恶性肿瘤细胞的检测方法

专利名称：恶性肿瘤细胞的检测方法
技术领域：
本发明涉及恶性肿瘤细胞的检测方法。
背景技术：
在肿瘤细胞表面特异性表达的蛋白质可用作使用了患者的外周血、骨髓细胞、组 织等的癌症诊断的细胞表面标记，通过检查其有无表达，从而也可应用于癌症治疗的效果 判定、复发的监测。
进而，近年来广泛进行以在肿瘤细胞表面特异性表达的蛋白质为靶标的抗体医 药品的开发。基于抗体医药品的治疗方法通过选择在正常细胞中不表达或表达量非常少 的抗原作为靶标，从而作为对正常细胞造成的影响为最小限度且可期待对肿瘤细胞选择 性高的治疗效果的治疗方法而备受关注。作为抗体医药品有效成分的抗体的作用机制 (mechanism)多种多样，例如使用针对在B细胞中特异性表达的CD20抗原制作的单克隆抗 体的属于B细胞淋巴瘤治疗药的利妥昔单抗(rituximab)对肿瘤细胞具有诱导凋亡、抗体 依赖性细胞毒(antibody-dependent cellular cytotoxicity :ADCC)活性、补体依赖性细 胞毒(complement-dependent cytotoxicity :Q)C)活性等作用。另外，使放射性同位素键 合于抗⑶20单克隆抗体而得的乾(9°Y)替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)在利用抗体 对肿瘤细胞进行攻击的基础上，还可预见基于放射线的治疗效果，对复发、难治性B淋巴瘤 治疗的有用性得到确认。
但是，现状是对肿瘤的治疗有用的单克隆抗体被限定在转移性乳腺癌、急性骨髓 性白血病、顽固性慢性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤等某些肿瘤种类。
因此，正在广泛开展可应用于癌症诊断、基于抗体医药品的癌症治疗的对肿瘤细 胞特异的新型细胞表面标记的探索。
LRll (LDL receptor relative withl I ligand-binding repeats)被鉴定为具有 LDL受体家族中特征性结构的新型LDL受体样蛋白质(专利文献1、非专利文献I)。LRll被 报告在因平滑肌细胞游走和增殖而形成的血管内膜肥厚部位，表达特异性亢进(非专利文 献2)。本发明人等发现哺乳动物的血液中存在可溶性LR11，以及动脉硬化性疾病患者血液 中的可溶性LRll浓度与健康人相比显著地为高值(专利文献2)。进而，本发明人等开发了 简便、准确地测定血液、脊髓液中的可溶性LRll的方法(专利文献3、非专利文献4)，测定了 在各种疾病中的可溶性LRll浓度，结果确认在恶性肿瘤、特别是白血病、恶性淋巴瘤之类 的造血器官肿瘤疾病中呈现异常高值，发现血液中的可溶性LRll成为新的肿瘤标记(专利 文献4)。但是，可溶性LRll不一定在所有造血器官肿瘤疾病患者的血液中均呈现异常高 值，其理由仍不明确。
另一方面，非专利文献5中报告了 LRll的mRNA在宽范围的来源于人的组织(神经 组织、肝脏、脑、外周血白细胞)中表达。进而，记载有如下内容在人骨髓细胞中的干细胞存 在的⑶34 +⑶38 —组分(骨髓性白血病细胞)中，LRl I的mRNA表达亢进，以及虽然未示出 数据，但LRll的mRNA在部分造血器官肿瘤培养细胞中也表达。但是，非专利文献5仅进行了在含有培养细胞的血液前体细胞方面的概括性的基因表达分析，没有关于在蛋白质水平上表达LRll的组织的记载，也完全没有关于造血器官肿瘤与LRllmRNA表达的关系的记载。
专利文献
专利文献1:日本特开平9-163988号公报
专利文献2 :TO2008/155891
专利文献 3 W02009/116268
专利文献4 :日本特愿2009-285492号公报
非专利文献
非专利文献I J. Biol. Chem. 1996; 271，24761-24768
非专利文献2 Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999; 19, 2687-2695
非专利文献3 J. Clin.1nvest. 2008; 118, 2733-2746
非专利文献4 :C1 in. Chem. 2009; 55，1801-1808
非专利文献5 !Experimental Hematology2000; 28, 1286-1296发明内容
本发明的课题在于提供通过测定在恶性肿瘤细胞表面表达的蛋白质标记而进行的恶性肿瘤细胞的检测方法。·
另外，本发明的课题在于提供以对恶性肿瘤细胞的表面蛋白质特异的抗体为有效成分的恶性肿瘤治疗药。
本发明人等制作抗LRll抗体并研究其反应性，结果发现可分别检测造血器官肿瘤细胞株溶解液中的LRll和被分泌于该造血器官肿瘤细胞株的培养上清液中的LRlI。另外，发现若将骨髓组织进行免疫染色，则不仅在血清中的可溶性LRll浓度为高值的造血器官肿瘤患者中LRll为阳性，在血清中的可溶性LRll浓度为正常范围(根据非专利文献4等) 的造血器官肿瘤患者中也存在LRll成为阳性的情况。
