柴胡皂苷a防治骨质疏松的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了柴胡皂苷a防治骨质疏松的应用，柴胡皂苷a对人骨髓间充质干细胞无毒性作用，不影响细胞增殖；对过氧化氢造成的人骨髓间充质干细胞的凋亡具有保护作用；并且在其分化过程中改善H2O2诱导的氧化应激状态；对H2O2造成的人骨髓间充质干细胞成骨分化抑制具有保护作用；对H2O2造成的人骨髓间充质干细胞成脂分化增强具有抑制作用；可以抑制骨吸收因子的表达，从而通过改善人骨髓间充质干细胞凋亡和分化抑制及间接抑制破骨细胞活化来对骨质疏松起保护作用。在去势小鼠骨松模型中，柴胡皂苷a可以改善血清中的氧化应激状态，改善股骨远端和第四腰椎的松质骨骨微结构。因此，柴胡皂苷a能够用于制备防治骨质疏松的药物。
【专利说明】柴胡皂苷a防治骨质疏松的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于骨质疏松的防治【技术领域】，涉及柴胡皂苷a防治骨质疏松的应用。
【背景技术】
[0002]骨质疏松症(osteoporosis，0P)是由多种病因导致的骨组织骨量丢失、骨微结构恶化和生物力学性能减退的一种全身性、退行性、代谢性骨骼疾病，导致骨脆性增加，容易发生骨折，严重威胁着中老年人的身心健康。
[0003]氧化应激(oxidative stress)是机体内高活性物质如ROS (Reactive oxygenspecies)产生过多，超出了机体的清除能力，导致氧化和抗氧化失衡的一种状态。生理范围内的ROS在调节人体正常的功能如细胞凋亡、基因表达、信号转导等方面起着重要的作用。然而，高浓度的ROS可以导致核酸、蛋白质、脂质产生氧化反应，损害细胞的结构和功能，弓丨起疾病的发生。
[0004]近年来，研究发现氧化应激在骨质疏松发生发展中起重要作用。过量氧自由基(ROS)的产生可以抑制骨髓基质干细胞(MSCs)成骨分化，造成MSCs和成骨细胞(OB)凋亡，促进破骨细胞(OC)活化和功能增强，导致骨吸收和骨形成失衡，引起骨微结构改变和骨量降低。
[0005]柴胡是一种具有高度生物活性的药用植物，广泛应用于传统中药中。柴胡皂苷是其主要活性成分，柴胡的大部分功效是通过柴胡皂苷发挥的。柴胡皂苷a (SSa)是包含在其中的最大量皂苷成分之一，具有多项生理功能:抗炎、免疫调节、抗菌、抗过敏、抗癌等。
【发明内容】
[0006]本发明解决的问题在于提供柴胡皂苷a防治骨质疏松的应用，柴胡皂苷a可应用于防治骨质疏松的药物的制备。
[0007]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0008]柴胡皂苷a在制备防治骨质疏松的药物中的应用。
[0009]含柴胡皂苷a的植物提取物在防治骨质疏松药物的制备中的应用。
[0010]柴胡皂苷a在制备改善人骨髓间充质干细胞氧化应激状态药物的制备中的应用。
[0011]柴胡皂苷a在制备抗人骨髓间充质干细胞凋亡药物中的应用。
[0012]柴胡皂苷a在制备抗人骨髓间充质干细胞成骨分化抑制的制备中的应用。
[0013]柴胡皂苷a在制备提高人骨髓间充质干细胞中ALP活性药物中的应用。
[0014]柴胡皂苷a在制备提高人骨髓间充质干细胞中促成骨分化基因ALP、C0L-1、0CN及OPN表达水平的药物中的应用。
