专利名称：柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法
技术领域：
本发明属于中药制备技术领域，特别涉及一种柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法。
背景技术：
柴胡是大宗常用中药，《神农本草经》列为上品，为伞形科植物柴胡Bupleurumchinense DC或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd的干燥根，味苦，微寒，归肝、胆经，是和解表里，疏肝，升阳之要药。柴胡主要有效成分为柴胡挥发油和柴胡皂苷。研究表明，柴胡皂苷中，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量最高，药理作用最显著，具有明显的解热、镇痛、消炎、保肝等作用。因此提取高纯度的柴胡皂苷a单体和柴胡皂苷d单体，对柴胡制 剂和新药开发等具有重要意义。目前，本领域尚没有一套系统的提取分离高纯度柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的制备工艺。中国专利申请CN 101333240A (
公开日2008年12月31日)“一种提取分离高纯度柴胡皂苷A的制备工艺”，公开了一种提取分离高纯度柴胡皂苷a的制备工艺。具体是，取柴胡药材，粉碎后，加热提取，减压浓缩，大孔吸附树脂分离柱分离，收集洗脱液，然后采用高速逆流色谱分离浓缩液，紫外检测收集柴胡皂苷a。前述方法虽提供了一种柴胡皂苷a的提取分离方法，但提取得到的柴胡皂苷a纯度并不理想，并且由于高速逆流色谱法上样量非常小，一次制备很难获得大量柴胡皂苷a，而且仪器价格昂贵，生产成本高，该方法很难得到工业化推广。因此，寻找一种能提取分离高纯度的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，并能实现工业化生产，成本可控的工艺方法，是本领域尚未解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的是，针对上述现有技术中提取方法获得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d纯度不高，且不适宜工业化生产的问题，提供一种柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法。该方法获得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d纯度高，方法适于工业化应用。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，包括步骤(I)柴胡总皂苷的提取；(2)柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化；所述步骤(2)包括D.取步骤(I)制得的柴胡总皂苷，加入5 10倍量(mL/g)溶剂2，得上样溶液；取相当于所述柴胡总皂苷15 50倍量(g/g)正相硅胶，干法装柱，所述上样溶液加入柱顶，用所述溶剂2以每小时I 3BV速度洗脱，收集洗脱液，薄层检识，分别合并含有柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的流分，回收溶剂得柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品；E.分别取柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品，加5 10倍量(mL/g)溶剂3，得上样溶液；取相当于所述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品15 50倍量(g/g)反相硅胶，湿法装柱，所述上样溶液加入柱顶，用所述溶剂3以每小时O. 15 I. 5BV洗脱，收集洗脱液，薄层检识，分别合并含有柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的流分，分别得柴胡皂苷a或柴胡皂苷d ；所述溶剂2选自水、乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿或丙酮的任一种或它们的任意混合物；所述溶剂3选自水、甲醇、异丙醇或乙腈的任一种或它们的任意混合物。