专利名称：一种柴胡皂苷的提取纯化方法
技术领域：
本发明公开了一种中药有效成分的提取纯化方法，具体地说涉及一种柴胡皂苷的提取纯化方法，属于药物有效成分的提取分离技术领域。
背景技术：
柴胡为大宗常用药材，2010版《中国药典》规定柴胡为伞形科植物 chinense DC.或狭叶柴胡召.Mor^werifWi腫Wilid.的干燥根。柴胡具有疏肝解郁，解表和里的功效。柴胡的有效成分主要为挥发性成分和皂苷类成分，皂苷类成分种类复杂，主要有柴胡皂苷a、c、d、bl、b2、h等，其中柴胡皂苷a、d具有抑制血栓形成、增高糖皮质激素等作用，是柴胡中的主要有效成分，通常以其为主要指标成分，2010版《中国药典》规定柴胡药材的质量控制以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的总量计，不得少于0.3% (《中国药典》2010 版，一部，263-264)。中国专利200610099498. 7公开了一种柴胡提取物的制备方法，该方法采用乙醇回流提取后减压浓缩，得到的浓缩液经大孔树脂提纯，收集洗脱液干燥后得到柴胡提取物。 该方法采用乙醇回流提取，乙醇用量大、耗能高，并且提取物中多糖含量高，为分离纯化带来了一定的困难。并且柴胡皂苷不稳定，在加热条件下，柴胡皂苷容易发生结构转化，生成活性较弱的次生皂苷。中国专利200710139343. 6公开了一种柴胡总皂苷的制备方法，该方法虽然在纯化工艺过程中通过控制乙醇的含量、应用大孔树脂纯化提取物，检测方法采用紫外-可见分光光度法，以总皂苷得率为衡量工艺标准。但该方法仍然采用乙醇加热回流提取柴胡药材，仍然存在使用乙醇回流提取所存在的不足。此外，采用紫外分光光度法测定总皂苷纯度的检测手段在现代质量检测体系中
已经使用的越来越少，检测方法的准确度和专属性尚有待商榷。中国专利200710039351. 3公开了一种从柴胡中获取提取物的方法，该方法中采用醋制柴胡进行渗漉，渗漉液浓缩后取乙酸乙酯提取物制备利胆药。该方法以醋制柴胡为原料，在酸性条件下，柴胡皂苷容易转化成次生皂苷而降低生物活性，采用高浓度乙醇进行渗漉，成本较高，另外，生产中使用大量氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等有机试剂，会对环境造成污染。中国专利200710111230. 5公开了一种从柴胡中提取总皂苷的方法，该方法虽然提及提取方法可以是煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取、高压提取等方法，但该发明旨在获得包括广泛的次生皂苷在内的柴胡总皂苷。关于柴胡皂苷的分离纯化，虽然现有技术中已广泛使用大孔树脂来分离纯化柴胡皂苷，但是大多采用提取物稀释后直接上样，分离所得物质中柴胡皂苷含量特别是柴胡皂苷d的含量较低。因此，有必要进一步研发柴胡总皂苷含量稳定的提取纯化工艺，提高提取物纯度， 降低成本，为工业生产、新药研发和临床的应用提供技术指导和物质基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种安全、稳定、能耗小、排污量小、高效的适合工业化生产的柴胡总皂苷的提取纯化方法，按照本方法提取得到的提取物中，柴胡皂苷的质量百分含量较高，且柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的质量百分含量较高，柴胡总皂苷质量百分含量达到50% 80%，其中柴胡皂苷a+d的总量达到35% 60% (除非特别指明，本申请中柴胡总皂苷、柴胡皂苷a+d的含量比例指的是占总的提取物的质量比例)。为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案