[0015]柴胡皂苷a在制备提高人骨髓间充质干细胞中抑制RANKL和IL_6水平的药物中的应用。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0017]柴胡皂苷a对人骨髓间充质干细胞(hBMSC)无毒性作用、对过氧化氢(H2O2)造成的hBMSC的凋亡具有保护作用；并且可以改善H2O2造成的氧化应激状态；对H2O2造成的hBMSC成骨分化抑制具有保护作用；对11202造成的hBMSC成脂分化增强具有抑制作用；可以抑制骨吸收因子的表达。在去势小鼠模型中，柴胡皂苷a可以改善血清中的氧化应激状态，改善股骨远端和第四腰椎的松质骨骨微结构。
[0018]hBMSC细胞是研究早期成骨前体细胞生长、分化的较常用的细胞模型，鉴于柴胡皂苷a对hBMSC具有保护作用，促进骨形成，并通过抑制骨吸收因子来抑制破骨细胞的活化，降低骨吸收，最终起到防治骨质疏松的作用。卵巢切除小鼠模型为常用的绝经后骨松模型，通过连续腹腔注射给与不同剂量柴胡皂苷a，明显改善了血清氧化应激状态，对松质骨骨微结构有保护作用，表明其能够发挥预防及治疗绝经后骨质疏松的作用。
[0019]柴胡皂苷a为我国传统中药柴胡的有效提取物之一，为纯天然提取物，用药较安全，毒副作用小。
[0020]因此，柴胡皂苷a可应用于骨质疏松的防治，尤其是在防治骨质疏松药物的制备中的应用。
【专利附图】
【附图说明】[0021]图1-1为不同浓度柴胡皂苷a对细胞增殖作用的影响。
[0022]图1-2为柴胡皂苷a对H2O2造成细胞凋亡的保护作用。
[0023]图2为柴胡皂苷a可以改善细胞氧化应激ROS水平的检测结果。
[0024]图3-1为柴胡皂苷a在H2O2作用后，对细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的作用。
[0025]图3-2为柴胡皂苷a在H2O2作用后，对细胞基质钙盐沉积的作用。
[0026]图3-3-1~图3-3-4为柴胡皂苷a在H2O2作用后，对4种成骨分化基因表达水平的影响。
[0027]图4-1为在H2O2作用后，柴胡皂苷a对细胞脂质生成的作用。
[0028]图4-2为在H2O2作用后，柴胡皂苷a对成脂分化基因PPAR Y 2表达水平的影响。
[0029]图5为柴胡皂苷a在H2O2作用后，对2种骨吸收因子RANKL和IL_6表达的影响。
[0030]图6-1A和图6-1B为柴胡皂苷a可以改善小鼠血清中氧化应激指标MDA和GSH水平的检测结果。
[0031]图6-2为柴胡皂苷a可以改善OVX小鼠股骨远端松质骨骨微结构的Micro-CT结
果O
[0032]图6-3为柴胡皂苷a可以改善OVX小鼠股骨远端松质骨骨微结构的VG染色结果。【具体实施方式】
[0033]下面结合具体的实施方案对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0034]hBMSC为人骨髓间充质干细胞，具有多向分化潜能，比如分化为成骨细胞、成脂细胞、成纤维细胞等，是研究骨髓间充质干细胞生长、分化的较常用的细胞模型，H2O2处理也是较常用的体外氧化应激模型，出于观察柴胡皂苷a对人骨髓间充质干细胞凋亡和分化的影响，及其抗氧化损伤的作用，所以选择hBMSC作为细胞模型，H2O2处理为体外氧化应激模型。卵巢切除(去势)小鼠模型作为动物模型，是常用的模拟妇女绝经后骨松的模型。[0035]1、柴胡皂苷a对氧化应激导致hBMSC凋亡的保护作用
[0036]1.1单纯柴胡皂苷a对细胞的毒性作用
[0037]将hBMSC细胞以2 X IO3接种到96孔板上，待细胞长满后，弃掉培养基，加含不同浓度0、0.1、1、10 μ M柴胡皂苷a的无血清培养基至孔板中，培养24h、48h和72h，观察柴胡皂苷a对细胞增殖作用的影响。在观察点，利用MTT法对细胞活性进行检测。
