管的根尖侧的牙髓干细胞和胞外基质。优选上述牙髓干细胞包含牙髓CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-I阳性细胞、⑶105阳性细胞、牙髓SP细胞、⑶31阴性且⑶146阴性细胞、⑶对阳性细胞、⑶150阳性细胞、CD^阳性细胞、CD34阳性细胞、CD44阳性细胞、CD73阳性细胞以及CD90阳性细胞中的至少任一种。优选上述牙髓SP细胞为CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-I阳性细胞、CD31阴性且⑶146阴性细胞、⑶M阳性细胞、⑶105阳性细胞、⑶150阳性细胞、⑶四阳性细胞、⑶34阳性细胞、⑶44阳性细胞、⑶73阳性细胞或者⑶90阳性细胞中的任一种。优选上述非拔牙根管填充材料使牙髓干细胞附着在根管的根尖侧，并且使含有细胞趋化因子、细胞增殖因子、神经营养因子以及血管新生因子中的至少一种因子的趋化因子附着在根管的牙冠侧。优选上述细胞趋化因子为SDF-1、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干细胞因子(SCF)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、Slit以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)中的至少任一种。优选上述细胞增殖因子为胰岛素样生长因子(IGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及血小板衍生生长因子(PDGF)中的至少一种。优选上述神经营养因子为胶质细胞系衍生神经营养因子(⑶NF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经肽Y(Neurop^tideY)以及神经营养蛋白3 (Neurotrophin 3)中的至少一种。优选上述胞外基质由生体亲和性材料组成，该生体亲和性材料包含胶原蛋白、人工蛋白聚糖、明胶、水凝胶、血纤蛋白、二乙氧磷酰硫胆碱、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、壳多糖、聚乳酸(PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙醇酸(PGA)、聚内消旋乳酸(PDLLA)、聚己内酯(PCL)、羟基磷灰石、β-磷酸三钙(β -TCP)、碳酸钙、钛以及金中的至少一种。优选上述牙髓干细胞在上述胞外基质中的含有率在lX103cell/yl以上1 X IO6Cell/μ 1 以下。本发明的第二观点所涉及的非拔牙的牙组织再生方法，是通过在摘除牙髓后或对受感染根管进行根管扩大清创后的非拔牙根管的根尖侧注入含有牙髓干细胞和胞外基质的非拔牙根管填充材料，使根管内的牙组织再生。优选上述牙髓干细胞包含牙髓CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-I阳性细胞、⑶105阳性细胞、牙髓SP细胞、⑶31阴性且⑶146阴性细胞、⑶对阳性细胞、⑶150阳性细胞、CD^阳性细胞、CD34阳性细胞、CD44阳性细胞、CD73阳性细胞以及CD90阳性细胞中的至少一种。优选上述牙髓SP细胞为CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-I阳性细胞、CD31阴性且⑶146阴性细胞、⑶M阳性细胞、⑶105阳性细胞、⑶150阳性细胞、⑶四阳性细胞、⑶34阳性细胞、⑶44阳性细胞、⑶73阳性细胞⑶90阳性细胞中的任一种。优选上述非拔牙根管填充材料使牙髓干细胞附着在根管的根尖侧，并且使含有细
6胞趋化因子、细胞增殖因子、神经营养因子以及血管新生因子中的至少一种因子的趋化因子附着在根管的牙冠侧。优选上述细胞趋化因子为SDF-I、VEGF、G-CSF, SCF、MMP3、Slit以及GM-CSF中的至少一种。优选上述细胞增殖因子为IGF、bFGF以及PDGF中的至少一种。优选上述神经营养因子为⑶NF、BDNF, NGF、神经肽Y以及神经营养蛋白3中的至少一种。优选上述胞外基质由生体亲和性材料组成，该生体亲和性材料包含胶原蛋白、人工蛋白聚糖、明胶、水凝胶、血纤蛋白、二乙氧磷酰硫胆碱、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、壳多糖、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、羟基磷灰石、β -TCP、碳酸钙、钛以及金中的至少一种。优选在将上述根管填充材料注入上述根管的根尖侧之前，通过对上述根管进行扩大，使根尖部的根管的粗细达到规定大小。优选上述牙髓干细胞在上述胞外基质中的含有率在lX103Cell/l·! 1以上1 X IO6Cell/μ 1 以下。-发明的效果-根据本发明，对牙根发育完全的牙齿能够实现不发生内部吸收或外部吸收，不出现破牙质细胞，成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上的牙组织再生。