一种柴胡皂苷的分离纯化方法，包括(1)提取、(2)提取液回收浓缩得浸膏、(3)大孔树脂处理、(4)洗脱液浓缩干燥等步骤，其中 步骤(1)中所述提取的方法如下
将柴胡药材用PH值为7-12的碱性溶剂浸泡12-4 后，进行渗漉/加压渗漉提取，得提取液，所述渗漉/加压渗漉的流速为5 500mL/min，所述渗漉/加压渗漉的流速优选为 5 200mL/min，特别优选为5_15 mL/min,所用碱性溶剂的体积为药材体积的5 20倍，优选为药材体积的8-15倍；
步骤(2)中所说提取液回收浓缩得浸膏的方法可以选用任何常规的浓缩方法，优选将收集的渗漉液于30-80°C减压浓缩至无醇味，优选的浓缩条件为40°C -70°C减压浓缩；
步骤(3)中所述大孔树脂可以是D4020、SP825、HPD100, D101、HP20或AB-8，大孔树脂处理的方法如下将步骤(2)所得浓缩浸膏用水稀释至柴胡总皂苷含量为0. 01 0. 05g/ mL (相当于生药lg-5g/mL)，调节pH值至7_12后上径高比为1:1-1:5的大孔树脂柱，静置吸附1 6小时，搅拌吸附4 10小时，再动态吸附，吸附流速IBV (柱体积)/h-;3BV/h ；待药液吸附完全后，进行洗脱，洗脱流速为lBV-2BV/h，所用洗脱剂为水、碱水、乙醇、甲醇或者其中几种溶剂的组合，收集洗脱液。上述柴胡皂苷的分离纯化方法中所述药材可以是新鲜柴胡药材，也可以是使用超临界提取过挥发油的柴胡药材，使用新鲜柴胡药材时的药材产地加工方法，可以采用传统的采收、晾晒、清洗、浸润、切片、晾晒/干燥的工艺；
进一步的，为了尽可能减少有效成分的损失，所述药材产地加工方法可以采用如下方
法
采收新鲜柴胡药材，立即清洗、切片、晾晒/干燥，最后粉碎。上述柴胡皂苷的分离纯化方法中，药材产地加工方法中所述清洗的具体方法为 用流动的水冲洗，药材切片后干燥粉碎；
干燥的条件为在40 50°C烘2 4h ； 粉碎方法为将干燥的北柴胡药材粉碎至10-20目。上述柴胡皂苷的分离纯化方法中，步骤(1)中所述碱性溶剂优选PH值为9-11的碱性乙醇溶液，最优选体积百分浓度为30%-70%的pH值为9-11的碱性乙醇溶液；调节pH 值的试剂可以为酒石酸钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠或氨水，优选无水碳酸钠、碳酸氢钠或氨水。上述柴胡皂苷的分离纯化方法中，步骤(3)大孔树脂处理中大孔树脂柱的径高比优选为1:2 1:4。
上述柴胡皂苷的分离纯化方法中，步骤(3)中大孔树脂处理过程中所述吸附搅拌吸附的方法为在大孔树脂中使用搅拌器搅拌吸附(搅拌器转速优选为60-180转/min)，或用气泵通入空气(空气流速优选为18L/min-50L/min)使药液流动，达到搅拌树脂的目的， 使树脂与药液充分吸附6-10小时。上述柴胡皂苷的分离纯化方法中，步骤(3)大孔树脂处理中所述洗脱的方法优选以下方法用水冲洗除杂，再用乙醇梯度洗脱，先用体积百分浓度为10% 50%的乙醇洗脱除杂，优选体积百分浓度为30% 35%的乙醇；再用体积百分浓度为70% 80%的乙醇洗脱；收集体积百分浓度为60% 95%的乙醇洗脱液，优选70% 80%的乙醇洗脱液，得到柴胡皂苷洗脱液；