[0038]结果如图1-1所示，横坐标为不同浓度的柴胡皂苷a作用时间，该图的纵坐标为吸光度OD值，以各组的OD值同空白对照组的OD值进行比较的百分数来表述。由图可见，不同浓度的柴胡皂苷a在观察时间内，对细胞的增殖并无明显影响。
[0039]1.2柴胡皂苷a对氧化应激导致hBMSC凋亡的保护作用
[0040]分组情况:空白对照组；单纯H2O2 处理组;0.I μ M SSa+H202; I μ M SSa+H202; 10 μ MSSa+H202。
[0041]将hBMSC细胞以2 X IO3接种到96孔板上，待细胞长满后，弃掉培养基，加含不同浓度0、0.1、1、10 μ M柴胡皂苷a的无血清培养基至孔板中，培养24h，加入H2O2 (300 μ M),再培养24h，利用MTT法进行细胞活性检测。
[0042]结果如图1-2所示，横坐标为各组的作用方式，纵坐标为吸光度OD值，以各组的OD值同空白对照组的OD值进行比较的百分数来表述。由图可见，单纯H2O2作用后，细胞活性降低，经不同浓度柴胡皂苷a作用后细胞活性增加，同单纯H2O2作用组相比，具有统计学差异。图中的#号表示:同对照组相比，#P〈0.05，##P〈0.01;图中的*号表示:同单纯H2O2作用组相比，*P < 0.05, #P < 0.01。这表明用柴胡皂苷a处理后能够保护H2O2诱导的hBMSC的凋亡。
[0043]综上所述，经柴胡皂苷a对hBMSC细胞作用，不同浓度柴胡皂苷a对细胞进行预处理，然后施加H2O2干预，通过MTT检测细胞活性，结果表明单纯H2O2作用可以导致细胞活性降低，造成细胞凋亡，而0.1、1、10μΜ柴胡皂苷a预处理，对这种损伤具有保护作用。因此，柴胡皂苷a对H2O2诱导的氧化应激导致的细胞凋亡具有保护作用。
[0044]2、柴胡皂苷a抗氧化作用检测
[0045]hBMSC细胞铺满后，在柴胡皂苷a和/或H2O2作用下，处理方法同上，进行氧化应激相关检测。
[0046]根据ROS检测试剂盒，利用荧光探针DCFH-DA对细胞内的活性氧进行检测。细胞爬片，0.1、1、10 μ M柴胡皂苷a预处理24h，300 μ M H2O2作用24h，然后进行原位装载探针，加入IOyM DCFH-DA,孵育20min，用无血清的培养液洗3次，去除未结合的探针，利用荧光酶标仪进行检测。
[0047]结果如图2所示，横坐标为各组的作用方式，纵坐标为吸光度OD值的百分率，以各组的OD值同空白对照组的OD值进行比较的百分数来表述。由图可见，单纯H2O2处理后，细胞内的ROS水平升高很明显，而0.1、1、10μΜ柴胡皂苷a预处理后，细胞内的ROS水平降低。因此，柴胡皂苷a可以改善hBMSC氧化应激ROS水平。
[0048]3、柴胡皂苷a对氧化应激造成hBMSC成骨分化抑制的保护作用
[0049]柴胡皂苷a对氧化应激造成hBMSC成骨分化抑制的保护作用:实验分组同上，将细胞铺于6孔板上,铺满后,加入地塞米松0.1uM, IOmM甘油磷酸钠,50ug/ml抗坏血酸进行成骨诱导培养。14天后，给予0.1、1、10 μ M柴胡皂苷a预处理24h，然后加入300 μ M H2O2处理 24h。
[0050]3.1根据碱性磷酸酶定量试剂盒(上海杰美)进行ALP定量，收集细胞，裂解后，提取蛋白。测定蛋白浓度，然后根据试剂盒的说明，进行ALP定量检测。