作为本发明的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，步骤(I)柴胡总皂苷的提取可采用本领域已知的柴胡皂苷提取方法，如超声提取、微波提取、高压提取、加热回流、煎煮中的任意一种。例如，可采用CN102166235A “一种柴胡皂苷的提取纯化方法”所公开的柴胡皂苷的提取方法。本发明的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，在步骤(I)制得的柴胡总皂苷后，进行正相硅胶和反相硅胶吸附、洗脱，并通过筛选流动相、洗脱速度和固定相使用量，提取得到的柴胡皂苷a纯度达到98%以上，柴胡皂苷d纯度达到98%以上。作为优选，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，所述步骤(I)包括步骤 A.取柴胡或者柴胡提取完挥发油后的药渣，粉碎，溶剂提取，提取液浓缩回收溶齐U，得总提取物；B. A步骤制得的总提取物加水分散，上大孔树脂吸附柱，碱水洗脱除杂，水洗脱至中性，体积百分比浓度20% 45%乙醇/水溶液洗脱除杂，体积百分比浓度70% 90%乙醇/水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩回收溶剂，得柴胡皂苷粗品；C.取步骤B制得的柴胡皂苷粗品，用3 5倍量(mL/g)溶剂I分散，加入相当于所述柴胡皂苷粗品2 5倍量(g/g)氧化铝，拌干溶剂，得拌样氧化铝；或取步骤B制得的柴胡皂苷粗品，加入5 20倍量(mL/g)溶剂I溶解，得柴胡皂苷上样溶液；取相当于所述柴胡皂苷粗品8 20倍量(g/g)氧化铝，干法装柱；将所述拌样氧化铝或所述柴胡皂苷上样溶液加入柱顶，所述溶剂I以每小时5 IOBV速度洗脱，收集洗脱液，薄层检识，合并含有柴胡皂苷的流分，浓缩回收溶剂，得柴胡总皂苷；所述溶剂I选自水、乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿或丙酮的任一种或它们的任意混合物。通过在提取得到柴胡皂苷粗品后增加氧化铝纯化步骤，得到的柴胡总皂苷质量百分含量达到70% 90%，其中柴胡皂苷a+d的质量百分量达到60% 80%，有利于进一步提高步骤(2)制得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的纯度。作为优选，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，步骤D所述的正相硅胶柱的径高比为I : 5 I : 15。作为优选，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，步骤E所述的反相硅胶柱的径高比为I : 5 I : 15。径高比是柱层析的重要工艺参数，影响到产物的纯度和洗脱速度，径高比过高影响洗脱速度，径高比过低影响产物纯度。发明人通过大量研究及筛选，获得了本发明中正相硅胶柱和反相硅胶柱的径高比。本发明筛选得到的正相硅胶柱和反相硅胶柱的径高比，既能得到高纯度的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，又能满足工业化生产，有效提高提纯效率。作为优选，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，步骤B所述大孔吸附树脂选自非极性、弱极性、中等极性大孔吸附树脂中的任一种；所述碱水溶液为碱性或弱碱性盐类成分的水溶液。作为进一步优选，所述碱性水溶液的PH值为7. 5 9。作为优选，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，步骤A所述溶剂选自任一醇类溶剂或水，或它们的任意混合物。作为优选，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，步骤C所述的氧化铝柱的径高比为I : 3 I : 5。