所述洗脱方法中除杂所用水的用量为2 6BV (柱体积)，洗脱除杂乙醇的用量为 2-6BV，洗脱乙醇的用量为5 8BV。上述柴胡皂苷的分离纯化方法中，步骤(3)中所述大孔树脂处理所用大孔树脂优选AB-8、DlOl、D4020，特别优D4020、DlOl弱极性大孔吸附树脂。上述柴胡皂苷的分离纯化方法中，步骤(3)大孔树脂处理中所述pH值优选为 7. 5-9，调节pH值的试剂可以是酒石酸钠，无水碳酸钠、碳酸氢钠、氨水中的一种。上述柴胡皂苷的分离纯化方法中，步骤(3)中所述大孔树脂处理方法中，树脂使用 2 4次后进行再生。上述柴胡皂苷的分离纯化方法中，步骤(3)中所述大孔树脂处理方法中，上样之前采用离心、抽滤、超滤等方法进行处理。上述柴胡皂苷的分离纯化方法中，步骤(4)中所述洗脱液浓缩方式优选为 40-70°C减压浓缩。柴胡皂苷为一类在其结构中的C-1348位之间含有环氧醚键的皂苷，如柴胡皂苷 a、c、d等。该类皂苷不稳定，在加热(如煎煮等)及植物中酸性成分的双重作用下，易发生结构转化，生成一系列活性较弱的次生柴胡皂苷，如柴胡皂苷bl、b2、h等。为了避免这些柴胡皂苷的次生化，需要控制严格的提取条件，如溶剂酸碱性、加热温度和时间等，且需要尽可能地避免柴胡皂苷的转变。本发明采用渗漉/加压渗漉的方法从柴胡药材中提取柴胡皂苷，并且调节渗漉溶剂为碱性，并且在使用大孔树脂对柴胡提取物进行分离提纯时，采用碱性上样，可尽可能地避免柴胡皂苷转变为次生皂苷，由此可提高柴胡皂苷提取物的生物活性。尤其是，发明人在试验中发现，高浓度醇反而不利于有效成分溶出，因此，本发明的柴胡皂苷提取分离方法在渗漉中优先采用中低浓度的碱性乙醇作为溶剂。进一步的，本发明还进一步优化了提取分离的工艺条件，包
括
1、在柴胡产地对药材进行初加工，由以前的采收、晾晒、清洗、浸润、切制、干燥的工序，改为采收、清洗、切制、干燥四个步骤，大大缩短了药材准备时间，节约劳力，防止浸润步骤中有效成分损失。2、本发明提取的原料还可以使用超临界提取过挥发油的柴胡药材，超临界提取温度低，时间短，经测定，提取挥发油的药材皂苷损失很小，且可以达到除杂的效果，本发明利用这一特点，最大限度利用药材，保护资源。
3、本发明采用低、中浓度乙醇渗漉，与现有的回流提取，高速逆流液相色谱、微波提取、超声提取等技术相比，仅需要渗漉桶，溶剂回收罐，层析柱等简单设备即可，设备投资低，水、电、气等能源消耗小，技术适用面广，且有较高的得率。4、本发明选用碱性pH值在7-12范围内渗漉，优选大孔树脂纯化碱性pH值在 7. 5-9的范围内上样，在提高总皂苷得率的同时，在纯化过程中能有效地防止柴胡皂苷a和柴胡皂苷d结构变化，总皂苷得率及纯度均较其他碱性范围佳。5、大孔树脂上样时增加搅拌器搅拌或通入空气搅动树脂和药液，吸附6-10小时的步骤，使树脂和药液充分接触，使皂苷完全吸附，减少损失。6、对大孔树脂的径高比进行调节，经过试验比较发现，径高比升高更有利于皂苷吸附和洗脱，本发明采用的低径高比以往惯用的径高比1:10吸附效率高。本发明与现有技术相比具有以下优点本发明的柴胡皂苷提取分离方法，优化了整个工艺流程中的各工艺条件，在上述工艺条件的协同作用下，提取物得率高，纯度高，在最大限度提取柴胡皂苷的同时，最大可能地提高柴胡皂苷
a和柴胡皂苷d的含量，为提高中药制剂的疗效提供有力保证。并且本发明的工艺中仅需要渗漉桶，溶剂回收罐，层析柱等简单设备即可，设备投资低，水、电、气等能源消耗小，技术适用面广。经高效液相及比色法测定柴胡总皂苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，按照本发明的分离纯化方法所得的柴胡皂苷提取物中，柴胡总皂苷含量达到50% 80%，其中柴胡皂苷a+d的总量达到35% 60%。应用本发明的柴胡皂苷提取物在抗肿瘤、抗炎、免疫系统疾病中有很好的疗效，可以根据实际需要，制成口服的固体或液体制剂。