图1是第一实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料的说明图。图2是对第一实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料的制备工序进行说明的说明图。图3Α是患有牙髓炎的牙齿的说明图。图;3Β是说明已进行了摘除牙髓后的根管扩大处置之处的示意图。图3C是对填充非拔牙根管填充材料之处进行说明的示意图。图3D是对已注入明胶(spongel)和树脂之处进行说明的示意图。图3E是表示牙髓再生和血管再生的示意图。图3F是对已注入形态发生因子和树脂之处进行说明的示意图。图3G是表示牙本质再生的示意图。图;3H是细菌到达根管壁的牙本质和根尖牙周组织的根尖性牙周炎的示意图。图4A是使趋化因子附着在根管的牙冠侧的非拔牙根管填充材料的说明图。图4B是使趋化因子附着在根管的牙冠侧，并且在牙冠部侧残留有胞外基质的非拔牙根管填充材料的说明图。图5是对第二实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料的制备工序进行说明的说明图。图6A是拔牙后在生体外进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-I和CD105阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，对将吸附有SDF-I和⑶105阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内并进行再移植14天后的情况进行说明的图。
图6B是拔牙后在生体外进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-I和CD105阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，将吸附有SDF-I和⑶105阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内并进行再移植14天后根管内部牙本质壁的高倍率图像。图6C是拔牙后在生体外进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-I和CD105阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，将吸附有SDF-I和⑶105阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内并进行再移植14天后牙根外侧的牙本质/牙骨质壁的高倍率图像。图7A是在未拔牙的情况下在生体内进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-I和CD105阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，对将吸附有SDF-I和CD105阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内14天后的情况进行说明的图。图7B是在未拔牙的情况下在生体内进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-I和CD105阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，将吸附有SDF-I和CD105阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内14天后根管内部牙本质壁的高倍率图像。图8A是在未拔牙的情况下在生体内进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-I和CXCR4阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，对将吸附有SDF-I和CXCR4阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内14天后的情况进行说明的图。图8B在未拔牙的情况下在生体内进行牙髓摘除后根管扩大，使SDF-I和CXCR4阳性细胞吸附在I型/III型混合胶原蛋白上，将吸附有SDF-I和CXCR4阳性细胞的I型/III型混合胶原蛋白注入根管内14天后根管内部牙本质壁的高倍率图像。图9A是表示从犬恒牙牙髓组织分离出的由流式细胞术得到的牙髓源性CD105阳性细胞之比例的图。图9B是表示从犬恒牙牙髓组织分离出的由流式细胞术得到的脂肪源性CD105阳性细胞之比例的图。图9C是表示从犬恒牙牙髓组织分离出的培养第3天的初代牙髓CD105阳性细胞的图。图9D是表示从犬恒牙牙髓组织分离出的培养第10天的初代牙髓CD105阳性细胞的图。图9E是表示从脂肪组织分离出的培养第3天的初代脂肪CD105阳性细胞的图。图9F是表示从脂肪组织分离出的培养第10天的初代脂肪CD105阳性细胞的图。