通过优选氧化铝柱的径高比，能进一步提高柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的纯度，有效控制提取效率。作为优选，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，步骤C所述的氧化铝选自碱性氧化铝或中性氧化铝。通过优选碱性氧化铝或中性氧化铝，制得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的纯度获得进一步有效提高。作为进一步优选，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，步骤D所述的正 相硅胶柱的径高比为I : 15。作为进一步优选，前述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，步骤E所述的反相硅胶柱的径高比为I : 15。通过进一步优选正相硅胶柱、反相硅胶柱的径高比，本发明制得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的纯度达到最优。 与现有技术相比，本发明的有益效果是一、发明人通过在提取得到柴胡总皂苷后，增加正相硅胶和反相硅胶层析的方法，并筛选工艺条件，提取纯化得到的柴胡皂苷a纯度可达到98%以上，柴胡皂苷d纯度可达到98%以上；并能根据需要同时或分别提取纯化柴胡皂苷a和/或柴胡皂苷d ；二、发明人通过在提取得到柴胡皂苷粗品后增加氧化铝纯化步骤，所得的柴胡总皂苷质量百分含量达到70% 90%，其中柴胡皂苷a+d的质量百分量达到60% 80%，进一步有效提高了柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的纯度。
图I是步骤C不同氧化铝对柴胡总皂苷提取效果的影响比较图。图2是步骤C不同上样方式及流动相用量对柴胡总皂苷提取效果的影响比较图。图3是步骤C不同装柱径高比对柴胡总皂苷提取效果的影响比较图。图4是步骤D正相硅胶不同装柱径高比对柴胡皂苷a和d的影响比较图。图5是步骤E反相硅胶不同装柱径高比对柴胡皂苷a和d的影响比较图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。以下实施例、对比例及试验例中，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的测定方法HPLC测定方法高效液相色谱柱条件美国agilent高效液相色谱仪；色谱条件Zorbaxextend-C18 (250mm X 4. 6mm, 5. O μ m)色谱柱；流动相为乙腈-水；梯度洗脱，时间程序为O — 24 — 27 — 30min,乙腈体积分数相应为25% — 69% — 25% — 25% ;流速为O. 8ml/min ;柱温为30°C ;检测波长210nm。进样量10微升。以下实施例及试验例中，柴胡总皂苷的测定方法比色法对照品溶液的制备精密称取柴胡皂苷a 4. 6mg，加甲醇溶解，定容于IOmL容量瓶中，摇匀，制得每ImL含O. 46mg的标准品溶液。供试品的制备准确称取柴胡总皂苷20mg，用20mL蒸馏水分两次溶解，水溶液用20mL饱和正丁醇萃取5次，再分别经过5%氨水洗2次，每次50mL，上层饱和正丁醇液于70°C 水浴中蒸干，残留物用甲醇溶解，定容至20mL容量瓶中，摇匀。测定方法取供试品或对照品溶液O. 2mL,加入O. 4%的对二甲氨基苯甲醛-乙醇溶液，在70°C水浴中反应lOmin，放至室温，加入磷酸4ml，在50°C水浴中反应20min后，在545nm处测定吸光值，计算含量即可。实施例I本实施例是柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的提取纯化工艺步骤(I):A.取柴胡药材20kg，清洗、切片、晾晒/干燥后，粉碎至16目，加入15倍量(L/g)的60%(v/v)、pH值为7的乙醇浸泡24小时，进行渗漉，渗漉流速为15mL/min，收集渗漉液，65°C减压浓缩成相对密度为I. I I. 2的浓缩液；B.