图1柴胡皂苷a和柴胡皂苷d标准品图谱。图2为样品液相图。图3为不同提取方法的比较。图4为pH值的考察结果。图5为不同树脂型号的比较。图6为不同pH值对吸附量的影响。图7为树脂使用次数的吸附量的影响。
具体实施例方式
下面结合试验例及具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。本发明列举的柴胡皂苷的分离纯化方法，包括以下工艺步骤
(1)提取；将柴胡药材用碱性溶剂浸泡后，进行渗漉或加压渗漉提取，得提取液；
(2)提取液40°C-70°C减压浓缩得浸膏；
(3)大孔树脂处理将步骤(2)所得浓缩浸膏用水稀释至柴胡总皂苷含量为0.01 0. 05g/mL (相当于生药lg-5g/mL)，调节pH值至7_12后上大孔树脂柱，静置吸附1 4小时，搅拌吸附6 10小时；待药液吸附完全后，进行洗脱，所用的洗脱剂为水、碱水、乙醇、甲醇或者其中几种溶剂的组合；
(4)洗脱液浓缩干燥步骤40-7(TC减压浓缩、干燥，得柴胡皂苷提取物。
步骤(1)中所述柴胡药材可以是新鲜柴胡药材，也可以是也可以是使用超临界提取过挥发油的柴胡药材，使用新鲜柴胡药材时的药材产地加工方法如下
采收新鲜北柴胡药材，立即用流动的水冲洗，将清洗后的柴胡药材切制成2 IOmm的切片，将切片于40 50°C烘2 4h进行干燥，然后粉碎至10-20目。本发明列举的实施例中，调节pH值的试剂可以为酒石酸钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠或氨水，优选无水碳酸钠、碳酸氢钠或氨水。实施例1
取新鲜北柴胡药材1kg，清洗、切片、晾晒/干燥后，粉碎至10目，加入8倍药材体积的 50%(v/v)、pH值为8的乙醇浸泡12小时，进行渗漉，渗漉流速为5mL/min，收集渗漉液，60°C 减压浓缩成稀浸膏，再加PH值为8的碱水将浓缩浸膏稀释至柴胡总皂苷含量约为0. 01g/mL (相当于生药lg/mL)，将稀释药液上DlOl大孔树脂柱，树脂柱径高比为1:1，静置吸附池， 搅拌吸附4h，再动态吸附，吸附流速为lBV/h，然后用4BV水洗柱除杂，再用2BV10% (ν/ν) 乙醇除杂；70% (ν/ν)乙醇5BV洗脱，洗脱流速2BV/h，收集70% (ν/ν)乙醇洗脱液，60°C减压浓缩，浓缩液冻干成淡黄色粉末。检测可得柴胡皂苷a+d含量为34. 51%，总皂苷含量为 63. 74%ο检测方法
1、用HPLC测定样品中柴胡皂苷 d的含量
高效液相色谱条件如下
色谱柱Diamonsil C18(250X4. 6mm)；
流动相乙腈-甲醇-水梯度洗脱，洗脱程序表1所示
表1、洗脱程序
权利要求
1.一种柴胡皂苷的分离纯化方法，包括(1)提取、(2)提取液回收浓缩得浸膏、(3)大孔树脂处理、(4)洗脱液浓缩干燥步骤，其特征在于步骤(1)中所述提取的方法为将柴胡药材用PH值为7-12的碱性溶剂浸泡12-4 后，进行渗漉/加压渗漉提取，得提取液，所述渗漉/加压渗漉的流速为5 500mL/min，所用碱性溶剂的体积为药材体积的 5 20倍；步骤(2)中所述提取液回收浓缩得浸膏的方法为将收集的渗漉液于30-80°C减压浓缩至无醇味；步骤(3)中所述大孔树脂为D4020、SP825、HPD100、D101、HP20或AB-8 ；所述大孔树脂处理的方法如下将步骤(2)所得浓缩浸膏用水稀释至柴胡总皂苷含量为0. 01 0. 05g/ mL,调节pH值至7-12后上径高比为1:1-1:5的大孔树脂柱，静置吸附1 6小时，搅拌吸附4 10小时，再动态吸附，吸附流速为lBV/hlBV/h;待药液吸附完全后，进行洗脱，洗脱流速为lBV-2BV/h，所用洗脱剂为水、碱水、乙醇、甲醇或者其中几种溶剂的组合，收集洗脱液。