[0051]结果如图3-1所示，横坐标为各组的作用方式，纵坐标为吸光度OD值的百分率，以各组的OD值同空白对照组的OD值进行比较的百分数来表述。单纯H2O2作用后，细胞ALP活性表达同空白对照组相比显著下降，柴胡皂苷a作用后，ALP活性表达升高，同单纯H2O2作用组相比具有统计学差异。ALP为成骨及其前体细胞分化中期的关键表达蛋白，为检测成骨及其前体细胞分化的特异性指标，氧化应激导致ALP活性降低，对成骨及其前体细胞分化为抑制作用，但经柴胡皂苷a作用后，ALP表达增加，改善了氧化应激对hBMSC成骨分化的抑制作用。
[0052]3.2钙化结节染色:用PBS冲洗培养细胞，多聚甲醛固定后，1%茜素红染色30分钟，用水冲洗5次，倒置显微镜下观察钙结节沉积。
[0053]结果如图3-2所示，单纯H2O2作用后钙化结节形成较少，但是柴胡皂苷a预处理后，结节面积有增加。钙结节形成为成骨及其前体细胞分化的矿化阶段，氧化应激可以抑制成骨及其前体细胞分化，而柴胡皂苷a可以通过改善氧化应激来改善hBMSC成骨分化。
[0054]3.3成骨基因的RT-PCR检测:实验分组同上，将细胞铺于6孔板上，铺满后，加入
0.1uM地塞米松，IOmM甘油磷酸钠，50ug/ml抗坏血酸进行成骨诱导培养。14天后,给予0.1、
1、10μ M柴胡皂苷a预处理24h，然后加入300 μ M H2O2处理24h。用Trizol裂解细胞，提取细胞内的mRNA，根据实时定量RT-PCR的程序，对目的基因ALP、C0L_1、0CN及OPN进行定量检测。
[0055]结果如图3-3-1~3-3-4所不，由图可见，H2O2作用后，细胞成骨分化基因ALP、COL-1, OCN及OPN表达水平下降，柴胡皂苷a作用后，可以显著促进成骨基因表达。ALP、COL-1, OCN及OPN基因分别为成骨及其前体细胞分化中期和后期的关键基因，决定着细胞的分化水平。H2O2抑制成骨及其前体细胞成骨分化基因的表达，而柴胡皂苷a作用后，成骨分化基因表达有上调，说明柴胡皂苷a可以改善H2O2导致的hBMSC成骨分化抑制。
[0056]4、柴胡皂苷a对氧化应激造成的hBMSC成脂增强的抑制作用
[0057]4.1油红O检测脂质的生成:成脂诱导14天后，细胞经柴胡皂苷a和/或H2O2处理2天，用PBS冲洗细胞，3.7%甲醛固定20分钟，再用油红O液体染色I小时。
[0058]结果如图4-1所示，单纯H2O2作用后脂滴形成较多，但是柴胡皂苷a预处理后，月旨滴生成明显减少。脂质生成为向成脂分化的标志，氧化应激可以促进成脂分化，而柴胡皂苷a可以通过改善氧化应激来抑制hBMSC成脂分化。
[0059]4.2成脂基因的RT-PCR检测:实验分组同上，将细胞铺于6孔板上，铺满后，再成脂诱导14天，之后给予0.1、1、10 μ M柴胡皂苷a预处理24h，然后加入300 μ M H2O2处理24h。用Trizol裂解细胞，提取细胞内的mRNA，根据实时定量RT-PCR的程序，对目的基因PPAR Y 2进行定量检测。
[0060]结果如图4-2所示，由图可见，H2O2作用后，细胞成脂分化基因PPAR Y 2表达水平升高，柴胡皂苷a作用后，可以显著抑制成脂基因的表达。PPAR Y 2为成脂及其前体细胞分化的关键基因，一定程度上决定着细胞的分化水平。H2O2促进成脂分化基因的表达，而柴胡皂苷a作用后，成脂分化基因表达下调，说明柴胡皂苷a可以抑制H2O2导致的hBMSC成脂分化。
[0061]5、柴胡皂苷a对骨吸收因子的表达影响