将浓缩液上DlOl大孔树脂柱，树脂柱径高比为I : 3，搅拌吸附12h，再动态吸附，吸附流速为lBV/h，然后用5BV水洗柱除杂，再用3BV30% (v/v)乙醇除杂(前述碱水溶液PH值为 . 5-9)；85% (v/v)乙醇8BV洗脱，洗脱流速I. 5BV/h,收集85% (v/v)乙醇洗脱液，50°C减压浓缩回收溶剂得柴胡总皂苷粗品，检测可得柴胡皂苷a+d含量为35. 7%，柴胡总皂苷含量为54. 2% ；C.取上述柴胡总皂苷粗品100g，加11倍量(mL/g)二氯甲烷甲醇10 I (v/v),5000转离心15min，取上清液，上碱性氧化铝柱，碱性氧化铝用量为柴胡总皂苷粗品的10倍量(g/g)，径高比为I : 3，二氯甲烷甲醇6 : I 10 : I混合溶剂洗脱，洗脱速度每小时8BV,收集洗脱液，薄层检识，合并含有柴胡皂苷的流分，浓缩回收溶剂，得高纯度柴胡总皂苷，检测可得柴胡皂苷a+d质量百分量为77. 4%，柴胡总皂苷质量百分比含量为87. 3%。步骤(2):D.取C步骤中所得柴胡总皂苷用8倍量(mL/g) 二氯甲烷甲醇6 I (V/V)溶解，取相当于柴胡总皂苷15倍量(g/g)正相硅胶，干法装柱径高比为I : 10，二氯甲烷甲醇6 : 1-9 : I (V/V)梯度洗脱，洗脱速度每小时2BV，经薄层检识，分离得7部分，各部分浓缩回收溶剂。E.取D步骤中第3部分用8倍量(mL/g) 70% (V/V)甲醇溶解，取相当于D步骤中第3部分15倍量(g/g)反相硅胶，湿法装柱，径高比为I : 10，用70%-100% (V/V)甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱速度每小时O. 5BV，分离得到5个部分，经薄层检识，第3部分即为柴胡皂苷a，第5部分为柴胡皂苷d，经液相色谱检测，皂苷a纯度为98. 3%，皂苷d纯度为98. 9%。E-2.取D步骤中第5部分8倍量(mL/g) 60%(V/V)甲醇溶解，取相当于D步骤中第5部分15倍量(g/g)反相硅胶，湿法装柱，径高比为I : 10，用60%-80%(V/V)甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱速度每小时O. 6BV,分离得到9个部分。经薄层检识，第5、6部分为柴胡皂苷a，合并5、6部分，经液相色谱检测，柴胡皂苷a纯度为98. 7%。实施例2本实施例是柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的提取纯化工艺步骤(I):A.取柴胡经超临界萃取挥发油后药渣20kg，加入12倍量(L/kg)的65% (v/v),pH值为8的乙醇浸泡24小时，进行渗漉，渗漉流速为10mL/min，收集渗漉液，65°C减压浓缩成相对密度为I. I I. 2的浓缩液； B.将浓缩液上DlOl大孔树脂柱，树脂柱径高比为1:3，静态吸附6小时，搅拌吸附6h，再动态吸附，吸附流速为I. 5BV/h，然后用6BV水洗柱除杂，再用4BV30% (v/v)乙醇除杂(前述碱水溶液PH值为7. 5-9)；80% (v/v)乙醇6BV洗脱，洗脱流速lBV/h，收集80% (v/V)乙醇洗脱液，50°C减压浓缩回收溶剂得柴胡总皂苷粗品，检测可得柴胡皂苷a+d含量为36. 5%，柴胡总皂苷含量为56. 8%。C.取上述柴胡总皂苷粗品200g，加15倍量(mL/g)乙醇溶解，5000转离心15min，取上清液，上碱性氧化铝柱，碱性氧化铝用量为柴胡总皂苷粗品的10倍量(g/g)，干法装柱，径高比为I : 5，二氯甲烷甲醇6 1-10 I (V/V)混合溶剂洗脱，洗脱速度每小时6BV，收集洗脱液，薄层检识，合并含有柴胡皂苷的流分，浓缩回收溶剂，得高纯度柴胡总皂苷，检测可得柴胡皂苷a+d质量百分比量为75. 4%，柴胡总皂苷质量百分比含量为86. 7%。步骤(2):D.取C步骤中所得柴胡总皂苷用10倍量(mL/g) 二氯甲烷甲醇6 I (v/v)溶解，取相当于C步骤中所得柴胡总皂苷20倍量(g/g)正相硅胶，干法装柱，径高比I : 15，二氯甲烷甲醇6 1-9 I (V/V)梯度洗脱，洗脱速度每小时I. 5BV，经薄层检识，分离得7部分，各部分浓缩回收溶剂。E.取D步骤中4、5部分合并，用10倍量(mL/g) 50%(V/V)甲醇水溶液溶解，取相当于D步骤中4、5部分20倍量(g/g)反相硅胶，湿法装柱，径高比I : 15，50%-80% (v/v)甲醇水溶液洗脱，洗脱速度每小时O. 2BV，经薄层检识，分离得7部分，第4部分为柴胡皂苷