2.根据权利要求1所述的柴胡皂苷的分离纯化方法，其特征在于步骤(1)中所述碱性溶剂为PH值为9-11的碱性乙醇溶液。
3.根据权利要求2所述的柴胡皂苷的分离纯化方法，其特征在于步骤(1)中所述碱性溶剂为体积百分浓度为30%-70%的pH值为9-11的碱性乙醇溶液。
4.根据权利要求1所述的柴胡皂苷的分离纯化方法，其特征在于步骤(1)中所述渗漉 /加压渗漉的流速为5-200mL/min，所用溶剂的体积为药材体积的8_15倍。
5.根据权利要求1所述的柴胡皂苷的分离纯化方法，其特征在于步骤(2)中所述浓缩方法的浓缩条件为40°C -70°C减压浓缩。
6.根据权利要求1所述的柴胡皂苷的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)大孔树脂处理中大孔树脂柱的径高比为1:2 1:4。
7.根据权利要求1所述的柴胡皂苷的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)大孔树脂处理中所述洗脱的方法为用水冲洗除杂，再用乙醇梯度洗脱，先用体积百分浓度为10% 50%的乙醇洗脱除杂；再用体积百分浓度为60% 95%的乙醇洗脱；收集体积百分浓度为 60% 95%的乙醇洗脱液，得到柴胡皂苷洗脱液；所述洗脱方法中除杂所用水的用量为2 6柱体积，洗脱除杂乙醇的用量为2-6柱体积，洗脱乙醇的用量为5 8柱体积。
8.根据权利要求7所述的柴胡皂苷的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)大孔树脂处理中洗脱所用的乙醇的体积百分浓度为30% 35%;洗脱所用乙醇的体积百分浓度为 70% 80%ο
9.根据权利要求1所述的柴胡皂苷的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)中所述大孔树脂处理所用大孔树脂为AB-8、DlOl或D4020。
10.根据权利要求1所述的柴胡皂苷的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)大孔树脂处理中所述pH值为7. 5-9，调节pH值的试剂为酒石酸钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠或氨水。
全文摘要
本发明公开了一种柴胡皂苷的提取纯化方法。该皂苷部位主要含柴胡皂苷a，柴胡皂苷d。该提取物可由渗漉或高压渗漉中某一种方法制得，应用乙醇溶液提取柴胡药材，在纯化工艺过程中，选用大孔树脂纯化，所制得的柴胡皂苷提取物中柴胡皂苷a+d的总量占提取物的30～60%，总皂苷占提取物的50～80%。本发明操作简单，生产成本低，节约能源，提取效率高，适于工业化生产。
文档编号A61K36/233GK102166235SQ20111010340
公开日2011年8月31日 申请日期2011年4月25日 优先权日2011年4月25日
发明者余伯阳, 寇俊萍, 戚进, 杨兴旺, 杨占国, 索志荣, 马家骅, 马璇 申请人:中国药科大学, 四川德培源中药科技开发有限公司, 西南科技大学