图IOA是表示在第30天，牙髓⑶105阳性细胞的脂肪诱导力的图。图IOB是表示在第30天，未分选的总牙髓细胞的脂肪诱导力的图。图IOC是表示在第30天，脂肪⑶105阳性细胞的脂肪诱导力的图。图IOD是表示牙髓⑶105阳性细胞、未分选的总牙髓细胞以及脂肪⑶105阳性细胞脂肪诱导力的基因表达对比图。图IOE是表示12小时后，牙髓⑶105阳性细胞的血管诱导力的图。图IOF是表示12小时后，未分选的总牙髓细胞的血管诱导力的图。图IOG是表示12小时后，脂肪⑶105阳性细胞的血管诱导力的图。图IOH是表示在第14天，牙髓CD105阳性细胞的神经球(Neurosphere)形成能力的图。图101是表示在第14天，未分选的总牙髓细胞的神经球形成能力的图。
8
图IOJ是表示在第观天，对牙髓⑶105阳性细胞进行神经丝免疫染色的图。图IOK是表示牙髓⑶105阳性细胞的神经丝、神经调制蛋白、电压依赖性钠通道以及Ia型(ScnlA)mRNA表达的图。图IOL是表示在第观天，牙髓⑶105阳性细胞的牙本质/成骨诱导力的图。图IOM是表示在第观天，未分选的总牙髓细胞的牙本质/成骨诱导力的图。图ION是表示在第观天，脂肪⑶105阳性细胞的牙本质/成骨诱导力的图。图100是表示牙髓⑶105阳性细胞、未分选的总牙髓细胞以及脂肪⑶105阳性细胞分化为成牙本质细胞的能力对比图。图IOP是表示已添加了 SDF-I终浓度50ng/ml的牙髓⑶105阳性细胞、未分选的总牙髓细胞以及脂肪CD105阳性细胞的增殖能力的图，表示培养2、12、24以及36小时后的细胞数。图IlA是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。图IlB是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的局部放大图。图IlC是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的局部放大图。图IlD是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的成牙本质细胞分化的图。图IlE是表示在摘除犬牙髓后第14天，只将CD105阳性细胞自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。图IlF是表示在摘除犬牙髓后第14天，只将SDF-I自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。图IlG是表示在摘除犬牙髓后第90天，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。图IlH是表示在摘除犬牙髓后第90天，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图，表示再生组织上部的新生血管。图IlI是表示在摘除犬牙髓后第90天，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图，表示再生组织中央部的新生血管。图IlJ是表示正常牙髓组织的细胞的图。图IlK是表示在摘除犬牙髓后，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到空洞的根管内，在第90天，并列在沿牙本质侧壁重新形成的骨样/管样牙本质(OD)上的成牙本质细胞的图。图IlL是表示在摘除犬牙髓后，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到空洞的根管内，在第90天，由原位杂交分析得到的成牙本质细胞分化的图，表示烯胺素(Enamelysin)/MMP20。图IlM是表示摘除犬牙髓后，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到空洞的根管内，在第90天，由原位杂交分析得到的成牙本质细胞分化的图，表示牙本质涎磷蛋白(Dentin Sialophosphoprotein，Dspp)。
图IlN是表示在摘除犬牙髓后第14天，将总牙髓细胞与SDF-I —起移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。图110是表示在摘除犬牙髓后第14天，将总牙髓细胞与SDF-I —起移植到空洞的根管内进行牙髓再生的血管新生的放大图。图IlP是表示在摘除犬牙髓后第90天，将总牙髓细胞与SDF-I —起移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。图IlQ是表示在摘除犬牙髓后第90天，将总牙髓细胞与SDF-I —起移植到空洞的根管内进行牙髓再生的放大图。图IlR是表示在摘除犬牙髓后第14天，将脂肪⑶105阳性细胞与SDF-I —起移植到空洞的根管内进行牙髓再生的图。图IlS是表示第14天的新生再生组织相对于根管表面积之比例的图，图中的数据是用5个试样的平均值士SD来表示的比例。图IlT是表示由BS-I凝集素进行免疫染色的图。