a,第5部分为柴胡皂苷d，经高效液相色谱检测，柴胡皂苷a纯度为98. 0%，柴胡皂苷d纯度为 98. 8%οE-2.取D步骤中第7部分浓缩回收溶剂，用5倍量(mL/g)60%(V/V)甲醇水溶液溶解，取相当于D步骤中第7部分20倍量(g/g)反相硅胶，湿法装柱，径高比I : 10，60%-80%甲醇水溶液洗脱，洗脱速度每小时O. 3BV,经薄层检识，得7部分，第4部分含皂苷a，第7部分含皂苷d，经高效液相色谱检测，柴胡皂苷a纯度为98. 5%，柴胡皂苷d纯度为98. 1%。实施例3本实施例是柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的提取纯化工艺步骤(I):步骤A、步骤B同实施例2。C.取上述柴胡总皂苷粗品200g，加3倍量(mL/g)乙醇分散，加相当于上述柴胡总皂苷粗品2倍量(g/g)中性氧化铝，拌干溶剂得拌样氧化铝；取相当于上述柴胡总皂苷粗品20倍量(g/g)中性氧化铝，干法装柱，径高比为I :5，二氯甲烷甲醇6 1-10 I (v/v)混合溶剂洗脱，洗脱速度8BV，收集洗脱液，薄层检识，合并含有柴胡皂苷的流分，浓缩回收溶剂，得高纯度柴胡总皂苷，检测可得柴胡皂苷a+d质量百分量为70. 1%，柴胡总皂苷质量百分比含量为83. 2%。步骤(2):D.取C步骤中所得柴胡总皂苷用10倍量(mL/g) 二氯甲烷甲醇6 I (V/V)溶解，得上样溶液，取相当于C步骤中所得柴胡总皂苷50倍量(g/g)正相硅胶，干法装柱，径高比I : 15，二氯甲烷甲醇6 1-9 I (V/V)梯度洗脱，洗脱速度每小时1.5BV，经薄层检识，分离得7部分，各部分分别浓缩回收溶剂。。E.取D步骤中4、5部分合并，浓缩回收溶剂，用10倍量(mL/g) 50% (v/v)甲醇水溶液溶解，取相当于D步骤中4、5部分50倍量(g/g)反相硅胶，湿法装柱，径高比I : 15，50%-80% (V/V)甲醇水溶液洗脱，洗脱速度每小时O. 6BV,经薄层检识，分离得7部分，第4部分为柴胡皂苷a，第5部分为柴胡皂苷d，经高效液相色谱检测，柴胡皂苷a纯度为98. 3%， 柴胡皂苷d纯度为98. 8%。E-2.取D步骤中第7部分，用10倍量(mL/g) 60% (V/V)甲醇水溶液溶解，取相当于D步骤中第7部分20倍量(g/g)反相硅胶，湿法装柱，径高比I : 10，60%-80% (v/v)甲醇水溶液洗脱，洗脱速度每小时O. 9BV,经薄层检识，得7部分，第4部分含皂苷a，第7部分含皂苷d，经高效液相色谱检测，柴胡皂苷a纯度为98. 5%，柴胡皂苷d纯度为98. 1%。实施例4本实施例是柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的提取纯化工艺步骤(I): 步骤A、步骤B同实施例2。步骤(2):C.取上述柴胡总皂苷粗品100g，加5倍量(mL/g) 二氯甲烷甲醇5 I (v/v)分散，加相当于上述柴胡总皂苷粗品5倍量(g/g)酸性氧化铝，拌干溶剂，得拌样氧化铝；取相当于上述柴胡总皂苷粗品8倍量(g/g)酸性氧化铝，干法装柱，径高比为I : 3，二氯甲烷甲醇6 I 10 I (V/V)混合溶剂洗脱，洗脱速度每小时5BV，收集洗脱液，薄层检识，合并含有柴胡皂苷的流分，浓缩回收溶剂，得高纯度柴胡总皂苷，检测可得柴胡皂苷a+d质量百分比量为62. 4%，柴胡总皂苷质量百分比含量为76. 5%。步骤(2):D.取C步骤中所得柴胡总皂苷用5倍量(mL/g) 二氯甲烷甲醇6 I (V/V)溶解，取相当于C步骤中所得柴胡总皂苷15倍量(g/g)正相硅胶，干法装柱，径高比为I : 5，二氯甲烷甲醇6 1-9 I (v/v)梯度洗脱，洗脱速度每小时3BV，经薄层检识，分离得7部分，各部分浓缩回收溶剂。E.取D步骤中第3部分用5倍量(mL/g) 70%(v/v)甲醇溶解,取相当于D步骤中第3部分15倍量(g/g)反相硅胶，湿法装柱，径高比为I : 5，用70%-100%(v/v)甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱速度每小时O. 