[0062]柴胡皂苷a对氧化应激刺激骨吸收因子增加的抑制作用:分组同上，将细胞铺于6孔板上，铺满后，进行成骨诱导培养，14天后，给予柴胡皂苷a处理，然后加入H2O2,裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白浓度，根据酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测RANKL和IL-6的表达情况。
[0063]结果如图5所示，H2O2作用后，细胞表达的RANKL和IL-6水平增加，柴胡皂苷a预处理可以抑制骨吸收因子的表达。RANKL和IL-6为成骨及其前体细胞分泌的细胞因子，可以活化破骨细胞，进而引起骨吸收增强，导致骨量降低，因此，柴胡皂苷a可以通过抑制RANKL和IL-6的表达，来抑制破骨细胞的活化，进而减少骨量的丢失。
[0064]综合以上表明:柴胡皂苷a对人骨髓间充质干细胞无毒性作用，不影响细胞增殖；对H2O2造成的人骨髓间充质干细胞的凋亡具有保护作用；并且在其分化过程中改善H2O2诱导的氧化应激状态；对11202造成的人骨髓间充质干细胞成骨分化抑制具有保护作用；对H2O2造成的人骨髓间充质干细胞成脂分化增强具有抑制作用；可以抑制骨吸收因子的表达，从而通过改善人骨髓间充质干细胞凋亡和分化抑制间接抑制破骨细胞活化来对骨质疏松起保护作用。
[0065]6.动物骨松模型的建立
[0066]50只8周大BALB/c雌性小鼠，体重为20_22g。本实验中5组小鼠的初始体重无统计学差异。在切除卵巢前，先将它们置于实验室条件下I周(即通气良好的20°C恒温环境中，每12小时光照与黑暗交替，水粮足量，自由取用)。适应I周后，用戊巴比妥钠(50mg/kg体重)进行麻醉，小鼠被切除卵巢(去势，n=40)或者假手术(n=10)。卵巢切除是通过背侧入路切除双侧卵巢。假手术意味着手术找到双侧卵巢，但不切除，直接缝合关闭切口。小鼠被随机分为5组:不处理组(假手术对照组)；不处理组(单纯卵巢切除组)；低剂量SSa给药组(卵巢切除后每日通过腹腔注射给予lmg/kg体重的SSa溶液)；中剂量SSa给药组(卵巢切除后每日通过腹腔注射给予5mg/kg体重的SSa溶液);高剂量SSa给药组(卵巢切除后每日通过腹腔注射给予10mg/kg体重的SSa溶液。SSa溶解于去离子水中，通过腹腔注射对不处理组小鼠注射同体积去离子水。手术后I周开始给药，连续给药12周时间。给药完成后，麻醉下通过心脏采血获得血液标本，并进行离心。提取每只小鼠的左侧股骨和第四腰椎，清除粘连的肌肉组织，妥善固定。
[0067]6.1使用脂质过氧化物MDA检测试剂盒检测各组血液样本。在脂质过氧化过程中硫代巴比妥酸与MDA结合生成显色复合物，其最大吸收峰在532nm，利用酶标仪在此处读数。同样，使用GSH检测试剂盒检测各组血液样本。GSH的检测是根据GSH与二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反应形成一个产物，此产物通过酶标仪在412nm处进行读数检测。
[0068]结果如图6-1A和图6-1B所示，横坐标为各组的作用方式，纵坐标为吸光度OD值的百分率，以各组的OD值同空白对照组的OD值进行比较的百分数来表述。由图可见，单纯H2O2处理后，血清中的MDA水平明显升高，GSH水平明显降低；而高、中、低剂量的柴胡皂苷a给药组血清中的MDA水平降低，GSH水平升高。因此，柴胡皂苷a可以改善血清中氧化应激状态。