进而，本发明人等使用所制作的抗LRll抗体来进行流式细胞术，结果首次确认 LRll在很多来源于造血器官肿瘤的细胞株的表面表达。另外，确认LRll在急性骨髓性白血病患者的外周血的未成熟单细胞组分中表达，以及虽然LRll在急性淋巴性白血病患者的外周血中的成熟B细胞中不表达，但LRll在分化过程的未成熟B细胞组分中表达。另一方面，确认在来源于上皮性恶性肿瘤的细胞株中LRll也在细胞表面表达。根据这样的见解， 发现通过测定被检试样中的细胞表面的LR11，从而在血中的可溶性LRll浓度不是显著高值的情况下，也可特异性地检测恶性肿瘤细胞的存在，以及LRll因在恶性肿瘤细胞表面表达而能够成为抗体医药品的靶分子，从而完成本发明。
即，本发明提供一种恶性肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，测定被检试样中的细胞表面的LRlI。
另外，本发明提供一种恶性肿瘤的诊断方法，其特征在于，测定被检试样中的细胞表面的LRlI。
另外，本发明提供一种恶性肿瘤治疗药，其是以对恶性肿瘤细胞表面的LRll特异的抗体为有效成分的恶性肿瘤治疗药。
另外，本发明提供一种抗体，其是用以治疗恶性肿瘤的对恶性肿瘤细胞表面的LRll特异的抗体。
进而，本发明提供一种用途，其是对恶性肿瘤细胞表面的LRll特异的抗体在制造 恶性肿瘤治疗药物中的用途。
进而，本发明提供一种恶性肿瘤的治疗方法，其特征在于，给予对恶性肿瘤细胞表 面的LRll特异的抗体。
根据本发明，可通过侵害性低的方法高精度地检测恶性肿瘤、特别是造血器官肿 瘤或上皮性恶性肿瘤，可得到在判断恶性肿瘤的存在和严重程度、治疗方法的选择和效果 判定、复发的危险性和复发的有无之际有用的信息。另外，可通过特异性地攻击恶性肿瘤细 胞而治疗恶性肿瘤。


图1为使用细胞溶解液并通过Western印迹法来检测LRll在各种造血器官肿瘤 细胞株中的表达的图。
图2为示出通过流式细胞术来分析LRll在各种造血器官肿瘤细胞株的细胞表面 表达的结果的图。
图3为示出通过流式细胞术来分析CD14和LRll在健康人和急性骨髓单细胞性白 血病患者外周血的细胞表面表达的结果的图。
图4为示出通过流式细胞术来分析⑶19和LRll在健康人和急性淋巴性白血病患 者外周血的细胞表面表达的结果的图。
图5为通过免疫染色来检测LRll在来源于急性白血病患者的骨髓组织中的表达 的图。
图6为示出通过流式细胞术来分析LRll在来源于胆囊癌的细胞株的细胞表面表 达的结果的图。
图7为使用NB-4细胞株对小鼠腹腔内进行免疫并确认小鼠血清中的抗LRll抗体 效价的图。
图8为使用膜组分溶解液并通过Western印迹法来检测LRll在各种上皮性恶性 肿瘤细胞株的细胞表面表达的图。
图9为通过免疫染色来检测LRll在来源于恶性淋巴瘤患者的淋巴结组织中的表 达的图。
具体实施方式
在本说明书中所谓“LR11”，只要无特殊说明，就均指具有与抗LRll抗体的反应性 的蛋白质。作为“全长LR11”、“可溶性LR11”，是指公知的蛋白质、它们被部分断裂或修饰 而得的蛋白质。另外，在本说明书中，“测定”与“检测”的用语具有相同的含义，只要无特殊 说明，就也包括“定性”测定、“定量”测定、“半定量”测定中的任一概念。另外，有时将“定量”、“半定量”统称为“定量等”。
在本说明书中当说到恶性肿瘤的诊断时包括判定恶性肿瘤的存在、严重程度、治 疗方法的选择或效果判定、复发的危险性或复发的有无。
本发明的恶性肿瘤细胞的检测方法的特征在于测定被检试样中的细胞表面的LR11。作为被检试样，只要是怀疑存在恶性肿瘤细胞的来源于生物的被检试样即可，可列举出外周血液、脊髓液、组织切片等。另外，被检试样不仅是人，还可列举出来源于小鼠、大鼠、 家兔、猪、犬、猫等哺乳动物的被检试样。
作为成为本发明检测对象的恶性肿瘤，可列举出造血器官肿瘤和上皮性恶性肿瘤。在这里，作为造血器官肿瘤,可列举出白血病和恶性淋巴瘤。白血病中包括急性白血病和慢性白血病，恶性淋巴瘤中可列举出非霍奇金氏淋巴瘤。另一方面,作为上皮性恶性肿瘤，可列举出胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、 结肠癌、大肠癌、肾癌、胆囊癌、神经肿瘤(神经胶质瘤)、恶性黑色素瘤(黑色素瘤)等。作为本发明的具体检测对象，对于造血器官肿瘤而言，在白血病中更优选急性白血病，在恶性淋巴瘤中更优选非霍奇金氏淋巴瘤。另外，对于上皮性恶性淋巴瘤而言，优选肝癌、胰腺癌、结肠癌、大肠癌、胆囊癌。
作为细胞表面的LRll的测定方法，可列举出使用与细胞表面的LRll特异性结合的蛋白质，例如抗LRll抗体、LRll受体相关蛋白(RAP)的方法。其中，在精度、特异性的方面，优选使用抗LRll抗体来测定细胞表面的LRll的方法。
作为与细胞表面的LRll反应的抗LRll抗体，单克隆抗体、多克隆抗体均可，但优选使用单克隆抗体。该抗体的制作可用众所周知的方法进行。例如，在多克隆抗体的制作中，作为进行免疫的动物，可使用小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、山羊、绵羊、鸡等。作为多克隆抗体，优选抗血清，抗血清可在动物的皮下、皮内、腹腔等一次或多次给予抗原后，从被免疫的动物的血清获得。将蛋白质、肽用作抗原时，更优选与具有免疫激活效果的补液的混合物的免疫。
另外，对于单克隆抗体的制作，可根据公知的单克隆抗体制作方法，例如长宗香明，寺田弘合著，《单克隆抗体》广川书店(1990年)或Jame ff. Golding, “Monoclonal Antibody”, 3rd edition, Academic Press( 1996 年)制作。另外，也可通过 DNA 免疫法制作单克隆抗体，可参考 Naturel992Marl2; 356152-154、J.1mmunol. Methods Marl; 249147-154 来制作。