15BV，分离得到5个部分，经薄层检识，第3部分即为柴胡皂苷a，第5部分为柴胡皂苷d，经液相色谱检测，皂苷a纯度为98. 1%，皂苷d纯度为98. 2%。E-2.取D步骤中第5部分用5倍量(mL/g) 60%(v/v)甲醇溶解,取相当于D步骤中第5部分15倍量(g/g)反相硅胶，湿法装柱，径高比为I : 5，用60%-80%(v/v)甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱速度每小时O. 15BV，分离得到9个部分。经薄层检识，第5、6部分为柴胡皂苷a，合并5、6部分，经液相色谱检测，柴胡皂苷a纯度为98. 2%。对比例I采用CN102166235A中实施例3的方法，取使用超临界 提取过挥发油的柴胡药材Ikg,加入8倍药材体积的30% (v/v)、pH值为8的乙醇浸泡24小时，进行渗漉，渗漉流速5mL/min,收集渗漉液，60°C减压浓缩，浓缩成稀浸膏，再加pH值为8的碱水将浓缩浸膏稀释至柴胡总皂苷含量为O. 8g/mL，将稀释药液上DlOl大孔树脂柱，树脂柱径高比为I : 4，静置6h，搅拌吸附10h，再动态吸附，吸附流速为2BV/h，然后用4BV水洗柱除杂，再用4BV30%(v/v)乙醇除杂；78% (v/v)乙醇6BV洗脱，洗脱流速2BV/h，收集洗脱液，60°C减压浓缩，浓缩液冻干成淡黄色粉末。检测可得柴胡皂苷a+d含量为34. 6%，总皂苷含量为58. 5%。对比例2按照CN 101333240A中实施例2进行取柴胡饮片10kg，O. 5%Na0H_55%乙醇15L回流提取3次，每次提取I. 5小时，回收溶剂，提取物加水分散溶解，使水溶液稀释倍数为I 12(以生药量计)通过6L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速4BV/h，树脂柱径高比为I : 7，上样量为O. 16g/ml (以生药量计)，45%乙醇洗脱4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为2BV/h，85%乙醇洗脱4倍树脂体积，洗脱流速为2BV/h，收集85%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为柴胡总皂苷提取物。测定柴胡总皂苷提取物中总皂苷含量为48. 2%，其中柴胡皂苷a、柴胡皂苷C、柴胡皂苷d三种成分的含量之和为23. 5%。通过以上两个对比例可见，本发明通过在柴胡皂苷粗品基础上增加氧化铝纯化步骤，得到的柴胡总皂苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量大大提高。以下就本发明筛选研究中的对比效果摘要如下试验例I步骤C不同氧化铝对柴胡总皂苷提取效果的影响本试验例提取分离柴胡皂苷的方法，包括(I)药材加工、(2)提取、(3)浓缩、(4)大孔树脂处理、(5)氧化铝处理、(6)含量测定，其中步骤(5)中所用氧化铝分别为酸性、碱性、中性三种氧化铝，方法同实施例I。用HPLC测定柴胡皂苷a+d的含量，用比色法测定柴胡总皂苷的含量，比较提取效果，结果如图I。由此对比试验可得，碱性和中性氧化铝处理结果优于酸性氧化铝。试验例2步骤C不同上样方式及流动相用量对柴胡皂苷提取效果的影响.本试验例提取分离柴胡皂苷的方法，包括(I)药材加工、(2)提取、(3)浓缩、(4)大孔树脂处理、(5)氧化铝处理、(6)含量测定，其中步骤(5)中所用氧化铝为中性氧化铝，上样方式及浓度分别为加相当于柴胡总皂苷粗品1，3、5、7倍量(g/g)碱性氧化铝拌样(5倍量溶剂分散)，加相当于柴胡总皂苷粗品3、5、10、15、20、25倍量(mL/g)溶剂溶解后上碱性氧化铝柱，上药液分别进行分离，其余方法同试验例I。每种提取分离方法平行三份取均值，用HPLC测定柴胡皂a+d的含量，用比色法测定柴胡总皂苷的含量，比较提取效果，结果见图2。
