抗肿瘤组合物的制作方法

专利名称：抗肿瘤组合物的制作方法
抗肿瘤组合物本发明涉及包含禽副粘病毒(Avian Paramyxovirus, APMV)的药物组合物,其用于治疗哺乳动物的肿瘤。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)是禽副粘病毒(APMV)的成员之一，其导致多种鸟类感染。NDV属于APMV I。该疾病以呼吸道、脑或胃肠道的炎症为特征。数十年前即已知，新城疫病毒具有另一种并且相当出乎意料的特性由于部分未知的原因，其在哺乳动物中具有抗肿瘤作用。因此，仅次于接种禽类物种的兴趣，对新城疫病毒和其他副粘病毒在癌症治疗(包括人癌症治疗)中的用途的兴趣不断增加。当新城疫病毒在人体内复制时，一般来讲，病毒不会表现出毒力。感染NDV的人体最熟知的症状是轻度结膜炎。首次参与用活的减毒NDV对大量鸡进行接种的兽医师常常患有这种结膜炎。然而，由于未研究透彻的原因，哺乳动物肿瘤细胞的致病性大大高于非肿瘤细胞的致病性。据估计，ND在癌症细胞中的复制高于正常细胞中高达约100. 000倍。NDV不是唯一具有抗肿瘤作用(例如溶瘤作用)的APMV。目前，APMV1、3、4、5、6、7、
8、9以及Mapuerta病毒和Fer-de_Lance病毒的溶瘤毒株是已知的,参见例如美国专利申请US2009/0208495。APMV有两种类型溶解性(Iytic)和非溶解性(non-lytic)毒株。溶解性和非溶解性毒株二者均能够杀死癌症细胞，但是溶解性细胞具有稍快的作用模式(Schirrmacher，V.等，Int. J. Oncol. 2001 May; 18(5) : 945-52)。据推测，溶解性毒株破坏已感染细胞的质膜，而非溶解性毒株表现为干扰细胞代谢。因此，尽管机制不同，溶解性和非溶解性毒株二者均对肿瘤细胞具有毒性。因此，为了避免混淆，溶解性和非溶解性毒株二者还将进一步被称为细胞毒性毒株。由于在文献中，溶解性毒株也被称为溶瘤毒株，因此此处溶解性毒株的用词将指溶瘤毒株。已经对溶解性和非溶解性NDV毒株在抗击癌症中的用途进行了研究。这使得开发出三种不同的基础性抗肿瘤疗法
I)对患者施用一种非溶解性或溶解性APMV毒株。2)对患者施用所谓的肿瘤溶解剂(oncolysates)，所述肿瘤溶解剂包含来自已体外感染APMV的癌症细胞的质膜碎片。3)对患者施用已感染非溶解性APMV毒株的完整癌症细胞。第一种方法的理论基础是溶解性病毒株的扩散以及随后该病毒株的复制将最终导致体内所有肿瘤细胞的感染。这种方法的一个不利结果是，一段时间后免疫应答将被诱导，其可能中和亲本和/或子代病毒。第二种和第三种方法的理论基础是当肿瘤细胞表面上的肿瘤特异性抗原与病毒抗原相互联系时，其被更好地识别。第二种和第三种方法之间的选择取决于经推测，是质膜还是全细胞提供较好的应答。基于病毒的抗肿瘤方法1、2和3的弊端是一段时间后将诱导针对APMV的免疫应答，其可能干扰亲本和/或子代病毒并阻断更多细胞感染。
这一难题已经通过几种途径解决。一些方法依赖于La.将编码干扰宿主免疫系统的化合物的异源基因引入病毒基因组中。另一种方法是一周数次给予(非常)高剂量的病毒，以克服所诱导抗体的作用，或诱导对病毒的某种免疫耐受性。
其他方法尝试通过非常强力的首次攻击来规避第二轮和更多轮病毒感染的必要性。这可以例如通过联合施用NDV和一些抗肿瘤药物(例如细胞毒性或细胞抑制性化合物)来进行。其他此类方法依赖于将编码例如靶向肿瘤特异性抗原的全长IgG抗体的基因引入NDV 中。这些方法共有的弊端是，与采用相对低浓度的NDV的基础性治疗相比，每一种均使患者更加恶化。因此，需要替代性方法以减少与抗体诱导相关的难题。本发明的一个目的是提供减少与抗体诱导相关的难题并且不会面临上面提及之弊端的方法。在该方面中，本发明的一个实施方案涉及包含禽副粘病毒(APMV)的药物组合物，其用于治疗哺乳动物的肿瘤，其中所述治疗包括对所述哺乳动物施用细胞毒性量的第一APMV的步骤以及随后在第一 APMV施用后2-56周内对该哺乳动物施用细胞毒性量的第二APMV的步骤，其中所述第二 APMV具有免疫学上不同于第一 APMV的HN蛋白的HN蛋白。所有APMV均携带编码血细胞凝集素(Hemagglutinin) /神经氨酸苷酶(Neuraminidase, HN)活性的基因和编码融合(F)蛋白的基因。血细胞凝集素/神经氨酸苷酶是保护性免疫应答的强力诱导者，而融合蛋白也在某种(尽管较少)程度上参与保护性免疫应答的诱导。现在令人惊讶地发现，禽副粘病毒(APMV’s)多个成员的血细胞凝集素/神经氨酸苷酶和融合蛋白之间具有非常低的免疫学交叉反应性。在一些情况下甚至实际上不存在免疫学交叉反应性。这一出乎意料的发现开辟了减少或优选避免出现与首次施用APMV毒株后免疫诱导相关之难题的新方法。达到此目的的一种途径是对哺乳动物施用细胞毒性量的第一 APMV，随后在所述第