作为用于制作抗体的抗原，可使用LRll或其部分片段(肽)、在细胞表面表达LRll 的细胞、或整合编码LRll的cDNA而得的表达载体。为了获得识别LRll的高级结构的单克隆抗体，插入人RLll全长基因的表达载体最适合，此外，也可使用插入LRll序列的部分区域的表达载体。DNA免疫法可通过如下方法实施，S卩，对免疫动物使用各种基因导入法(例如肌肉注射、电穿孔、基因枪等)中的任一种方法，将上述表达载体单独或混合地注入到动物 (小鼠、大鼠等)的皮下，使之被摄入细胞内。
该单克隆抗体可通过以下方法制造，S卩，培养根据常规方法制作的杂交瘤并从培养上清液分离的方法、将该杂交瘤对与其具有相容性的哺乳动物给药并作为腹水回收的方法。
抗LRll抗体可根据需要由抗血清、培养上清液或腹水纯化来使用。作为纯化、分离抗LRll抗体的方法，有以往公知的方法，例如硫酸铵沉淀法等的盐析、利用葡聚糖凝胶等的凝胶过滤法、离子交换色谱法、利用蛋白A柱等的亲和纯化法等。
使用了抗LRll抗体的对被检试样中的细胞表面的LRll的具体测定方法无特殊限定，可列举出流式细胞术、免疫组织染色法、细胞膜组分的Western印迹法等，其中优选流式细胞术。当采用流式细胞术时，使以荧光色素标记的抗LRll抗体与被检试样中的细胞群反应，用生理盐水、其它培养基清洗后，使用从Becton-Dickinson公司等可通过商业途径获取的荧光激活细胞分选仪(FACS)进行荧光染色图的分析和细胞的分类。应予说明，为结束与细胞表面的LRll结合，作为上述抗LRll抗体的替代，也可使用RAP等对LRll具有亲和性的物质，这样的实施方式包含在本发明的范围内。
在本发明的LRll的测定中，除测定细胞表面有无LRll的存在的定性测定以外，也可通过与作为校正基准的LRll浓度或量比较而进行定量测定或半定量测定。此时，作为校正基准的LR浓度或量可使用浓度或量已知的LRll表达细胞、LRll表达细胞株的溶解液、 由培养上清液或LRl I高浓度血液回收的LRl1、重组LRl1、或在抗体制作中能够用作免疫原的合成肽等来设定。
在本发明的方法中，例如通过使被检试样中的LRll的测定结果(定性、定量等)与预先测定的健康人群、用肿瘤种类等框定的特定癌症患者群的测定结果(定性、定量等)进行对比，从而可获得与疾病状态有关的详细信息。例如，在存在恶性肿瘤细胞的情况、加重的情况或存在复发的危险性的情况下，被检试样中的细胞表面的LRll浓度或量存在相对于健康人群、特定癌症患者群的测定值为高值的情况，通过使两者进行对比，从而可判定恶性肿瘤的存在或严重程度、治疗方法的选择或效果判定、复发的危险性或复发的有无。
作为测定方法、判定方法的具体实例，可列举出以下手段。在用流式细胞术的测定中，可确定阳性、阴性的分界(cutoff)，通过阳性细胞在一定的细胞群中的存在比例而进行上述判定。另外，在用免疫组织染色的测定中，可确定阳性、阴性的分界，通过将在一定组织范围内的阳性区域所占的比例(宽窄)、对阳性区域的局部存在状态、与正常区域的边界状态等进行图像分析而进行上述判定。另外，在上述判定中，使用与下述LRll以外的细胞表面标记组合等以往公知的方法，可提闻判定精度。
上述恶性肿瘤的严重程度成为癌症进展到何种程度的指标。在本发明中，所谓“判定恶性肿瘤的存活或严重程 度”，例如在造血器官肿瘤的情况下，由于根据WHO分类将白血病、恶性淋巴瘤详细分类，还评价恶性度，所以包括给予肿瘤细胞表面的LRll的测定结果， 划分为这些分类。另外，在非霍奇金氏淋巴瘤的情况下，根据WHO分类，通过细胞增殖的速度而被分为“高恶性度”、“中等恶性度”和“低恶性度”，因而包括基于肿瘤细胞表面的LRll 的测定结果来划分成这些分类。对于分别被划分为各种恶性度的非霍奇金氏淋巴瘤的代表性肿瘤，可列举出滤泡性淋巴瘤(低恶性度)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(中等 高恶性度)、T 淋巴母细胞淋巴瘤(高恶性度)。另外，关于上皮性恶性肿瘤，包括使用与基于肿瘤大小和恶化程度、有无向所属淋巴结的转移情况和远处转移进行分类的 μ分类这样的国际性病期分类有关的指标，进而使用基于此分类而将癌症的恶化程度和扩散程度一起表示的阶段 (stage)分类，基于肿瘤细胞表面的LRll的测定结果，划分成这些分类。
就治疗方法的选择或效果判定而言，可通过观察白血病母细胞在骨髓细胞中的比率的变化、发病的肿瘤大小的变化而进行评价。另外，对于复发的危险性而言，在通过治疗而未使与细胞表面LRll有关的指标(浓度、量、阳性细胞的存在比率、组织中的阳性区域的比率等)下降至正常范围的情况下，可判断复发的危险性高，进而，对于有无复发而言，当在间歇期、因治疗而缓解后，上述与细胞表面LRll有关的指标开始上升或增加的情况下，可评价肿瘤再次发生的可能性高。
目前，就白血病的诊断而言，在通过使用了外周血的血液形态检查而确认异常的 情况下，实施骨髓穿刺，进行普通染色而确诊，进而为了进行详细的分类，实施细胞表面的 抗原分析检查。根据本发明的使用了抗LRll抗体的被检试样中的细胞表面的LRll测定方 法，在使用外周血的检查中可提高白血病细胞的检测精度。另外，在判定上述恶性肿瘤细胞 的存在等之际，不仅通过细胞表面LRll的测定值，而且通过与其它公知的细胞表面标记进 行组合而进行更高精度的判断。
