专利名称：ErbB受体激动剂在制备治疗缺血性脑血管病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ErbB受体激动剂在制备治疗缺血性脑血管病的药物中的应用。
背景技术：
脑血管病是我国人群的第三位致死因素，其中缺血性脑卒中约占75%，发病率和死亡率不断攀升，是严重影响我国人民健康和国民经济的重大疾病。脑血管病的发病率与年龄成正相关，随着我国人口老龄化程度加重。其发病呈上升趋势。以脑卒中为例，我国每年发病率为150/10万人，死亡率为120/10万人，存活中约有75%致残，5年复发率高达 41%，由此造成了社会和经济负担日趋加重。据世界卫生组织统计，我国脑卒中的发病率和死亡率已经高居世界首位。脑缺血患者不仅要渡过急性期的各种并发症，还有可能要面对未来长期病残所带来的巨大物质和经济负担，因此，寻找有效和安全的治疗药物是生物医学重要的目标之一。ErbB4在大脑有丰富表达，并且有研究显示ErbB4参与调节神经发育和突触可塑性。一旦与NRGl结合，ErbB4即被激活，其羧基末端的络氨酸残基发生磷酸化并聚集连接蛋白如Shc和GA2等，进而激活Ras-Raf-Erk信号通路。ErbB4的胞内区域还可以结合并激活PI3激酶和Akt。与许多受体激酶不同的是，NRGl/ErbB4信号通路还受RNA剪接的调节。 第一对被发现的ErbB4异构体主要区别就是其胞内段含或不含有一段由外显子沈编码的 16个氨基酸组成的片断(分别被称为CYT-I和CYT-2)。该片断含有络氨酸-X-X-甲硫氨酸构成的一致序列，是PI3激酶结合区域。因此，CYT-I能够激活PI3kinaSe/Akt通路，CYT-2 则不具此功能，但CYT-1/2均能激活Erk通路。有意思的是，CYT-I异构体最近被发现在缺血性脑损伤大脑呈过表达。相反，CYT-2异构体与正常对照呈现相似的表达水平。考虑到 NRGl和ErbB4均是缺血性脑损伤的易感基因，这些发现为缺血性脑损伤病人异常的NRGl/ ErbB4信号通路和GABA活性之间的关联提供一种解释。神经调节蛋白(Neuregulin-1，NRG)是一类多肽因子，由nrg21基因的编码产物选择性剪接体所组成。NRG是一种被证明具有神经保护作用的生长因子家族成员之一。NRGs 可以与ErbB家族的ErbB3、ErbB4酪氨酸酶结合，从而形成ErbB同二聚体和杂二聚体，通常包括ErbB^，继而激活细胞外信号传导通路，产生一系列细胞反应，包括增生、凋亡、迁移、 分化和黏附的活跃或抑制。神经调节蛋白的功能受体由ErbB酪氨酸激酶受体组成，ErbB蛋白为表皮生长因子受体，包括ErbB2、ErbB3、ErbB4。在缺血性脑血管病中，以ErbB为靶点的关联信号转导途径在缺血性脑损伤病理情况下的保护药物尚未见报道和专利。
发明内容
本发明研究了 ErbB4激动剂NRGl对缺血性脑损伤的保护作用，为探索缺血性脑损伤保护药物的新型有效“靶标”分子提供研究方向，为治疗以脑神经元病变为基础的脑系疾病提供候选治疗药物。本发明采用的技术方案是ErbB受体激动剂在制备治疗缺血性脑血管病的药物中的应用。所谓ErbB4受体激动剂，是指神经调节蛋白-I (Neuregulin-I)。所述Neuregulin-I分为内源性和外源性激动剂两种。外源性Neuregulin-I为人重组蛋白Neuregulin-Ibeta 2 (NRGl)，它是由61个氨基酸组成的多肽链。内源性Neuregulin-I是由神经元或胶质细胞产生，这里所用ErbB4胞外段(aal-659, ecto_ErbB4)中和掉的部分。优选的，所述ErbB受体激动剂为ErbB4受体激动剂。