图IlU是由全样载片(Whole Mount)凝集素染色得到的新生血管的三维解析，是表示移植牙髓⑶105阳性细胞存在于新生毛细血管周围之状态的图。图IlV是由全样载片凝集素染色得到的新生血管的三维解析，是表示第14天再生组织的诱导血管之三维图像的图。图IlW是由全样载片凝集素染色得到的新生血管的三维解析，是表示DiI标记的移植细胞分散在整个再生组织中之状态的图。图IlX是表示正常牙髓组织的图。图IlY是表示第14天的新生再生组织的蛋白基因产物9. 5 (PGP 9. 5)免疫染色的图。图IlZ是表示在下颚第三切牙再生的牙髓组织DiI标记的图。图12A是表示正常牙髓组织的二维电泳的图。图12B是表示再生牙髓组织的二维电泳的图。图12C是使正常牙髓组织的二维电泳与再生牙髓组织的二维电泳重叠所得的图。图12D是表示正常牙髓组织的二维电泳的图。图12E是表示牙周膜组织的二维电泳的图。图12F是使正常牙髓组织的二维电泳与牙周膜组织的二维电泳重叠所得的图。图13A是表示在犬受感染根管治疗后第14天，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到已拔牙的根管内进行牙髓再生的图。图13B是表示在犬受感染根管治疗后第14天，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到未拔牙的根管内进行牙髓再生的图。图13C是表示在犬受感染根管治疗后第14天，将牙髓⑶105阳性细胞与SDF-I —起自体移植到未拔牙的根管内进行牙髓再生的局部放大图。图14A是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓⑶105阳性细胞与G-CSF —起自体移植到已拔牙的根管内进行牙髓再生的图。图14B是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓⑶105阳性细胞与G-CSF —起自体移植到未拔牙的根管内进行牙髓再生的图。
10
图14C是表示在摘除犬牙髓后第14天，将牙髓⑶105阳性细胞与G-CSF —起自体移植到未拔牙的根管内进行牙髓再生的局部放大图。-附图标记说明_
100对象牙齿
110根尖性牙周炎
200非拔牙根管填充材料
210胞外基质
220牙髓干细胞
230趋化因子
400管
500牙本质
610明胶
620树脂
630形态发生因子。
具体实施例方式《第一实施方式》以下，参照附图对本发明的实施方式进行具体说明。本实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料含有牙髓干细胞和胞外基质，在摘除牙髓后或在对受感染根管进行根管扩大清创后，插入非拔牙的根管的根尖侧。图1是本实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200的说明图。非拔牙根管填充材料200通过使牙髓干细胞220附着在胞外基质210上而形成。牙髓干细胞220附着在非拔牙根管填充材料200的根管的根尖侧。牙髓干细胞是源自恒牙或乳牙的牙髓干细胞。牙髓干细胞包含牙髓CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-I阳性细胞、⑶105阳性细胞、牙髓SP细胞、⑶31阴性且⑶146阴性细胞、CD24阳性细胞、CD150阳性细胞、CD29阳性细胞、CD34阳性细胞、CD44阳性细胞、⑶73阳性细胞以及⑶90阳性细胞中的至少一种。例如，犬恒牙牙髓细胞包含0. 8%的CXCR4阳性细胞，血管新生能力等组织再生能力较高。牙髓SP细胞包含CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-I阳性细胞、CD31阴性且⑶146阴性细胞、⑶M阳性细胞、⑶105阳性细胞、⑶150阳性细胞、⑶四阳性细胞、⑶34阳性细胞、⑶44阳性细胞、⑶73阳性细胞、或者⑶90阳性细胞中的任一种。应予说明，⑶31-/⑶146-侧群(SP)细胞若移植到小鼠下肢缺血部位则能促进血流恢复、血管新生，若移植到大鼠脑梗死缺血部位则能促进神经细胞的分化、使运动麻痹康复。而且，⑶31-/⑶146-SP细胞若移植到犬活髓切断面上则在活髓切断面上的窝洞内出现血管新生、神经再生、牙髓再生。由此，在采用⑶31-/⑶146-SP细胞作为牙髓干细胞的情况下，虽然认为牙髓再生能力较高，但为了分选SP细胞，需要用DNA结合荧光色素即Hoechst33342对细胞进行标记，因此应用于临床时在安全性方面可能会产生问题。但是，由于能够不采用因为存在污染的可能性而在临床上无法使用的流式细胞术或者因价格高昂而使用受到限制的抗体珠(Antibody Beads)法对牙髓CXCR4阳性细胞进行分选，而是通过使用了 SDF-1、AMD3100、或G-CSF等的迁移法对牙髓CXCR4阳性细胞进行分选，因此能够安全且低成本地进行分选。因此，在用CXCR4阳性细胞作为牙髓干细胞的情况下，能够立刻用于临床，而且还有价格便宜这一重要优点。牙髓干细胞可以是从接受牙组织再生处置的对象动物本身提取出的自体细胞，也可以是从接受牙组织再生处置的对象动物以外的动物提取出的同种细胞。