在血液细胞中当造血干细胞分化成各种系统的细胞时，对应于细胞分化成熟度而 表达的抗原组的种类、表达时期发生变化。在造血器官细胞的表面存在抗原受体、细胞粘 附分子、细胞因子受体、补体受体、Fe受体等各种分子，可将它们作为标记而推测细胞的归 属。另外，在白血病的病型诊断中，使用细胞化学的方法，利用过氧化物酶反应(POD)进行 是淋巴性白血病还是骨髓性白血病的分类。作为急性白血病分类之一的FAB分类的MO为 P0D3%以下,若是以往则被分类为淋巴系白血病，但在现在检索细胞表面抗原，若标记中的 ⑶13或⑶33为阳性，⑶19、⑶20为阴性，则作为骨髓性白血病而开始治疗。M7也与MO — 样为P0D3%以下，表面抗原检索是重要的。在淋巴性白血病、恶性淋巴瘤中，由于不像骨髓 性白血病那样形态学特征那么明确，所以细胞表面抗原检索就成为更重要的检查项目。这 样，细胞表面形质的检索对确定肿瘤细胞的归属发挥重要的作用，在WHO分类中记载了所 有造血器官肿瘤的免疫表型。通过将本发明的LRll作为细胞表面标记而与这些以往的方 法组合，从而使获得用以更详细地把握病情的信息成为可能。应予说明，对于上述白血病的 诊断、分类等而言，例如在浅野茂隆等主编，《三轮血液病学》文光堂(2006年)等中被详细 记载，在实施本发明的测定时可参照。
通过本发明可确认LRll在恶性肿瘤细胞表面表达，因此以恶性肿瘤细胞表面的 LRll为靶分子的分子靶向治疗，具体而言使用了对LRll特异的抗体的恶性肿瘤治疗是可 能的。上述分子靶向治疗可通过以抗LRll抗体为有效成分的恶性肿瘤治疗药、所谓的抗体 医药品的给药而进行。应予说明，在本说明书中，“恶性肿瘤治疗药”与“抗体医药品”未特 别区分而以相同含义使用。
在上述抗体医药品中该抗LRll抗体可作为担载放射性同位素、抗癌剂或毒素等 (以下有时统称为“抗癌剂等”)的担载体使用。在这里抗LRll抗体作为向靶分子(LRll)表 达的恶性肿瘤细胞(靶细胞)运送抗癌剂等的载体起作用。作为担载于抗LRll抗体上的抗 癌剂等优选放射性同位素，优选使用9°Y (钇90)、1311 (碘131)。
在上述抗体医药品中，当抗LRll抗体具有细胞毒活性的情况下，可获得直接杀细 胞效果。根据最近的见解，在抗体医药品的作用机制中细胞毒活性被认为是重要的，优选与 在恶性肿瘤细胞表面表达的LRll结合、具有细胞毒活性的抗体。这样的抗体通过使用如上 制作的抗LRll抗体来筛选细胞毒活性而获得。应予说明，本发明中的所谓“细胞毒”是指以 任何形式对细胞造成病理变化，不限于基于ADCC活性、⑶C活性的直接细胞杀伤，也指DNA 的切断或碱基二聚体的形成、染色体的切断、细胞分裂装置的损伤、各种酶活性的降低等一 切细胞结构、功能上的损伤。本发明中的所谓“细胞毒活性”是指引起上述细胞毒。另外， 作为本发明的恶性肿瘤治疗药的对象的恶性肿瘤与上述检测对象相同。
用于本发明的恶性肿瘤治疗药(抗体医药品)的抗LRll抗体以与LRll特异性结合 为限度，无特殊限制。具体而言，可列举出来源于小鼠等免疫动物的抗体、来源于与作为治疗对象的哺乳动物相同的动物的抗体、嵌合抗体、人源化抗体、完全人源化抗体等。它们可考虑对作为给药对象的哺乳动物的给药量、给药频率、抗原性等，从上述中适宜选择。在抗体医药品的给药对象为人的情况下，优选使用嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体。上述嵌合化、人源化等可通过公知的方法进行。
上述ADCC活性、⑶C活性可通过用公知的方法而赋予抗LRll抗体或使之增强。作为将ADCC活性和/或CDC活性赋予抗LRll抗体或使之增强的方法，例如可列举出改变抗体的Fe区氨基酸序列的方法(Shields R. L.，et. al. ;J. Biol. Chem. ,276,6591-6604 (2001))、改变Fe区中的糖链而提高对Fe Y受体II的结合力的方法(Umana P.，et. al;Nat. Biotechnol.，17，176-180 (1999)、Shields R. L. , et. al, ; J. Biol. Chem.，27726733-26740 (2002)、Shinkawa T.，et. al. ; J. Biol. Chem.，278，3466-3473 (2003))、使Fe区形成串联多聚体的方法(国际公开W02007/100083)、导入具有增强⑶C活性的能力的Fe片段的方法(国际公开W02006/114700)等。
另外，若从抗LRll抗体之中选择中和或抑制肿瘤细胞中的LRll生物活性的抗体， 则例如也可制成以对恶性肿瘤细胞诱导凋亡为作用机制的抗体医药品。
在体外基于抗LRl I抗体的对肿瘤细胞中的LRll生物活性的中和作用例如可通过以各种浓度向过度表达LRll的细胞培养系统中添加抗LRll抗体，测定LRll具有的粘附、 迁移活性的抑制程度而进行评价。另外，也可通过测定肿瘤细胞的抗癌剂敏感性的变化来进行评价。另外，在使用过度表达LRll的上皮性恶性肿瘤细胞的情况下也可通过测定对转化灶形成、集落形成和球状体增殖的抑制活性而进行评价。