具体的，所述ErbB受体激动剂用于制备治疗缺血性脑损伤或缺血性脑卒中的药物。所述ErbB受体激动剂为人重组蛋白NRGl，其氨基酸序列如下uhlvkcaekektfcvn ggecfmvkdlsnpsrylckcpneftgdr cqnyvmasfykaeel yq，分子量为 7055 道尔顿。本发明以体内、体外脑神经元损伤模型为研究平台，探索NRGl对神经元细胞损伤和实验性脑缺血的保护作用，同时深入研究其可能作用分子机制，充分论证了通过对缺血性脑损伤后NRGl-ErbB4关联信号途径的调控具有脑保护作用。因此NRGl及关联ErbB4激动剂研究将可能为开发保护脑神经元细胞的新型药物、防治缺血性脑血管疾病开辟广阔的前景。本发明的有益效果主要体现在本发明揭示了 ErbB4激动剂NRGl对神经元细胞损伤和实验性脑缺血的保护作用，提示缺血性脑损伤后NRGl作为脑保护药物具有很好的应用前景。
图1为NRGl对OGD诱发培养神经元细胞损伤的保护作用；图2为NRGl对OGD诱导的小鼠皮层神经元细胞ErbB4核移位影响；图3为NRGl_ErbB4信号途径参与缺血性脑损伤病理过程(图A中白色表示梗塞区)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 :NRG1对OGD诱发培养神经元细胞损伤的保护作用药品与试剂高糖DMEM、高糖DMEM培养基购于美国GIBICO公司，NRGl购自美国Prospec公司，胎牛血清、新生小牛血清购于杭州四季青生物工程材料研究所。ErbB4兔抗一抗(Santa Cruz Biotechnology)，鼠二抗(Amersham Bioscience)，其它试剂均为国产和进口分析纯试齐LU细胞培养取用孕18天的胎鼠，无菌条件下快速取出脑置于D.Hank’ s液中，在解剖显微镜下分离剥除脑膜和血管，分离出大脑皮层，将皮层脑组织剪碎后置于离心管。用0. 25% (w/w)胰蛋白酶(含EDTA)37°C消化15min，用含10% (ν/ν)血清的DMEM培养液终止消化。使细胞分散成单细胞悬液，低速离心lOmin，弃上清。再用无血清DMEM洗2次，用Neurobasal 培养基悬浮细胞，吹打形成单细胞悬液。培养基内补充添加2% (ν/ν)的Β27补充剂 (Invitrogen), 25moI/L的谷氨酰胺。调节细胞浓度至IX IO6个/mL，接种于预先经多聚赖氨酸处理过的盖玻片、培养皿(35mm)，在37°C、饱和空气湿度、含5% (v/v) CO2的培养箱内常规传代培养4 后，加入盐酸阿糖胞苷以抑制非神经元生长。培养7d用于后续实验。体外低糖缺氧(oxygen and glucose cbprive，简称0GD)模型构建将单细胞悬液移入96孔板，3X103Cells/Well、37°C、5% CO2培养箱内培养，细胞完全融合时加入不同处理空白对照组在正常条件下培养；OGD组和OGD合并NRGl组 (5nM)，每孔用预热至 370C 的 HBSS (按如下组成配制=NaCl 8. OOg, KCl 0. 20g, CaCl2O. 14g， MgSO4. 7H20 0. 20g, Na2HPO4. H2O 0. 06g, KH2PO4O. 06g, NaHCO3O. 35g,去离子水补足至 IOOOmL) 清洗三次，并换入相同培养基，以上每组每种剂量设平行3孔，先放入缺氧密闭箱通入混合气体(含95% ，5% CO2)约5min，然后将密闭箱放入孵箱处理他，然后收集细胞进行蛋白定量。采用原代培养小鼠皮层神经元细胞结合缺氧缺糖条件开展NRGl对OGD诱发神经元细胞损伤的保护作用研究。