由图2可知(I)氧化铝拌样时，氧化铝用量选用3 5倍量效果较好，少于3倍量时，提取效果不好，多余5倍量时，提取效果并没有相应明显提高；(2)采用溶解上样时，溶剂用量选用5 20倍量效果较好，当溶剂用量小于5倍时，提取效果不好，当溶剂用量大于20倍量时，提取效果没有明显提高。试验例3步骤C不同装柱径高比对柴胡皂苷提取效果的影响本试验例提取分离柴胡皂苷的方法，包括(I)药材加工、(2)提取、(3)浓缩、(4)大孔树脂处理、(5)氧化铝处理、(6)含量测定，其中步骤(5)中所用氧化铝为中性氧化铝，装径高比分别为I : 1、1 3、1 5、1 7、I. 9中性氧化铝柱，上药液分别进行分离，其余方法同试验例I。每种提取分离方法平行三份取均值，用HPLC测定柴胡皂苷a+d的含量，用比色法测定柴胡总皂苷的含量，比较提取效果，结果见图3。由图3可知步骤C氧化铝柱的径高比在I : 3 I : 5时，柴胡皂苷提取效果好，并在选取I : 5时效果最佳；径高比小于I : 3时，提取效果有显著下降；径高比大于I 5时，提取效果并无明显提高。试验例4步骤D正相硅胶不同装柱径高比对柴胡皂苷a和d的影响本试验例提取分离柴胡皂苷的方法，包括(I)药材加工、(2)提取、(3)浓缩、(4)大孔树脂处理、(5)氧化铝处理、(6)正相硅胶处理、(7)含量测定，其中步骤(6)中所用硅胶装柱径高比分别为I : 3、1 5、1 IOU 15、1 20，上药液分别进行分离，其余方法同实施例I。每种提取分离方法平行三份，用HPLC测定柴胡皂苷a和d的含量，结果见图4。由图4可知步骤D正相硅胶径高比在I : 5 I : 15时，柴胡总皂苷及柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的提取效果好；并在选择I : 15时效果最佳；径高比小于I : 5时，提取效果有显著下降；径高比大于I : 15时，提取效果并无明显提高。试验例5步骤E反相硅胶不同装柱径高比对柴胡皂苷a和d的影响本试验例提取分离柴胡皂苷的方法，包括(I)药材加工、(2)提取、(3)浓缩、(4)大孔树脂处理、(5)氧化铝处理、(6)正相硅胶处理、(7)反相硅胶处理、(8)含量测定，其中步骤(7)中所用反相硅胶装柱径高比分别为I : 3、1 5、1 IOU 15、1 20，上药液分别进行分离，其余方法同实施例I。每种提取分离方法平行三份取均值，用HPLC测定柴胡皂苷a和d的含量，结果见图5。
由图5可知步骤E反相硅胶径高比在I : 5 I : 15时，柴胡总皂苷及柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的提取效果好；并在选择I : 15时效果最佳；径高比小于I : 5时，提取效果有显著下降；径高比大于I : 15时，提取效果并无明显提高。
权利要求
1.柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，其特征在于，包括步骤 (1)柴胡总皂苷的提取； (2)柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化； 所述步骤(2)包括 D.取步骤(I)制得的柴胡总皂苷，加入5 10倍量(mL/g)溶剂2，得上样溶液；取相当于所述柴胡总皂苷15 50倍量(g/g)正相硅胶，干法装柱，所述上样溶液加入柱顶，用所述溶剂2以每小时I 3BV速度洗脱，收集洗脱液，薄层检识，分别合并含有柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的流分，回收溶剂得柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品； E.分别取柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品，加5 10倍量(mL/g)溶剂3，得上样溶液；取相当于所述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品15 50倍量(g/g)反相硅胶，湿法装柱，所述上样溶液加入柱顶，用所述溶剂3以每小时0. 15 I. 5BV洗脱，收集洗脱液，薄层检识，分别合并含有柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的流分，分别得柴胡皂苷a或柴胡皂苷d ； 所述溶剂2选自水、こ醇、甲醇、ニ氯甲烷、氯仿或丙酮的任ー种或它们的任意混合物；所述溶剂3选自水、甲醇、异丙醇或こ腈的任ー种或它们的任意混合物。