在体外基于抗LRll抗体的肿瘤细胞毒活性例如可通过测定抗LRll抗体对过度表达LRll的细胞所显示的抗体依赖性细胞毒活性、补体依赖性细胞毒活性或补体依赖性细胞性细胞毒活性而进行评价。例如，可通过培养过度表达LRll的细胞，以各种浓度向培养系统中添加抗LRll抗体，进而添加小鼠等的脾脏细胞，测定培养适当时间后的对LRll过度表达细胞的细胞死亡诱导率来进行评价。
在体外利用实验动物的抗LRll抗体对肿瘤的治疗效果例如可通过在WTl基因转基因小鼠等白血病模型动物中，对过度表达LRll的转基因模型动物给予抗LRll抗体，测定肿瘤细胞的变化而进行评价。这样得到的中和LRll生物活性的抗体或特异性损伤表达 LRll的肿瘤细胞的抗体可用作药物，特别是可用作以癌症治疗为目的的抗体医药品的有效成分。
本发明还提供含有对治疗有效的量的抗LRll抗体和药学上所容许的稀释剂、担载体、增溶剂、乳化剂、保存剂和/或助剂的医药组合物。
在本发明的医药组合物 中，作为所容许的制剂中使用的物质，优选在给药量、给药浓度下对被给予医药组合物的对象无毒性的物质。
本发明的医药组合物可含有用以改变、维持或保持pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、无菌性、稳定性、溶解率、缓释率、吸收率、渗透率的制剂用物质。作为制剂用物质，可列举出以下物质，但并不限定于此甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等氨基酸类，抗菌剂，抗坏血酸、硫酸钠或亚硫酸氢钠等抗氧化剂，磷酸、枸橼酸、硼酸缓冲液、碳酸氢盐、三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)溶液等缓冲剂，甘露醇等填充剂， 乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂，咖啡因、聚乙烯吡咯烷、β -环糊精、羟丙基-环糊精等络合剂，葡萄糖、甘露糖、糊精等增量剂，单糖类、二糖类、葡萄糖、甘露糖、糊精等其它碳水化合物，着色剂，香味剂，稀释剂，乳化剂、聚乙烯吡咯烷等亲水聚合物，低分子量多肽，成盐反离子，苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢等防腐剂，甘油、丙二醇或聚乙二醇等溶剂，甘露醇或山梨醇等糖醇，助悬剂， PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨酯(Polysorbitate) 20、聚山梨酯80等聚山梨酯、Triton、氨丁三醇(tromethamine)、卵磷脂或胆固醇等表面活性剂,鹿糖、山梨醇等稳定增强剂,氯化钠、氯化钾、甘露醇、山梨醇等弹性增强剂，输送剂，稀释剂，赋形剂，和/或药学上的助剂。 这些制剂用物质的添加量优选相对于抗LRll抗体的重量添加O. OflOO倍、特别是O. Γ10 倍。制剂中适宜的医药组合物的组成可由本领域技术人员根据应用疾病、应用给药途径等适宜确定。
医药组合物中的赋形剂、担载体可以是液体，也可以是固体。适当的赋形剂、担载体可以是注射用水、生理盐水、人造脑脊液、通常被用于非经口给药的其它物质。也可将中性生理盐水、含有血清白蛋白的生理盐水用于担载体。医药组合物中也可含有ρΗ7. (Γ8. 5 的Tris缓冲液、ρΗ4. (Γ5. 5的乙酸缓冲液，它们中还可含有山梨醇、其它化合物。本发明的医药组合物按照所选择的组成以必要的纯度制成适当的药剂，作为冻干品或液体进行准备。含有抗LRll抗体的医药组合物也可成型为使用了蔗糖之类的适当赋形剂的冻干品。
本发明的医药组合物可制备成非经口给药用，也可制备成基于经口的消化道吸收用。制剂的组成和浓度可根据给药方法确定，或者由于就本发明的医药组合物中含有的抗 LRll抗体对LRll的亲和性，即相对于LRll的解离常数(Kd值)而言，亲和性越高(Kd值越低)，则能够以越少的对人的给药量发挥药效，所以也可根据此结果确定本发明的医药组合物对人的给药量。就给药量而言，在对人给予人源化抗LRll抗体时，只要在广30日内I次给予约0.1 100mg/kg即可。
作为本发明的医药组合物的形态，可列举出包含点滴的注射剂、栓剂、经鼻制剂、 舌下制剂、经皮吸收制剂等，但优选包含点滴的注射剂。
实施例
以下列举实施例来更详细地说明本发明。
实施例1各种造血器官肿瘤细胞株的LRll表达的确认
各种造血器官肿瘤细胞株中的LRl I表达通过利用将具有LRl I的部分氨基酸序列的合成肽进行免疫而制作的抗LRll单克隆抗体(A2-2-3 :专利文献3)的Western印迹法来确认。细胞株使用来源于急性骨髓性白血病的3株(HL-60、ML-2、NB-4)、来源于急性淋巴性白血病的3株(CCRF-SB、MOLT-4、NALL-1 )、来源于恶性淋巴瘤的2株(Daud1、U937)， 合计8种。将这些细胞株混悬于HT培养基(含有15%胎牛血清HT添加剂、青霉素/链霉素的RPM1-1640)中，在5% 二氧化碳培养箱内于37°C下培养适当的时间，使之增殖。计算各种细胞株的细胞数，以成为I X IO7个的方式进行分取后，加入含有1%蛋白酶抑制剂(Sigma Aldrich 公司制造，P8340)的 RIPA 缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.6、150mM NaCl、1%NP_40、1% 脱氧胆酸钠、0. 1%SDS)，使之溶解。通过离心分离除去不溶物后，测定细胞溶解物中的蛋白质浓度，在含有SDS的还原条件下将每I泳道20 μ g的量进行煮沸处理。将该处理液上样于 SDS-PAGE (2-15%)的各个泳道进行电泳。电泳结束后，将蛋白质由凝胶转印于PVDF膜，使作为第一抗体的抗LRll单克隆抗体(A2-2-3)发生反应，使用小鼠IgG ABC试剂盒(Vector公司制造)，检测LRlI。