MTT法检测OGD 4h后NRGl对缺氧缺糖条件下细胞存活率的影响。预实验结果显示NRGl (3nM, 5nM, IOnM)可以有效减轻0⑶导致的神经元细胞死亡(图 1A)，初步验证了 NRGl的神经保护作用。此外，采用流式细胞术ANNEXIN V-FITC加碘化丙啶(PI)双染检测细胞凋亡率来研究NRGl的抗神经元细胞凋亡作用。与上述结果一致，流式细胞仪测定的细胞凋亡率显示OGD 4h后神经元细胞凋亡率明显增加，而NRGl (5nM)干预具有显著的抗OGD条件下神经元细胞凋亡作用(图1B)。实施例2 :ErbB4在缺氧缺糖条件下的亚细胞分布变化及NRG调控药品与试剂高糖DMEM、高糖DMEM培养基购于美国GIBICO公司，NRGl购自美国Prospec公司，胎牛血清、新生小牛血清购于杭州四季青生物工程材料研究所。ErbB4兔抗一抗(Santa Cruz Biotechnology)，兔二抗(Amersham Bioscience)，其它试剂均为国产和进口分析纯试齐LU细胞培养取用孕18天的胎鼠，无菌条件下快速取出脑置于D. Hank's液中，在解剖显微镜下分离剥除脑膜和血管，分离出大脑皮层，将皮层脑组织剪碎后置于离心管。用0. 25%胰蛋白酶(含EDTA) 37°C消化15min，用含10%血清的DMEM培养液终止消化。使细胞分散成单细胞悬液，低速离心lOmin，弃上清。再用无血清DMEM洗2次，用Neurobasal培养基悬浮细胞，吹打形成单细胞悬液。培养基内补充添加2%的B27补充剂，25moI/L的谷氨酰胺。调节细胞浓度至IXlO6个/mL，接种于预先经多聚赖氨酸处理过的盖玻片、培养皿(35mm)，在 37°C、饱和空气湿度、含5% CO2的培养箱内常规传代培养4 后，加入盐酸阿糖胞苷以抑制非神经元生长。培养7d用于后续实验。 体外低糖缺氧模型构建 将单细胞悬液移入96孔板，3X103Cells/Well、37°C、5% CO2培养箱内培养，细胞完全融合时加入不同处理空白对照组在正常条件下培养；OGD组和OGD合并NRGl组 (5nM)，每孔用预热至 370C 的 HBSS (按如下组成配制=NaCl 8. 00g, KCl 0. 20g, CaCl2O. 14g，MgSO4. 7H20 0. 20g, Na2HPO4. H2O 0. 06g, KH2PO4O. 06g, NaHCO3O. 35g,去离子水补足至 IOOOmL)
清洗三次，并换入相同培养基，以上每组每种剂量设平行3孔，先放入缺氧密闭箱通入混合气体(含95% N2，5% CO2)约5min，然后将密闭箱放入孵箱处理他，然后收集细胞进行蛋
白定量。免疫印迹法定量检测NRGl对OGD诱导原代培养神经元细胞ErbB4再分布的影响 原代培养神经元细胞OGD损伤后ErbB4膜蛋白表达变化定量检测，蛋白标本电泳、转膜、5% 脱脂奶粉室温封闭45分钟。滴加ErbB4兔抗一抗(1 500)，4°C过夜。IOmM PBS洗3次各5分钟。滴加兔抗二抗(1 2000)室温120分钟。IOmM PBS洗3次各5分钟，ECL化学发光法显影。对免疫印迹的条带进行定量分析。预实验结果发现原代培养小鼠皮层神经元细胞在OGD 4h后发生了明显的形态学改变细胞皱缩、结团、突起缩短(图2A)。同时，OGD诱发了 ErbB4由细胞膜转入细胞核的改变(图2)。激光共聚焦免疫荧光组织化学(图2A)和Western Blot(图2B)结果均提示NRGl处理可以有效抑制OGD诱导的细胞浆ErbB4向细胞核移位。上述神经元细胞体外实验结果与前述整体动物实验结果相一致，进一步确认了 ErbB4在缺氧缺糖条件下的亚细胞分布变化。采用本实验体系，可以用于进一步的机制研究和药效评价。