优选牙髓干细胞在非拔牙根管填充材料200中的含有率在IX IO3Cell/μ 1以上1 X IO6Cell/μ 1以下。这是因为如果牙髓干细胞的含有率小于lX103cell/y 1，则根管内牙组织的再生可能会不充分。另一方面，如果牙髓干细胞的含有率大于lX106cell/yl，则可能会对对象牙齿产生难以预料的副作用。优选胞外基质(支架(Scaffold))210由生体亲和性材料组成，该生体亲和性材料包含胶原蛋白、人工蛋白聚糖、明胶、水凝胶、血纤蛋白、二乙氧磷酰硫胆碱、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、壳多糖、聚乳酸(PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙醇酸(PGA)、聚内消旋乳酸(PDLLA)、聚己内酯(PCL)Ji基磷灰石、β-磷酸三钙(β-TCP)、碳酸钙、钛以及金中的至少一种。应予说明，蛋白聚糖是蛋白质和糖链(糖胺聚糖)以共价键连接而成的一种复合糖。而且，胞外基质还可以使用三维结构体，该三维结构体呈海绵状，由用热塑性高分子等高分子体制成的数均直径为Inm IOOOnm的纳米纤维构成。优选这种三维结构体的空隙率为80% 99. 99%。优选作为胞外基质使用的胶原蛋白采用I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的混合物即I型/III型混合胶原蛋白。I型胶原蛋白是基础胶原蛋白，即纤维性胶原蛋白。III型胶原蛋白形成与胶原蛋白纤维不同的称为网状纤维的细网眼状结构，成为细胞等的支架。优选III型胶原蛋白在上述混合胶原蛋白中的比例在10重量％以上50重量％以下。这是因为如果III型胶原蛋白的比例大于50重量％，则混合胶原蛋白可能会无法固化。另一方面，如果III型胶原蛋白的比例小于10重量％，则I型胶原蛋白的比例增加，可能不会发生后述血管新生，而是使牙本质再生。接着，用图2对本实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200的制备方法进行说明。图2是对非拔牙根管填充材料200的制备方法进行说明的说明图。非拔牙根管填充材料200通过使牙髓干细胞220附着在胞外基质210的根尖侧而形成。优选牙髓干细胞220附着非拔牙根管填充材料200根尖部的1/4 2/3，更优选附着根尖部的1/3。作为根管填充材料的制备方法的一个具体例，首先，向自动移液器(Pipetman)的内管等中吸入10 μ 1 13μ 1的I型/III型混合胶原蛋白，然后吸入7 μ 1 10 μ 1混合有牙髓干细胞的I型/III型混合胶原蛋白(例如胶原蛋白XYZ (新田明胶))，总吸入量为20μ1。优选在吸入自动移液器的内管等时以缓慢的速度抽吸，以避免产生气泡。这是因为如果根管填充材料内部产生气泡，则所产生的气泡会妨碍细胞的迁移并不利于牙组织再生的促进。优选自动移液器的内管的内径较细，例如可以使用内管的下内径为0. 5 0. 7mm的自动移液器，例如可使用QSP公司的H-010-96RS微细吸头(MicroCapillary Tip)。非拔牙根管填充材料的形状没有特别限定，其形状例如为圆锥、圆台、圆柱等。接着，用图3A 图3F对使用非拔牙根管填充材料200的牙组织再生方法进行说明。
如图3A所示，本实施方式所涉及的牙髓组织再生方法对作为例如患有牙髓炎的对象牙齿100，以非拔牙的方式进行牙组织再生。对象牙齿是指，由于龋齿、牙髓炎等，细菌感染扩及冠部牙髓或根部牙髓的牙齿。如图:3B所示，对对象牙齿100进行牙髓摘除或受感染根管的根管扩大清创。牙髓摘除是指，将存在于牙齿内部的牙髓除去的行为。受感染根管是指，在细菌到达牙髓后再扩及根管壁的牙本质的情况下的根管，根管扩大清创后是指，将受感染根管中的细菌除去后。优选在摘除牙髓后，通过将对象牙齿的根管扩大，使根尖部的根管的大小达到规定的粗细。这是因为如后所述，将非拔牙根管填充材料200填充到已摘除牙髓或完成受感染根管治疗的根管内时，事先将根管扩大的方式更容易填充非拔牙根管填充材料200，而且血管和神经也更容易从根尖牙周组织进入。此处，根尖是指与对象牙齿的牙槽骨结合的端部(牙根的尖端部分)。例如，在图;3B中，优选根尖部根管的粗细d为根管直径在0. 7mm以上1. 5mm以下。这是因为如果根管的粗细d小于0. 7mm，则血管和神经难以从根尖牙周组织进入，并且非拔牙根管填充材料200的填充可能难以进行；另一方面，如果根管的粗细大于1. 5mm，则对象牙齿可能会受到不必要的负担而变得容易破裂。接着，如图3C所示，用小镊子等将非拔牙根管填充材料200填充到根管的根尖侧。由于非拔牙根管填充材料200含有生物学材料，因此能够作为生物学的根管填充材料。优选将非拔牙根管填充材料200填充到根管内牙髓存在过之处即牙髓对应部位。应予说明，在胞外基质210为凝胶状的情况下，无法用小镊子等夹住胞外基质210，此时要利用自动移液器、注射等注入胞外基质210。在将非拔牙根管填充材料200注入根管的根尖侧后，如图3D所示，将明胶610注入非拔牙根管填充材料200的上部，用树脂620将其覆盖。