其结果是，在各细胞株的细胞溶解液中，在以分子量计略大于230kDa的位置，可确认大小略有不同的2条条带。
实施例2各种造血器官肿瘤细胞株的流式细胞术
针对在实施例1中分析过的8种细胞株，用流式细胞术分析LRll是否在细胞表面表达。使5X105个的各细胞株悬浮于染色介质(1%FBS/PBS)中，于1500rpm下离心分离5 分钟后，除去上清液，向沉降小片状物中添加3 μ L的lmg/mL FITC标记的抗LRll单克隆抗体(M3:专利文献3)，于4°C反应60分钟。将细胞用染色介质清洗2次后，根据使用说明书， 使用JSAN(Bay bioscience公司制造),实施流式细胞术分析。FITC标记的抗LRll单克隆抗体的阴性对照使用正常小鼠IgG (BD pharmingen公司制造)。将其结果示于图2中。在实施例1中LRll的表达得到确认的8株之内，对于HL-60、ML-2、NB-4、MOLT-4、CCRF-SB, U937这6株而言，可见强阳性至弱阳性的反应，由此确认LRll在这些细胞株表面表达。
实施例3急性骨髓性白血病(AML)患者外周血的流式细胞术分析
使用Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare公司制造)从急性骨髓单细胞性白血病患者(FAB分类M4)的外周血分离单核细胞，根据实施例2，对LRll是否在细胞表面表达进行利用流式细胞术的分析。阴性对照使用健康人的外周血。使5X105个的各细胞株悬浮于染色介质中，于1500rpm下离心分离5分钟后，除去上清液，向沉降小片状物中添加各3 μ L 的lmg/mL FITC标记的抗LRll单克隆抗体(M3)和PE标记的抗0)14抗体(BD pharmingen 公司制造)，于4 °C反应60分钟。将细胞用染色介质清洗2次后，根 据使用说明书，使用JSAN (Bay bioscience公司制造),实施流式细胞术分析。将其结果示出于图3中。
可知在健康人外周血中的白细胞中，LRll在作为单细胞表面标记的⑶14阳性组分中表达，同样地可知在急性骨髓单细胞性白血病患者外周血中的白血病细胞中，LRll仍然还在CD14阳性单细胞系母细胞中表达。在白血病中，成单核细胞、前单核细胞等未成熟单细胞居多，由此可知LRll不仅在健康人中可见的成熟的单细胞中表达，而且也在作为白血病细胞的未成熟单细胞中表达。
实施例4急性淋巴性白血病(ALL)患者外周血的流式细胞术分析
使用Ficoll-paque PLUS (GE Healthcare公司制造)从急性淋巴性白血病患者 (FAB分类L2)的外周血分析单核细胞，根据实施例2，针对LRll是否在细胞表面表达，用流式细胞术进行分析。阴性对照使用健康人的外周血。使5X IO5个的各细胞株悬浮于染色介质中，于1500rpm下离心分离5分钟后，除去上清液，向沉降小片状物中添加各3 μ L的 lmg/mL FITC标记的抗LRll单克隆抗体(M3)和PE标记的抗0)19抗体(BD pharmingen公司制造)，于4°C下反应60分钟。将细胞用染色介质清洗2次后，根据使用说明书使用JSAN (Bay bioscience公司制造),实施流式细胞术分析。将其结果示于图4中。
查明在来源于健康人外周血的白细胞中，在作为B细胞表面标记的⑶19阳性组分中LRll大部分为阴性，与之相对，在来源于急性淋巴性白血病患者外周血的白细胞中， 在多数白血病细胞化而成为CD19阳性的成淋巴细胞中LRll成为阳性。
实施例5来源于急性白血病患者的骨髓组织的免疫染色
针对I名急性淋巴性白血病(ALL)患者(血清中可溶性LRll浓度407ng/mL)和3 名急性骨髓性白血病(AML)患者(各自血清中可溶性LRll浓度70、6、8ng/mL)的骨髓组织，进行免疫染色。阴性对照使用正常小鼠IgG。组织切片使用切片机将石蜡包埋的病理样品薄切成厚度为4μπι而制作。所制作的切片用二甲苯进行脱石蜡，用乙醇进行水合处理后， 用以下方法进行免疫染色。将组织切片浸溃于枸橼酸缓冲液(ΡΗ6. O)中，通过进行微波处理而活化抗原。接着，为了封闭内源性过氧化物酶，将切片用含有O. 3%过氧化氢的甲醇液处理 30 分钟。然后，使用 Protein Block (Dako 公司制造)和 Avidin/biotin blocking kit (Vector公司制造)进行封闭处理。接着，将10 μ g/mL的抗LRll单克隆抗体(A2-2-3) 置于切片上，于4°C下反应一晚。用TBS (50mMTris-HClU50mM NaCl)清洗后，于室温下与稀释500倍(终浓度为1. 14ng/mL)的生物素偶联家兔抗小鼠IgG (Dako公司制造)反应30 分钟。清洗后于室温下与过氧化物酶偶联链霉亲和素(Nichirei公司制造)反应5分钟，用 TBS清洗，用显色液(0. 3%mg/mL 二氨基联苯、O. 006%过氧化氢、50mM Tris-HCl (pH7. 6))使之显色。最后，使用Mayer苏木精(Muto公司制造)进行核染色，在用乙醇处理使之脱水和用二甲苯使之澄清后，用Malinol (Muto公司制造)进行封入。将其结果示出于图5中。