2.根据权利要求I所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(I)包括步骤 A.取柴胡或者柴胡提取完挥发油后的药渣，粉碎，溶剂提取，提取液浓缩回收溶剂，得总提取物； B.A步骤制得的总提取物加水分散，上大孔树脂吸附柱，碱水洗脱除杂，水洗脱至中性，体积百分比浓度20% 45%こ醇/水溶液洗脱除杂，体积百分比浓度70% 90%こ醇/水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩回收溶剂，得柴胡皂苷粗品； C.取步骤B制得的柴胡皂苷粗品，用3 5倍量(mL/g)溶剂I分散，加入相当于所述柴胡皂苷粗品2 5倍量(g/g)氧化铝，拌干溶剤，得拌样氧化铝；或取步骤B制得的柴胡皂苷粗品，加入5 20倍量(mL/g)溶剂I溶解，得柴胡皂苷上样溶液；取相当于所述柴胡皂苷粗品8 20倍量(g/g)氧化铝，干法装柱；将所述拌样氧化铝或所述柴胡皂苷上样溶液加入柱顶，所述溶剂I以每小时5 IOBV速度洗脱，收集洗脱液，薄层检识，合并含有柴胡皂苷的流分，浓缩回收溶剂，得柴胡总皂苷； 所述溶剂I选自水、こ醇、甲醇、ニ氯甲烷、氯仿或丙酮的任ー种或它们的任意混合物。
3.根据权利要求I所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，其特征在干，步骤D所述的正相硅胶柱的径高比为I : 5 I : 15。
4.根据权利要求I所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，其特征在干，步骤E所述的反相硅胶柱的径高比为I : 5 I : 15。
5.根据权利要求2所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，其特征在干，步骤B所述大孔吸附树脂选自非极性、弱极性、中等极性大孔吸附树脂中的任ー种；所述碱水溶液为碱性或弱碱性盐类成分的水溶液。
6.根据权利要求2所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，其特征在干，步骤A所述溶剂选自任ー醇类溶剂或水，或它们的任意混合物。
7.根据权利要求2所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，其特征在干，步骤C所述的氧化铝柱的径高比为I : 3 I : 5。
8.根据权利要求2所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，其特征在干，步骤C所述的氧化铝选自碱性氧化铝或中性氧化铝。
9.根据权利要求3所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，其特征在干，步骤D所述的正相硅胶柱的径高比为I : 15。
10.根据权利要求4所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，其特征在干，步骤E所述的反相硅胶柱的径高比为I : 15。
全文摘要
本发明涉及中药制备领域，具体公开了一种柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的提取纯化方法。柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法，包括步骤(1)柴胡总皂苷的提取；(2)柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化，所述步骤(2)包括正相硅胶和反相硅胶层析。进一步，所述步骤(1)包括柴胡皂苷提取、大孔树脂分离及氧化铝纯化步骤。本发明方法获得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d纯度高，并适合于工业化生产。
文档编号C07J63/00GK102659903SQ20121014359
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者张翠鳌, 杨兴旺, 杨占国, 索志荣, 马家骅, 马璇 申请人:青川德康源药业有限公司