[0069] 6.2显微CT检测骨微结构:第四腰椎和股骨远端的骨微结构通过探索轨迹SP预临床标本显微CT进行检测。分辨率为8mm,管电压为50kV,管电流为0.1mA。通过一个桌面显微CT处理软件进行重建和3D定量分析。所有标本的扫描环境和分析方法相同。股骨扫描区域限定为远端干垢端，并且向近端的初级松质近末端区域延伸2.0mm。在排除了颅骨及尾终板区后，椎体的松质骨区域被包含在每一个显微CT选区中。在这些待扫描的区域中，松质骨与皮质骨的分界为内皮质骨面。选定的感兴趣区的3D参数用于数据分析，包括:骨矿物质密度、连接密度、结构模型指数、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分离度和相对骨体积分数。进行扫描分析的操作者对标本的处理过程单盲。
[0070]结果如图6-2所示，相对于假手术组，卵巢切除导致了小鼠松质骨骨微结构的损害，表现为骨矿密度、连接密度、骨小梁数量、骨小梁厚度及骨体积分数的下降。同时，卵巢切除后结构模型指数和骨小梁分离度明显提高。结果具有统计学差异。然而，高、中、低剂量柴胡皂苷a给药组明显逆转了卵巢切除引起的骨微结构参数的变化趋势，起到保持第四腰椎及股骨远端小梁骨骨量的作用。因此，柴胡皂苷a能够对绝经后骨质疏松发挥预防及治疗作用。
[0071]6.3通过VG染色进行组织学检测:小鼠的左侧股骨取材完成后，用4%多聚甲醛固定48小时。所有标本用80%酒精脱水，并用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)进行包埋。用旋转切片机切取240mm片厚的冠状位薄片，然后将所有切片打磨成20mm片厚，用于进行VG染色。
[0072]结果如图6-3所示，相对于假手术组，卵巢切除组骨小梁数量明显下降，小梁间的距离明显变宽。给予高、中、低剂量柴胡皂苷a药物处理后，上述骨小梁损害效果明显得到改善，表现为骨小梁数量的增加及骨小梁间距的减小。[0073]因此，柴胡皂苷a可应用于骨质疏松的防治，尤其是在防治骨质疏松药物的制备中的应用。
[0074]而柴胡皂苷a是柴胡中主要活性成分之一，那么含有柴胡皂苷a的柴胡提取物也具有相应的应用。
【权利要求】
1.柴胡皂苷a在制备防治骨质疏松的药物中的应用。
2.含柴胡皂苷a的植物提取物在防治骨质疏松药物的制备中的应用。
3.柴胡皂苷a在制备改善人骨髓间充质干细胞氧化应激状态药物的制备中的应用。
4.柴胡皂苷a在制备抗人骨髓间充质干细胞凋亡药物中的应用。
5.柴胡皂苷a在制备抗人骨髓间充质干细胞成骨分化抑制的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，柴胡皂苷a在制备提高人骨髓间充质干细胞中ALP活性药物中的应用。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，柴胡皂苷a在制备提高人骨髓间充质干细胞中促成骨分化基因ALP、COL-1、OCN及OPN表达水平的药物中的应用。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，柴胡皂苷a在制备提高人骨髓间充质干细胞中抑制RANKL和IL-6水平的药物中的应用。
9.如权利要求1~8所述的应用，其特征在于，柴胡皂苷a的给药量至少为lmg/kg。
【文档编号】A61P19/10GK103933055SQ201410150437
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】刘建, 黄强, 高博, 杨柳, 罗卓荆 申请人:中国人民解放军第四军医大学