根据使用了实施例1中记载的抗LRll单克隆抗体(A2-2-3)的免疫组织染色结果得到以下有趣的见解，即不仅是来源于血清中可溶性LRll浓度高的患者的组织，在正常区域的来源于患者的组织中也可确认LRll的表达。除了在实施例3和4中示出的外周血的未分化单细胞、在B细胞表面的表达检测以外，检测组织切片中的LRll的表达也可启示应用于治疗效果判定或复发监测的可能性。另外，通常在外周血中检测·不出癌细胞的恶性淋巴瘤等中，进行利用肿瘤组织切片的精密检查，由此认为应用的价值高。
实施例6上皮性恶性淋巴瘤细胞株的流式细胞术分析
从上皮性恶性肿瘤之中，针对高浓度地检测出血清中可溶性LRll的例子多的胆囊癌，使用2株来源于胆囊癌的细胞株(0CUG-1、Ν0Ζ)，根据实施例2，采用流式细胞术分析 LRll是否在细胞表面表达。使用在培养后经胰蛋白酶处理、过尼龙筛的细胞。使5X105个的各细胞株悬浮于染色介质中，于1500rpm下离心分离5分钟后，除去上清液，向沉降小片状物中添加3μ L的lmg/mL FITC标记的抗LRll单克隆抗体(M3)，于4°C下反应60分钟。 将细胞用染色介质清洗2次后,根据使用说明书,使用JSAN (Bay bioscience公司制造)， 实施流式细胞术分析。FITC标记的抗LRll单克隆抗体的阴性对照使用正常小鼠IgG (BD pharmingen公司制造)。其结果是，LRll阳性细胞的比例在0CUG-1中约为60%，在NOZ中约为20% (图6)。
实施例7细胞免疫
根据实施例5的结果，将LRll在细胞表面强表达的作为来源于造血器官肿瘤的细胞之一的NB-4株用HT培养基进行扩大培养，用PBS清洗2次后，以细胞数成为f 2 X IO7个的方式混悬于PBS中，注入BALB/c小鼠(雌)的腹腔内进行免疫。隔周或每周进行免疫，在合适的时期根据如下所示的方法确认小鼠血清中的抗LRll抗体效价。
将来源于人尿的纯化可溶性LRll用PBS稀释成50ng/mL，向微孔板(NUNC公司制造)中每孔添加50 μ L，于室温下固化2小时。用含有0. 05%吐温20的PBS (PBST)清洗后，每孔添加200 μ L的含有1%BSA的PBST(BSA-PBST)，于室温下封闭I小时。将由小鼠尾部采血得到的血清利用BSA-PBST稀释20(Γ1600倍，每I孔添加50 μ L，于室温下反应I小时。用PBST清洗后，将HRP标记的抗小鼠IgG多克隆抗体(Rockland公司制造)稀释10000 倍，每孔添加50 μ L，于室温下反应I小时。用PBST清洗后，接着每孔加入50 μ L的邻苯二胺底物液，于室温下反应20分钟，每孔加入50μ L的1. 5Ν硫酸，使反应停止后，用酶标仪 (Abs. 492nm)进行测定。
将确认免疫5次后的小鼠血清中的抗LRll抗体效价得到的结果示出于图7中。
在免疫前的小鼠血清中，几乎未见与固化的来源于人尿的纯化LRll的反应，与之相对，在免疫NB-4细胞的情况下，可见与固化的来源于人尿的纯化LRll的明确反应，由此确认产生了针对LRll的抗体。对于与在恶性肿瘤细胞表面表达的LRll结合的抗体、进而具有细胞毒性的抗体，可通过在抗体效价变得足够高时，根据常规方法取出脾脏，实施细胞融合，建立抗LRll单克隆抗体，从其中选择具有肿瘤细胞表面LRll的结合活性与LRll生物活性的中和活性和/或细胞毒性活性的抗体而获得，另外，细胞毒性活性可通过公知的方法赋予或增强。
实施例8各种上皮性肿瘤细胞株中的LRll蛋白的确认
通过利用在实施例1中使用的抗LRll单克隆抗体(A2-2-3)的Western印迹法，确认各种上皮性肿瘤细胞株中的LRll蛋白表达。细胞株使用HLE (来源于肝癌)、MKN1 (来源于胃癌)、Τ·Τη (来源于食道癌)、C0L0201 (来源于大肠癌)、AsPC_l (来源于胰腺癌)、Caki_l (来源于肾癌)、Oka-C-1 (来源于肺癌)、PC-3 (来源于前列腺癌)、KMBC-2 (来源于膀胱癌)、 HeLa (来源于宫颈癌)、OVISE (来源于卵巢癌)、YMB-1 (来源于乳腺癌)、KINGSl (来源于神经肿瘤)、G-361 (来源于恶性黑色素瘤)，合计14种。将这些细胞株混悬于指定的培养基(例如含有10%胎牛血清、青霉素/链霉素的RPM1-1640)中，在5% 二氧化碳培养箱内于 37°C下培养适当时间，使之增殖。增殖的细胞在用PBS清洗数次后，用胰蛋白酶-EDTA溶液 (Invitrogen公司制造25200-072)回收。计算各种细胞株的细胞数，以成为I X IO7个的方式进行分取后，加入适量的PBS，使之混悬，通过离心分离，回收细胞。重复此操作3次，清洗细胞。向回收的细胞中加入IOOyL的含有1%蛋白酶抑制剂(Sigma Aldrich公司制造， P8340)的PBS后，用超声振荡器(均质器)粉碎细胞。通过离心分离除去细胞碎片后，将上清液通过超速离心分离(IOOOOOg, 10分钟)而使膜组分沉淀。除去上清液，用PBS清洗沉淀后，加入100 μ L的含有1%蛋白酶抑制剂(Sigma Aldrich公司制造，P8340)和1%MEGA_9的 PBS,用超声振荡器(均质器)混悬、溶解膜组分，再次通过超速离心分离(100000 X g、10分钟)除去不溶的膜组分，从而获得可溶性膜组分溶液。