由此，使根管内的牙组织再生。如图3E所示，再生的牙组织为例如为根管内的牙髓固有组织、血管400、神经等。而且，通过使用骨形态发生蛋白(BMPs)等形态发生因子，再生的牙组织还包括牙本质。并且，在将非拔牙根管填充材料200填充到受感染根管内的情况下，再生的牙组织，还包括牙周膜(使牙齿固立在牙槽骨上的牙周组织)、牙骨质等牙周组织。然后，如图3F所示，一次性除去树脂620，将BMI^s等形态发生因子630或牙本质形成因子涂布在牙冠部牙髓上，用树脂620进行覆盖。如图3G所示，通过将形态发生因子630或牙本质形成因子涂布到牙冠部牙髓上，还能使牙本质500再生。使用本实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200进行的牙组织再生，在再生组织中未出现内部吸收和外部吸收，而且也未出现破牙质细胞，成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上。考虑到若出血所产生的血块大量存在则会对牙髓组织再生造成障碍，由于本实施方式所涉及的发明是非拔牙，因此能够将血块的产生抑制得很低，从而能够有效率地促进牙组织再生。并且，由于本实施方式所涉及的发明是非拔牙，因此能够在根管上敷药，待根管扩大后的出血或症状消失后再进行根管填充，从而能够更贴近实际临床治疗。应予说明，如上所述，对象牙齿100是因龋齿、牙髓炎等细菌感染扩及冠部牙髓或根部牙髓的牙齿，但并不限于此，对象牙齿100还包括神经功能降低咬合感减弱的牙齿。在此情况下，通过在摘除牙髓后填充非拔牙根管填充材料200，能够使牙髓再生以提高咬合
13感。而且，如图3H所示，对象牙齿100还包括细菌感染扩及根尖牙周组织的牙齿(细菌到达牙髓后再扩及根管壁的牙本质和根尖牙周组织的牙齿)。这样的牙齿多伴随有根尖性牙周炎110。对受感染根管进行根管扩大清创后注入非拔牙根管填充材料200。《第二实施方式》图4A和图4B是本发明第二实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200的说明图。如图4A所示，非拔牙根管填充材料200使牙髓干细胞220附着在根管的根尖侧，并使包含细胞趋化因子、细胞增殖因子、神经营养因子以及血管新生因子中的至少一种因子的趋化因子230附着在根管的牙冠侧(例如根管的上部1/2 2/3)。使牙髓干细胞220附着在根管的根尖侧，并使趋化因子230附着在根管的牙冠侧的原因是，即便让牙髓干细胞220附着至根管的牙冠侧，也无法供给来自组织的营养，可能会发生坏死。而且，附着在根管的根尖侧的牙髓干细胞220被附着在根管的牙冠侧的趋化因子所牵引，易于促进牙组织再生。应予说明，如图4B所示，可以在非拔牙根管填充材料200的根管的牙冠侧残留胞外基质210。细胞趋化因子是指，通过与受体结合来激活与细胞迁移有关的信号传导系统的分子。细胞增殖因子是指，通过与受体结合来激活与细胞增殖有关的信号传导系统的分子。神经营养因子是指，通过与受体结合来激活与细胞存活有关的信号传导系统的分子。血管新生因子是指，通过与受体结合来激活与血管内皮细胞的增殖、迁移、抗细胞凋亡有关的信号传导系统的分子。优选细胞趋化因子采用SDF-1、VEGF、G-CSF、SCF、MMP3、Slit以及GM-CSF中的至少一种。特别是MMP3的细胞迁移能较高，可优选使用。优选细胞增殖因子采用IGF、bFGF以及PDGF中的至少任一种。优选神经营养因子采用⑶NF、BDNF, NGF、神经肽Y以及神经营养蛋白3中的至少一种。优选血管新生因子采用内皮细胞选凝素(E-selectin)、血管内皮细胞粘附分子 1 (VCAMl)、ECSCR(Endothelial Cell-specific Chemotaxis Receptor)以及SLC6A6 (Solute Carrier Family 6Member 6)中的至少一种。趋化因子在附着有趋化因子的胞外基质中的含有率在0. Ing/μ 1以上500ng/y 1以下。这是因为如果趋化因子的含有率小于0. Ing/μ 1，则迁移程度可能会减少。另一方面，如果趋化因子的含有率大于500ng/y 1，则可能会对对象牙齿产生难以预料的副作用。接着，用图5对本实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200的制备方法进行说明。图5是对使趋化因子230附着在根管的牙冠侧的非拔牙根管填充材料200的制备方法进行说明的说明图。作为实施方式2所涉及的非拔牙根管填充材料200的制备方法之一具体例，首先，向自动移液器的内管等中吸入10μ 1 13μ 1混合有趋化因子的I型/III型混合胶原蛋白(I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的混合比为1 1)，然后吸入7μ1 ΙΟμΙ混合有牙髓干细胞的I型/III型混合胶原蛋白，总吸入量为20 μ 1。在实施方式2中也优选在吸入自动移液器的内管等时以缓慢的速度抽吸，以避免产生气泡。而且，优选自动移液器的内管的内径较细。由此，制备图4Α所示的根管填充材料200。