一APMV施用后2-56周内对该哺乳动物施用细胞毒性量的第二 APMV’注意第二 APMV具有免疫学上不同于第一 APMV的HN蛋白的HN蛋白(优选融合蛋白)。本方面中的免疫学上不同是指第二 HN蛋白(优选融合蛋白)来自不属于第一 APMV的APMV。仅仅作为示例，如果第一 APMV的HN蛋白属于APMVI，则第二 APMV的HN蛋白必须属于另一种APMV，例如APMV3或APMV5，以符合免疫学上不同的标准。通过依照这种方法，由于不同APMV之间的(非常)低的免疫学交叉反应性，第二APMV将较少或者甚至更少受到针对第一 APMV的可能性免疫应答的阻碍。这使得能够随时间进行数轮病毒施用。这种方法的优势是显而易见的，当待受治疗的肿瘤是实体瘤时更是如此。特别是在这种情况下，肿瘤质(tumor mass)的所有细胞不可能在同一时间全部被感染。肿瘤的核心将首先保持不被攻击。第一次病毒施用后被感染的那些细胞在肿瘤质中的较深细胞层能够被感染之前将不得不死亡或消失。彼时，针对病毒产生的免疫力能够很好去除残留的病毒，结果使得这些较深细胞层不会被杀死。然而现在用未针对其产生免疫应答的第二 (必要时第三或更多)APMV毒株进行第二轮APMV施用将解决这一问题。有几种方法可以对第一和第二 APMV进行选择或筛选。一种简单的方法是使用选自由 APMV1、3、4、5、6、7、8、9、Mapuerta 病毒和 Fer-de-Lance 病毒组成的组中的一种 APMV作为第一 APMV,以及该组的另一种APMV作为第二 APMV。仅仅作为示例可以施用细胞毒性量的APMVl作为第一 APMV，随后在首次施用后2-56周内施用细胞毒性量的APMV3。筛选第一和第二 APMV的另一种更加复杂但是讲究的方法依赖于以下事实如上面所述，针对APMV的主要的免疫应答是针对病毒的HN，虽然较少程度上针对F蛋白。通过简单地将一种特定APMV的HN编码基因以及如果需要F蛋白编码基因替换为另一种APMV的那些，可以两次使用相同的APMV骨架一次作为野生型，第二次作为重组型，所述重组型目前携带另一种APMV的HN以及可能地还有F蛋白(编码基因)，以替代野生型的那些。仅仅作为示例可以使用NDV作为第一 APMV，重组NDV作为第二 APMV，其中重组NDV基于相同的NDV骨架，但是目前携带另一种APMV (例如APMV3)的HN以及可能地F蛋白(编码基因)，以替代初始NDV的HN或融合蛋白。第二(重组NDV) APMV会(更)较少受到针对第一 APMV产生的免疫应答的阻碍，因为(虽然事实上第二 APMV的基础是NDV)第二 (重组NDV)的主要免疫原性决定子不是NDV的，而是另一种APMV (例如APMV3)的。第一和第二 APMV施用之间2-56周的时间期具有以下理论基础一些肿瘤是快速生长的，而其他肿瘤或者甚至已转移的癌症细胞可以缓慢生长，或甚至在很长一段时间中是“休眠的”。因此，取决于肿瘤的特征，较早或较晚及时给予第二 APMV可能是有益的。在很多情况下，第一和第二 APMV施用之间的时间期较短，因为“休眠”时间少于56周。此外，可能希望避免细胞较早过度生长的风险。因此，优选的时间期是2和28周之间，按照优先顺序更优选2-20、2-16、2-12或者甚至2_8周之间。这种新颖的方法具有超越现存方法的优势，即其仅仅依赖于APMV的细胞毒性作用，因而原则上无需强制使用如上面所述已有方法所基于的，干扰免疫系统和免疫应答的细胞毒性药物或化合物或方案。本发明的一个额外优势是以下如果已经用根据本发明的组合物分两步对患者进行治疗后，一段时间后休眠的(或)已转移的肿瘤细胞开始分裂，可以通过施用第三APMV以及如果需要又一种APMV，s简单地重复该步骤。鉴于某些免疫应答针对F蛋白激发的事实，优选第二 APMV不仅具有免疫学上不同于第一 APMV的HN蛋白的HN蛋白，还具有免疫学上不同于第一 APMV的F蛋白的F蛋白。应当理解的是，如果例如一种NDV骨架用于第一和第二步中，那么第二重组NDV中的HN和融合蛋白应当优选来源于一种且相同的非NDV APMV0作为示例，如果第一 NDV是野生型NDV，那么第二 NDV，重组NDV应当优选同时携带例如APMV4或APMV5的HN和融合蛋白，而非APMV4的HN和APMV5的融合蛋白。因此，本发明的一个优选实施方案涉及根据本发明的药物组合物，其中第二 APMV额外地具有免疫学上不同于第一 APMV的F蛋白的F蛋白。病毒的选择非常广泛。APMV适用于抗肿瘤治疗是已知的，并且在本领域已知很长时间。例如，人癌症研究中使用的NDV毒株的概况包括i. a.毒株73-T(Cassel WA, GarrettRE. Cancer 18: 863-8， 1965)>UlsterCBohle ff, Schlag P, Liebrich W等，Cancer 66