实施例3 :NRGl-ErbB4信号途径参与缺血性脑损伤的病理过程操作方法小鼠大脑中动脉一过性缺血再灌注模型制备雄性C57小鼠，体重22 27g。小鼠采用异氟烷气体麻醉，固定，颈正中切口，分离左侧颈总动脉、颈内、颈外动脉。颈外动脉、颈总动脉近心端结扎，在距颈内、颈外动脉分叉之前剪口，插入直径统一的5-0尼龙线栓(造成脑缺血现象)，1. 5小时后尼龙线栓退出 (造成脑血再灌注现象)，皮肤缝合。实验分组如下假手术组、脑血管损伤模型组，脑血管损伤+NRGl治疗组，每组动物 8 只。NRGl 脑室给药(150ng/kg ；采用ALZET MICRO-OSMOTIC PUMP)，连续给药 3 天。 3天后实验动物评价观察动物行为变化、通常动物会出现眼球震颤，共济失调，运动障碍等一系列神经功能损害的表现，按照Longa法对脑血管损伤SD大鼠行为学评分。评分标准如下0分无神经功能缺损症状；1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为向外侧转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。评分1分至3分的实验动物用于梗塞面积测定。缺血性脑损伤后梗塞面积测定实验用小鼠缺血1. 5小时，再灌注M小时后实验动物断头取脑，去掉小脑和低位脑干，用小鼠脑模冠状切片，每片厚2mm。脑片用常规红四氮唑(TTC)染色，用Image J软件计算梗塞面积占百分比。预实验已证明NRGl 脑室给药(150ng/kg ；采用ALZET MICRO-OSMOTIC PUMP) 可以有效减少脑梗塞灶的体积(图3A)。定量统计结果进一步提示NRGl在野生型小鼠 (ErbB4+/+)具有脑保护作用而在ErbB4基因敲除小鼠(ErbB4+)却未能看到；反之，脑梗塞灶的体积在ErbB4+小鼠有明显的增加(图3B，P < 0. 05)。上述结果提示NRGl的脑保护作用是以依存于ErbB4受体的机制完成的。所有数据以均数士标准差表示，统计学分析采用Durmett-t检验。
权利要求
1.ErbB受体激动剂在制备治疗缺血性脑血管病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述ErbB受体激动剂为ErbB4受体激动剂。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述ErbB受体激动剂用于制备治疗缺血性脑损伤或缺血性脑卒中的药物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述ErbB受体激动剂为人重组蛋白 Neuregulin-Ibeta 2，其氨基酸序列如下:shlvkcaekektfcvnggecfmvk dlsnpsryIckcpnef tgdrcqnyvmasfykaeelyq0
全文摘要
本发明提供了ErbB受体激动剂在制备治疗缺血性脑血管病的药物中的应用。本发明以体内、体外脑神经元损伤模型为研究平台，探索NRG1对神经元细胞损伤和实验性脑缺血的保护作用，同时深入研究其可能作用分子机制，充分论证了通过对缺血性脑损伤后NRG1-ErbB4关联信号途径的调控具有脑保护作用。因此NRG1及关联ErbB4激动剂研究将可能为开发保护脑神经元细胞的新型药物、防治缺血性脑血管疾病开辟广阔的前景。
文档编号A61K38/18GK102389569SQ20111035466
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者卢应梅, 李晓明 申请人:浙江大学