实施方式2所涉及的非拔牙根管填充材料200的使用形态与实施方式1相同，在摘除牙髓后或对受感染根管进行根管扩大清创后，填充到非拔牙根管的根尖侧。根据本实施方式所涉及的非拔牙根管填充材料200，由于含有趋化因子，故能够更有效率地进行牙组织再生，再生组织中没有内部吸收，也未出现破牙质细胞，成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上。《第三实施方式》在上述第一实施方式中，使牙髓干细胞220附着在非拔牙根管填充材料200的根管的根尖侧形成非拔牙根管填充材料200。但并不限于这样的实施方式，牙髓干细胞220还可以均勻混合在整个非拔牙根管填充材料200中。这种非拔牙根管填充材料200也能够对牙根发育完全的牙齿实现不发生内部吸收或外部吸收，不会出现破牙质细胞，并且成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上的牙组织再生。这种非拔牙根管填充材料200例如可通过以下方式制备将牙髓干细胞与I型/III型混合胶原蛋白(例如胶原蛋白XYZ(新田明胶))不产生气泡地混合均勻。在上述第二实施方式中，使牙髓干细胞220附着在根管的根尖侧，并使趋化因子230附着在根管的牙冠侧，组成非拔牙根管填充材料200。但并不限于这样的实施方式，牙髓干细胞220和趋化因子230可以一起均勻地混合在整个非拔牙根管填充材料200中。这种非拔牙根管填充材料200也能够实现对牙根发育完全的牙齿不发生内部吸收或外部吸收，不会出现破牙质细胞，并且成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上的牙组织再生。该非拔牙根管填充材料200例如可通过以下方式制备将牙髓干细胞、趋化因子以及I型/III型混合胶原蛋白(例如胶原蛋白XYZ(新田明胶))不产生气泡地混合均勻。[实施例]《实施例1》〈细胞分选和特征化〉摘出人牙髓后，用胶原酶在37°C下进行1. 5小时酶消化分离出牙髓细胞后，以1 X 106cells/ml的浓度将细胞分散在含有2%血清的DMEM中，用CXCR4抗体在4°C下标记30分钟，然后进行流式细胞术。人牙髓源性CXCR4阳性细胞占总量的20%。表1表示流式细胞术的结果。对于⑶四和⑶44，CXCR4阳性细胞与⑶105阳性细胞同样在90%以上。对于⑶105，⑶105阳性细胞为90. 0%，而CXCR4阳性细胞为1.7%。对于⑶146，CXCR4阳性细胞与⑶105阳性细胞同样为较低值。而且，对于用于未分化的干细胞的标记物即⑶150，CXCR4阳性细胞显示出比⑶105阳性细胞略高的值。[表1]
权利要求
1.一种非拔牙根管填充材料，其特征在于该非拔牙根管填充材料含有在摘除牙髓后或者在对受感染根管进行根管扩大清创后，插入非拔牙根管的根尖侧的牙髓干细胞和胞外基质。
2.根据权利要求1所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述牙髓干细胞包含牙髓CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-I阳性细胞、⑶105阳性细胞、牙髓侧群细胞、⑶31阴性且⑶146阴性细胞、⑶对阳性细胞、⑶150阳性细胞、⑶四阳性细胞、⑶34阳性细胞、⑶44阳性细胞、⑶73阳性细胞以及⑶90阳性细胞中的至少任一种。
3.根据权利要求2所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述牙髓侧群细胞为CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-I阳性细胞、⑶31阴性且⑶146阴性细胞、⑶M阳性细胞、⑶105阳性细胞、⑶150阳性细胞、⑶四阳性细胞、⑶34阳性细胞、⑶44阳性细胞、⑶73阳性细胞或者⑶90阳性细胞中的任一种。
4.根据权利要求1所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述非拔牙根管填充材料使所述牙髓干细胞附着在根管的根尖侧，并且使含有细胞趋化因子、细胞增殖因子、神经营养因子以及血管新生因子中的至少一种因子的趋化因子附着在根管的牙冠侧。
5.根据权利要求4所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述细胞趋化因子为基质细胞衍生因子-1、血管内皮细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、干细胞因子、基质金属蛋白酶3、Slit以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的至少任一种。