(7): 1517-23，1990)、MTH-68 (Csatary LK, Moss Rff, Beuth J 等，Anticancer Res 19(IB): 635-8, 1999) (Csatary LK, Eckhardt S, Bukosza I 等，Cancer Detect Prev 17(6) : 619-27, 1993)、Italien(Mallmann P. Hybridoma 12 (5): 559-66，1993)、Hickman(ffheelock EF, Dingle JH. N Engl J Med 271 (13) : 645-51，1964)、PV701 (PecoraAL, Rizvi N, Cohen GI 等，J Clin Oncol 20 (9) : 2251-66，2002)、HUJ (Freeman Al,Zakay-Rones Z, Gomori JM 等，Mol Ther 13 (I): 221-8，2006)和 LaSota (Liang W,Wang H, Sun TM 等，World J Gastroenterol 9 (3): 495-8，2003)。关于施用途径，再次，本领域现存知识又给予技术人员充分的指导。仅仅作为本领域的示例，提供以下概况
在动物研究中，已经通过i.a.瘤内、腹膜内和静脉内途径完成NDV感染，如Schirrmacher V, Griesbach A, Ahlert T. , Int J Oncol 18 (5) : 945-52，2001 中所综述。通过肌内或皮下途径的NDV感染已经由i. a. Heicappell R, Schirrmacher V, vonHoegen P等，Int J Cancer 37 (4): 569-77，1986综述。在人体研究中，在患者已经感染溶解性NDV毒株的情况下，已经使用了瘤内、静脉内或肌内注射(Cassel WA, Garrett RE,Cancer 18: 863-8， 1965, Csatary LK, Moss Rff, Beuth J等，Anticancer Res 19 (IB):635-8，1999，Pecora AL, Rizvi N, Cohen GI等，J Clin Oncol 20 (9): 2251-66，2002，Csatary LK, Bakacs T, JAMA 281 (17): 1588-9， 1999， ffheelock EF, Dingle JH, NEngl J Med 271 (13): 645-51，1964，Csatary LK. , Lancet 2 (7728): 825，1971。还使用以下途径吸入和直接注射入结肠内(即通过结肠造口术开口)。(CsataryLK, Moss Rff, Beuth J 等，Anticancer Res 19 (IB): 635-8， 1999 Jan-Feb, CsataryLK, Eckhardt S，Bukosza I 等，Cancer Detect Prev 17 (6) : 619-27，1993)。此夕卜，可以在National Cancer Institute 的 Position DescriptionQuestionaire “Newcastle Disease Virus (PDQ ) Health Professional Version” 中找到APMV (例如NDV)在癌症治疗中的用途的全面概况。APMV的细胞毒性量是诱导细胞死亡所必需的病毒量。理论上来讲,一个APMV能够感染并且杀死一个细胞。然而在实际环境中会施用多于将要被感染的肿瘤细胞数目的量。适且的量例如不于 Csatary LK, Eckhardt S，Bukosza I 等Attenuated veterinaryvirus vaccine for the treatment of cancer. Cancer Detect Prev 17 (6): 619-27，1993中。