在含有SDS的还原条件下，对每I泳道2 μ L的量的各种细胞株的可溶性膜组分溶液进行煮沸处理，将各处理液进样于SDS-PAGE (2-15%)的各泳道，进行分离。电泳结束后， 将蛋白质由凝胶转印于PVDF膜，使作为第一抗体的抗LRll单克隆抗体(Α2-2-3)发生反应， 然后将生物素化的抗小鼠IgG多克隆抗体(DAKO)和HRP标记的链霉亲和素组合，最终用二氨基联苯胺(Diaminobenzidine)进行显色，检测LR11。
结果在所使用的全部14种细胞株的膜组分溶解液中均确认了显示LRll蛋白的条带(图8)。此见解启示在上皮性恶性肿瘤疾病中的患者病变部位的细胞表面LRll蛋白表达亢进的可能性。
实施例9来源于恶性淋巴瘤患者的组织的免疫染色
根据实施例5的方法，针对恶性淋巴瘤中被分类为非霍奇金氏淋巴瘤的I名弥漫性大B细胞型淋巴瘤(DLBCL)患者(血清中可溶性LRll浓度79ng/mL)和健康人的淋巴结组织进行免疫染色。阴性对照使用正常大鼠IgG (Santa Cruz Biotechnology公司制造)。组织切片是使用切片机将石蜡包埋的病理样品切成厚度为4μπι的薄片而制作的。将所制作的切片用二甲苯进行脱石蜡，用乙醇进行水合处理后，根据以下方法进行免疫染色。为了封闭内源性过氧化物酶，将切片用含有3%过氧化氢的甲醇溶液处理5分钟。然后,使用 Protein Block (Dako公司制造)进行封闭处理。接着，将10 μ g/mL的抗LRll单克隆抗体 (R14，非专利文献4)和正常大鼠IgG置于切片上,于室温下反应一晚。用PBS清洗后，于室温下与稀释了 3000倍的生物素偶联家兔抗大鼠IgG (Dako公司制造)反应30分钟。清洗后于室温下与过氧化物酶偶联链霉亲和素(Nichirei公司制造)反应5分钟，用PBS清洗， 使用ImmPACT DAB过氧化物酶底物(Vector Laboratories公司制造)进行染色。最后,使用Mayer苏木精(Muto公司制造)进行核染色，在用乙醇处理使之脱水和用二甲苯使之澄清后，用Malinol (Muto公司制造)进行封入。将其结果示出于图9中。
根据使用了抗LRll单克隆抗体(R14)的免疫组织染色结果，在恶性淋巴瘤的 组织切片中LRll的表达也得到确认。
权利要求
1.一种检测恶性肿瘤细胞的方法，其特征在于，测定被检试样中的细胞表面的LR11。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，恶性肿瘤为造血器官肿瘤或上皮性恶性肿瘤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，造血器官肿瘤为白血病或恶性淋巴瘤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，白血病为急性白血病。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，恶性淋巴瘤为非霍奇金氏淋巴瘤。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，上皮性恶性肿瘤选自胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、 前列腺癌、膀胱癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、大肠癌、肾癌、胆囊癌、神经肿 瘤、及恶性黑色素瘤。
7.根据权利要求广6中任一项所述的方法，其中，被检试样为外周血液、骨髓液或组织 切片。
8.根据权利要求f7中任一项所述的方法，其中，细胞表面的LR11的测定是使用至少 与细胞表面的LR11特异性结合的蛋白质来进行的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，蛋白质为抗体或受体相关蛋白。
10.一种恶性肿瘤的诊断方法，其特征在于，测定被检试样中的细胞表面的LR11。
11.一种恶性肿瘤治疗药，以对恶性肿瘤细胞表面的LR11特异的抗体为有效成分。
12.用于治疗恶性肿瘤的对恶性肿瘤细胞表面的LR11特异的抗体。
13.对恶性肿瘤细胞表面的LR11特异的抗体在制造恶性肿瘤治疗药中的应用。
14.一种恶性肿瘤的治疗方法，其特征在于，给予对恶性肿瘤细胞表面的LR11特异的 抗体。
全文摘要
本发明提供一种通过测定在恶性肿瘤细胞表面表达的蛋白质标记而检测恶性肿瘤细胞的方法。所述恶性肿瘤细胞检测方法的特征在于测定被检试样中的细胞表面的LR11。
文档编号A61K39/395GK103003695SQ20118003441
公开日2013年3月27日 申请日期2011年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者海老沼宏幸, 田久保耕平, 深町勇, 吉田彩舟, 武城英明, 中世古知昭, 斋藤康 申请人:积水医疗株式会社