6.根据权利要求4所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述细胞增殖因子为胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及血小板衍生生长因子中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述神经营养因子为胶质细胞系衍生神经营养因子、脑衍生神经营养因子、神经生长因子、神经肽Y以及神经营养蛋白3中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述胞外基质由生体亲和性材料组成，该生体亲和性材料包含胶原蛋白、人工蛋白聚糖、明胶、水凝胶、血纤蛋白、二乙氧磷酰硫胆碱、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、壳多糖、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙二醇、聚乙醇酸、聚内消旋乳酸、聚己内酯、羟基磷灰石、β-磷酸三钙、碳酸钙、钛以及金中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的非拔牙根管填充材料，其特征在于所述牙髓干细胞在所述胞外基质中的含有率在IX IO3Cell/μ 1以上1 X IO6Cell/μ 1以下。
10.一种非拔牙的牙组织再生方法，其特征在于该非拔牙的牙组织再生方法通过向摘除牙髓后或对受感染根管进行根管扩大清创后的非拔牙根管的根尖侧注入含有牙髓干细胞和胞外基质的非拔牙根管填充材料，使根管内的牙组织再生。
11.根据权利要求10所述的非拔牙的牙组织再生方法，其特征在于所述牙髓干细胞包含牙髓CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-I阳性细胞、⑶105阳性细胞、牙髓侧群细胞、⑶31阴性且⑶146阴性细胞、⑶对阳性细胞、⑶150阳性细胞、⑶四阳性细胞、⑶34阳性细胞、⑶44阳性细胞、⑶73阳性细胞以及⑶90阳性细胞中的至少任一种。
12.根据权利要求11所述的非拔牙的牙组织再生方法，其特征在于所述牙髓侧群细胞为CXCR4阳性细胞、SSEA-4阳性细胞、FLK-I阳性细胞、⑶31阴性且⑶146阴性细胞、⑶M阳性细胞、⑶105阳性细胞、⑶150阳性细胞、⑶四阳性细胞、⑶34阳性细胞、⑶44阳性细胞、⑶73阳性细胞或者⑶90阳性细胞中的任一种。
13.根据权利要求10所述的非拔牙的牙组织再生方法，其特征在于所述非拔牙根管填充材料使所述牙髓干细胞附着在根管的根尖侧，并且使含有细胞趋化因子、细胞增殖因子、神经营养因子以及血管新生因子中的至少一种因子的趋化因子附着在根管的牙冠侧。
14.根据权利要求13所述的非拔牙的牙组织再生方法，其特征在于所述细胞趋化因子为基质细胞衍生因子-1、血管内皮细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、干细胞因子、基质金属蛋白酶3、Slit以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的至少任一种。
15.根据权利要求13所述的非拔牙的牙组织再生方法，其特征在于所述细胞增殖因子为胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及血小板衍生生长因子中的至少一种。
16.根据权利要求13所述的非拔牙的牙组织再生方法，其特征在于所述神经营养因子为胶质细胞系衍生神经营养因子、脑衍生神经营养因子、神经生长因子、神经肽Y以及神经营养蛋白3中的至少一种。
17.根据权利要求10所述的非拔牙的牙组织再生方法，其特征在于所述胞外基质由生体亲和性材料组成，该生体亲和性材料包含胶原蛋白、人工蛋白聚糖、明胶、水凝胶、血纤蛋白、二乙氧磷酰硫胆碱、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、壳多糖、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙二醇、聚乙醇酸、聚内消旋乳酸、聚己内酯、羟基磷灰石、β-磷酸三钙、碳酸钙、钛以及金中的至少一种。
18.根据权利要求10所述的非拔牙的牙组织再生方法，其特征在于在将所述根管填充材料注入所述根管的根尖侧之前，通过对所述根管进行扩大，使根尖部的根管的粗细达到规定大小。
19.根据权利要求10所述的非拔牙的牙组织再生方法，其特征在于所述牙髓干细胞在所述胞外基质中的含有率IX IO3Cell/μ 1以上IX IO6Cell/μ 1以
全文摘要
本发明公开了一种非拔牙根管填充材料，该非拔牙根管填充材料对牙根发育完全的牙齿能够实现不发生内部吸收或外部吸收，不出现破牙质细胞，成牙本质细胞平滑地排列在牙本质壁上的牙组织再生。非拔牙根管填充材料(200)含有牙髓干细胞(220)和胞外基质(210)，在摘除牙髓后或对受感染根管进行根管扩大、清创后，插入非拔牙的根管的根尖侧。牙髓干细胞例如为牙髓CXCR4阳性细胞。优选使含有细胞趋化因子、细胞增殖因子、神经营养因子、和血管新生因子中的至少一种因子的趋化因子附着在根管的牙冠侧。
文档编号A61P43/00GK102596270SQ201080040308
公开日2012年7月18日 申请日期2010年9月10日 优先权日2009年9月11日
发明者中岛美砂子, 庵原耕一郎 申请人:独立行政法人国立长寿医疗研究中心