一般来讲，哺乳动物非肿瘤细胞中非常温和的感染行为使得允许施用相对高的剂量。IO4和IO12Pfu之间广泛范围的剂量均是可以接受的剂量。IO5和IO9Pfu之间的剂量是大多数应用的优选剂量。上面引用的文献给予了这方面的充分指导。在新城疫感染是由强毒力或中等毒力NDV毒株引起的情况下，在大多数西方国家中该疾病是需要上报的。因此，如果抗肿瘤组合物中使用NDV毒株，应当选择低毒力毒株，以规避上报。在所有的APMV中，新城疫病毒(NDV)是最常使用的病毒。因此，可以优先使用该病毒作为第一或第二 APMV。因此，本发明的一个更优选的实施方案涉及根据本发明的药物组合物，其中第一 APMV是新城疫病毒。在第二 APMV是重组APMV因而携带另一种APMV的HN蛋白以及如果需要还有F蛋白(编码基因)以替代该APMV野生型基因的情况下，第一和第二 APMV 二者的优选APMV骨架是 NDV。另一种诱人的APMV是APMV3，其可以作为第一或第二 APMV。因此，本发明的另一个更优选的实施方案涉及根据本发明的药物组合物，其中第一 APMV是APMV3。
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甚至更优选的是根据本发明的药物组合物，其中第一 APMV是新城疫病毒，第二APMV是APMV3，反之亦可。因此，本发明的一个甚至更优选的实施方案涉及根据本发明的药物组合物，其中第一 APMV是新城疫病毒，第二 APMV是APMV3。本发明的另一个这种甚至更优选的实施方案涉及根据本发明的药物组合物，其中第一 APMV是APMV3，第二 APMV是新城疫病毒。如上面所提及，如果与非溶解性APMV相比，溶解性APMV在较快杀死细胞的意义上来说作用较快。因此，优选APMV的一种或多种应当是溶解性APMV0因此，本发明的一个甚至更优选的实施方案涉及根据本发明的药物组合物，其中至少第一或第二 APMV是溶解性的。该实施方案的最优选形式涉及根据本发明的药物组合物，其中第一和第二 APMV二者均是溶解性的。特别是在发达国家，对罹患癌症的猫科动物和犬科动物的兴趣和爱护不断增加。与人类似，寿命的增加使这些动物中的癌症率增加。已经显示根据本发明的药物组合物在猫科动物和犬科动物中疗效非常好。因此，该实施方案的另一种形式是用于伴侣动物(companion animals)中的根据本发明的药物组合物，所述伴侣动物例如马科、雪貂、猫科和犬科动物物种。优选这种组合物用于马科和犬科动物物种中，更优选用于犬科动物物种中。如上面所示，药物组合物当如此使用时具有超越已知抗癌症方法的显著优势。但是仍然有理由将根据本发明的药物组合物与任何抗肿瘤药剂联合使用。这种抗肿瘤药剂的全面列表提供于例如美国专利申请US2009/0208495中。因此，该实施方案的另一种形式涉及根据本发明的药物组合物，其中在至少第一或第二 APMV施用期间，共施用一定量的抗肿瘤药剂，例如细胞毒性药物。 第一和/或第二 APMV可以是额外地携带异源基因或结合蛋白的重组APMV，所述异源基因例如编码使前体药物转化的酶。这种结合蛋白可以例如是抗体。这种基因的另一个示例可以是编码携带免疫球蛋白结构域的融合蛋白的基因，如WO 2006/050984中所描述。因此，该实施方案的另一个形式是根据本发明的药物组合物，其中至少第一或第
二APMV是携带额外基因的重组APMV。根据本发明的药物组合物原则上应当包含药学上可接受的载体中的APMV，以使得能够施用APMV。载体的性质取决于La.施用途径。如果施用途径是通过吸入，载体可以简单地是无菌水、生理盐水溶液或缓冲液。如果优选途径是注射，载体应当优选是等渗的并且具有使其适于注射的PH限制。然而这种载体是本领域广泛已知的。本发明中使用的药学上可接受的载体的示例包括稳定剂(例如SPGA)、碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、右旋糖苷)、蛋白(例如白蛋白和酪蛋白)、含有例如胎牛血清或脱脂乳试剂的蛋白以及缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)。特别是当疫苗中加入这种稳定剂时，疫苗非常适于冷冻干燥。冷冻干燥是防止APMV失活的十分适宜的方法。因此，在一个更优选的形式中，根据本发明的药物组合物是冻干形式的。携带异源基因的重组APMV可以i. a.通过描述用于很多非分段(non-segmented)负链RNA病毒的公知的逆向基因技术制备。参见例如Conzelmann, J. Gen. Virol. 77:381-389 (1996), Conzelmann, Ann. Rev. Genet. 32, 123-162 (1998), Palese 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11354-11358 (1996), Peeters 等，J. Virology 73:5001-5009 (1999)，R0mer_Oberd0rfer 等，J. Genvirol. 80: 2987-2995 (1999)。实施例:
实施例I
犬中不同低毒力APMV株的安全性和复制I简介
I.I本实验的目的是评定低毒力禽副粘病毒(APMV) NDV Clone 30、NDV Ulster和APMV3在犬中是否是安全并且能够复制的。2材料和方法2.1实验的简短概述
用活的低毒力NDV Clone 30,NDV Ulster或APMV3通过口腔、鼻腔、眼部以及皮下途径对3组比格犬(每组2只动物)进行接种，如表7 “分组和剂量”中积元、。将4只犬分成3组(1-1-2),用作接触对照(contact control)(sentinel)。在接种后第 3-6-9-13 和 15 天获取口腔、眼部和直肠拭子。鼻腔试子仅在接种后第3和6天获取。每周采集血液样品，至接种后8周。首次接种后第6周，用NDV Clone 30或APMV3通过口腔、鼻腔、眼部以及皮下途径对犬进行第2 '伙参见表1“分组和剂量第2次接种后第3和6天，获取口腔、鼻腔、眼部和直肠拭子。拭子计划用于病毒再分离。第I次和第2次接种后第3和6天，经由膀胱采集尿液样品(必要的话使用利尿剂)。在每次接种后14天的期间内，利用植入芯片测量每只犬的体温。每日观察犬中疾病或其他异常的临床指征的出现情况。第I次接种后8周，即第2次接种后2周，对犬实施安乐死并进行肉眼研究。从胰脏、脾脏、肝脏、肾脏、脑、心脏、气管、肺和腹股沟淋巴结中获取组织学样品。2. 2所使用的毒株
活的 NDV Ulster - 9. 7 IoglO EID50/ml
活的 NDV Clone 30 : - 9. 5 IoglO EID50/ml活的 APMV3:- 8.7 IoglO EID5(l/ml。表I :分组和剂量
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权利要求
1.包含禽副粘病毒(APMV)的药物组合物，其用于治疗哺乳动物的肿瘤，其中所述治疗包括对所述哺乳动物施用细胞毒性量的第一 APMV的步骤以及随后在所述第一 APMV施用后2-56周内对所述哺乳动物施用细胞毒性量的第二 APMV的步骤，其中所述第二 APMV具有免疫学上不同于第一 APMV的HN蛋白的HN蛋白。
2.根据权利要求I的药物组合物，其中所述第二APMV额外地具有免疫学上不同于第一APMV的F蛋白的F蛋白。
3.根据权利要求I或2的药物组合物，其中所述第一APMV是新城疫病毒。
4.根据权利要求I或2的药物组合物，其中所述第一APMV是APMV3。
5.根据权利要求3的药物组合物，其中所述第一APMV是新城疫病毒，所述第二 APMV是APMV30
6.根据权利要求4的药物组合物，其中所述第一APMV是APMV3，所述第二 APMV是新城疫病毒。
7.根据权利要求1-6中任一项的药物组合物，其特征在于至少第一或第二APMV是溶解性的。
8.根据权利要求7的药物组合物，其特征在于第一和第二APMV均是溶解性的。
9.根据权利要求1-8中任一项的药物组合物，其特征在于所述哺乳动物是马科动物、犬科动物或猫科动物物种。
10.根据权利要求1-9中任一项的药物组合物，其特征在于在至少第一或第二APMV施用期间共施用一定量的抗肿瘤药剂。
11.根据权利要求1-10中任一项的药物组合物，其特征在于至少第一或第二APMV是携带额外基因的重组APMV。
全文摘要
本发明涉及包含禽副粘病毒(Avian Paramyxovirus,APMV)的药物组合物，其用于治疗哺乳动物的肿瘤。
文档编号A61K35/76GK102917717SQ201180028519
公开日2013年2月6日 申请日期2011年6月9日 优先权日2010年6月10日
发明者C.C.施里尔, H.J.M.贾格特 申请人:英特维特国际股份有限公司